ДНҚ диагностикалық әдістер

Дәріс № 6 Тақырып: Молекулалық-генетикалық зерттеу әдістері

Жоспар:

Адам геномының структуралық құрылымы.

«Адам геномы» бағдарламасы және оның маңызы.

ДНҚ диагностикалық әдістер: ПТР (полимеразалық тізбектік реакция), секвенсті анықтау, рестрикциялық талдау, саузерн-блот талдау, нозерн-блот талдау.

Қазіргі кездегі молекулалық-генетикалық әдістер мен технологияларды медицинада қолданудың негізгі принциптері.

Әдебиеттер:

Генетика. Учебник для ВУЗов/ Под ред. академика РАМН В. И. Иванова. - М. . : ИКЦ «Академкнига», 2006. - 327 б.

Введение в молекулярную медицину / Под. ред. М. А. Пальцева, М. Медицина, 2004.

Б. Льюин. Гены. - М. -Мир. - 1997.

Медициналық биология және генетика / Е. Ө. Қуандықовтың редакциясымен, Алматы, 2004, 158-178 б.

Геномика медицине/ Под ред. академика РАМН В. И. Иванова. - М. . : ИКЦ «Академкнига», 2006.

Адам геномының құрылымы

ХХІ ғасыр тарихқа молекулалық генетика ғасыры ретінде кіреді.

Молекулалық-биологиялық әдістердің қарқынды дамуы, жаңа және компьютерлік әдістердің пайда болуы, геномның қызметі мен құрылысы туралы мәліметтерді талдау барысында, жаңа көріністер берді.

Қазіргі кездегі геномдық технологияларды қолдануды шартты түрде 4 бөледі:

Сканерлеуші

Скринирлеуші

Функциональді

Хромосомалық

Осы әдістердің көмегімен алынған көп мөлшердегі информациялар биоинформациялық технологияны қолдану арқылы өңделеді.

Молекулалық-генетикалық тестілердің негізгі этаптары мен принциптерін жақсы меңгеру, қолданып жүрген технологияларды әрі қарай жетілдіруге және ол әдістердің қауіпті болуынан сақтануға мүмкіндік береді.

Геномика - деп тірі ағзалардағы геномдардың молекулалық құрылысын зерттейтін ғылымды айтады.

Геномика ғылым ретінде ХХ ғасырдың 80 жылдары соңында пайда болды.

Халықаралық бағдарлама бойынша геномика саласындағы алғашқы зерттеулер “Адам геномы” болып табылды.

Геном - деп, ағзаның белгілі бір ортада тіршілік етуіне, дамуына, эволюциясына және бірқатар ұрпақтарына тұқым қуалайтын қасиеттерін беретін, толық информациясы бар, жасушаның тұқым қуалайтын аппаратын айтады.

«Геном» терминін алғаш рет неміс ботанигі Ганс Винклер өсімдіктердегі хромосомалардың гаплоидты жиынтығын құрайтын генетикалық материалды белгілеу үшін енгізген.

Молекулалық генетикада геном термині хромосомалардың гаплоидты жиынтығындағы ДНҚ мөлшерін (1С) көрсетеді.

Геномдағы ДНҚ мөлшерін нуклеотидтердің мың жұбымен (н. м. ж. ), пикограмммен (1пг 10 -9 мг) және дальтонмен өлшеу қабылданған.

Геномның негізгі қызметі - жасушаның, ұлпаның және мүшелердің тіршілігін қамтамасыз ету және ағзаның тұқым қуалайтын қасиеттері туралы ақпаратты ұрпақтан ұрпаққа беру.

Геномиканың міндеттері

Гендердің және ген-аралық аймақтардағы нуклеотидтердің қатарын анықтау (сиквенирование), карталау (орнын анықтау) және қызметін анықтау.

Адам геномикасы молекулалық медицинаның негізі болып табылады. Оның адамдағы тұқым қуалайтын, тұқым қуаламайтын ауруларға диагноз қоюда және алдын алуда, емдеу әдістерін табуда маңызы зор.

Геномиканың жаңа бағыттары

Семіру: бір генде жүрген мутация адамдар мен тышқандарда ұқсас зардап тудыруы мүмкін

Салыстырмалы геномика

2003 жылдың сәуір айында Адам геномының толық ретін анықтау аяқталды.

Адамдағы гендер саны 20 - 25 мың

Адам геномының құрылымын зерттеу мақсаттары:

Адам геномындағы нуклеотидтер қатарын анықтау.

Адам геномының генетикалық және физикалық карталарын құру.

Адам геномы құрылымын зерттеу нәтижелері:

● Жасушадағы ДНҚ молекуласының жалпы ұзындығы - 1, 5- 1, 7 м.

