Каллус жасушаларының культурасы

Каллус жасушаларының культурасы. Каллустық талдау.

Тапсырма:

1. Дедифференциация және каллузогенез жасуша дақылдарын құрудың негізі ретінде.

2. Каллус алу үшін эксплантты таңдау критерийлерімен танысу.

3. Каллус түзілу индукциясы әдістерін оқу.

1. Каллус өндіру және өсіру

Каллус тіндері in vitro ұзақ мерзімді өсірудің негізгі объектілерінің бірі болып табылады.

Каллус жараның жазылуына ықпал етеді және бастапқыда дифференциациялануға қабілетті тін жасушаларынан (камбий, флоэма, жас ксилема жасушалары) жара бетінде пайда болатын дифференцирленбеген жасушалардан тұрады. Бұл тін жарақат орнын қорғайды, анатомиялық құрылымдарды немесе жоғалған органды қалпына келтіру үшін қоректік заттарды жинайды.

Өсімдік үшін каллус - ерекше жағдайларда (әдетте жарақаттармен) пайда болатын және қысқа уақытқа қызмет ететін ұлпа.

In vitro жағдайында каллус тіннің оқшауланған бөліктерінде (экспланттарда) түзіледі. Каллус дақылының түзілуі мен өсуі ауксиндер мен цитокининдер арқылы реттеледі. Бұл гормондар жарақатқа жауап ретінде каллус түзбейтін өсімдіктерде каллус түзілуін тудырады.

Каллус тінін in vitro кез келген дерлік тірі өсімдік ұлпасынан алуға болады.

Эксплантты таңдау зерттеу мақсаттарымен анықталады. Таңдалған экспланттың қолайлы биологиялық күйде болуын қамтамасыз ету керек.

Жас ұлпалар жетілгендерге қарағанда каллус өсіруге қолайлы.

Ең жақсы экспланттарға сонымен қатар пролиферацияға жауапты тіндер (жасушаның бөлінуі арқылы тіннің өсуі) табылады. Каллузогенезді индукциялау үшін лигнизацияланған тіндерді, метаболизмі төмен ескі тіндерді, нашар пролиферацияланатын тіндерді (жеміс целлюлозасы және т. б. ), балауызбен жабылған ұлпаларды және т. б. қолдану қажет емес.

Асептикалық жағдайда зарарсыздандырылған тұқымдардың өнуі көбінесе каллус өндіру үшін ең қолайлы материалды береді.

Бастапқы каллус алу процесі және оны одан әрі өсіру стерильділікті қажет етеді. Әдетте стерилизацияның белгілі әдістері қолданылады немесе олар әрбір нақты объект үшін эксперименталды түрде әзірленеді.

Көптеген ұлпалардың физиологиялық полярлығы бар, сондықтан оларды қоректік ортаға көшіру кезінде экспланттардың кеңістіктегі белгілі бір бағдары маңызды.

- Тамыр ұштарын агарға көлденең орналастырса оңай каллус түзеді.

- Сабақ сегменттері тігінен орналасса жақсы каллус түзеді, ұштарының бірі агарға батырылады.

Бұл жағдайда каллус аналық өсімдікте тамырға қараған экспланттың жағында қарқынды түрде түзіледі.

Тамыр дақылдарынан экспланттарды оқшаулау жағдайында полярлық маңызды емес.

Каллус тінінің пайда болуы үшін in vitro эксплант жасушалары дифференциациялануы керек, яғни. бастапқы тіннің ерекше қасиеттерін жоғалтады.

Каллузогенездің алдында болатын әртүрлі маманданған эксплант жасушаларының қайта орналасуы да осыған ұқсас жүреді.

Эксплант жасушалары өздерінің резервтік заттарын - липидтерді, крахмалды, ақуыздарды жоғалтады.

Фотосинтездеуші жасушалар хлорофилл мен хлоропласт липидтерін жоғалтады.

Гольджи аппараты бұзылады

Эндоплазмалық ретикулум және цитоскелет элементтері қайта орналасады, полисомалардың саны артады

Жасуша РНҚ мен ДНҚ синтездейді, ал каллус жасушаларына тән гендердің экспрессиясы басталады.

