ДНК секвенирлеу әдісі


Slide 1

ДНК секвенирлеу әдісі

Slide 2

ДНК секвенирлеу әдісі

Белгілі ДНК молекуласындағы нуклеотидтердің санын мен ретін жалғыз-жалғыздан ретті түрде ыдырауы арқылы анықтауға болады.

Қызықты сұрактар:

Адам геномында қанша нуклеотид жұптары (base pairs (bp) ) бар?

Адамның геномын секвенирлеу қанша ақшаға түсті?

Неше жылда адамның бірінші геномы секвенирленді?

Адамның геномын секвенирленуі нешінші жылдар арасында бітті?

Ол кімнің геномы болды?

Slide 3

3 миллиард гаплоидты ген

$2. 7 миллиард жуық

13 жылда

2000-2003 жылдар арасында

Бірнеше адамның геномы секвенерленді, бірақ көбінесе Буффала қаласында тұратын бір ер адамның геномы боп шыкты

Slide 4

ДНК секвенерлеу әдісінің қолдануы:

Геномдық анализ

Медицина

Микороганиздердің метагеномикалық анализы

Slide 5

Азотты негіздер

Slide 6

Нуклеозидтер

Негізіне 2-диокси-Д-рибозаға 1-ші көміртекке қосылады

Нуклеотид

Нуклеозид 5-ші көміртекке қосылңған фосфат группасымен

Slide 7

Фосфодиэфирлік байланыстар

ДНК полимераза

Slide 8

ДНК-ның бірінші реттік құрылымын анықтау

Әдістері:

Тізбектің үзілуі немесе дидеокси әдіс

Ф. Сэнгер әдісі

Максам және Гильберт әдісі

Шотган (Shotgun) секвенирлеу әдісі

2ші ұрпақты секвенирлеу әдісі

Пиросиквенирлеу

Slide 9

Максам және Гильберттің химиялық әдісі

Бұл әдіс 4 азоттық негіздер бойынша 5’ ұшты радиоактивті белгісі бар ДНК-ның химиялық модификациясына негізделген. Арнайы төрт химиялық реакциялар арқылы азоттық негіздерді өзгеріске ұшыратып, фосфодиэфирлік байланыстарды үзеді.

Slide 10

ДНК-ның толық нуклеотидті реттілігін анықтау үшін көп мөлшерде бірдей ДНК-молекулалары қажет.

Әр тізбектің 5’ немесе 3’ ұшына радиоактивті белгі енгізеді.

ДНК-ны балкытып, біртізбекті ДНК бөлініп алынады.

Әр пробиркаға 1 немесе 2 белгілі азоттық негіздерді арнайы бұзатын химиялық реагент қосылады.

Нәтижесінде осы нуклеотид орналасқан жерде ДНК тізбегі бұзылады.

Максам және Гильберттің химиялық әдісі

Slide 11

Ұзындықтары әртүрлі біртізбекті ДНК-ның радиоактивті белгімен белгіленген фрагменттер қоспасы түзіледі.

Келесі сатыда қоспадағы компоненнтерді полиакриламидті электрофорезде бөледі.

Максам және Гильберттің химиялық әдісі

Slide 12

DMS

G

G

G

FA

G

A

G

G

A

G

A

H

C

T

T

C

T

C

C

T

H+S

C

C

C

C

Максам және Гильберттің секвенирлеу әдісінде қышқылды реагент орнын құмырсқа қышқылын пайдаланады. Мысалы, пиперидин дезоксирибозасының дегликлозилденген альдегид тобымен әркеттесіп, Шифф негізін түзеді де, аденин мен гуанин қалдықтары бойыша арнайы ыдырауы дүреду.

Slide 13

Секвенстелген гельді астынан үстіге қарай оқиды (5′-тен 3′) .

Максам және Гильберттің химиялық әдісі

Slide 14

Сэнгер әдісі

ddNTP- 2’, 3’-дидеоксинуклеотид

3’ гидрооксил группасы жок

ДНК-полимераза ферменті қолданылады

Slide 15

Азот негізі

Дезоксинуклеотид

Ди-дезоксинуклеотид

Азот негізі

Slide 16

Сэнгер әдісі

Фосфодиэфирлік қатынасына қажет 3’-ОН группасы ddNTPs жок.

