Өсімдіктердің гендік инженериясының негіздері

Жоспар:

Өсімдіктердің гендік инженериясына анықтама және оның кезеңдері

ДНҚ рекомбинанттарын алу үшін қолданылатын ферменттер

Өсімдіктердің гендік инженериясында қолданылатын векторлар

Рекомбинантты ДНҚ-ны құрастыру және оны клеткаға енгізу

Трансформацияланған клеткаларды бөліп алу және гендердің экспрессиясы

Гендерді өсімдіктерге тасымалдау әдістері

Гендік инженерия- функционалдық активті генетикалық құрылымдарды рекомбинанттық (будан) ДНҚ молекулалары түрінде қолдан құрастыру. Гендік инженерияның мәні жеке гендерді бір организмнен алып басқа организмге көшіріп орналастыру.

Өсімдіктердің гендік инженериясының жұмысы мынадай кезеңдерден тұрады:

1) Басқа организмге көшірілетін құрылымдық (структуралық) генді алу;

2) Оны вектордың құрамына енгізу, яғни рекомбинанттық ДНҚ-ны жасау;

3) Рекомбинанттық ДНҚ-ны өсімдік клеткасына тасымалдау;

4) Өсімдік клеткаларында бөтен ДНҚ-ның экспрессиясын талдау;

5) Геномы өзгерген жеке клеткалардан регенерант өсімдігін алу.

Гендік инженерияда рекомбинантты ДНҚ алу үшін рестриктаза және лигаза ферменттері қолданылады.

Рестриктаза (рестрикциялық эндонуклеазалар) ДНҚ молекуласын белгілі жерлерден жеке үзінділерге қиып бөлшектейтін ыдыратушы фермент.

Алынған полинуклеотид бөлшектерінің (ДНҚ фрагменттерінің) комплементарлық немесе “жабысқыш” ұштарын ДНҚ лигазасы бір-біріне “желімдеп” реттеп жалғастырып қосады.

Осы ферменттердің көмегімен бір ДНҚ молекуласынан қажетті ген бөлініп алынып басқа ДНҚ молекуласының үзінділерімен құрастырылып рекомбинанттық, яғни жаңа будан ДНҚ жасалады

Рекомбинантты ДНҚ-ны құрастыру

Рекомбинанттық ДНҚ бірнеше әдістермен тірі клеткаға енгізіледі. Жаңа геннің экспрессиясы өтеді де, клетка сол ген белгілейтін белокты синтездей бастайды. Клеткаға рекомбинанттық ДНҚ молекуласы түрінде жаңа генетикалық информацияны енгізіп, жаңа белгісі бар организмді алуға болады. Мұндай организмді трансгендік немесе трансформацияланған организм деп атайды, себебі, бір организмнің өзгеріп басқа қасиетке ие блуын трансформация деп атайды.

Алғашқы рет рекомбинанттық ДНҚ 1972 жылы АҚШ-та Стэнфорд университетінде П. Бергтың зертханасында жасалды. Онда пробирка ішінде 3 түрлі микроорганизмнің ДНҚ-лары -лямбда фагтың және ішек таяқшасы бактериясының ДНҚ фрагменттері мен маймылдың онкогендік вирусының толық геномы қосылған еді. Өсімдіктердің гендік инженериясы саласында бірінші жұмыстар in vitro өсірілетін клеткалармен 1980 жылы жүргізілген. 1983 жылы алдымен, күнбағыстың трансгендік каллусы, кейін сол каллустан табиғатта мүлдем болмаған санбин өсімдігі алынды. Санбин деген ол геномында бұршақтың белогы фазеолинді кодтайтын гендері бар күнбағыс өсімдігі еді.

Бөтен генді клетка ішінде тасымалдап алып баратын арнаулы ДНҚ молекуласын вектор деп атайды. Векторлар ретінде көбінесе ішек таяқшасы E. coli және басқа да бактерия плазмидалары қолданылады. Өсімдіктер үшін ең лайықты вектор Agrobacteria деген топырақ бактерияларының плазмидалары.

Гендерді тасымалдайтын векторлар

Agrobacteria өсімдіктерге жұғып тәж тәрізді өсіндіні, яғни ісікті, бұлтықты пайда болғызады. Ісікті қоздыратын агент осы бактерияның плазмидасы, оны Ti-плазмида деп атайды. Тәж тәрізді ісіктер өсімдік хромосомасының құрамына Ti-плазмиданың белгілі бір бөлігінің кіруі арқасында пайда болады. Бұл фрагментті Т-ДНҚ деп атайды.

Табиғи жағдайда агробактерия гендерінің өсімдікке енуі

Agrobacterium tumefaciens-тің өсімдік сабақтарын зақымдауы

Ісік клеткаларында сау клеткаларда болмайтын опиндер деген химиялық заттар табылды. Опиндер- ол аргинин амин қышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендері: октопин - аргинин мен пирожүзім органикалық қышқылының туындысы, нопалин - аргинин мен α-кетоглутараттың туындысы.

Октопиндік және нопалиндік Ti-плазмидалардың генетикалық карталары

Нопалиндік Ti- плазмиданың физикалық картасы. Onc гендері онкогендікке жауапты, Noc гені - нопалин синтезіне, Arc гені - аргининнің деградациясына.

Құрамына қажетті ген тіркестірілген Т-ДНҚ-ны (рекомбинанттық ДНҚ) өсімдік клеткасына енгізудің 2 әдісі бар:

Екі аралық векторлар әдісі- ішек таяқшасы бактериясының (E. coli) pBR 322 плазмидасын қолдануға негізделген.

2. Бинарлық векторлар жүйесін қалыптастыруға негізделген. Өсімдіктерге ісік ауруын жұқтырып, оларды трансформациялау үшін бүтін Ti-плазмида емес, оның екі бөлшегі ғана жеткілікті. Біріншісі- Т-ДНҚ-ның екі жағындағы тек шекаралық бөліктері, басқасы- Ti-плазмиданың вируленттілік (vir) бөлігі.