ДНҚ зерттеу әдістері. ДНҚ диагностикасының тура және көлденең әдістері. ДНҚ – фингерпритинг

ПРЕЗЕНТАЦИЯ Такырыбы: ДНҚ зерттеу әдістері. ДНҚ диагностикасының тура және көлденең әдістері. ДНҚ - фингерпритинг.

Орындаған: Рысдаулет Н.

Тобы: 107 «Б» ЖМ

Қабылдаған: Жазықбаева Г. Т.

Қазақстан Республикасының Денсаулық Сақтау Министрлігі

Оңтүстік Қазақстан мемлекеттік Фармацевтика академиясы

Биохимия, биология және микробиология кафедрасы

Шымкент-2017

Жоспар

І Кіріспе

ІІ Негізгі бөлім

1. Молекулалық - биологиялық зерттеу әдістері

2. ДНҚ-диагностикасының тура және көлденең әдістері

ІІІ Пайдаланылған әдебиеттер

Цитогенетикалық әдістердің мәні-микроскоп арқылы адам хромосомаларын зерттеу болып табылады. Бұл әдіс ХІХ ғ. аяғынан қолданылып келеді. Цитогенетикалық әдістер арқылы-хромосома санының не жеке хромосомалардың құрылымын жарық микроскоп арқылы зерттейді. Цитогенетикалық зерттеулер объекті- бөлінуші (митоз, мейоз) не интерфазалық жасушалар болып табылады.

Молекулалық -цитогенетикалық әдістер - хромосомаларды зерттеудегі жаңа әдіс болып саналады, оны - флюоресцентті будандастыру (гибридтеу) (FISH) деп атайды. Бұл әдіс бірнеше сатылардан тұрады:

1) Алғаш зерттелінетін хромосомамен не оның бір учаскесімен будандасатын ДНҚ-зонд дайындалады. ДНҚ-зонд-биотин не дигоксигенин жалғанған ДНҚ-ның бір тізбегі болып табылады.

2) Микроскопиялық препараттағы хромосома ДНҚ-сын сілті ерітіндісімен өңдеп оны денатурациялайды, яғни ДНҚ жіпшелері арасындағы сутектік байланыстарды үзеді де ДНҚ жіпшелерін бір-бірінен ажырастырады.

3) Препаратқа ДНҚ-зондты енгізеді. Осы кезде ДНҚ-зонд нуклеотидтері зерттелетін хромосоманың ДНҚ тізбегіндегі нуклеотидтермен комплиментарлық байланысады, яғни ДНҚ ренатурацияланады.

4) Осыдан кейін препараттағы биотин не дигоксигенинді олармен таңдамалы қосылатын затпен (биотин үшін-стрептовидин, дигоксигенин үшін-антидигоксигенин) әрекеттестіреді, содан кейін бұл заттарға 1-2 кезеңмен флюоросцентті бояуларды (қызыл түсті бояу-родамин, жасыл түсті-изотиоцианат флюоресцин) қосады.

5) Люминесцентті микроскоп арқылы боялмаған хромосомалар арасынан боялған хромосомаларды айқын көріп, бақылауға, әрі қарай зерттеуге болады.

FISH әдісі арқылы геннің орналасу орнын анықтаудан бастап бірнеше хромосомааралық күрделі қайтақұрылымдарды ажыратуға мүмкін болады.

FISH әдісі анеуплоидияларды анықтау үшін де қолданылады.

Молекулалық-генетикалық әдістер зерттелінетін ДНҚ молекуласының нақтылы учаскесінің (аллель, ген) құрылымының ерекшеліктерін анықтауға бағытталған зерттеу әдістері болып табылады. Бұл әдістер ДНҚ және РНҚ молекулаларын тәжірибелік зерттеулерге негізделінеді. Қазіргі кезде молекулалық биология, генетика жетістіктері, адам геномын зерттеулер, молекулалық-генетикалық әдістерін медицина практикасында кеңінен қолдануға мүмкіндік туғызды.

Молекулалық-генетикалық әдістерінің негізгі кезеңдері мен нұсқаларының сипаттамасы 8 кестеде келтірілген:

1) ДНҚ (РНҚ) үлгісін алу-жасушадағы ДНҚ-молекуласын бөліп алу не полимеразалық тізбектік реакция (ПТР) арқылы жинақтау.

ДНҚ молекуласын кез-келген ядролы жасушалардан бөліп алуға болады. Ол ағзаның біртұтас геномы болғандықтан оны геномдық ДНҚ деп атайды.

Әдетте, ДНҚ молекуласын лейкоциттерден, хорион жасушаларынан, амнион сұйықтығының жасушаларынан, фибробласт культурасынан бөліп алады. Бір рет талдау жасау үшін бірнеше нанограммнан бірнеше микрограмға дейін ДНҚ қажет. Бұл үшін 20-40 мг. хорион, 1 мл қан, 5-10 мг қолдан өсірілген жасушалар қажет.

