Иммуноферментті анализ. Полимеразды тізбекті реакция

Қазақстан Республикасының Білім және Ғылым министрлігі

Семей қаласы Шәкәрім атындағы мемлекеттік университеті

Орындаған: Куатбек М. М.

Тобы: ВМ-503

Тексерген: Нуркенова М. К.

Мақсаты:

Иммуноферментты анализ - науқас сарысуындағы қоздырушы антиденелерді

немесе

зерттелетін материалдың қоздырушы антигендерін анықтау үшін арналған.

Иммуноферменттік талдаудын (ИФА) түрлері:

«гомогендік»

«гетерогендік».

Осы әдістердің бір бірінен айырмашылығы және өткізу ұстанымдары.

ИФАда қолданылатын ферменттер.

Ақырғы жылдарда иммунохимиялық сараптау әдістері белсенді даму жолына тұрып, биологияда маңызды проблемаларды шешуге көмектесіп, медицинада, ветеринарияда тәжірибе қолдану тауып отыр. Осы сараптау әдістерінің жоғары сезімталдығы және ерекшелігі (10-9 - 10-3 мг/мл) әдейленген маркер-изотоптар, флуоресцентті бояулар, ферменттер қолданумен жетіліп отыр.

Иммуноферментті сараптау (ИФА) - ферменттермен антигенді және антиденені таңбалау көмегімен әр түрлі физиологиялы белсенді заттарды анықтау әдістері. Өзінің сезімталдығына сәйкес ИФА радиоиммундық сараптауға тең болып бір қатар қасиеттеріне ие болды: ферменттермен таңбаланған реагенттердің тұрақтылығы, радиоактивтік заттармен қарым-қатынасқа кірмеу; реакцияны бақылау жеңіл болу (ферменттің әсерімен субстраттың түсі өзгеруі көзге байқалады) .

ИФА «гетерогенді» әдістердің негізінде (ELISA - enzyme linked immosorbenti assay) ковалентті иммобилденген немесе ерімейтін негізде (целлюлоза, сефароза, 4В, сефадекс, биогель, ұсақ тесіктері бар шыны, ацетаттық және нитроцеллюлозалық мембранды сүзгіштер және т. б. ) адсорбталған антигендермен және антиденелермен қолдану жатыр.

Ең көп таралған әдіс - антигенді және антиденені полистиролды ұялардың үстіне немесе сынауықтарға физикалық адсорбтау әдісі.

Сараптау екі нұсқада өтеді:

сәйкес келетін антигенге қарсы таңбаланған иммунды сары суды қолданатын тұра әдіс

зерттелетін ағзаның иммуноглобулиндеріне қарсы таңбаланған сары судың көмегімен - тұра емес әдіс. «Гомогенді» ИФА әдістерде (EMIT - enzyme multozid immunotest) фермент антигенмен коньюгатталады. Сол антиген байлану үдірісте қасиетін жоғалтпайды. Осы әдістердің негіздерінде антиденелермен таңбаланған антиген қарым қатынасқа кіргенде ферменттік белсенділік төмендейді. Ден саулық сақтау бағытында және ауыл шаруашылықта гомогендік әдістерге қарағанда реакция аяқталғанда екі фазасы жеңіл бөлінетін ELISA нұсқасы кең таралған.

ИФА әдісімен адамдардың, жануарлардың, өсімдіктердің бактериалдық және вирустік ауруларды зерттегенде, гормондарды анықтағанда, ісік антигендерін, наркотиктерді, антибиотиктерді, иммундық жүйелерді анықтағанда қолданады. Қаттыфазалық ИФА-мен ұлпалық дақылдарда моноклоналды антиденелердің синтезін өткізгенде қолданады.

Ветеринариялық тәжірибеде ИФА-мен инфекциялық аурулардың басты кезеңдерін анықтағанда, жануарлардың өнімдерінің ветеринариялы-санитариялық сараптауын өткізгенде қолданады. Осыдан басқа, осы әдіс вакциналармен және сары сулармен қолданғанда жануарлардың иммунобиологиялық жағдайларын анықтағанда көмектеседі. Иммунохимиялық сараптаулардың жалпы көлемінде иммуноферменттік сараптаудың әдістері зертханалық және клиникалық зерттеулерде болашақта бірінші орын алу мүмкін.

