Стрептококкоз патоморфологиясы

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 11 бет
Таңдаулыға:

Жоспар

І Кіріспе

ІІ Негізгі бөлім

А. Полимеразалық тізбекі реакция

Ә. ПТР- ге қажетті компоненттер

Б. ПТР -дың сатылары

В. ПТР-дың әр түрлілігі

Г. ПТР -дың мәні

ІІІ Қорытынды

VІ Пайдаланған әдебиеттер тізімі

Дезоксиринбонуклеин қышқылы (ДНҚ) -тірі организмдердің қызмет

ету туралы генетикалық ақпараттардың іске асырылуын және ұрпақтан

ұрпаққа берілуін, сақталуын қамтамасыз ететін нуклеиндік қышқылдардың

екі түрінің бірі болып табылады. Талшықтағы ДНҚ-ның негізгі рөлі РНҚ

және ақуыздардың құрылымы туралы ақпараттарды ұзақ уақыт сақтау.

Химиялық тұрғыдан алғанда ДНҚ - бұл мономер-нуклеотидтерден

тұратын полимер. Әрбір нуклеотид азот негізінен, қанттан (дезоксирибоз)

және фосфант топтардан тұрады.

ДНҚ-да азот негіздерінің төрт түрі ( аденин, гуанин, тимин және цитозин) кездеседі. Нуклеотидтар арасындағы байланыс дезоксирибоз және фосфат топтары есебінен құралады.

Көпшілік жағдайда ДНҚ бір-біріне азот негіздерімен болжамданған екі тізбектен тұрады. Тізбектердің бірінің азот негіздері келесі тізбектің азот негіздерімен сутегі байланыстарымен байланысқан, комплемантарлық принципке сәйкес аденин тек тиминмен, гуанин тек цитонинмен байланысады. Бұл қос тізбекті молекула спиралды түрде байланысқан. Бұл ретте тізбектер антипарарллель болып табылады, яғни бір тізбектің 5-шеткі ұшы келесі тізбектің 3-шеткі ұшына қарсы орналасады. Нуклеотидтардың кезектілігі РНҚ-ның тҥрлі типтері туралы мәліметтерді «кодтауға» мҥмкіндік береді, олардың ішінде аса маңыздысы ақпараттық, немесе матрикалық (мРНҚ), рибосомалық (рРНҚ) және көліктік (тРНҚ) болып табылады. РНҚ осы барлық түрлері ДНҚ матрицасында РНҚ кезектілігінде ДНҚ кезектілігін көшіру есебінен синтезделеді. ДНҚ кезектілігі жазбасының жалпы қабылданған нысаны 5-тен 3- шетіне дейінгі нуклеотидтер жазбасы болып табылады. ДНҚ қыздыру кезінде су текті байланыстар жарылады және қосарлы спиралдағы жіптер ажырайды. Қыздыру процессі ДНҚ қызуы деп аталады, бұл ретте А-Т және Т-Ц жұптары арасындағы байланыс бұзылады. ДНҚ А- Т жұбы қаншалықты көп болса, бір-бірімен байлау жіптерінің мықтылығы аз болғандықтан, ДНҚ еріту жеңіл болады.

Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) - ДНҚ тұтас фрагментінің көп қырлы ферментативті ампликациясына, биологиялық материалдағы анықталатын нуклеин қышқылдарындағы (ДНҚ) аз концентрациялы фрагменттердің айтарлықтай ұлғайтылуын қамтамасыз ететін молекулярлық биологиядағы эксперименталды әдіс.

Полимеразды тізбекті реакцияны 1983 жылы американ ғалымы Кэри Мюллис ойлап тапты. Ол кейіннен осы еңбегі үшін Нобель сыйлығын алды. ПТР әдісі негізіне зерттеуші таңдап алған ДНҚ бөлігінің көп қырынан қосарлану алынды. Нәтижесінде көзбен детекциялауға жеткілікті ДНК көлемі жасалады. ДНҚ амплификациялаудан басқа ПТР нуклеин қышқылдары мен көптеген басқа да әрекеттерді (мутацияны енгізу, ДНҚ фрагменттерін өсіру) жүргізуге мүкіндік береді және биологиялық және медициналық практикада кеңінен қолданылады. ПТР өткізу үшін, микорценртлік приборкаға ДНҚ-матрицаны, нуклеотиды, ДНҚ полимеразы, ферменттерге арналған буферді араластырады. Бұл реакция су ерітіндісінде жүргізіледі.

Полимераздық тізбектік реакция әдісі (ПТР) соңғы кездерде молекулалық биологияда, генетикада, экологияда, медицинада әр алуан мәселелерді шешу үшін кеңінен қолданылады. Бұл әдіс локустардағы ДНҚ полиморфизмін анықтауға, ДНҚ және РНҚ фрагменттерін клондауға, генетикалық карта құруға қолданылады.

