Иммунологиялық әдіс - қан сарысуының спецификалық антиденелер мен антигендерді зерттеу немесе анықтау үшін қолданылатын әдіс

Презентация қосу

ИММУНОГИСТОХИМИЯЛ
ЫҚ ӘДІСТЕР
Жоспары:
I. Кіріспе.
II. Негізгі бөлім:
1)Иммунопреципитация әдісі;
2)Ферментті иммуносорбентті анализ;
3)Иммуноблоттинг әдісі және Гибридомдық технология;
4)Иммунохроматография және Иммуногистохимия әдісі;
I. Қорытынды.
• ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР.
Кіріспе.
Иммунологиялық әдіс - қан сарысуының спецификалық
антиденелер мен антигендерді зерттеу немесе анықтау
үшін қолданылатын әдіс.
Зерттеулер in vitroда жүргізіледі.

Антиген – қанға еніп, ерекше антиденелерді қалыптастыруға қабілеті бар
ақуызды заттар.

Антидене - адам мен жануарлар организміне енген жат антигендерге қарсы
иммундық реакциялар нәтижесінде түзіліп, олардың зиянды әсерлерін жоятын
протеиндік заттар; адам және жылықанды жануарлар денесінде пайда
болған антигендерге қарсы қан плазмасында түзілетін ақуыздық заттар.
Иммунологиялық әдіс инфекциялық және паразиттік ауруларға лабораториялық
диагностика жүргізу үшін кең қолданылады.

Қан топтарын анықтау;

Жүктілік;

Гормондық бұзушылықтар;

Аллергиялық аурулар;

Аутоиммундық ауруларды, сондай-ақ ғылыми зерттеу
жұмыстарында қолданылады.
Көптеген иммундық әдістер үшін антиденелер
молекулаларын қандай да бір қатты ортаға мықтап
бекіту керек. Бұл тасымалдаушылардың бірнеше
түрлері бар
Иммунопреципитация
• Антиденелердің ерекше қасиеті — тек тиісті антигендерге
жабысу мүмкіндігі-оларды биотехнологтың қолында "сиқырлы
магниттер" етеді.
• Антиденелердің көмегімен қажет молекулаларды қажет емес
молекулалардан (әдетте белоктар) табуға болады.
Антиденелерді қолдануға негізделген әдістерді күрделі ақуыз
қоспасын немесе ғылыми тілде протеоманы зерттеу үшін де
қолдануға болады.
• Иммундық әдістердің ең қарапайым әдістердің бірі —
иммунопреципитация.
1. X ақуызына антиденелер аламыз .Біз бұл антиденелерді кейбір қатты
ортаға, әдетте агарозды шайырға бекітеміз.
2. Тасымалдаушыға антиденені "тігу" және сіз альдегидті топтарға
антиденелерді "ұстайтын" арнайы агарозды қолдана аламыз.
3. Біз антиденелерді зерттелетін ерітіндіге тасымалдаушыға
орналастырамыз (мысалы, ұнтақталған жасушалар — лизаттар
немесе қан плазмасы болуы мүмкін), сондықтан антиденелер x ақуыз
молекулаларын жабыстырады.
4. Біз тасымалдаушыны антиденелермен және оларға жабысқан ақуыз
x молекулаларымен алып жүреміз, қажетсіз молекулалардан жуып,
алып тастаймыз.
Ферментті иммуносорбентті анализ

• Антидененің антиген-нысанмен байланысқанын анықтауға
мүмкіндік беретін түрлі жолдар бар. Олардың бірі –
диагностикада көп қолданылатын ферментті иммуносорбентті
анализ (ELISA). Процедура келесі этаптардан тұрады.
• Егер бірінші антидене үлгі нысанымен байланыспаса, онда ол
алғашқы рет шайғанда жойылады. Бұл жағдайда екінші
антидене-фермент конъюгатының байланысатын заты жоқ
болғандықтан, ол екінші рет жуғанда жойылады және үлгі
боялмай қалады. Егер нысанмен байланысу жүрсе, онда
екінші антидене біріншімен бірігеді, конъюгирленген фермент
жеңіл тіркелетін боялған өнімнің қалыптасуын катализдейді.
н
м
йі
й
с
ө
е
н
у
ні
г
бі
а
б
м
е
рі
л
с
ні
(
н
у
т
ң
п
ш
ы
р
с
іо
н
а
а
д
а
к
т
п
л
н
а
е
а
о
т
н
л
ж
и
а
гі
ы
к
д
л
з
қ
а
и
е
н
),
н
з
ді
е
м
е
.д
м
ы
ні
е
е
с
ң
й
с
а
б
ті
е
л
а
н
с
ы
й
ф
а
л
е
н
а
р
д
қ
н
м
ы
у
ы
е
қ
ы
с
н
а
с
п
т
н
ы
а
ж
ы
б
ғ
а
қ
а
л
т
р
н
ғ
а
п
м
а
у
л
о
н
ы
а
л
ғ
ELISA-ның негізгі қағидасы (принципі) – бірінші
антидененің нысанмен спецификалық байланысуы.

