Эмбрионның ядросын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыру арқылы эмбриондарды клондау

Тақырыбы: Клоундау.

Орындаған: Аязбай Л. Б Тексерген :Төлеген Т. Д

Қазақ Ұлттық Аграрлық Университеті

Технология және биоресурстар

факультеті

Казахский Национальный Аграрный Университет

Факультет технология и

биоресурсы

Клондау технологиясы және оның жетістіктері мен болашағы

Клондау (грек. clon - ұрпақ, бұтақ) деген сөз мағананы береді.

Клон - организмдерді жыныссыз жолмен көбейту арқылы сол организмдерге фенотиптік және генотиптік бірдей ұрпақтар алуды айтады.

Клондау маманданған клеткалардың тотипотенттігі мәселесін шешуге көмектеседі

Жоғары сатыдағы жануарларда өнімділікке жауап беретін, арнайы гендер кешені өте сирек туындайды, әрі келесі ұрпақтарда олар айтарлықтай өзгеріске ұшырайды және де алатын ұрпақ саны аз болады.

Сонымен қатар, соматикалық жасуша аталған организмнің толық генетикалық ақпаратына ие екендігі белгілі, және егер осы ақпараттың іске асуы үшін жағдай жасасақ, онда белгілі бір дарақтың шексіз көп генетикалық көшірмелерін (клондарын) алуға болады.

Бірақ, көптеген сомалық жасушалардың ядролары дифференцияланған күйде болатындықтан, бұл мәселені ұрықтың белгілі бір даму кезеңінде олардың дифференциациясы жүрмей тұрғанда, эмбриондық жасушаларда пайдалана отырып шешті.

Бластомерлердің ядроларын пісіп жетілген ооциттерге көшіру осындай мүмкіндіктер береді, себебі, ооциттер цитоплазмасы көшірілген ядроны қайта бағдарлай алатын және жаңа эмбрионның даму бағдарламасын іске қосатын спецификалық факторларға ие.

Клондау тарихы

1826 жылы орыс эмбриологы Карл Бэр сүтқоректілердің жұмыртқа жасушасын ашты.

1940 жылдары атақты орыс эмбриологы Г. В. Лапашов трансплантация әдісін қолдану арқылы бақаның аналық клеткасына ядросын тасмалдаған, алайда жұмысы баспаға шықпады.

1950 жылдары американдық Р. Бриггс пен Т. Кинг ұқсас тәжірибелер жүргізді.

Ұлыбританияның Оксфорд университетінің ғалымы

Д. Гердон (1962-1970 жылдары) алғаш рет жануарды клондауға болатынына қол жеткізді. Ол өзінің ядросы алдын ала ультракүлгін сәулелері арқылы жойылған құрбақаның жұмыртқа клеткасына, ішек клеткаларынан алынған ядроны ауыстыру арқылы әуелі итбалықты, соңынан сол ядро алған құрбақаға ұқсас дарабасты алды.

1985 жылы Е. В. Конюхов пен Е. С. Платонов ядроны тасмалдаудың жетілген микроманипуляциялық әдісін тапты.

Онда алдымен микропипеткамен пеллюцид зонасымен плазматикалық мембрананы тесіп пронуклеусті шығарады, содан соң басқа диаметрі үлкендеу (12 мкм) пипеткамен диплоидты донор ядросын сол тесік арқылы ендіреді. Бұл жағдайда ұрық цитоплазмасы мен донордың тасмалданушы ядросы аз бүлініске ұшырайды.

Бір клеткалы егіздерді алу. Бір клеткалы егіздерді алу мал шаруашылығында үлкен маңызға ие. Бір жағынан бір донордан шығатын төл саны көбейеді, екіншіден - екі генетикалық жағынан бірдей егіздер алынады. Бірдей егіздерді көп мөлшерде алу бұқаларды, ұрпақтың сапасына қарай, бағалауды жеңілдетеді, сперма өндірудің бағасын төмендетті.

