Молекулалық биологияда қолданылатын әдістер: ДНҚ-ның тұқым қуалаушылығы, денатурация/ренатурация және секвенирлеу тәсілдері

Тақырыбы: МОЛЕКУЛАЛЫҚ БИОЛОГИЯДА ҚОЛДАНЫЛАТЫН ӘДІСТЕР. ДНҚ-НЫҢ ТҰҚЫМ ҚУАЛАУШЫЛЫҚТАҒЫ РӨЛІ.

ДНҚ денатурациясы (DNA denaturation) [лат. de-бір нәрсенің бөлінуін, жойылуын, жойылуын, жойылуын білдіретін префикс және natura - табиғи қасиеттері, табиғаты] - әртүрлі әсерлерге (температура, рН, денатурация агенттері, химиялық факторлар - мочевина, гуанидинхлорид, қышқыл) байланысты екі ішекті ДНҚ молекуласының тізбектерінің алшақтауы, бұл оның биологиялық белсенділігінің жоғалуымен және ДНҚ құрылымының бұзылуымен бірге жүреді.

Ультракүлгін диапазонда денатурацияланған және қос тізбекті ДНҚ-ның сіңіру спектрі интегралды интенсивтілігі бойынша елеулі ерекшеленеді, яғни гипохромды эффект байқалады. ДНҚ-ның денатурациясы кезінде гипохромды эффектінің мөлшері бастапқы спектр интенсивтілігінің 10-20 %-ын құрауы мүмкін.

Температураның жоғарылауна байланысты ДНҚ ерітіндісінің оптикалық тығыздығының жогарылауы гиперхромды эффект деп аталады. ДНҚ денатурациясы кезінде оптикалық тыгыздықтың өзгерісін 260-280 нм толқын ұзындығында тіркеу ыңғайлы, осы тоолқын ұзындығында азоттық не-гіздердің сіңірілуі жогары және олар нуклеин қышқылдарында негізгі хромофорды топ болып табылады.

Ренатурация (қайта қосылу, қайта қосылу немесе күйдіру процесі) - температура немесе рН төмендеген кезде пайда болатын ДНҚ-ның табиғи конформациясын қалпына келтіру процесі. Егер температура немесе рН біртіндеп төмендесе, онда тізбектер барлық бастапқы негіз жұптарының қалпына келуімен дұрыс қосылады. Температураның немесе рН-ның күрт төмендеуімен қосымша тізбектердің дұрыс қосылуы бір немесе әртүрлі тізбектердегі жергілікті қосымша аймақтардың негіздерінің жұптасуына байланысты қиындайды.

Секвенирлеу бұл - нуклеин қышқылдарынының нуклеотидтік ретін анықтау әдісі. Жоғары эфиктивті секвенирлеу әдісінің пайда болуына көптеген әдістердің бірігуі әкеп соқты, солардың ішіне келесі әдістер жатады:

Елеулі орын алатын әдістің бірі бұл электрофорез әдісі, бұл әдістің дамуы не бәрі 1 нуклеотид ұзындығы болатын олигомерлерді бөлуге мүмкіндік берді.

Азотты негіздердің спецификалық химиялық модификация әдісі.

P 32 изотопы арқылы ДНҚ тізбегіндегі ақырғы (концевых) нуклеотидтердің радиоктивті таңбалау әдісі.

ДНҚ тізбектерін ДНҚ полимеразамен көшіру әдісі.

Секвенирлеу тарихы

ДНҚ-ның құрылымын анықтаудың көптеген әдістері белгілі, солардың ішінде Максам және Гильберт ұсынған химиялық әдіс немесе 1977 ж. Ф. Сэнгер ұсынған дидеокси әдісі. Қазіргі уақыта басқа да жаңа әдістер ашылуда мысалға Шотган (Shotgun) секвенирлеу әдісі, бірақ Сэнгер ұсынған әдісі кең ауқымда қолданылады.

ДНК-ның толық нуклеотидті реттілігін анықтау үшін көп мөлшерде бірдей ДНК-молекулалары қажет.

Әр тізбектің 5’ немесе 3’ ұшына радиоактивті белгі енгізеді. ДНК-ны балкытып, біртізбекті ДНК бөлініп алынады.

Әр пробиркаға 1 немесе 2 белгілі азоттық негіздерді арнайы бұзатын химиялық реагент қосылады.

Нәтижесінде осы нуклеотид орналасқан жерде ДНК тізбегі бұзылады.

Ұзындықтары әртүрлі біртізбекті ДНК-ның радиоактивті белгімен белгіленген фрагменттер қоспасы түзіледі.

Келесі сатыда Ұзындықтары әртүрлі біртізбекті ДНК-ның радиоактивті белгімен белгіленген фрагменттер қоспасы түзіледі.

Келесі сатыда қоспадағы компоненнтерді полиакриламидті электрофорезде бөледі. Максам және Гильберттің химиялық әдісі

2. СЭНГЕР ӘДІСІ

Сэнгер ұсынған әдісте ерекше (ddNTP) деп аталатын модификацияланған нуклеотидтер қолданылады. ddNTPтердің кәдімгі dNTP-терден кішкентай айырмашылығы бар. Олардың қантының 3-ші көміртегісінде гидроксилді ОН тобының орнына сутегі тобы болады. ddNTP ДНҚ тізбегіне енген кезде, фосфодиэфирлік байланысқа қажетті ОН тобы болмағандықтан, тізбек ұзара алмайды; нәтижесінде тізбек терминацияланады.