Каллустық жасушаның өсу фазалары
Дәріс № 1 Кіріспе. Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
1. Биотехнологияның дамуы.
2. Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
Биотехнологияның пайда болуы және дамуы микроорганизмдерді қолдануға тікелей байланысты. Осыдан 6000 жыл бұрын көне Египет елдерінде және XIX ғасырдың ортасында Еуропа елдерінде микроорганизмдерді нан, қышқылды-сүт тағамдарын дайындау, спиртгі және т.б. алу үшін кеңінен қолдана бастады. Ерте заманнан дәстүрлі технологияда қолданылып келе жатқан микроорганизмдерге қарағанда, жоғарғы сатыдағы организмдердің жасушалық өсінділері биотехнологияның жаңа объектісі болып саналады. Олардың тіршілігіне негізделе отыра, биологиялық белсенді заттар, вакциналар, моноклональды антиденелер өндіріледі.
Жасушалық биотехнология -биотехнологияның аса маңызды бағыттарының бірі болып саналады. Ол негізінде жаңа объект -оқшауланған жасушаларды қолдануға бағытталған, яғни эукариоттық организмдердің жасушаларын немесе ұлпаларын, сонымен қатар өсімдік жасушаларының ғажайып қасиеті - тотипотенттікке негізделген. Бұл саладағы жетістіктер глобальды теориялық және тәжірибелік тапсырмаларды шешуге зор мүмкіндік туғызды. Осыған байланысты фундаментальды ғылымдар саласында мынандай күрделі дағдарыстар шешімін тапты: ұлпалардағы жасушалардың өзара байланысы, жасушаның дифференциялануы, морфогенез, жасушалардың тотипотенттігінің жүзеге асуы, рак жасушаларының пайда болуы және т.б. Тәжірибелік мақсаттарға қол жеткізу барысында: селекцияға, жануарлар жасушасын колдана отырып, дәрі-дәрмектік биопрепараттар және өсімдіктерден көп мөлшерде бағалы биологиялық метаболиттерді алуға, атап айтқанда, арзан дәрі-дәрмектер, сонымен қатар вируссыз өсімдіктерді өсіру, олардың клондық көбеюіне және т.б. аса көңіл аударылып отыр.
Жасушаларды организмнен тыс өсіруге болатыны туралы идеялар XIX ғасырдың аяғында байқала бастады. XIX ғасырдың аяғы мен XX ғасырдың басында неміс ғалымы X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Харбеландт (1902) өсімдіктер ұлпасы мен органдарының сахароза сіңдірілген сорғыш қағазда өсуін шапшаңдатуға алғашқы рет қадам жасады. Ешқандай нәтиже шықпаса да, бұл жүргізген жұмыстардың зор маңызы болды. Бұл зерттеулерде байқалған идеялар сол замандағы ғылымның дамуын анықтады және ондаған жылдардан соң олардың дұрыстығы дәлелденді. Ал жануарлар жасушасын жасанды қоректі ортада өсіру алғашқы per XX гасырдың басында жүргізілді. Зерттеушілер көп уақытқа дейін, өсімдік жасушаларын жасанды ортада өсіру барысында тиісті нәтиже ала алмады. Бұл салада алғашқы жетістіктер өткен ғасырдың 30-шы жылдарында алынып, сол ғасырдың 60-70-ші жылдарында өсімдіктер және жануарлар жасушаларын өсіру бағыты қарқындап дамыды.
XX ғасырдың 70-ші жылдарында жасушалық өсіндіні өсіруде маңызды жетістіктерге қол жеткізілді. Бұл кезде өсімдіктер протопластарын бөліп алу әдістері ойлап шығарылды, сонымен қатар сомалық жасушаларды будандастыру ашылды. Жоғарғы өсімдіктердің оқшауланған протопластары мен жакуарлардың жасушалық өсінділері, будандастыру және оларға генетикалық бөгде зат (жасушалық органеллалар, бактериялар) енгізу арқылы жасушалық конструкторлық объектіге айналды. Жасушалық конструкторлық әдістерді қолдану өсіндідегі продуценттік жасушалардың қасиеттерін жақсартуды көздейді, ал өсімдіктер жасушаларын қолданған кезде, жаңа қасиеті бар (өсімдік жасушасының тотипотенттігіне негізделген) өсімдіктердің түрін алуға мүмкіндік туғызады.