• Егер молекула-нысан ақуыз болса, онда оның тазаланған препаратын
берілген нысанды анықтауға көмектесетін антиденелерді алу үшін
пайдаланады. Иммунизирленген жануардың (әдетте қоян) қанының
сарысуында пайда болатын антиденелер, молекула-нысанның әртүрлі
антигенді детерминанттарымен (эпитоп) байланысады. Антиденелердің
мұндай қоспасын поликлональді препарат деп атайды.
• Поликлональді антиденелерді пайдаланудың екі кемшілігі бар:
•
1) 2)
пол еге
икл р
она екі
льд ұқс
і ас
• Дегенмен қазіргі кезде бір антигенді детерминантқа арнап
пре ны
шығарылған, яғни моноклональді антиденелер препаратын алуды
пар сан
үйренгеннен соң, бұл мәселелерді шешуге мүмкіндік туды.
атт дар
ағ ды
ы аж
же ыр
Вставка рисунка
Вестерн-
блоттинг
Вестерн-блоттинг (ағылш.
western blot) -
антиденелердің көмегімен
зерттеуші өзіне қажет
ақуызды көптеген басқа
ақуыздар арасында ұстай
алатын тағы бір әдіс. Бұл
"молекулалық балық
аулау" тізбегі ИФТ-ға өте
ұқсас, тек" балық аулау "
планшеттің тесігінде
емес, нитроцеллюлоза
мембранасында жүреді.
Иммуноблоттинг әдістемесі бойынша жабдықтар мен
анықтамалық материалдар

• Электрофорезге арналған камералар және қоректендіру көздері
• Ақуыз электрофорезіне арналған гельдер (Abcam, Bio - Rad, Thermo) және ақуыз
бояғыштары
• Ақуыздардың молекулалық салмағының маркерлері
• Мембранада ақуыздарды тасымалдауға (дымқыл, құрғақ және жартылай құрғақ
әдіспен) және детекциялауға арналған жабдық
• Fusion Solo және Fusion Fx Гель және химидокуаттау жүйелері
• Мембраналар және ECL химилюминисцентті детекцияға арналған жиынтықтар
Вставка рисунка
Гибридомдық
технология
Иммундық әдістердің тиімділігі
моноклоналды антиденелерді
(яғни молекулалары бір-біріне
мүлдем ұқсас) қолдануды
қамтамасыз етеді.

Бұған алғаш рет 1975 жылы Жорж
Келлер мен Сезар Мильштейн
жасаған гибридомдық
технологияның көмегімен қол
жеткізілді. Осы өнертабыс үшін
1984 жылы олар физиология
бойынша Нобель сыйлығын алды.

Техника қажетті антиденелер
шығаратын гибридті
жасушалардың Өлмейтін сызығын
құрудан тұрады: бұл сызық
гибридома деп аталады.
ГИБРИДОМА ӘДІСІ 1. Иммундау. Алдымен біз
БІРНЕШЕ КЕЗЕҢНЕН антиденелер алғымыз келетін
ТҰРАДЫ антигенмен жануарды (әдетте
тышқан немесе қоян) иммундау
керек.

2. Бөлу. Енді біз бұл в лимфоциттерін
тышқанның көкбауырынан
шығарамыз.

3, Біріктіру. В лимфоциттеріне
миелома жасушалары қосылады.

4. Селекция.

