Максам Гилберт тізбектеу

Презентация қосу

Факультеті: Биология және Биотехнология
Кафедрасы: Молекулалық биология және генетика

2 - СӨЖ

Тақырыбы: Молекулалық биологияда қолданылатын әдістер. ДНҚ-ның тұқым
қуалаушылықтағы рөлі.
Мақсаты: ДНҚ-ның тұқымқуалаушылықтағы рөлін және әртүрлі ғалымдармен
жасалған тәжірибелермен таныстыру.

Алматы , 2020 жыл
Жоспары:
Кіріспе
Негізгі бөлім
1.Нуклеотидтердің ДНҚ тізбегіндегі орналасу тәртібін анықтау əдістері.
2.Максам-Гильберт әдісі
3. Сэнгер әдісінің тиімділігі
ІІ Қорытынды
ІІІ Пайдаланылған әдебиеттер

Кіріспе
Жасушалардың өз құрылымында жоғары тәртіпті сақтау
қабілеті дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНҚ) түрінде
сақталатын генетикалық ақпаратқа байланысты. Тұқым
қуалайтын қасиеттердің берілуіндегі ДНҚ-ның рөлін ашу -
қазіргі биологияның басты жетістіктерінің бірі.
Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНҚ) - тірі организмдердің
дамуы мен қызмет етуінің генетикалық бағдарламасын
сақтауды, ұрпақтан ұрпаққа беруді және жүзеге асыруды
қамтамасыз ететін макромолекула. ДНҚ молекуласы
биологиялық ақпаратты нуклеотидтер тізбегінен тұратын
генетикалық код түрінде сақтайды. ДНҚ-да әр түрлі РНҚ
мен ақуыздардың құрылымы туралы ақпарат бар.
Нуклеотидтердің ДНҚ тізбегіндегі орналасу тәртібін
анықтау əдістері
ДНҚ секвенциясы дегеніміз- ДНҚ-ның нақты
нуклеотидтің ретін анықтайтын процесс. ДНҚ
секвенциясының әр түрлі әдістері бар.
Максам Гилберттің секвенциясы және Сангер
секвенциясы - бұл бірінші буын
секвенциясына жататын екі ДНҚ
секвенирлеу әдісі. Максам Гилберт тізбектеу

Сэнгер процедурасы негізгі тізбекті 5'-таңбаланған
ДНҚ фрагменттерінің химиялық
бөлшектелуімен, төрт нуклеотидтің

әдісі әрқайсысында және гельдік электрофорез
арқылы анықтайды. Сэнгер тізбектеу
процедурасы нуклеотидтер тізбегін ДНҚ-
полимераза мен дидезоксинуклеотидтер мен
гельдік электрофорез көмегімен бір тізбекті
ДНҚны синтездеу арқылы 4
анықтайды.
Нуклеотидтердің ДНҚ тізбегіндегі орналасу тәртібін анықтау əдістері.

Бірінші әдісті АҚШ ғалымдары У. Гилберт пен оның шәкірті Л. Максам ұсынды. Мұнда қостізбекті ДНҚ
үзіндісінің 5’— ұштарын радиоактивті фосформен белгілейді. Мұны ішек таяқшасын зақымдайтын, Т4
бактериофагынан бөлінген полинуклеотидкиназа іске асырады. Бұл фермент АТФ молекуласынан фосфат
тобын ажыратып, полинуклеотидтің 5’— ұшына жалғайды. Бұдан кейін қос тізбекті ДНҚ-ны
денатурациялап, ДНҚ-ның жеке тізбектерін гелде электрофорез арқылы айырады. Мұнан соң тізбектің
әрқайсысын гелден жеке жуып алып, бөлек зерттейді. Ары қарай, үлгілерді төрт бөлікке бөледі. Біріншісіне
ДНҚ-ны кез келген аденинді нуклеотидінен кейін үзетін ерітінді қосады. Оны ДНҚ тізбегінің бір аденин
бөлігін ғана үзетіндей етіп қосу керек. Нәтижесінде тізбекте адениннің әр қилы орналасуына байланысты
ұзындығы әр түрлі ДНҚ үзінділері пайда болады.
Дәл осындай жолмен басқа үш бөлікті де ДНҚ-ны тиминнен, гуаниннен
және цитозиннен кейін үзетін реагенттермен өңдейді. Барлық төрт
үлгідегі ДНҚ үзінділері бір-біріне параллель орналасып, полиакриламид
гелінде электрофорез арқылы айырады: молекуласы аз кесінділер жоғары
молекулалы кесінділерге карағанда гельде жылдам қозғалады. Максам
Гилбертті секвенирлеу әдісі келесі бірнеше қадамдармен
орындалады:
Шектеу эндонуклеазаларын қолдана отырып, ДНҚ тізбегін тазарту
ДНҚ фрагменттерінің ұштарын радиоактивті фосфаттармен таңбалау
Әр түтіктің құрамындағы электрофорезді гельдегі жеке сызықтар мен
фрагменттердің ұзындығына қарай бөлу.
Автографограф арқылы фрагменттерді анықтау.
Максам-Гильберт