Қазіргі күні биотехнологияның үздіктері болып, АҚШ және Япония елдері саналады, бұл елдерде ауылшаруашылық, фармацевтік, тағам және өндірістік биотехнология салалары өте жақсы дамыған. Ал ферменттік препараттарды, аминқышқылдарын, белокты, дәрі-дәрмектерді өндіру бойынша, көп жетістіктермен көш ілгері дамыған болып Еуропа елдер (Германия, Франция, Ұлыбритания) және Ресей саналады. Бұл елдерде биотехнология жаңа техника және жоғарғы технологияның қолдануымен, тағы да биотехнологияның салаларындағы қарқынды түрде орындалған фундаментальды және тәжірибелік зерттеулерімен сипатталады.
Қазақстанда биотехнология саласының дамуы жасушалық өсінділермен тікелей байланысты. Қазақстан ғалымдары А.Қ. Бұлашев, Қ.Қ. Мұқанов және т.б гибридомды технологиясының негізінде көптеген антигендерге моноклональды антиденелерді алуды жүзеге асырды. Бүгінгі күні А.Қ. Бұлашев басқарған авторлар тобы өндіретін бруцеллез, туберкулез, лептоспироз және т.б антигендерге арналған моноклональды антиденелер тәжірибеде кеңінен қолданылады.
XX ғасырдың соңы, XXI ғасырдың басы, жасушалық биотехнологияның жаңа жетістіктерімен адам баласын таң қалдырады. Ерекше орын алатын сала ол - гибридомды технология. Моноклональды антиденелерді қолдана отырып, тек инфекциялық және рак ауруларын анықтап ғана қоймай, сонымен қатар лейкоз, гепатит В және стрептококкалық ауруларын емдеуге болады. Медициналық тәжірибеде фетальды жасушаларды, орталық жүйке жүйесінің және қалқанша без ақауларын емдеу үшін кеңінен қолданады. Жасушалық биотехнологияның табыстары биология, биохимия, медицина, ветеринария және т.б. салаларында кеңінен қолданылады.
Биотехнологияның болашағын және оның адам өміріндегі маңызын, жапон профессоры К. Сакагучи былай сипаттайды: ... не қаласаңыз соны микроорганизмдерден таба аласыз, олар ешқашан сізді алдамайды... Жануарлар мен өсімдіктер жаоушаларының күрделі, әлі толық зерттелмеген тұқым қуалау аппаратына әрекет жасау, биотехнологияның қолдану салаларын кеңейтеді және оның принципиальді басқа бағыттарын тудырады.
2 Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
Жасушалық биотехнолгияның негізі - жеке бөлініп алынған жасуша және ұлпа өсінділері. Клеткаларды толық меңгеру үшін оларды өсімдіктер, жануарлар мен адам организмдерінен бөліп алу және оларға организмнен тыс өсу үшін қолайлы жағдай жасау қажет. Жеке бөлініп алынған жасушалар мен ұлпаларды жасанды қоректі орталарда асептік жағдайда өсіру (in vitro) биотехнологияда кеңінен қолданылады.
Жалпы биотехнологиялық процестер жасанды ортада өсірілген микроорганизмдердің, өсімдіктердің, жануарлар мен адамдардың жасушалары және ұлпаларының биосинтетикалық потенпиалына негізделеді. Қазіргі уақытта бүкіл әлемде биотехнологияның дамуына көп көңіл аударылады, себебі басқа технологиялармен салыстырғанда биотехнологияның көп артықшылығы бар: биотехнологиялық процестер энергияны аз мөлшерде қажет етеді; ешқандай қалдықсыз; экологиялық таза технология. Бүгінгі таңдағы биологиялық технология, тек алдыңғы қатарлы жоғары технологиялық құрал-жабдықтарды қолдану арқылы жүзеге асады, сонымен қатар оның тағы бір ерекшелігі - зерттеулер климаттық жағдайларға тәуелсіз және шағын орын ала отырып, жыл бойы жүргізіледі. Осындай ерекшеліктермен жасуша мен ұлпа өсінділерінің технологиясы сипатталады.
Жасуша және ұлпа өсінділері адам тіршілігіне қажетті үш бағытта қолданылады.