Полимераздық тізбектік реакцияның екі негізгі нұсқасы бар:

1 ПТР туынды праймерлермен мысалы, RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA), АР- РСR (Arbitrarily Primed PCR) немесе DAF (DNA Amplification Fingerpriming) маркеры;

2 ПТР арнайы праймерлер қолданумен (ұзындығы 20-27 нуклеотидтер), белгілі нуклеотидті тізбекке құрылған: STS (Sequenасе Tagged Sites) маркерлер ;

Реакция компоненттері

ПТР-ды ең қарапайым жағдайда жасау үшін келесі компоненттер керек болады:

Амплификация жасалатын ДНҚ үлескісі бар ДНҚ-матрица
Талап етілетін ДНҚ фрагменті әр түрлі тізбектерінің ұштарына комплиментарлы екі праймер
Жоғары температураға тұрақты ДНҚ-полимераза - ДНҚ полимеризациясын катализдейтін фермент.
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
Полимеразаның қызметіне қажетті Mg2+ иондары
Реакцияға қажетті жағдайларды (pH, ерітіндінің иондық күші) қамтамасыз ететін буферлік ерітінді.

Праймерлер - бұл ДНҚ-ның бірцепті шағын ферментері, матрицаның түрлі цептерінің коплементарды бөлігі, бірі-бірінен алыс емес қашықтықта орналасқан .

Праймерлерге негізгі талаптар

Праймерлер ұзындықтары 18-30 нуклеотидтерден GC құрамы 45-55%, матрица құрамындағы GC санына жақын болуы керек
Праймерлердің жабысуы t 5 ° C жоғары болмауы керек
-димердің, қайталанудың, екіншілік құрылымның болмауын;
-ПЦР өнімнің өлшемі 200-600 мкм арасында болуы

Leptospira interrorgans генінен алынған праймерлердің сипатамасы

Taq полимераза E coli штамынан бөлінген рекомбинатты фермент .

Агароза - полисахаридтер тізбегі, агардың бейтарап құрауышы, кезектесе орналасқан β-D-галактопиранозалардың және 3, 6-ангидридо-α-1-галактопиранозалардың қалдықтарынан тұрады. Биополимелердің сірне-электрофорезі мен сірне хроматографиясында тасымалдаушы ретінде қолданылады. Агароза лабораториялық зерттеулерде гель жасау үшін қолданылады.

Трис ацетоттық буфер - TAE буфері - ерітінді. Бұл гель молекулярлы биологияда нуклеин қышқылдарының фрагменттерін бөлу үшін элетрофорезде қолданылады.

50 краттық ТАЕ буферін дайындау үшін қажетті компонеттер

Трис

24, 22 г

Трис: ЭДТА тұзы

24, 22 г: 1, 862 г

Трис: Сірке қышқылы

24, 22 г: 8, 96 мл

Трис: Н₂ О (дистелденген )

24, 22 г: 73, 3 г

ТАЕ буфері қолданылады:

-Электрофорез жүргізу үшін

-ДНҚ өнімдерін талдау үшін

-ДНҚ үзінділерін бөлу үшін

Электрофорездің түрлері. Электрофорез - ДНҚ фрагменттерін көлемге (фрагменттің ұзындығына) бөлу мүмкіндігін беретін аналитикалық әдіс. Электрофорездің екі түрі бар: агароздық гель электрофорезі және полиакриламидті гель электрофорезі. ДНҚ-ны фрагменттердің ұзындығы бойынша бөлу үшін екі түрді де қолайлы. Алайда агарозды гельде тек ірі ДНҚ үзінділері 50 базалық будан және 10 000 базалық жұптан бастап тиімді бөлуге болады Агарозды бөлудің оңтайлы өлшемі 500-ден 5000 базалық жұптарға тең. Полиакриламидті гельде тек кішкене фрагменттерді бөлуге болады - 10-нан 1000-ға дейінгі базалық жұптарға, үзінділердің оңтайлы диапазоны 50-ден 200 базалық жұптарға дейін. Полиакриламидті гельдегі фрагменттерді бөлудің дәлдігі өте жоғары, 1-нуклеотидтің сезімталдығына (мысалы, 200 және 201 базалық жұптың үзінділері) жетуге жеткілікті ұзын үзінділері бар. Aгароздық гелі 1 нуклеотид айырмашылығы бар бөліктерді ажыратуға мүмкіндік бермейді. Бірнеше базалық жұптардан (Метафор агарозасы) ерекшеленетін үзінділерді ажырататын агароздың ерекше түрлерін шығаратын фирмалар бар.

ПТР -сы ондаған циклдардан құралады, әр қайсысы үш сатыны шығарады.

Бірінші саты - ДНҚ-нің денатурациясы. Ол реациялық сместердің +93, +95 градуста қызығанда пайда болады. Бұл этапта азоттық негіздер арасындағы су байланыстары бұзылады. Тізбек ізі бойынша ДНҚ айналасында бір-бірін ұстауды тоқтатады.