5. Моноклональды антиденелерді
алу.
Иммунохроматография
• Иммунохроматография-бұл талданатын сұйықтықтағы
ақуызды анықтаудың өте тапқыр әдісі, онда реакция үшін
сұйықтықтың болу фактісі қолданылады
Иммуногистохимия

• Антигендерді бүкіл ұлпада "көруге" болатын әдіс
иммуногистохимия деп аталады.
• Ол медициналық диагностикада жиі қолданылады,
дәрігерлерге ісіктің қандай да бір түрге жататынын
анықтауға және қажетті емдеуді таңдауға көмектеседі . Ол
сондай-ақ онкологиялық және иммунологиялық ауруларды
диагностикалау үшін жиі қолданылады.
• Ғалымдар иммуногистохимияны назардан тыс
қалдырмайды. Мысалы, оның көмегімен ұлпада Апоптоздың
басталғанын немесе нейродегенеративті ауруларды
зерттеуге болады
Қорытынды.
• Иммунды анализде қолданылатын екінші антиденеге боялмайтын субстратты боялған қосылысқа
айналдыратын ферментті алдын ала қосады. Қуыстардың бірінде түстің өзгеруі бастапқы культуралды
ортада берілген антигенге сезімтал антидененің болғанын білдіреді. Егер мұндай антидене ортада
болмаған болса, онда екінші антиденеге байланысатын зат болмайды және ол екінші рет жуғанда
шайылып кетеді. Мұндай қуыстардағы субстрат боялмаған күйде қалады.
• Бір жасушадан дамыған линиялар алу үшін (клондар), осындай қуыстардан жасалған жасушалық
суспензияны культуралды ортамен араластырады да, басқа қуыстарға отырғызады. Алынған
клондарды культивирлегеннен соң орталарды қайта тексереді, антиген-нысанды танитын
моноклональды антиденелерді қай жасушалық линия (гибридома) продуцирлейтінін анықтайды.
Бірден көп өзіндік (специфичный) гибридомалар алған жағдайда, ары қарай түрлі клондардан
өндірілетін антиденелер бір антигенді детерминантқа қарсы бағытталды ма, жоқ па екенін анықтайды.
Моноклональды антидене продуцирлейтін әрбір клонды культурада шексіз ұстауға болады. Сондай-ақ,
үлгілерді сұйық азотта қатырып, ары қарай оларды жасушалар көзі ретінде пайдалануға болады.
• Бір ғана, қатаң түрде анықталған антигенді сайтпен ғана байланысатындықтан, моноклональды
антиденелерді қолдану ELISA әдісінің ерекшелігін арттырады. Қазіргі кезде әртүрлі қосылыстар мен
патогенді микроорганизмдерді анықтауда қолдануға болатын бірқатар моноклональды антиденелер
алынған. E. coli көмегімен антиген-нысанға қарсы бағытталған моноклональды антиденелер мен
олардың бөліктерінің (Fv-фрагменттер) таңдалып алынуы және өндірілуі гибридомды жасушалар
культурасынан моноклональды антиденелерді алудың альтернативі болуы мүмкін.
Пайдаланылған әдебиеттер:

1.Альтшулер Е.П., Серебряная Д.В., Катруха А.Г. (2010).
Получение рекомбинантных антител и способы увеличения
их
афинности. Успехи биологической химии. 50, 203–258;
2.Моноклональные антитела;
3.12 методов в картинках: микроскопия;
4. Жалпы иммунология. Оқулық | Шортанбаев Ә.Ә.,
Кожанова С.В.
5. Толысбаев, Б.Т. . Микробиология және иммунология:
оқулық / Б.Т. Толысбаев; К.Б. Бияшев.
НАЗАРЫҢЫЗҒА
КӨП РАХМЕТ!

Ұқсас жұмыстар

Вирусологиялық балау әдістері

ПРЕЦИПИТАЦИЯ РЕАКЦИЯСЫ. Антиденелер (преципитин) мен антигендердің (преципитоген)

Иммуноферментті анализ. Полимеразды тізбекті реакция

Қанды зерттеу. Иммунофлюресценциялық әдіс

Иммундық ферменттік талдау

Антидене түзу

Стандартты микробиологиялық зертхана

Бактериологиялық лаб

Микробиологиялық зертхана құрылымы

МИКРОБИОЛОГИЯЛЫҚ ЗЕРТХАНАЛАРДЫҢ НОМЕНКЛАТУРАСЫ

Пәндер