Бірінші багыт:
:: жеке бөлініп алынған жасушалардан медицина және парфюмерияға, косметикаға қажетті екінші метаболиттік- өнімдер (алколоидтар, стериодтар, гликозидтер, гормондар, эфирлік майлар т.б.) алу;
:: жасушалық технологияның негізінді қажетті медициналық препараттар алынады (диосгенин, аймолин);
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, тағам өнеркәсібіне қажетті биологиялық қоспалар мен препараттарды алу.
Екінші багыт:
:: жасуша өсінділерін өсімдіктерді вирустық және басқа да агенттерден сауықтыру үшін қолдану;
:: өсімдіктердің микрокөбеюі арқылы бір жылда жалғыз меристемадан жүз мың өсімдіктерді алуға болады;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, адам мен жанурлардың инфекциялық ауруларына қарсы вакциналарды алу;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, инфекциялы ауруларды анықтау үшін қолданылатын диагностикумдарды алу.
Үшінші багыт:
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, селекциялық жұмыстардың нәтижесінде жылдам өсетін, қолайсыз факторларға төзімді өсімдіктерді алу;
:: оқшауланған протопластарды қоса (құйлып қосылу) отыра, өсімдіктердің жаңа түрін алу;
:: гендік инженерияға негізделіп, протопластарға бөгде генді енгізе отыра, тұқымқуалаушылық қасиеті бар өсімдіктер алуға болады;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, вирустық аурулардың патогенезін толық зерттеуге болады;
:: жасушаларды организмнен тыс (in vitro) пробиркада үрықтандыру.
Дәріс № 2 Жасушалық биотехнологияның негізі - жасуша өсіндісі
1. Жасуша өсіндісі ұғымы.
2. Жасушалық өсінділердің классификациясы.
3. Жасушалық линиялардың кейбір танымалы түрлері
Жасушалық технологияның негізі - жануарлар мен өсімдіктерден алынатын жасуша өсінділері.
Жасуша өсіндісі дегеніміз - ол биосистема жасушаларының организмнен тыс (in vitro) жасанды ортада өсіп көбеюі.
Жасуша өсіндісін өсіру әдістемесі жиырмасыншы ғасырдың 40-шы жылдарынан кейін өркендеп дами бастады. Ол антибиотиктардың ашылуымен тікелей байланысты, себебі антибиотиктарды қолдана отыра, жасуша өсінділерінің бактериялармен ластануына кедергі жасауға болады. Сонымен қатар жасушалық биотехнологияның дамуына өз үлесін тигізген. Коккингтың (1960) жеке жасушаларды бөліп алу және өсіру әдістемелерін табуы, ал Зиммерманның (1984) оқшауланған протопластарды электрдің көмегімен қосу туралы ғылыми ашуы болды.
Жасуша өсінділерінің ашылуы көптеген глобальді, теориялық және тәжірибелік проблемаларды шешуге мүмкіндік туғызды. Фундаментальдік ғылымдар саласында өте күрделі жайт - ұлпалардағы жасушалардың өзара қатынасын, жасушалық дифференциялауды, морфогенезді анықтауға, жасушалардың тотипотентігінің жүзеге асуына және ракты жасушалардың пайда болу механизмін зерттеуге мүмкіндік жасады.
Тәжірибелік салада аса көңіл аударылатын бағыттар: селекция; көп мөлшерде биологиялық заттарды алу; вируссыз өсімдіктерді өсіру; өсімдіктердің клондық көбеюі; өсімдік, жануарлар мен адамдардың жеке жасушаларын өсіру.
Жасуша өсінділерінің көздері ол биосистемалар: өсімдік, жануарлар және адам жасушалары мен ұлпалары (сурет 2).
Жасуша өсіндісін жануар мен адамның кез келген органы мен ұлпасынан алуға болады. Бірақ эмбрионнан алынған жасуша өсіндісі өзінің шапшаң өсу қабілетімен ерекшеленеді. Көбінесе осы мақсатпен жануарлар эмбрионының бүйрегі, терісі, тимусы және т.б. органдары мен ұлпалары алынады.