Ауруларды дұрыс анықтау (диагностика), не гетерозиготалық күйін анықтау, үшін геномның кішкентай фрагментін зерттеудің өзі жеткілікті, тек осындай фрагменттерді жеткілікті мөлшерде көшірмелеп көбейту (амплификация) қажет. Бұрын бұл проблеманы шешу әжептеуір қиын болатын, яғни ол бірнеше саты арқылы жүргізілетін: рекомбинантты плазмида құрастыру→оны бактерия жасушасына енгізу→бактерияны көбейту→ДНҚ фрагменттерін бөліп алу. Қазіргі кезде қажетті ДНҚ фрагменттерін жинақтау полимеразалық тізбекті реакциялар (ПТР) арқылы жеп-жеңіл жүзеге асады. Бұл реакцияны 1983 ж. американ зертеушісі К. Мюллис ашқан және оның ашылуы тұқым қуалаушылық ауруларды молекулалық-генетикалық зерттеулер арқылы анықтауда, адам геномын зерттеуде, революция жасады десе болады.

2) Полимеразалық тізбекті реакциялар (ПТР) -ДНҚ-ны амплификациялау, яғни көшірмелеп көбейту болып табылады. Бірнеше сағат ішінде ДНҚ-ның кез-келген бөлшектерін (бір генге дейін) миллиондаған дана күйінде көбейтуге мүмкіндік береді. ПТР жүргізу үшін көбейтілетін ДНҚ фрагментінің нуклеотидтер бірізділігін күні бұрын білу қажет.

Зерттелетін ДНҚ учаскесінің 51 және 31 ұштарының нуклеотидтер бірізділігіне сәйкес 20-30 нуклеотидтен тұратын екі олигонуклеотидтік праймерлер (РНҚ -ұйытқы) синтезделінеді.

ДНҚ фрагментін амплификациялау үдерісі қайталанатын циклдардан тұрады. Әр бір цикл 3 сатыға бөлінеді:

1. Жылылықпен әсер етіп (940) ДНҚ молекуласын жеке-жеке тізбектерге ыдырату (денатурациялау) ;

2. бір тізбекті ДНҚ-ның негіздеріне комплиментарлы праймерлерді байланыстыру (отжиг) (37-680) ;

3. ДНҚ полимераза ферментінің қатынасуымен жаңа ДНҚ тізбегін синтездеу (720) .

3) ДНҚ молекуласын фрагменттерге бөлшектеу (рестрикциялау) -рестриктезалар (бактерия эндонуклеазасы) арқылы ДНҚ молекуласын ұзынды қысқалы бөлшектерге (фрагмент) кесу. Рестриктазалар қос тізбекті ДНҚ молекуласының 4-6 нж нуклеотидтер бірізділігін танып кеседі де, фрагменттерге бөлшектейді.

Геномдық ДНҚ-молекуласын рестриктазалармен әрекеттестірсек ол ұзындығы түрліше болып келетін бірнеше фрагменттерге кесіледі.

4) ДНҚ фрагментерінің электрофорезі-рестриктазалар арқылы кесілген фрагменттер агрозды не полиакриламидті гель бетінде өлшемдеріне қарай түрліше таралып үлестіріледі, яғни молекула массасы үлкен фрагменттер баяу қозғалса, молекула массасы кіші -жеңіл фрагменттер тез қозғалады. Электрофорез аяқталған соң ДНҚ фрагменттері гель бетінде әртүрлі орындарда орналасады. ПТР-дан кейін ДНҚ фрагменттерін визуальды зерттейді, ол үшін агроздық гелде электрофорез жүргізеді. Содан кейін гельді этидий бромидімен өңдейді. Этидий бромиді ДНҚ-мен байланысып, гель бетін ультракүлгін сәулесімен сәулелегенде, спектрдің қызыл учаскесінде жарқырау байқалады. Сол жарқыраулар зерттеуге қажет ДНҚ фрагменттері болып табылады. Адам геномы өте үлкен болғандықтан (3, 2 миллиард нуклеотидтер жұбы, яғни 190 см. ) рестрикция нәтижесінде көптеген рестрикция фрагменттері түзіледі және электрофорезден кейін оларды этидий бромидімен бояғанда ультракүлгін спектрінде ДНҚ фракцияларының бәрі біркелкі боялады. Сондықтан, ДНҚ-ның ерекше фрагменттерін бөліп алып зерттеу Саузерннің блот-гибридтеу (будандастыру) әдісі арқылы жүргізіледі.