Бір жұмыртқалы тышқандардың алғашқы ұрпағы механикалық изоляцияланған екі жасушалы эмбриондар бластомерлерінен 1970 жылы алынды.

Осы техниканы қолдана отырып, бірақ агарға егу әдісін қолдана отырып С. М. Вилладсен (1979) қойларда 2-клеткалық эмбриондарды бөлу арқылы бір жұмыртқалы егіздерді алуды сипаттады.

Мал шаруашылығы үшін бір жұмыртқалы егіздер алудың үлкен маңызы бар. Бір жағынан саны өседі, әрі генетикалық бірдей егіз алынады.

Жануарлар биотехнологиясы тәжірибеде «құрастырылған» жануарларды алу технологиясының екі түрі бар: түрішілік және түраралық.

Түрдің ішінде «құрастырғанда» клондалған, түрлердің арасында «құрастырғанда» - химералық жануарлар алынады.

Клондалған жануарларды алу екі әдістен тұрады: имплантацияға дайындалған ұрықтың дисекция әдісі және энуклеация әдісі.

Табиғи монозиготалы егідердің пайда болу мүмкіндігі 0, 01%-тен аспайды.

Дисекция әдісі

Дисекция әдісі монозиготалы жануарлар алу негізіне бластомераның ұрықтан бөлінгенде тіршілікке және қабілетін жоғалтпайтыны, оның барлық онтогенез сатыларын өтіп, толық организмге дейін дами алуы қасиеті (тотипотенттік) жатыр.

Сүтқоректілердің бластомерлерінің тотипотентілігі бірінші рет тышқан эмбриондарында дәлелденген.

1978 жылы 8-16-жасушалық даму сатысында алынған 80 деми-эмбрионды тасмалдау арқылы 30 тышқан алынған.

Мұнда пеллюцид зоналары алынып тасталған.

Мал шаруашылығында эмбрион клондарын алу мүмкіндігін Ф. Сиделдің қояндарға жасаған тәжірибелері көрсетті

Қойларда 2-клеткалық эмбриондарды тек қана өте қысқа уақыт көлемінде алуға болады.

Қойлардан тек кейбір бөлініп жатқан эмбриондарды іздеу (күйіт) басталғаннан кейін 48 сағатқа дейін бөлініп алады, ал 60 сағаттан кейін эмбриондардың көпшілігі

4-клеткалық даму сатысында болады.

Кейінгі зерттеулер бірдей егіздерді бластомерлерді екі топқа бөлу арқылы 4- және 8-клеткалық эмбриондардан алуға болатындығын көрсетті (С. М. Вилладсен, 1980) .

2-, 4- және 8-клеткалық эмбриондар, қойлардың қалыпты эмбриондары сияқты, тіршілікке қабілетті.

Қазіргі уақытта эмбриондардың дамуының әртүлі кезеңінде (кеш моруладан бластоциста жарылып шыққанға дейін) пеллюцидтер зонасын кесу арқылы екі бірдей бөлікке бөлу арқылы қарапайым техниканы қолданады. Ал, пеллюцидті зонаның бөлінген бластоцистаның дамуының тиімділігінде айтарлықтай рөлі анықталмаған.

Ірі қараларда бір жұмыртқалы егіздерді алу үшін эмбриондарды дамудың кеш кезеңінде қолдану, оларды хирургиялық емес жолмен алуға болатындығы жеңілдетеді.

Бөлудің қарапайым техникасы шошқаның 6 күндік эмбриондарына да жасалған.

Бұл кезде шыны инемен эмбрионның ішкі жасушалық массасын және 40% пеллюцид зонасын кеседі.

Одан кейін пеллюцид зонасының ішіндегі трофоэктодермалық қабатты кеседі.

Эмбрионның бір жартысын өзінің пеллюцидті зонасына, ал екіншісін пеллюцидті зонасынсыз жатыр-түтіктік байланысқан 5 см қашықтықта 6 күндік реципиенттің жатыр мүйізіне көшіреді.