1966 жылы ұлпалық өсінділерге бірыңғайланған терминология қабылданды. Оның негізгі тәртібі төменде көрсетіледі. Ұлпа өсіндісі - бұл жүйеде көп жасушалы организмнен бөлініп алынған жасушалар, ұлпалар және органдар 24 сағат тіршілігін сақтап, in vitro жағдайда көбейе алады. Биологиялық объектінің түріне байланысты келесі түрлерге жіктелінеді: 1) жасушалар өсіндісі - бұл термин, in vitro жасушалардың өсуін көрсетеді, бірақ өсіндіде жасушалар ұлпа түзбейді; j 2) ұлпа немесе органдар өсіндісі - бұл термин ұлпаның, орган ұрықтары мен мүшелерінің кұрылыстық дифференциясын сақтай отыра, in vitro өсуін қолдауды білдіреді.
Биологиялық тәжірибеде қолданылатын жасушалық өсінділердің классификациясы:
Каллустық жасуша - жасанды ортада өсірілетін өсімдік жасушасының басты түрі. Каллустық жасуша-бөліну арқылы каллустық ұлпаны немесе каллусты түзеді. Осы процесс жоғарғы өсімдіктерге тән жасушалық дифференциялануды көрсетеді. Каллусты алу үшін өсімдіктің әртүрлі мүшелерінің кесіндісін (эксплант) жасанды ортада in vitro өсіреді.
Алгашқы жасуша өсіндісі - ол тікелей организмнен алынып, in vitro өсірілген жасушалар (3-5 тәулікте пайда болады). Мұндай өсіндіні адам мен жануардың кез келген органынан немесе ұлпасынан алуға болады.
Жоғарыда көрсетілгендей, алғашқы жасуша өсіндісін эмбрион органдары мен ұлпаларынан алған жөн, себебі эмбрион жасушалары жасанды ортада жылдам көбейеді. Осы мақсатпен көбінесе тауық эмбрионы, сүткоректілердің эмбрионынан және төлдерден алынатын бүйректер, тері, тимус қолданылады.
Субкультуралар - ол алғашқы жасуша өсіндісінен бірінші пассаж (қайталап егу) жасалғаннан кейін алынады (2-3 тәулікте пайда болады), көптеген жасушалық линиялардан тұрады.
Субкультураны барлық алғашқы жасуша өсінділерінен алуға болады. Өзінің биологиялық қасиеті бойынша алғашқы жасуша өсіндісінен қалыспайды, сонымен қатар олар экономиялық жағынан тиімді. Субкультураны 2-5 пассаж жасау арқылы алады, кейбір өте сирек жағдайларда 8-10 пассажға дейін жасалады.
Қайталап өсірілген жасуша өсінділері - ол, организмнен тыс шексіз өсуге қабілетті жасуша өсінділері. Тұрақты өсінді деп - ол үш күн сайын, кемінде 70 ретке дейін пассаж жасалынған, қайталап өсірілген жасушаны айтады. Қайталап өсірілген жасуша өсіндісінде жасушаның пішіндері бірдей, құрамы гетероплоидты (алғашқы жасуша өсіндісінде ол диплоидты), олардың кейбіреулерінің онкогендік қасиеттері бар. Осыған байланысты мұндай жасуша өсінділері адамдардың вирустық ауруларына қарсы вакциналарды алу үшін қолданылмайды.
Қайталап өсірілген жасуша өсінділерінің артықшылығы: оларды дайындау оңай және арзан, олардың көптеген вирустарға, сезімтал болуында (вирустарды анықтау үшін қолданылады). Олардың кемшілігі қатерлі ісікті тудыру қасиеті болып саналады.
Диплоидты жасуша өсінділері дегеніміз морфологиялық бірқалыпты жасушалар популяциялары. Бұл жасуша өсіндісінің тіршілігі шектеулі, пассаж кезінде өзінің кариотипін сақтап қалады, контаминанттардан таза. Диплоидты жасуша өсінділерін алғашқы жасуша өсіндісінен алады, олардың кайталап өсірілген жасушалардан айырмашылығы диплоидты кұрамын сақтап қалуы және тіршілігінің шекті болуында. Пассаж саны 40-60 болады, содан кейін бөлінуші жасушалар саны күрт азайып, олар өледі.
Диплоидты жасуша өсінділерінің артықшылығы: 10-12 күн ауыстырылмаған қоректі ортада тіршілігін сақтай алады, жұмасына бір рет қоректі ортасын ауыстырған кезде тіршілігін 4 жұма сақтайды.