Тінге спецификалық антиген белоктары жойылып, жасушалардың бөлінуіне тән белоктар пайда болады

Осылайша, кез келген жасушаның каллус жасушасына айналуының алдында терең биохимиялық және құрылымдық қайта құрылымдау процесі жүреді.

Ортаға экзогендік гормондардың қосылуы каллузогенездің басталуына әкеледі. Жасушаның және оның каллус жасушасына айналуының алғы шарты қоректік ортада өсу реттегіштерінің екі тобының өкілдерінің: ауксиндер мен цитокининдердің болуы болып табылады.

(Дифференциялану мен каллус түзілу механизмін зерттеудің ең қолайлы үлгісі темекі сабағының өзек паренхимасының мәдениеті болып табылады, өйткені ол үшін бөліну және каллус түзілу индукциясы ауксин мен цитокининнің болуына қатаң тәуелділік бар. )

Дедифференциация процесінің нәтижесінде in vitro жағдайында біріншілік каллус түзіледі. Бірақ көбінесе жаңа өсімдік материалынан каллусты алғаш рет алу қиынға соғады, өйткені әр түрлі өсімдік түрлерінің ұлпалары, тіпті әртүрлі өсімдік бөліктері дедифференциация мен каллузогенез үшін гормондардың әртүрлі мөлшері мен қатынасын қажет етеді.

Агарда беттік әдіспен өсірілген каллус ұлпасы - қатаң анықталған анатомиялық құрылымы жоқ жұқа қабырғалы паренхималық жасушалардың аморфты массасы.

Дегенмен, каллус тіндерін монотонды деп ойлау қателік болар еді. Зерттеушілер оларды түсі, құрылымы, беткі сипаты сияқты морфологиялық белгілеріне, сондай-ақ өсу қарқындылығы мен жасылдану қабілетіне қарай түрлерге бөледі.

Каллус тінінің түсі ақшыл, сарғыш, қоңыр, қоңыр, хлорофилл немесе антоцианиндер толық немесе ішінара пигментті болуы мүмкін. Қою қоңыр түс көбінесе каллус жасушаларының қартаюы кезінде пайда болады және оларда фенолдардың жиналуымен байланысты. Соңғылары хинондарға дейін тотығады. Олардан құтылу үшін қоректік ортаға антиоксиданттар қосылады.

Өндіріс көзіне қарай гомогенді (бір жасуша түрі бар) және гетерогенді (бірнеше жасуша түрі бар) каллустар бөлінеді.

Консистенциясына қарай каллус тіндері борпылдақ, орташа тығыз және тығыз болып келеді. Борпылдақ каллустар жоғары гидратталған жасушалардан тұрады және ұсақ агрегаттарға оңай ыдырайды.

Орташа тығыздықтағы каллылардың меристемалық белсенділік ошақтары жақсы анықталған, олардың жасушаларын бір-бірінен қатты шайқау арқылы бөлуге болады.

Тығыз каллустар өте ұсақ жасушалармен, сондай-ақ камбиальды және трахея тәрізді элементтері бар айқын аймақтардың болуымен сипатталады.

Оңтайлы таңдалған қоректік ортасы бар бастапқы каллусты алған жағдайда, кейбір экспланттардың трансплантациясы үшін жеткілікті мөлшерде әдетте 3-8 апта ішінде мозолей түзеді. Қаллус жасушаларының қартаюын, бөліну қабілетін жоғалтуын және өлуін болдырмау үшін пайда болған каллус жаңа қоректік ортаға ауыстырылады. Бұл операция өту деп аталады.

Бастапқы каллус бөліктерге бөлінеді, олар одан әрі бөлек өсіріледі. Жаңа қоректік ортаға ауыстырылған каллус бөліктерінің мөлшеріне назар аудару керек: егер олар тым кішкентай болса, онда каллустың одан әрі өсуі тежелуі мүмкін.

Каллус тіндерін мезгіл-мезгіл жаңа қоректік ортаға трансплантациялау арқылы in vitro жағдайында шексіз өсіруге болады. Сәтті қалыптасқан каллус культурасының линиялары шамамен әр 4 апта сайын тұрақты көшіруді қажет етеді.

Өсіру жағдайларына және бастапқы экспланттың шығу тегіне байланысты каллус дақылдарында әртүрлі трансформациялар болуы мүмкін. Олардың бірі - «көндірген» тіннің пайда болуы. Қоршаған орта факторларының әсерінен өсіру процесінде мутантты жасушалар пайда болуы мүмкін - фитогормондардың көп мөлшерін өндірушілер.