Бұл әдіс төмендегі кезеңдерден тұрады :

Саузерн бойынша блот-гибридтеу

1) Электрофорезден кейін гельді сілтілі ерітіндіге енгізеді, бұл кезде қос тізбекті ДНҚ молекуласы біртізбекті болып ыдырайды (яғни тізбектер арасындағы сутектік байланыс үзіледі) ;

2) ДНҚ фрагменттерін буферлік ерітінді көмегімен нитроцеллюлозалы не нейтронды фильтрге ауыстыру. Ол үшін гель бетін фильтрмен және бір бума фильтрлеуші қағаздармен жабады. Капиллярлық эффект нәтижесінде гель бетіне перпендикуляр буферлік ерітіндіағыны пайда болады. Гельден бөлініп шыққан ДНҚ фрагменттерінің бәрі фильтрде ұсталынып қалады. ДНҚ фрагменттерінің фильтрде орналасу реті олардың гельдегі орналасуына дәлме- дәл болады.

3) Қажет фрагменттерді визуальды табу үшін (фильтрде ұсталынып қалған ДНҚ фрагменттері көзге көрінбейді) ДНҚ фрагменттерін радионуклид не флюоресценттік таңбамен таңбаланған синтетикалық олигонуклеотидтік зонд бірізділігімен гибридтейді (будандастырады) . Әрбір зонд 16-30 жұп негіздерден тұрады. Зонд нуклеотидтерінің бірізділігі зерттелуші геномдық ДНҚ фрагментімен толық не ішінара комплиментарлы болуы қажет.

4) таңбаланған зонды бар ерітіндімен фильтрді әрекеттестіргенде ДНҚ фрагменттерімен ДНҚ-зонд тізбектері комплиментарлы гибридтелінеді (будандасады) . Радиоактивтік таңбамен таңбаланған будан учаскелерін рентгенмен зерттегенде (ауторадиография) зерттелуші ДНҚ фрагменттері айқын байқалады.

ДНҚ-диагностикасының тура және көлденең әдістері

ДНҚ-диагностика әдістерін ауру диагнозын растау үшін, ауру симптомдары клиникалық байқалғанға дейін, туылғанға дейін қүрсақтағы бала ауруларын анықтау үшін жүргізеді.

Моногендік түқым қуалайтын аурулардың тура және көлденең ДНҚ-диагностика деп аталатын әдістері белгілі.

Тура ДНҚ-диагностика әдістерін ауру гені клонданған, оның экзон-интрондық қүрылысы белгілі болған жағдайларда жүргізеді. Тура ДНҚ-диагностика әдістерінде ген мутациялары зерттелінеді.

Егер ауру гені клонданбаған болса, не ауру генетикалық гетерогенді күйде болатын болса, тура ДНҚ-диагностика әдістерін қолдануга болмайды. Бүл жағдайларда көлденең ДНҚ-диагностика әдістері қолданылады.

Мутацияларды диагностикалаудың тура әдістері. Қазіргі кезде ДНҚ-диагностикасының 2 әдісі қолданылады: белгілі мутацияларды детекциялау әдістері; мутациялық скрининг әдістері.

Белгілі мутацияларды детекциялау әдістері. Егер мутациялар белгілі болса, онда оларды фермент-рестриктазалар арқылы кесіп рестрикциялық талдау не ДНҚ-гибридизация (будандастыру) арқылы табуға болады.

Рестрикциялық талдау-мутацияларды тікелей детекциялаудың қарапайым әдісі болып табылады. Бүл кезде рестрикциялық эндонуклеазалар (бактерия ферменттері) арқылы қостізбекті ДНҚ молекуласын 4-8 нуклеотидтер аралығында кеседі. Мутантты ДНҚ -молекуласын осылайша кескенде үзыңдығы қалыпты жағдайдағыдан ерекше фрагменттер пайда болады, оларды электрофореграмма арқылы оп-оңай табуға болады.

Аллельспецфикалық ПТР-нүктелі мутацияларды (шағьш делекциялар, инсерциялар) табу үшін жүргізіледі. ПТР-ДНҚ молекуласының кез-келген бірізділігін миллиондаған рет көбейтуге мүмкіндік береді, содан кейін сол көбейтілген учаскелердегі мутацияларды табу үшін оларды талдап зерттейді.

Мутациялық скрининг әдістері. Егер мутация сипаты белгісіз, бірақ аурудың клиникалық көрінісі қандай генде мутация пайда болганын болжамдауга мүмкіндік беретін болса, онда мутация л ық скрининг әдістерін қолданады. Олардың түрлері: 1) Саузерннің б л от-гибридизация әдісі арқылы қайта құрылымдарды талдау; 2) бір-тізбекті ДНҚ молекуласының конформация полиморфизмін талдау; 3) денатурант градиентінде қос тізбекті ДНҚ электрофорезі: 4) гетеродуплексті талдау т. б.