Өсіру тәсіліне байланысты жасуша өсінділері екі түрге бөлінеді: дара қабатты жасуша өсінділері; суспензиялық жасуша өсінділері.
Дара қабатты жасуша өсіндісі деп қоректі ортаның беткі қабатында пайда болған жасуша өсіндісін айтамыз.
Организмнің көптеген жасушалары суспензиялық ортада өсуге қалыптаспаған, сондықтан да оларды өсіру үшін қатты бетті орта қажет. Ең алғаш рет, жасушаларды өсіру әдісі пайда болған кезде, оларды плазманың бетінде өсірді, бүгінгі күні жасушаларды өсіру үшін шыны, палстиктен жасалған ыдыстар қолданылады. Жасушалар өсу үшін өздеріне қоректік заттарды қажет етеді.
Суспензиялық жасуша өсіндісі дегеніміз жасушалардың бос кеңістікте өсіп-көбеюі. Мұндaй жасуша өсіндісін алу үшін суспензияны үнемі араластырып отыру қажет. Қазіргі күні суспензиялық жасушаларды алу толық дамыған, соның нәтижесінде белгілі бір қасиеттері негізделінген жасушаларды алуға болады.
Сүтқоректілердің көптеген жасушалары белгілі бөліну дәрежесінен кейін тіршілігін жояды. Мысалы: адамның тері жасушалары тіршілігін жойғанға дейін 50-100 рет бөлінеді. Мынандай тұжырым, жасуша өсіндісіндегі өсу шектілігі, жануардың тіршілігінің шектілігімен тығыз байланысты. Себебі жылдам қартаятын және өлетін ауру организмнен алынған жасушалардың тіршілігі қысқа. Кейбір уақытта өсіндіде, кенеттен мутантты жасушалар пайда болады, олардың тіршілігі шексіз. Мұндай жасушалар үздіксіз көбейіп, жасушалық линия түзеді, 2-ші кестеде тәжірибеде жиі қолданылатын жасушалық линиялар түрлері сипатталған. Бұл жасушалар қатты бетте өседі, дара қабат түзгеннен
Кесте 2- Жасушалық линиялардың кейбір танымалы түрлері
Жасушалық линия
Жасуша түрі, алынған организм
3Т3
Фибробласт (тышқан)
ВНК 21
Фибробласт( сириялық атшалман)
Hela
Эпителия жасушасы (адам)
PTK 1
Эпителия жасушасы (кенгуралық егеу құйрық)
L6
Миобласт ( егеу құйрық)
PC 12
Хромаффиндік жасуша (егеу құйрық)
SP 2
Плазматикалыұ жасуша (тышқан)
кейін өз тіршіліктерін жояды. Жоғарыда сипатталып өткен жасушалық линиялардың маңызы, олар бір түрлі жасушалардың алыну көзі болып саналады. Сонымен қатар мұндай жасушалар - 70° С, активті түрде өте ұзақ сақталады. Жасушалық линиялардың бір тектес болуын клондау әдісі арқылы нығайтуға болады. Клон - дегеніміз бір жасушадан туындаған жасушалар популяциясы.
Дәріс № 3 Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын қоректі орталармен ерітінділер
1. Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын ерітінділердің түрлері.
2. Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын қоректі орталардын құрамы.
1.Жиырмасыншы ғасырдың 70-ші жылдары жасуша өсіндісін алу аса маңызды ғылыми жаңалықтардың бірі болды. Ол кезде көптеген ғалымдар, жасушалардың организмнен тыс өсуін ғылым мен сиқырдың әрекеттесуі деп қарастырды. Жасушалық биотехнологияның өркеңдеп дамуы, көптеген сұрақтардың жауабын тауып түсіндіре білді.
Плазманың орнына пластмасалы табақшалар мен құрамында белгілі бір мөлшерде тұз қоспалары, аминқышқылдар және витаминдер бар қоректі орталар қолданыла бастады. Бірақ ол кезде қоректі орталардың құрамында, толық тазармаған: жылқы сарысуы, тауық эмбриондарының өңделмеген экстрактары, сондай ақ бұзау эмбрионының сарысуы секілді биологиялық заттар болды, Көптеген қарапайым жасуша өсінділері үшін мұндай қоректі орталар бүгінгі күнге дейін қолданылып келеді.