Зерттелетін материал

Қан сарысуы

Анализдің жүргізілуі:

Полистиролды планшеттің шұңқырында өткізіледі.

Зерттеу методикасы.

Зерттелетін материалды үстінде антигендермен сорбирленген планшет шұңқырларына енгізеді.

30-60 минут T=37C инкубациялайды. Антиденелер антигендермен байланысады.

Шұңқырларды байланыспаған спецификалық антиденелерден бірнеше рет шайып, ферменттермен таңбаланған антиденелерді иммуноглобулиндерге қосады.

Инкубациялайды, шайып жібереді.

Фермент субстратын және хромоген (химиялық реакция нәтижесінде өзінің түсін өзгертетін зат) қосады.

Ферментативтік реакцияның өнімі әсерінен хромоген өз түсін өзгертіп - реакция нәтижесі анық көрінеді.

Антиденелер мен антигендерді анықтау.

Зерттелетін сұйықтықты үстінде антигендермен сорбирленген планшет шұңқырына енгізеді.

Инкубация кезінде антиденелер антигендермен байланысады.

Планшетті байланыспаған антиденелерден бірнеше рет шайып, ферменттермен таңбаланған антиденелерді иммуноглобулиндерге (екіншілік антиденелер) қосады.

Планшетті қайтып шаяды, субстрат ферментін және хромоген қосады.

Ферментативтік реакцияның өнімі әсерінен хромоген өз түсін өзгертеді.

Ферментпен таңбаланған екіншілік антиденелердің антиген-антидене комплексімен қанша көп байланысы болса, соншама фермент белсенділігі және ерітінді боялу қарқындылығы көп болады. Антиденелер концентрациясы сынамасын спектрофотометриялық әдісімен анықтайдығ яғни боялған ерітіндінің оптикалық тығыздығымен. Сынамадағы антиденелерді анықтау үшін де осы әдіс қолданылады. Бұл жағдайда зерттелетін антигендерге антиденелермен сорбирленген планшет қолданылады, ферментпен таңбаланған екіншілік антиденелерде осы антигенге бағытталады.

Қорытынды есеп

Спектрофотометрде - боялған ерітіндінің оптикалық тығыздығы бойынша (боялудың қарқындылығы)

Иммуноферменттің оң қорытындысы диагноз ретінде есептелмейді.

Диагноз қою үшін дәрігер барлық клиникалық және лабораториялық деректер жиынтығын тексеруі қажет.

Аурудың кезеңін анықтау үшін белгілі бір мөлшердегі антиденелерді иммуноферментті анализ әдісімен қозғалыста анықтайды.

Полимеразалық тізбекті реакция

Полимеразалық тізбекті реакция (ПТР) - биологиялық материалдағы анықталатын нуклеин қышқылдарындағы (ДНҚ) аз концентрациялы фрагменттердің айтарлықтай ұлғайтылуын қамтамасыз ететін молекулярлық биологиядағы эксперименталды әдіс.

ДНҚ-ны амплификациялаудан басқа ПТР нуклеин қышқылдарына әр түрлі әсер етуге мүмкіндік береді (мутация, ДНҚ фрагменттерін тұтастыру) . Сонымен қатар, ПТР биологиялық және медициналық практикада кеңінен пайдаланылады, мысалы, мирастық немесе инфекциялық ауруларды анықтау, әкелікті орнату, гендерді клондау, жаңа гендерді бөліп шығару, т. б.

ПТР-ды іске асыру

Әдіс нуклеин қышқылының белгілі бір үлескісінің қайталанып отыратын таңдаулы көшірмеленуіне негізделген. Бұл үрдіс ферменттердің көмегімен жасанды жағдайда жүзеге асады (in vitro) .