Жарты эмбриондарға бөлу техникасы қойлар мен ешкілерде сәтті қолданылып келеді.

Эмбриондарды бөлу техникасының қарапайымдалынуы екі негізгі себепке байланысты:

1) агарға енгізу техникасынан және уақытша реципиенттерді пайдаланудан бас тарту;

2) мөлдір қабықтан бөліп алу және оған операция жасалған эмбриондарды ретрансплантациялау кезеңдерін алып тастау.

Бір жұмыртқалы егіздерді алу үшін аралық материал ретінде соңғы уақытта 5, 5-8 күндік ерте морула-бластоциста кезеңіндегі эмбриондарды қолданады.

Эмбрионның ядросын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыру арқылы эмбриондарды клондау

Соңғы жылдары эмбриондардың ядросын энуклеирленген жұмыртқа

(ядросы алып тасталған) жасушасына ауыстыру монозиготалы егіздер алуда кеңінен қолданылады.

Бұл әдіс - ядроның плюрипотенттілігіне негізделген.

Эмбрионның ядросын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына ауыстыру арқылы эмбриондарды клондау үш негізгі сатылардан тұрады:

Біріншісі, ұрғашы донордың жыныс жолдарынан 2-8 бластомералық бөліну кезеңіндегі ұрықтарды бөліп алу;

пеллюцид зонасынан шығару. Ал бұл әдістің екі жолы бар: микроманипулятордың көмегімен механикалық бөлу және фермент проназаның көмегімен ферменттік әсер ету арқылы бөлу. Содан кейін ұрықты бөлек бластомераларға бөліп, олардан интакты донор ядросын алу;

Екінші саты, ооцитті энуклеация жасау; Энуклеация әдісінде овуляциядан өткен жұмыртқа жасушаны донордың жыныстық жолынан алып, микроинемен ұрықтандырылған жұмыртқа жасушаны кесіп цитохалазин қосылған фосфаттық ортаға салады.

Пипеткамен полярлы денені және оның қасындағы цитоплазманы бір сағат культивирлеуден кейін сорып алады.

Сонымен жұмыртқа жасушасы екіге бөлінеді. Полярлы дененің бар жартысында метафаза ІІ кезеңіндегі хромосомалары бар (жұмыртқа жасушаның «ядролық» жартысы) .

Екінші бөлекте ядролық құрылымдары жоқ («энуклеирленген» жарты) .

Үшінші саты, бөлініп алынған бластомера ядроларын энуклеирленген жұмыртқа жасушасына инъекциялау. Сүтқоректілерде амфибияның (Rana pipiens) ядросын ауыстырғаннан өзгешелігі ооцитті қоздыруды (стимулдеу) керек етеді, сондықтан

төртінші кезең болып ооциттің активациясы, яғни электрлік импульстің әсерімен донордың жасуша ядросы мен энуклеирленген реципиент-ооциттің мембранасының құйылысуы табылады.

Осылай реконструкциядан өткен ұрықтарды культивирлеу үшін реципиентке ендіреді.

Ұрықтарды бластоциста кезеңіне дейін өсіреді. Кейіннен лапаротомия әдісімен бластоцистаны жұмыртқа жолынан алып, қапталған агарды алып тастап, ұрықты бағалайды.

Осындай әдіспен алған жануарларды монозиготтық егіздер деп атайды.

Бұл технология арқылы, тірі қояндар, тышқандар, қойлар, қозылар, сиырлар мен шошқалар алынған.

Ірі қараның эмбриондарын ірі көлемде клондауды АҚШ және Канададағы екі коммерциялық фирмалар жүргізді.

Бірінші жағдайда донор-ядроларды 32-64-клеткалық эмбриондардан алды, екінші жағдайда - 8-64-клеткалық эмбриондардан алды.

Екі жағдайда да ооциттерді іздеу басталғаннан кейін 24-48 сағаттан кейін суперовуляциясы туындаған сиырлардан алынды, ал эмбриондарды хирургиялық емес жолмен бөліп алды.