Сүткоректілердің клеткалармен жұмыс істеу

Презентация қосу

Сүткоректілердің
хромосомадан тыс
экспрессиялаушы
векторлары
сүткоректілердің
геномдарының
функцияларын және
реттелуін зерттеу
үшін қолданылады.
Сонымен қатар
олардың көмегімен Сурет 7.13. Сүткоректілердің
адамдардың кейбір экспрессиялаушы векторының жалпылама
схемасы. Полилинкер (ПЛ) және селективті
сырқаттарын емдеу маркер эукариоттық промотор (р) және
үшін қолданылатын полиаденирлену сигналы (ро). Бақылауында
болады. Е. coli және сүткоректілер
аутентикалық клеткасындағы векторлар репликациясы
белоктар алынуы репликация репликациясы сайттарымен oriE и
orieuk қамтамасыз етіледі.
мүмкін. Трансформирленген E. coli клеткаларын
таңдау үшін ампицилинге (Ampr) тұрақты ген
қолданылады.
• 7.13 суретте келтірілген жануар вирусының
иниация репликация сайты. Клонданған
және селективті маркерлі гендерлдің
промоторлары, сонымен қатар олардың
транскрипция терминациясының
сигналдпары эукариот клеткаларында өтуі
керек; көбіне жануар вирустарының ДНҚ –
ң реттегіш кезектілігін қолданады. Мұнда
күшті промоторлар және ұтымды
полиаденирлену сигналдарын қолданған
жөн.
Селективті маркерлі гендер
• Сүткоректілердің транфицирленген жасушаларын таңдау үшін, көбіне
неомицинфосфотазаны кодтайтын Neor бактериальды генді қолданады. Бұл жүйеде
генетицин деп аталатын токсинді қосылыс қолданылады, ол сүткоректілердің
трансфицирленбеген клеткаларындағы трансляцияны шектейді. Сонымен қатар ,
трансфицирленген клеткаларда G – 418 неомицинфосфотрансферазамен
фосфорланады және инактивтеледі. Сәйкесінше, Neor ген өнімін синтездейтін
клеткалар тірі қалады және маманданады.
• Сүткоректілердің трансфицерленген клеткаларын таңдаудың басқа жүйесі
дигидрофолатредуктаза ферментін кодтайтын генді қолдануға негізделген. Бұл
жүйеде DHFR дефекті гені бар клетканы қолданады, бұл клеткаларда DHFR
функциясы синтезделмейді. Трансфекциядан кейін ортаға метотрексат қосады.
Оның қатысында трансфицирленбеген клеткалар өспейді, ал
дигидрофолатредуктазаны синтездейтін клеткалар тірі қалады. DHFR-генді
клеткаларды шамамен таңдап алғаннан кейін, метотрексат концентрациясын
жоғарлатады және көп мөлшерде рекомбинантты белок синтездейтін вектор
көшірмелерінің саны көп клеткаларды таңдап алады.
Доминантты маркермен таңдап алудың басқада схемалары жасалған,
мысалы, глутаминсинтетаза ферментін қолданумен , ол
метионинсульфоксиминнің цитотоксинді әсеріне тұрақтылықты
қамтамасыз етеді. Бұл жүйеде GS – генін тасымалдайтын вектор
қолданылады. Оны сүткоректі клетка культурасына енгізеді және көп
мөлшерде вектор көмірмесін тасымалдайтын клеткаларды даңдайды,
ортада метионинсульфоксиминнің концентрациясын жоғарлатады.
Мұнда қожайын клеткаларда GS болуы керек, себебі тек GS – генінің
көп көшірмесінің болуы метионинсульфоксиминге тұрақтылықты
қамтамасыз етеді. Мұндай схеманың белгілі артықшылықтары бар.
• Сүткоректілердің экспрессияланатын векторларына түрлі белоктардың
гендері енгізілген және олардың қожайын клеткаларында
экспрессиясы іске асқан. Кейде промотор және клонданған ген
арасына интрон орналастырса, өнімнің шығуы жоғарлайды. Бұл
феноминнің механизмі белгісіз.
Клонданған геннің экспрессиясын жоғарлату
селективті маркерлі геннің экспрессиясын
координациялау арқылы қол жеткізді. Бұл үшін
DHFR генін клонданған генге жақын
орналастырды, себебі екі генде бір промотордың
бақылауында болуы қажет және
полиоденилирленудің ортақ сигналы болуы тиіс.
Ал DHFR гені интрон сплайсинг сайттарымен
фланкирленген. DHFR және рекомбинантты
белок біріншілік транскриптен трансляцияланды
және сплайсирленген м РНҚ сәйкесінше (сур.
7.14)
Сүткоректінің бір клеткасында
клонданған екі ген экспрессиясы
Сурет. 7.14
Дигидрофолатредуктазаның және
рекомбинантты белоктың
гендерінің координацияланған
экспрессиясы. DHFR гені
интронның донорлы және
акцепторлы сплайсинг
сайттарының арасына
орналастырған, нысана геннің
алдына (ген α). DHFR және
клонданған ген бір эукариоттық
промотордың бақылауында және
полиаденирленудің ортақ сигналы
бар. DHFR сплайсирленбеген
біріншілік транскриппен
трансляцияланады, ал
гетерологинді белок (белок α)
сплайсингке түскен транскриптен. )
Сурет. 7.15. Экспрессияның екі
векторлы жүйесі. Клонирленген гендер
(а ж/е β) димерлі белоктың (αβ)
суббірліктерін кодтайды. Бір
уақыттағы трансфекциядан кейін
клеткалар екі плазмидалармен және
онда екі суббірлікте синтезделеді және
функциональды димерлі белок
жиналады. Қос векторда E. coli(oriE)
және сүткоректілер клеткасында (oriE)
қызмет ететін репликацияның
инициация сайтын тасымалдауда;
маркерлі ген (Ampr) Е. Coli- дің
трансформирленген клеткаларын
жинау үшін; эукариоттық промотор (р)
және полиаденирлену сигналы (ра)
барлығы селективті маркерлі геннің
және әрбір клонданған геннің
экспрессиясын реттейді.
• Димерлі және тетрамерлі белоктарды in vivo құрастыру ұтымды
өтеді. Сондықтан бір клеткада екі түрлі рекомбинантты белокты
синтездеу стратегиясы жасалды. Бұл үшін қожайын клетканы бір
уақытта сүткоректінің екі экспрессирлеуші векторымен
трансфицирледі, олардың әрқайсысы ген немесе к ДНК буббірліктің
біріне тасымалдады және селективті маркерлердің гені (сур.7.15).
Трансфицерленген клеткаларды екі рет таңдауға ұшыратты,
сәйкесінше тірі қалған клеткалар екі векторды да тасымалдады. Екі
векторлы жүйелер аутентті димерлі және тетрамерлі рекомбинантты
белоктарды синтездеу үшін қолданылады. Кейде екі рет
трансфирленген клеткалар екі векторларының бірінен айырылады.
Сонымен қатар, әрбір вектордың көшірмелерінің саны әр уақытта
бірдей емес, сондықтан бір суббірлік екіншісімен салыстырғанда
көп мөлшерде синтезделуі мүмкін және соңғы өнімнің шығымы
азаюы мүмкін. Осы мәселені шешу үшін құрамында екі клонданған
гені бар вектор құрастырылды. Рекомбинантты белоктордың бірдей
мөлшердегі синтезіне қол жеткізу үшін екі ыдысты векторлар
жасалды, онда клонданған гендер ДНқ сенменттеріне бөлінді, онда
рибосомамен байланысудың ішкі сайты болды.
. Мұндай сайттар сүткоректілер вирустарының
геномдарында табылған; Олар бір уақытта полицистронды
мРНҚ – сы бар түрлі белоктардың бір уақыттағы
трансляциясын қамтамасыз етеді. Конструкция
транскрипциясы «ген – рибосомаларды байланыстырудың
ішкі сайты – ген», бір промотормен және полиаденирлену
сигналымен басқарылады. Бір транскрипті екі ген
синтезделеді. Трансляция мРНҚ 5 ′ - соңынан және ішкі
сайтттан басталады, нәтижесінде α және β димерлі
белогінің суббірліктері синтезделеді. ( сур. 7. 17).
Жинақтай келе, зерттеу және медициналық
мақсаттарда аутентикалық рекомбинатты белоктар алу
үшін, сүткоректілердің экспрессиялаушы векторлары
әмбебап және ұтымды деп айта аламыз. Бірақта
сүткоректілердің модификацияланған клеткаларын
қолдану арқылы синтезделіп алынған рекомбинатты
белоктар өте қымбат.