Өсірудің физикалық факторлары

Оқшауланған өсімдік жасушалары мен ұлпаларын табысты өсіру үшін белгілі бір физикалық өсу жағдайларын сақтау қажет.

Температура факторы in vitro жағдайында өсуге, ферменттердің белсенділігіне айтарлықтай әсер етеді, олардың кейбіреулері тамақ көздерінің метаболизмі үшін қажет және т. б. Көптеген зертханаларда фитотрондық камералардағы температура 26, 1 ° C деңгейінде сақталады; 29 -30 oC. Морфогенезді индукциялау жағдайында температура 18-20 ° C дейін төмендейді.

toC

Каллус ұлпаларының көпшілігі жарықты қажет етпейді, өйткені оларда хлоропластар жоқ және гетеротрофты түрде қоректенеді. Ерекшелік - кейбір жасыл калли. Каллус тіндерінің көпшілігі қараңғыда немесе диффузиялық жарықта алынады.

Морфогенез үшін анықталған тіндер жарыққа ауыстырылады, содан кейін 1000-4000 люкс жарықтандыруда өсіріледі. Оқшауланған меристемаларды өсіру және олардың микрокөбеюі жарықта да жүреді.

Жарықтандырудың қарқындылығынан басқа, жарықтың сапасы тіндердің мәдениетіне және оның физиологиялық сипаттамаларына әсер етеді. Әртүрлі толқын ұзындығындағы жарық біріншілік және қайталама метаболизм процестерін реттейді. Берілген мәдени нысанға қажетті фотопериодты ескеру қажет.

Мәдениет бөлмесіндегі ылғалдылық 60-70% болуы керек. Кептіргіш ауа пробиркалар мен колбалардағы қоректік ортаның кебуіне, егер олар мақта тығынымен жабылса, оның концентрациясының өзгеруіне және өсіру жағдайларының бұзылуына ықпал етеді.

Климаттық камералардың көмегімен ең жақсы жарық және температура режимдерін, сондай-ақ оңтайлы ылғалдылық режимін жасауға болады. Жасуша популяциясын жер үсті және суспензияда өсіруде аэрация жағдайы мен газ құрамы маңызды.

Жасуша және ұлпа культурусы газ режимінің оңтайлы шарттары әлі де аз зерттелгенімен, газ қоспасына (оттегі, азот, көмірқышқыл газы) байланысты жасушаның бөліну қарқындылығы да, дифференциация және морфогенез процестері де өзгеретіні белгілі.

Жарық бөлменің түрі

Жасуша культурасындағы дифференциация түрлері

Өсімдік жасушаларының дифференциациясы in vitro әртүрлі тәсілдермен және әртүрлі дәрежеде - жеке жасушалардың дифференциациясынан бастап бүкіл өсімдіктің дамуына дейін болуы мүмкін. Келесі түрлер бөлінеді:

1. Дифференциацияның қарапайым түрі - каллус тінінде ерекше морфологиялық құрылымы бар және ерекше қызмет атқаратын дифференциалданған жасушалардың пайда болуы. Көбінесе эпибласттардың пайда болуы байқалады - қосалқы заттарды, сондай-ақ қайталама метаболиттерді орналастыратын жасушалар.

2. Каллус жасушаларының гистологиялық дифференциациясы (гистогенез) - каллуста әртүрлі ұлпалардың түзілуі. және флоэманың серіктес жасушалары.

Каллус тінінде сүтті, талшықтар, трихомалар түзілуі мүмкін; бұған сонымен қатар тамырлар жүйесінің элементтерінің - трахея мен ксилема трахеидтерінің, елеуіш түтіктердің түзілуі жатады.

3. Органогенез - каллус жасушаларының бүтін мүшелерге дифференциациялануы; оларды сабақ шыңдарына немесе гүл элементтеріне айналдыру.

4. Соматикалық эмбриогенез - каллус тінінде немесе суспензия дақылында эмбриоидтардың түзілуі, т. б. ересек өсімдікке айналуға қабілетті бүтін өсімдіктің микробтары.

Ризогенез

Развитие эмбриоидов