Моноклоналды антиденелер туралы

Моноклоналды антиденелер

Адам мен жануарлардың ағзасына бөтен заттар (ақуыздар, полисахаридтер), антигендер енгенде қан құрамында антиденелер пайда болады.

Антидененің бір түрі ерекше өзіндік қасиетін көрсетеді, антигеннің бір ғана детерминантын танып, онымен байланысады. Антиденелердің түзушілері - В-лимфоциттер.

В-лимфоциттің бір жасушасы және оның ұрпақтары, клоны антиденінің бір түрін синтездейді.

Бір В-лимфоциттің клоны синтезделген антиденелер моноклоналды антиденелер деп аталады. Табиғи моноклоналды антиденелерді ісік жасушалары, плазмоцитомалар (В-лимфоциттердің муттантары) синтездейді.

Миеломатоз ауруларда иммуноглобулиндерді синтездейтін бір ісік жасушаларының ұрпақтары түзіледі. Барлық жасушалар иммуноглобулиннің бір түрін синтездейді. Бұл миеломді ақуыз, М-ақуыз қан сары суында жиналады. миеломды ақуыз моноклоналды антидене болып табылады.

Антиденелердің қызметі

Антиденелердің көмегімен:

- бактериялық уыттыларды (токсиндерді), жылан уларын, қан құрамына түскен вирустарды бейтараптандырады;

- ұлпа құрамында, биологиялық және басқа сұйықтықтарда әр түрлі заттарды теңестіреді. Адам мен жануарлардың ағзасына бөтен заттар (ақуыздар, полисахаридтер), антигендер енгенде қан құрамында антиденелер пайда болады. Антидененің бір түрі ерекше өзіндік қасиетін көрсетеді, антигеннің бір ғана детерминантын танып, онымен байланысады.

Моноклоналды антиденелердің қасиеттері

Моноклоналды антиденелер - бір ғана В-жасушаның ұрпақтарымен, бір ғана антиген детерминатына (эпитопқа) қарсы түзілген антиденелер, иммуноглобулиндердің бір класына жатады, олардың құбылмалы бөліктері, құрылымы, идиотипы, аффиндігі бірдей, бір эпитопты (детерминанттық топты) таниды.

Моноклоналды антиденелерді алу

Моноклоналды антиденелердің түзушілері (продуценттері) ретінде гибридомаларды қолданады.

Бірінші рет гибродомаларды гибридизация әдісті пайдаланып Б. Келлер мен Ц. Мильштейн 1975 жылы жасады.

Гибридомаларды алу

Гибридомалар - өмір сүру қабілеттілігі бар жасушалар, іn vіtro жағдайда

ұрпақтанады. Бірінші рет гибродомаларды гибридизация әдісті пайдаланып

Келлер мен Ц. Мильштейн 1975 жылы жасады.

Гибридома екі дене жасушаларының қосылуының нәтижесінде түзіледі. Екі

қосылатын жасушалардың генетикалық қасиеттері, жіктелу қабілеттілігі ұқсас,

себінді жағдайда минималды қоректік ортада өсу қабілеті болу керек.

Жасушалардың қоспасын дайындайды, жасушалар қосылады да бөліну

қабілеттілігін жоғалтпайды. Екі ядерлік гибридті жасушалар түзіледі. Гибридті

жасушалары бөлінгенде екі ядросынын хромосомалары қосылады, бір ядролы

екі дене жасушаларының ұрпағы, гибридома түзіледі.

Моноклоналды антиденелдерді синтездейтін гибридомаларды В-лимфоциттерді

плазмоцитомаларымен қосқанда алады. Плазмоцитома мен В-лимфоциттердің

генетикалық қасиеттері, жіктелу қабілеттілігі ұқсас және плазмоцистоманың

аппараты иммуноглобулиндердің синтезіне бағытталған.

Плазмоцитома мен лимфоциттерді қосып алған гибридомалар ісік жасушалары сияқты

шексіз бөлінеді, лимфоциттер сияқты антиденелерді синтездейтін қабілеттілігі болады.

Гибридті жасушалар жеке гибридті жасушаның клоны синтездейтін антиденелер

моноклоналды антиденелер болып табылады.

Моноклоналды антиденелерді алу әдісінің кезеңдері

В-лимфоциттерді алу.

Гибридті клеткаларды (гибридомаларды) алу.

Моноклоналды антиденелерді синтездейтін

гибридомаларды теңестіру мен скрининг.

Клондау.

В-лимфоциттерді алу.

Моноклоналды антиденелерді алу әдісінің бірінші сатысында В-лимфоциттерді алады.

Тышқандарды иммундайды, антигенді енгізеді. Бірнеше аптадан кейін тышқандарда иммундық жауаптың дамыған деңгейін тексереді. Иммундық жауаптың деңгейі жоғары болса, жануарларды жансыздандырады да көк бауырын алады. Ұлпаны жуады, майдалайды, абайлап сілкіп жеке жасушаларын босатады. Жасушаларының қоспасына антидене синтездейтін В-лимфоциттер кіреді.

Метаболиттік сұрыптау

Метаболиттік сұрыптау әдісте мутантты жасушаларды пайдаланады.

Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу

үшін қосалқы жолы арқылы нуклеотидтердің синтезі жүзеге

аспайтын мутантты плазмоцистомаларды алады. Плазмоцистомалар өсетін ортаға гипоксантин мен тимидиннің

уытты аналогтарын қосады, гипоксантин мен тимидин

қабылдамайтын жасушалары ғана тірі қалады. Мутанты

жасушаларда ДНҚ синтезіне қажет аденозинфосфаттың қосалқы

жол арқылы түзілуіне қатысатын гипоксантин-гуанинфосфо-

рибозил-трансферазасы болмайды.

Гибридомаларды алу

Көк бауыр жасушаларының қоспасын мутантты миелом

жасушаларымен араластырады.

Жасуша қоспасын 35% полиэтиленгликолы (ПЭГ) бар ортада бірнеше минут ұстайды,

ГАТ ортаға ауыстырады. ГАТ ортаға гипоксантин, аминоптеридин және тимидин кіреді. Жасушалардын қоспасы түзіледі.

Қоспаның құрамына 5 түрлі жасушалар кіреді:

- бастапқы жасушалар - миелом және көк бауыр жасушалары,

қосылған жасушалардың үш түрі - миелом-көк бауыр

жасушалары, миелом-миелом жасушалары, көк бауыр-көк

бауыр жасушалары.

ГАТ ортада миелом-көк бауыр гибридті жасушалары ғана өседі, басқа

жасушалары пролиферацияға ұшырамайды. 10-14 апта кейін тек көк бауыр-

миелом гибридті жасушалары ғана қалады. Бұл жасушаларды пластик

плашкаларға ауыстырады да толық себінді ортада өсіреді.

Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды теңестіру мен скрининг.

Себінді ортаның скринингін жүзеге асырады. Антиденелер бар себінді ортаны беті нысана антигеннің молекулаларының бір қабатымен қапталынған екінші микроплашкаға ауыстырады. Сонан соң плашканы жуады. Себінді ортада антиденелер болса (Ант1) олар антигенмен байланысады да лункаларының антигендерімен байланысып, жуғаннан кейін қалады. Одан кейін лункаларға екінші антиденені (Ант2) қосады. Екінші антидене бірінші антиденеге қарсы бағытталған, сондықтан екі антидене байланысады. Екінші антиденеге боялмаған субстраты боялған өнімге айналдыратын фермент қосылған. Лункаларға субстратты қосқанда екінші антиденемен байланысқан ферменттің қатысуымен түсі өзгеше өнім түзіледі. Сонымен анықталды, қай лункада антиденелерді синтездейтін гибридті жасушалары болады. Бірақ лункаларда гибридті жасушалардың қоспасы болу мүмкін.

Клондау.

Тұрақты моноклоналды антиденелерді түзушілер

жасушалардың линияларын клондау арқылы алады. Антидене бір лунканың жасушалық суспензиясын

сұйылтады, сонан соң басқа лункаларға егеді де гибридті

жасушаны клондайды. Бір гибридті жасушаның тұқымдары,

яғни бір клоны түзіледі.

Клондау нәтижесінде қоспадан антидене синтездейтін қабілеттілігі жоқ жасушалар жойылады, керек ерекшелігі бар, тұқым қуалаушылық қабілеті тұрақты клондарды бөліп алу мүмкіндігі туады.

Гибридті жасушаларды жарым-жартылай сұйық агар ортада немесе шекті сұйылту әдісін қолданып клондайды.

Фидерлік жасушалар

- бұл жасушалар өсу факторларды синтездейді де ортаға шығарады және өлген жасушалардың фагоцитозына жауапты.

Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушалардың негізгі критериясы: гибридті жасушаларды бірнеше рет клондаса да әр түрлі клондары физика-химиялық қасиеттері толық ұқсас антиденелерді синтездейді. Бұл зерттеу мынадай жолмен жүргізеді: гибридті жасушаларды көп рет клондайды, әр кезеңнің клоны синтездейтін антиденелерді изоэлектрофокустеу әдіспен зерттейді. Моноклоналды антиденелердің орналасатын орны тұрақты болу керек.

Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушалардың негізгі критериясы

гибридті жасушаларды бірнеше рет клондаса да

әр түрлі клондары физика-химиялық қасиеттері

толық ұқсас антиденелерді синтездейді.

Бұл зерттеу мынадай жолмен жүргізеді:

гибридті жасушаларды көп рет клондайды, әр

кезеңнің клоны синтездейтін антиденелерді

изоэлектрофокустеу әдіспен зерттейді. Моноклоналды

антиденелердің

орналасатын орны тұрақты болу керек.

Гибридомаларды сақтау

Гибридті жасушаларды ерекше стерильді ампулаларда -700С немесе сұйық азотта сақтайды. Алдымен ампулаларды 00С дейін мұздатады да оларға 5% диметилсульфоксид қосылған ұрықтың сары суындағы гибридомды жасушалардың суспензиясын енгізеді, одан кейін ампулаларды мұздатады. Бұл процесте температураны 1 миннуттың ішінде 1о-қа төмендетеді. Гибридті жасушаларды барлық кезеңдерде мұздату керек. Ампулаларды бір түн тоңазытқышта (-70оС) ұстайды, сонан соң ампулаларды сұйық азотқа ауыстырады.

Гибридті жасушалардың клондарын -700С ұзақ уақыт сақтауға болады.

Моноклонды антиденелдерді синтездейтін гибридома клонды себінді жағдайда 0, 1% азид натрий қосқан ортада 4оС температурада 1 жыл сақтау мүмкін. Бұл себіндіні керек уақытта гибридті жасушалардың көзі ретінде пайдаланады. Гибридомалардың банкі құрылған.