Сэнгер әдісі
ДНҚ тізбегінің біріншілік реттілігін анықтауда Максим-Гилберттің химиялық әдісімен қатар
Сэнгердің ұзартылған тізбекті аяқтау әдісі пайда болды. Бұл әдіс сәйкес аналогтың тізбекке
қосылған жерінде дара тізбекті матрица бойынша ДНҚ-ның комплементарлы тізбегінің синтезін
бұзатын нуклеотидтер аналогтарының қолданылуына негізделген. Химиялық әдіс сияқты
нуклеотидтер реттілігін талдау үшін зерттелетін молекула фрагменттерінің жиынтығын алу тиіс,
фрагменттер белгілі азоттық негіздер тізбегінде арнайы үзілген. Сэнгер әдісі бойынша осындай
фрагменттерді ДНҚ полимераза ферменті арқылы алады. Қалыпты жағдайда ДНҚ полимераза
бастапқы ДНҚ тізбегіне комплементарлы жаңа тізбек түзеді. Реакция субстраттары -
дезоксинуклеозидүшфосфаттар (dNTP). Оларға сәйкес 2 ,3 –дидезоксинуклеозид үш фосфаттар да
(ddNTP) ДНҚ полимеразаның субстраттары рөлін атқаруы мүмкін, өйткені олардың құрылымы
dNTP құрылымынан өте аз ерекшеленеді. Бірақ дидезоксинуклеотидтер ұзарып жатқан ДНҚ
тізбегіне қосылған кезде оның синтезі (тізбектің ұзаруы) тоқтайды, өйткені оның құрамында келесі
нуклеотидті қосуға қажетті 3 -гидроксильді тобы (3-ОН) жоқ. [3]

3-сурет.Дидезоксинуклеотидтің хим-қ құрылымы және Дезоксинуклеотид
Сэнгер әдісінде нуклеотидтер қатары белгісіз ДНҚ сегментін
М1З бактериофагының ДНҚ-сынан құрастырылған арнайы
векторға енгізеді. Біз бұл фагтың векторлық молекула ретінде
ыңғайлы айырмашылығы атап айтқанда генді жалғыз тізбекті
күйде тасымалдай алады. Мұндай тізбектің нуклеотидтер
қатарын анықтау оңай. М1З бактериофагының ДНҚ-сы қос
тізбекті күйде де бола алады. Осындай фагтың негізінде
бірнеше векторлар құрастырылды. Фагтың репликациясы
үшін оның геномының маңызды емес аймағына шамамен
ондаған әр түрлі рестриктазалар үзе алатын полилинкер
жалғанады. Полилинкердің қатарына 17 н. ж. құралған тізбек
жалғанады. Осындай векторды рестриктазалардың бірімен
үзгеннен кейін оны талдауға алынған және сол
рестриктазамен үзілген ДНҚ бөлігімен біріктіреді. Мұнда ол
вектордың 17 мүшелік тізбегімен қатар орналасады. Міне
осындай рекомбинантты ДНҚ-ны бактерия клеткасына
енгізіп, одан жалғыз тізбекті ДНҚ-сы бар фагтарды алады.
Енді фагтан ДНҚ-ны айырьш, оны талдауға кірісуге болады.