Slide 17

Сэнгер әдісі

Кезеңдері:

Денатурация

Праймерлердің байланысуы және негіздердің ұзаруы

Терминация

Гель электрофорез

Slide 18

Сэнгер әдісінің схематикалық көрсетілуі

1

4

3

2

Gel electrophoresis

5

Slide 19

Сэнгер әдісі

4 түрлі реакция әртүрлі ddNTPs қоспасымен

Осы 4 қоспа гельдің 4 түрлі коланкасында электрофорез жүргүзүледі

Гельдің нәтижелері астынан үстіге қарай оқылады

Slide 20

Мультициклдық молекулар, олар абсорцияланып және флуоресцент шамдарын ерекше сәулеұзындыктарында шығарады.

Секвенирдеу әдістерінде нуклеотидтермен ковалентті байланысады.

Мысалы, флуоресцин мен родамин туындылары.

Флюресцентті бояғыш қоспасы

Fluorescent Dyes

Slide 21

Праймер бояғышы, флуоресцентті бояғыш коньюгантты нуклеотидттерден тұрады, секвенс тізбегінің 5′ ұшын таңбалайды.

Секвенсттің терминатор бояғышы молекуласы ковалентті дидеоксинуклетидпен байланысады және тізбектің 3′ ұшын таңбалайды.

Флюресценстті бояғыш қоспасы

Slide 22

Cэнгер әдісінің кемшіліктері

500-750bp

Қымбат

Көп уақыт жұмсалады

Адамның геномы 3 миллиард bp жуық

Slide 23

Шотган әдісі

Қадамдар:

ДНК-ны кездейсоқ кішкентай фрагменттерге бөлінеді

Дидеокси әдісімен фрагметтер оқылады

Бір-бірімен жабылатын фрагменттер оқылып қайта біріңғай ұзын тізбекке жиналады

Strand

Sequence

Бірінші шотган секвенсі

Екінші шотган секвенсі

Біріңғай ұзын тізбек

Толық геномды секвенирлеуге арналған

Slide 24

2ші ұрпақты секвенирлеу әдісі: Пиросиквенирлеу әдісі

Синтездік секвенирлеу

Пайдалығы:

Дәл нәтижелі әдіс

Автаматандырылған

Танбаланған праймер мен нуклеотидттердің қажжетілігін жояды

Гель электрофорез қадамы керегі жоқ

Slide 25

Пиросиквенирлеу әдісі

1ші әдісі

Қатты фазасы

Иммобилизацияланған ДНК

3 энзим

Жуып шығу қадамы, нуклеотид фрагменттерін бөліп шығару үшін

Slide 26

Пиросиквенирлеу әдісі

2nd Method

Сұйық фазасы

3 энзим + апираза (нуклеотидтерді дегдарадияға ұшыратын энзим)

Жуып шығу қадамы жоқ

Slide 27

Пиросиквенирлеу әдісі

Slide 28

Пиросиквенирлеу әдісінің нәтижесінің мысалы:

Slide 29

Пиросиквенирлеу әдісінің кемшілітері:

Кішкентай секвенс тізбектері

Біртізбекті сәуле жауабы 5-6 көп біртекті нуклеотидтерден болмайды

Slide 30

Қорытынды

ДНК секвенерлеу барлық жерде қолданылады

Дидеокси әдісі (Сэнгер әдісі)

Дәл нәтижелер

ДНК-нің кішкентай фрагменттеріне қолданылады

Геномның толық секвенерлеу

Адамның геномын секвенерлеуге қолдануға болады

Пиросеквенерлеу

Синтездік секвенерлеу

Дәл және тәз нәтижелерін береді


Ұқсас жұмыстар
ДНҚ тізбектерін ДНҚ полимеразамен көшіру әдісі
Қолданбалы иммунология
ДНҚ денатурациясы
Максам Гилберт тізбектеу
Зерттеудің молекулалық - генетикалық әдістері
Мал қора ауасының шаң - тозаңдармен механикалық қоспалардың, бактериалық ластануын анықтау
Митохондриялық ДНҚ
Нуклеин қышқылы нуклеотидтер нуклеозидтер гетероциклді негіздер
Гендік инженерияда қолданылатын векторлар
ЖОБАСЫ ГЕН
Пәндер



Реферат Курстық жұмыс Диплом Материал Диссертация Практика Презентация Сабақ жоспары Мақал-мәтелдер 1‑10 бет 11‑20 бет 21‑30 бет 31‑60 бет 61+ бет Негізгі Бет саны Қосымша Іздеу Ештеңе табылмады :( Соңғы қаралған жұмыстар Қаралған жұмыстар табылмады Тапсырыс Антиплагиат Қаралған жұмыстар kz