● Адам геномы (гаплоидты жиынтық) 3 млрд. нуклеотидтік жұптардан тұрады.

● ДНҚ-ның 2 % жуығы ғана белоктардың құрылысын кодтайтын бөлігін құрайды, 98 % қызметі белгісіз.

● 50 % астам бөлігі қайталанатын нуклеотидтер қатарынан тұрады.

● 99, 9 % адам геномындағы нуклеотидтер қатары, барлығында бірдей.

● 40 % астам адам ақуызы жеміс шыбыны мен құрттардың ақуыздарына ұқсас.

● Көптеген аурулардың гені мен олардағы нуклеотидтер қатары анықталған: сүт безінің рагі, бұлшық еттің дистрофиясы, соқырлық пен саңыраулық. ● Мөлшеріне байланысты 1-ші хромосомада көп - 2968, ал У-хромосомасында аз - 231 ген орналасқан. ● Адам геномында 3 млн жуық нүкте табылған, олар бір-бірінен бір нуклеотид бойынша ажыратылады. Бұл мәліметтің келешекте ДНҚ-ғы нуклеотидтер қатарын анықтауда маңызы зор болады. ● Зерттеу нәтижесіндегі таң қалдыратын мәлімет, адам геномындағы гендер саны 30 000 жуық.

Барлық қайталанатын қатарлар ұзындығы мен қайталану жиілігіне байланысты жіктеледі

Жиілігіне байланысты:

Жиі қайталанатын қатарлар

Орташа қайталанатын қатарлар

Аз қайталанатын қатарлар

Барлық қайталанатын қатарларды екі топқа бөлуге болады:

Тандемдік қатарлар (бірінен соң бірі орналасқан)

Геномда дисперсияланған (шашыраңқы) қатарлар

Тандемдік қатарлар гендер аралығында және интрондарда, әсіресе, хромосомалардың центромерлік және теломерлік аймақтарында орналасады.

Тандемдік қатарлар:

Хромосоманың перицентромерлік аймағындағы қатарлар сателлиттік ДНҚ -ға жатады.

Микросателлиттік қатарлар - мөлшері 1-4 ж. н тұратын (2-8) тандемді қайталанатын қатарлар. Жиі кездесетін түрі - ЦА - қатарлары. Микросателиттер гендерді карталауда қолданылады.

Минисателиттік қатарлар - 10-нан 100 000 ж. н. дейін қайталанатын қатарлар.

Мини және микросателиттік қатарлар әр адам үшін әр түрлі локуста тандемдік қатарлардың санының комбинациясы бойынша уникальды болып табылады. Бұл адам полиморфизмін сипаттайды.

Медико-генетикалық және сот-медициналық мақсатта маркерлер ретінде қолданылады.

Адам геномының құрылымы

Геномда кең таралған дисперсияланған қатарлар:

Қысқа дисперсияланған қатарлар - SINE - ( 100-500 н. ж. соңында poly - А бөлігі бар )

Осы типке жататын қатарлар - Alu -қатарлар (300 ж. н. 3 соңында poly - А бөлігі бар ) . Бұл қатарлар гендер аралығында, интрондарда, сателлиттік ДНҚ бөліктерінде кездеседі.

Ұзын дисперсияланған қатарлар - LINE -қатарлар (6-7 мың н. ж. ) - ретротранспозондардың бір түрі .

Адам геномының ерекшелігі - ұлтына, нәсіліне және этникалық тобына байланысты емес. Адам геномының 99, 9 % барлық адамдарда бірдей болады.

Тек - 0, 1 % ғана бір нуклеотидтік алмасулар - SNP (single nucleotide polimorphizms) негізінде бір-бірінен айырмашылығы бар.

SNP - геномда әрбір 1-2 мың ж. н. соң кездеседі, жалпы саны - 3, 2 млн.

Осы алмасулар адам полиморфизмінде және тұқым қуалайтын ауруларға диагноз қоюда маңызды роль атқарады.

Адам геномының сипаттамасы (Н. П. Бочков бойынша, 2004)

Геномдық технологиялар

(этаптары және әдістері)

I ДНҚ алу және бөлу

Нативті ДНҚ бөліп алу.

ДНҚ химиялық синтезі

ДНҚ ферменттік синтезі (ПТР) - ДНҚ амплификациясы

3. ДНҚ белгілі фрагменттерін алу және бөлу

ДНҚ-зондтармен гибридизациясы

Клондау

II. ДНҚ фрагменттерін визуализация (электрофорез әдісі)

III. ДНҚ қатарын анықтау (секвенирование)

Геном полиморфизміне негізделген зерттеу әдістері

РФҰП-талдау (рестрикциялық фрагменттің ұзындығындағы полиморфизмді талдау)

Геномдық дактилоскопия

Геномды карталау әдістері

Бұл әдістерді пайдаланып, ДНК фрагменттерін талдап, зерттеу арқылы тұқымқуалайтын ауруларға диагноз қояды.