Сэнгер әдісі «тізбекті үзу» әдісі деп аталады. Яғни ДНҚ-полимераза арқылы
түзілетін комплементарлы ДНҚ-ның синтезі Максам-Гилберт әдісіне сәйкес әрбәр
негізде тоқтайды. (үзіледі).Ал, ДНҚ-полимераза үшін ашытқы (праймер) керек, ол
үші фектордың 17-мүшелік тізбегіне комплементарлы олигонуклеотид
синтезделеді.
Егер олигонуклеотид-ашытқыны матрицалық ДНҚ-мен байланыстырып, ДНҚ-
полимераза мен дезоксинуклеозид-трифосфаттарды қосса, онда ДНҚ бөлігінің
толық көшірмесін ала аламыз. Мұнда әрбір келесі азоттық негіз өсіп жатқан
тізбектің 3’— ұшының гидроксил тобына жалғанатынына мән беру керек. Сэнгер
әдісі үшін ДНҚ бөлігінің толық көшірмесі емес, оның үзінділері қажет.
Матрица-ашытқы комплексін төрт бөлікке бөледіде, олардың әрқайсысына
тізбектің 3’— ұштары азоттық негіздерініңаналогтары —
дидезоксинуклеозидтрифосфаттарды (ddNТФ) қосады. Мұндай
дидезоксинуклеозидтердің рибоза қалдығының көміртегі атомдарында гидроксил
тобы болмайды, сондықтан өсіп жатқан 3’— ұшының синтезін белгілі негізден
кейін тоқтайды. Мысалы, тимидинмен аяқталатын ДНҚ фрагменттерін алу үшін
ортаға дидезокситимидинтрифосфатты, тізбекті аденозин бойынша үзу үшін
дидезоксиаденозинтрифосфатты және т.с.с.
Екі әдістің айырмашылығы

Максам Гилберт пен Сангер секвенирациясы - бұл ДНҚ-ның бірінші буынының
реттілігіне түсетін ДНҚ-ны секвенирлеу техникасының екі түрі. Максам Гилберт
секвенирациясы - 1976 жылы ДНҚ-ны ретке келтірудің алғашқы әдісі және ол
ДНҚ фрагменттерінің негізін химиялық заттармен бөліп алу арқылы жүзеге
асырылады. Демек, ол химиялық реттілік ретінде белгілі. Sanger секвенирлеу
әдісі 1977 жылы енгізілген және ddNTP басқарылатын тізбекті тоқтату
реакцияларына негізделген. Максам Гилберт әдісіне қарағанда Максим Гилберт
әдісіне қарағанда танымал, шамадан тыс уақытты пайдалану, қауіпті химиялық
заттарды пайдалану және т.с.с., бұл Максим Гилберт пен Сэнгерді жүйелеу
арасындағы айырмашылық.

Қорытынды
Ген инженериясының соңғы этапында алынған ДНҚ үзіндісінің
нуклеотидтер қатарын анықтау керек. Көп жылдар бойы бұл проблеманы
шешу үшін ғалымдар әр түрлі әдістерді қолданды, алайда оның
ешқайсысы ойдағыдай болмады. Ақырында ген инженериясы әдістерінің
дамуымен бұл проблема 1977 ж. таза химиялық әдіс арқылы шешімін
тапты.
Қазіргі кезде ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтау үшін екі
әдіс — Максам-Гилберт және Сэнгер-кең қолданылады. Екі әдістің де
мәні мөлшері бойынша бір негізге айырмашылығы бар жалғыз тізбекті
ДНҚ молекуласын алудан тұрады. Мұндай молекулаларды электрофорез
көмегімен акриламид гелінде бөлуге болады. Мөлшері әр түрлі
белдеулер ұзындығы 300 нуклеотидке дейін жететін «саты» түзейді.
Пайдаланылған әдебиеттер

1. Қуандықов, Есенгелді Өсербайұлы Молекулалық биология
негіздері
2. http://elib.kaznu.kz/book/1359
3. https://baribar.kz/student/55/dnq-nynh-nukleotidter-qataryn-any
qtau/

Ұқсас жұмыстар

ДНҚ денатурациясы

ДНК секвенирлеу әдісі

ДНҚ тізбектерін ДНҚ полимеразамен көшіру әдісі

ДНҚ зерттеу әдістері. ДНҚ диагностикасының тура және көлденең әдістері. ДНҚ – фингерпритинг

Денелердің электрленуі

Менің ойымша - перископ

Аксиомалар системасының интерпретациясы

Ашық мәтін

Менеджмент ғылымы

Рекурсия және итерация

Пәндер