Сур. 7.16. Екі тәуелсіз транскрибирленуші гендері бар экспрессирленуші
вектор. Клонданған (α және β) гендері диммерлі белок (αβ) суббірліктерін
кодтайды.
Сур. 7.17. Екі жүктемелі
экспрессиялаушы вектор. Клонданған (α
және β) гендері диммерлі белок (αβ)
суббірліктерін кодтайды. Олар
сигментті ДНҚ - мен бөлінген,
транскрипциядан кейін мРНҚ
деңгейінде рибосомаларды
байланыстырудың ішкі сайт қызметін
атқарады. Әр ген эукариоттық промотор
(р) және полиаденирлену сигналы (ра)
бақылауында болады. мРНҚ - ң
трансляциясы 5 ′ - соңынан және ішкі
сайттан басталады. Синтезделген
суббірліктер функциональды димерлі
белокты қалыптастырып бірігеді.
Векторда E. coli (oriE) сүткоректілер
клеткасында (orieuk) қызмет ететін
репликацияның ннициация сайттары
бар. Селективті маркерлі ген (Ampr) Е.
соli – дің трансформацияланған
клеткаларын таңдау үшін. Селективті
маркерлі ген промотор (р) және
полиаденирлену сигналы (ра)
бақылауында болады.
Прокариоттық экспрессия жүйелері көптеген белоктардың
синтезі үшін жемісті қолданылады. Бірақта кейбір белоктар
активті формаға өту үшін кейбір арнайыв посттрансляционды
модификациядан – гликолиздену, фосфорирлену немесе
ацетилденуден өтуі керек, ал бактериялар мұндайға қабілетсіз.
Сондықтан клонданған гендерді эукариот клеткалардың
көмегімен арнайы жасалған эукариоттты экспрессиялаушы
векторлармен экспрессилауға бел буды.
Клонданған гендермен кодталатын түрлі белоктардың синтезі
үшін S. Cerevisiae ашытқылары қолданылды. Олардың
генетикасы жақсы зерттелген, сонымен қатар оларды оларды
үлкен ферментерларда өсіруге болады. Белоктарды тазартуды
жеңілдету үшін, олардың секрециясын қамтамасыз ететін
векторлар құрастырылды. S. Cerevisiae ашытқылары көмегімен
көптеген түрлі аутентикалық белоктар алынды. Бірақта бұл
жүйедегі көптеген рекомбинатты белоктар посттрансляционды
модификацияға ұшырамады, олардың шығымы жеткілікті жоғары
болмады. Сондықтан рекомбинантты белоктардың синтезіне
басқа ашытқы жүйелерді қолдану ұсынылды.
Биологиялық активті ақуыздар алуға болатын, экспрессияның
басқа эукариотты жүйесін іздестіруде зерттеушілер көптеген
насекомдардың клеткасын

