Эдвин Саузер жасаған ДНҚ анықтау әдістемесі

СЕМЕЙ ҚАЛАСЫНЫҢ ШӘКӘРІМ АТЫНДАҒЫ УНИВЕРСИТЕТІ

КОМЕРЦИЯЛЫҚ ЕМЕС АКЦИОНЕРЛІК ҚОҒАМ

Орындаған : Нұрлыбекова Дана

Тобы: ВМ-803

Тексерген: Сабырова. А. Қ

Тақырыбы:Вестерн блодинг

СӨЖ

Жоспар

Кіріспе

Негізгі бөлім

2. 1 Түрлері

2. 2 Кезеңдері

2. 3 Артықшылық пен кемшілік

Қорытынды

Вестерн блотинг (Вестерн блот, ақуыздық иммуноблот, Вестрн блотинг)

Вестерн блоттинг Джордж Старк зертханасында жасалды (Стэнфорд, Ұлыбритания) Атауы вестерн-блот берілді техникасы. У. Нейлом Бурнеттом болып табылады ойын сөздерді атау Саузерн Блоттинг (Southern blotting) . - бұрын Эдвин Саузер жасаған ДНҚ анықтау әдістемесі

Кіріспе .

Ақуыздарды SDS-PAGE гель электрофорезі арқылы бөлу/ Гель электрофорезінің көмегімен ақуыздар полиакриламидті гельде бөлінеді.

2. Ақуыздарды мембранаға беру

3. Бұғаттау және анықтауСодан кейін олар антиденелерді қолдана отырып анықталады:біріншіден, ақуыздар бастапқы (моно немесе поликлональды) антиденелермен байланысады, олар өз кезегінде байланысады ферменттермен конъюгацияланған екінші антиденелермен (желкек пероксидазасы немесе сілтілі фосфатаза) .

ПРОТОКОЛ

Синтетикалық антидене немесе жануарларданалынған антидене (бастапқы антидене деп аталады) жасалады, ол белгілі бір мақсатты ақуызды танидыжәне байланыстырады. Электрофорез мембранасыартық антиденелерді жуар алдында бастапқыантидене бар ерітіндімен жуылады. Екіншіантидене қосылады, ол бастапқы антиденені танидыжәне онымен байланысады. Екінші антидене белгілібір мақсатты ақуызды жанама түрде анықтауғамүмкіндік беретін бояу, радиоактивтілік сияқты әртүрлі әдістерменбейнеленеді.

Артықшылығы: сезімталдық

Вестерн- блоттингтің пайдасына басты дәлелдердің бірі-оның сезімталдығы. Үлгіде ақуыздыңтек 0, 1 нанограммасын анықтау қабілетінің арқасында, әдіс пациенттің үлгісінде вирустыңнемесе бактерияның ең аз иммуногендік реакциясын анықтай отырып, теориялық тұрғыданерте диагноз қоюдың тиімді құралы бола алады. Жанама Вестерн блоттинг қосымша екіншіантидененің визуализация жүйесі анықтаған сигналдың қарқындылығын арттыру қабілетінебайланысты осы сезімталдыққа негізделген. Үлкен сезімталдық тестілеу үшін аз антиденелерқажет екенін білдіреді, бұл зертханалық шығындарды едәуір азайтады.

Артықшылығы: Спецификасы

Ветерн- блоттинг техникасы екі маңызды факторға байланысты. Біріншіден, гель электрофорезі үлгіні әртүрлі мөлшердегі, зарядты және конформациялық ақуыздарғасұрыптайды. Бұл процестің өзі анықтауға үлкен қадам болып табылады, өйткені гельде пайдаболған жолақтар қызығушылық ақуызының немесе полипептидтің мөлшері туралы түсінікбереді. Антидене-антигеннің өзара әрекеттесу ерекшелігі екінші маңызды фактор болыптабылады. Белгілі бір антиденелер белгілі бір ақуыздарға жақындық танытатындықтан, процесс мақсатты ақуызды, тіпті 300 000 түрлі ақуыздардың қоспасында да іріктеп анықтайалады

Кемшілігі: жалған немесе субъективті нәтижелерге бейімділік

Оның сезімталдығы мен ерекшелігіне қарамастан, Вестерн блот әлі де қате нәтиже береалады. Жалған оң нәтиже антидене оған арналмаған ақуызбен әрекеттескен кезде пайдаболады, бұл көбінесе АИТВ-ға тексерілген науқаста туберкулез немесе бірқатар паразиттікинфекциялар болған кезде пайда болады. Екінші жағынан, жалған теріс нәтиже, егер үлкенбелоктардың мембранаға дұрыс өтуіне жеткілікті уақыт берілмесе, оңай пайда болуы мүмкін. Қате тегістеу және өңдеу көбінесе бұрмалануға, түсіп кетуге немесе тіпті бірнеше жолаққаәкеледі, бұл сынақ нәтижелерін маманның түсіндіруіне мүмкіндік береді.

Кемшілігі: жоғары құны және техникалық сұраныс

Вестерн блодинг кептелісінің құны - бұл таңбаланған антиденелерге, білікті сарапшыларғажәне зертханалық жабдықтарға үлкен жеке шығындардың жиынтығы. Нәзік процесс, батыстық блоттинг үлгінің компоненттерін дұрыс анықтау үшін әр кезеңде дәлдікті қажететеді. Реагент концентрациясындағы немесе инкубация кезеңіндегі шамалы қателік бүкілпроцесс үшін апатты болуы мүмкін. Сонымен, анықтау және визуализация үшін қажетжабдық - химилюминесцентті, флуоресцентті, радиоактивті немесе лазерлік анықтаужүйелері - микробиологияның орташа бөлімі үшін тым қымбат болуы мүмкін.

Вестерн блоттингінің ең көп қолданылатын процедурасы келтірілген. Бұл процедурада бастапқы антиденелер зерттелетін ақ антиденеге тән, ал пероксидаза пероксидазасымен байланысқан қайталама антиденелер первич антиденесіне тән. Мұндай екі сатылы емдеу күшті сигнал береді (өйткені бірнеше қайталама антиденелер бір бастапқы антиденемен байланыса алады) және желкек пероксидазасын затбелгі ретінде қолдану өте сезімтал химилюминесцентті анықтау әдісін қолдануға мүмкіндік береді. Вестерн бұл процедурасы жасушада бірнеше молекулалардың мөлшерінде болатын ақуыздарды анықтау үшін жеткілікті сезімталдыққа ие.

Қорытыды

Ветерн- блотинг (Вестерн блот, ақуыздық иммуноблот, ағылш. Western blot) - үлгідегі ерекше ақуыздарды анықтау үшін қолданылатын аналитикалық әдіс. Бірінші кезеңде ақуыз электрофорезі полиакриламидті гельде денатуратталған полипептидтерді ұзындығы бойынша (әдетте SDS болған кезде) немесе ақуыздың үш өлшемді құрылымы бойынша (туғанкүйінде) бөлу үшін қолданылады.