Зерттеу үшін түрлі мүше, ұрық ұлпаларының биоптаттары, қан лейкоциттері т. б. қолданылады.

Ғылыми мақсатта ДНҚ-ны жасанды түрде, химиялық синтездеу жолымен алады, онда ДНҚ-ның өсу 5‘ ұшынан басталады.

Барлық генетикалық-молекулалық әдістер әртүрлі кластарға жататын феремнттерге негізделген, оның ішіндегі ең маңыздылары:

1. ДНҚ - полимераза

2. Рестриктаза

ДНҚ - полимераза зерттелетін ДНҚ фрагментінің амплификациясына қатысады.

Оның бір түрі - полимераздық тізбектік реакция немесе ПТР.

ПТР 1983 ж. К. Муллис ұсынған.

Полимеразалық тізбектік реакция әдісімен in vitro жолымен, ДНҚ-полимеразаның көмегімен екі праймерлерді қолданып, таңдамалы түрде, ген фрагменттерінің өте көптеген (млн. есе) көшірмелері алынады.

ПТР-дің нәтижесін электрофорездік гельден өткізіп, арнайы бромид этидиймен бояп, электрофореграмманы УКС өткізу арқылы талдағанда, ДНҚ қызыл жолақша түрінде көрініс береді.

ПТР (стадиялары)

Бастапқы ДНҚ

ДНҚ-ның рестрикциясы

Рестриктазалар - ферменттер, эндонуклеазалық активтілікке ие, олар ДНҚ-ны қорғау және оның 4-12 нуклеотидтер қатарынан тұратын сәйкес бөліктерін тану жүйесіне қатысады.

Бактериялық рестриктазаның 500 аса түрі бар.

Рестриктаза ДНҚ молекуласындағы өздері таныған бөліктерін фрагменттерге бөледі, оны рестрикциялық сайттар д. а.

Сайттар жиі орналасқан сайын, фрагменттер қысқа болады.

Рестрикциялық сайттардың жиі орналасуына байланысты, ДНҚ молекуласындағы рестриктазаны 3 класқа бөледі:

1 Жиі бөлетін - ұзындығы 4-5 ж. н. тұратын арнайы қатарларды таниды.

2. Орташа бөлетін - ұзындығы 6-7 ж. н. тұратын арнайы қатарларды таниды.

3. Сирек бөлетін - ұзындығы 8-12 ж. н. тұратын арнайы қатарларды таниды.

Фрагменттердің молекулалық массасын анықтау рестрикциялық сайттар мен ДНҚ молекуласының соңы арасындағы физикалық ара-қашықтықты анықтауға мүмкіндік береді. Бұл әдісті физикалық карталау әдісі деп атайды.

ДНҚ молекуласындағы фрагменттерді электрофореграммада анықтау үшін ДНҚ-зондпен будандастыру қажет.

ДНҚ-зонд - бір тізбекті, ұзындығы 30 жуық нуклеотидтерден тұратды.

Оны үлкен немесе орташа көлемді ДНҚ молекуласындағы комплементарлы нуклеотидтер қатарларын табу үшін қолданады.

ДНҚ-зондар жасанды түрде немесе геномнан алынады және көп мөлшерде көшірмесін алу үшін клондалады.

Талданатын ДНҚ-ны ДНҚ-зондпен будандастырудың бірнеше әдістері бар.

Блот-будандастыру әдісі

ДНҚ молекуласындағы ерекше нуклеотидтер қатарын идентификациялаудың өте сезімтал әдісі.

а) ДНҚ-ға денатурация, фрагментация жүргізіп, агарозалық гельде электрофорездейді.

в) Ол фрагменттерден сілтілі ертіндіде бір тізбекті ДНҚ кесінділерін алады.

с) Біртізбекті ДНҚ-ды нейлон сүзгіге фиксациялайды

Ұқсас жұмыстар

Өкпе туберкулезінің диагностикасында қолданылатын заманауи әдістер

САПАСЫН ТАЛДАУ ӘДІСТЕРІН ИГЕРУ

ПТР әдісі, барысы - Саузерннің блотгибридизация методликасы

Бояу үлгісі

Криминалистік идентификация және диагностика

Генетикалық қауіпсіздік

ДНҚ тізбектерін ДНҚ полимеразамен көшіру әдісі

Зерттеудің молекулалық - генетикалық әдістері

Вирустардың ерекшелігі

ДНҚ зерттеу әдістері. ДНҚ диагностикасының тура және көлденең әдістері. ДНҚ – фингерпритинг

Пәндер

Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.

Ақпарат

Қосымша

Email: info@stud.kz