Екінші саты - праймерлердің жануы. Отжиг Праймерлердің маңызды сипаттамасы -праймер-матрица комплексінің құбылысының температурасы (t) . Ол температура ретінде жартысы бос болмауымен анықталады. T мына формуламен анықтауға болады: t=2 А+Т) +4(G+С) . егер праймер қысқа болса, t аз болса, онда праймер басқа матрицалық ДНҚ аймағына жайлап ауысады, ал ол спецификалық емес өнімдердің пайда болуына әкеп соғады. Жоғарыда температура полимераза оптимумымен өлшенеді.

Үшінші саты - элонгация (ДНҚ тізбектерінің ұзаруы) . Праймермен гибридизацияның матрицасынан кейін соңғы матрицалардың тізбектерінің қорытындысына әкеледі

Полимеразаны тізбекті реакцияның бір циклінде фрагменттердің көлемі 2 есе ұлғаяды. Реакцияның N циклі ішінде амплифицирлеуші фрагмент көлемі 2 есе ұлғаяды. Қазіргі таңда ПТР -ға термофильді бактерияны Thermus aguaticus ДНҚ- полимеразасы қолданылып жүр. Бүл әдіс 1980 жылғы кеңес ғалымдары мен генетиктері А. С Каледин, А. Г. Смосаренко және С. И. Городецкийдің зерттеулеріне сүйенеді. Таg-полимеразалы реакцияның температуралық оптимумы 70 С шамасында. Бұл реакцияның тағы бір маңызды қасиеті аталған полимераза +95 С-да ұзаққа созылған инкубация кезінде инактивтелмейді. Таg-полимеразасын қолдана отырып бірден 2 мәселені шешуге болады. Біріншіден, термотұрақты полимераза ДНҚ денатурациясы кезеңінде инактивтелмейді, сондықтан реакцияның әр циклынан соң жаңа фермент қосудың қажеттілігі жоқ. Бұл жеңілдік ПТР-ны жүргізуді автоматтандыруға мүмкіндік береді. Екіншіден реакцияның Жоғары температуралық оптимумы зерттелініп отырған геномда праймерлердің гибридтенуін қамтамасыз етеді. Бірақ Таg полимеразаның кемшілігі де бар мысалы, салыстырмалы төмен дәлділік, сонымен қатар ДНҚ соңында аденозинмонофосфат қосу қасиеті. Таg-полимеразадан басқа қазіргі уақытта көптеген термотұрақты полимеразалар қолданып жүр. Соның ішінде жоғары дәлдікке арналған Pyrococcus furiosus ішінен pfu . Реакция өнімдері агарлы гельде бөлініп бромды этидимен боялып визуалданады. Бромды этидий ДНҚ-мен әсерлесіп оның флуоресценциясына әкеледі, сәулеленгенде ультракүлгін түске енеді.

ДНҚ тізбегінің арнайы фермент (рестриктаза) көмегімен бөлінуін рестрикция деп атайды. Рестриктазалар (рестрикциялаушы эндонуклеазалар, эндонуклеазалары) - гидролаз класына жататын ферменттер тобы. Олар нуклеин қышқылдарының гидролиз Экзонуклеозаларға қарағанда рестриктазалар ыдыратуды молекуланың соңынан емес, ортасынан бастайды. Бұл кезде әрбір рестриктаза ұзындығы 2 жұп нуклеотидтен тұратын ДНҚ-ның белгілі бір аймағын танып, тану аймағының ішіндегі немесе одан тыс жердегі нуклеотидтік тізбекті ыдыратады. Тану сайтының симметриясына және эндонукеазаның тану сайтының кесіндінің орналасу орнына байланысты рестрикцияны үш негізгі түрге (немесе класс) бөледі. Гендік инженерияда екінші типті рестриктазаны пайдаланады, өйткені қалғандарымен салыстырғанда екінші тәртіптегі симметрияға ие реттілікті біледі және тану сайтының шегінді кесінді жасайды.

Полимеразды тізбекті реакция әртүрлілігі : ПТР "ыстық" старт (hot-start PCR) - модификациясы түрінен бастау алады, оның мәні пробиркада қолайлы жағдай тумағанша реакцияны тоқтатып тұруы, отжигқа тән праймерлердің қамтамасыз етілуі. ПТР кері транскрипциясын (ПТР, RT-PCR) -амплификация үшін, яғни РНК белгілі жалғасын бөлу немесе идентификациялау үшін қолданылады. ПТР нәтижелерін "соңғы нүктесінде" талдау әдісі (End-point PCR) - бұл ПТР модификация түрі, яғни амплификациядан кейін флуоресценция нәтижелерін пробиркаларды ашпай көруге мүмкіндік береді. Осындай әдістердің бірі "FLASH" (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization -гибридизационды олигонуклеотидті зондтарды қолдану арқылы) әдісі.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.