инфекциялайтын, бакуловирусы негізінде алынған, (бакуловируса
AcMNPV) векторларды алуға көңіл бөлді. Рекомбинантты
бакуловируспен инфекцияланған насеком клеткасы
гетерологикалық белокты синтездеді.
Рекомбинантты бакуловирустардың пайда болу жиілігіне 1 % - тен
99% дейін қол жеткізуге мүмкін болды. Бұл үшін ДНК AcMNPV
эндонуклеазды рестрикциямен өңдеді, ол ДНҚ – ны екі
спецификалық сайтттарда ыдырата отырып, литикалық цикльді
жүзеге асыру үшін геннің қажетті бөлігін әкеле жатқан
фрагменттерді босатады. Насеком клеткаларын осы фрагменттерге
трансфицирледі, кейін транспортты векторларға. Қосарлы
кроссинговор нәтижесінде кей клеткаларда AcMNPV сақиналы
геномы қалпына келіп жатты, онда литикалық циклды іске асыру
үшін клонданған ген және функциональды ген болды. Нәтижесінде
барлық вирулентті бакуловирустар рекомбинантттыға айналды.
Бакуловирустар негізінде экспрессия жүйесін жетілдірудің келесі қадамы: Е. Coll
барлық генноинженерлік іс – әрекеттерді іске асыруға мүмкіндік беретін,

Е. соli/ насеком клеткасынан тұратын челночнего вектор бакмидтты жасауда
болды. Насеком клеткаларын рекомбинантты бакмидпен тек гетерологикалық
белокты алу үшін ғана трансфицирледі.
Сүткоректілердің хромасомадан тыс экспрессиялаушы векторлары көбіне ғылыми
немесе медициналық мақсатта қолданылатын гетерологикалық белоктарды
синтекздеу үшін қолданылды. Олар челночные векторлар жануарлар вирусының
инициация репликация сайттары және Е. соli-плазмидтер , көп жағдайда
транскрипцияның реттеуші элементтері жануарлар вирусының геномынан немесе
сүткоректілер геномынан болады. Трансфицирленген клеткаларды таңдау үшін
доминантты селективті маркерлі гендерді қолданады. Кейбір таңдау жүйелері
ортаға өспелі мөлшердегі цитотоксинді қосылыстарды енгізуге негізделген.
Мұнда вектор көшірмелері көп клеткаларды алуға мүмкіндік береді, ол бөтен
белоктың шығымын жоғарлатады.
Іске асырылған сүткоректілердің экспрессия жүйелері екі түрлі суббірліктерден
тұратын белоктарды алуға мүмкіндік береді. Ол үшін қожайын клеткаларды
суббірліктердің бір генін тасымалдаушы екі вектормен трансфицирледі.

Ұқсас жұмыстар

Қызыл кітапқа енген өсімдіктер

Британдық галла (беріш) түзуші нематода – meloidogyne britanika goel

УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИЯ

Тақтұяқтылар отрядының ерекшеліктері

Сүтқоректілердің бүршік

Қазақстандағы Сүтқоректілердің сүтқоректілер дене мөлшері класы

ӨЗЕКТЕРДІҢ КӨПШІЛІК

Қорық Шығыс Қазақстан облысы

Аталық жыныс торшалары

Сүтқоректілер классы

Пәндер