Жасушалар дайындалған қоректі орталар енгізгеннен кейін, оларға температуралық қолайлы жағдай жасау қажет. Жасушалар пластмасты ыдыстың қабырғасына жабысып, бөлінуді бастайды. Қолайлы ортада жасушалар өскенде: адаптациялық, логарифмдік өсу, стационарлық және ескіру (жасушаларың өлуі) түрінде бірнеше фазадан өтеді. Көбею арқылы жасушалар пластмасаның бетіне жайылады, оны толық жапқан кезде бір-бірімен байланысып бөлінуін тоқтатады (контакты ингибиция). Ыдыстың бетінде бір жасушаның өсіндісі көбінесе 3-5 тәулік арасында түзіледі, түзілу жылдамдығы келесі жағдайларға байланысты болады: ұлпаның түріне; оны алған сүтқоректінің, өсімдіктің жасына; қоректі ортаның сапасына; егу кездегі жасушалар мөлшеріне (концентрациясына) және т.б. факторларға байланысты.
Жасуша өсіндісін дайындау кезінде қолданылатын ерітінділер үш топқа бөлінеді:
жасуша өсіндісін дайындауға қажетті ерітінділер;
жасушалар тіршілігін in vitro жағдайында сақтайтын ерітінділер;
жасушаларды егуді қамтамасыз ететін ерітінділер.
Жасуша өсінділерін дайындаған кезде Хенкс және Эрла ерітінділері кеңінен қолданылады. Олар бидистелденген суда әртүрлі тұздар мен глюкоза қосьш дайындалады.
Тұзды ерітінділер қоректі орталарды дайындау үшін қолданылады. Себебі олар рН-тың тұрақтылығын, жасушаларға қажетті осмостық қысымды қамтамасыз етеді және бейорганикалық заттардың концентрациясын тұрақтайды. Сонымен қатар оларды жасушаларды дайындау кезінде шаюға, жасушаларды сұйылтуға қолданады (кесте 3).
Жасушаларды өсіру кезінде, жасуша аралық заттарды ыдырату үшін ферментті ерітінділер қолданылады. Жасуша өсіндісін өсіру үшін қолданылатын қоректі орталар табиғи және жасанды (синтетикалық жоне жартылай синтетикалық) болып екіге бөлінеді.
Кесте 3- Хенке және Эрла ерітінділерінің құрамы
Ерітінділер
Су (1 л)
Тұздар
Басқа қосылыстар
Хенке
Бидистилденген
NaCl, KCl; MgSo4, CaCl2, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3
Глюкоза, фенолрот
Эрла
Би дистилденген
NaCl, KCl; MgSo4, CaCl2, Na2HPO4, NaHCO3
глюкоза
2.Табиғи қоректі орталар трды ерітінділерден, адам немесе жануар сары суларынан, ұлпалық экстрактан, амниондық сұйықтықтан тұрады.
Жасушалық биотехнология саласында жасанды қоректі орталар кеңінен қолданылады.
Жартылай жасанды қоректі орталарға әртүрлі белокты препараттардың ферментті підролизаттары жатады: лактальбуминнің гидролизаты, бұлшық ет гидролизаты, гемгидролизаты және т.б.
Кеңінен қолданылатын синтетикалық қоректі орталарға 199 ортасы және Игла ортасы жатады. Олардың құрамына 60 артық компоненттер кіреді: 20 аминқышқылдары, 17 витаминдер, нуклеин қышқылының компоненттері, липидтер көздері, 8 минералды тұздар және басқа да заттар болады (кесте 4). Синтетикалық қоректі орталарды, тұзды ерітінділерде жоғарыдағы химиялық заттарды белгілі мөлшерде еріту жолымен дайындайды.
Барлық қоректі орталардың құрамына, оның рН анықтау және бақылау үшін 0,002% фенол қызыл индикаторының ерітіндісін қосады. рН төмендегенде ортаның түсі сарғыштанады, бұл жасушалар метаболизмінің өнімдерімен ортаның қышқылдануының көрсеткіші. Мұндай жағдайда қоректі ортаны ауыстырады. Индикаторлардың көмегімен қоректі орталарға баға беруге болады.
Тұзды ерітінділердің және қоректі орталардың рН реттеу үшін 7,5% бикарбонат натрий және 3% сірке қышқылы ірітінділері қолданылады.
Жануарлар және адам жасушаларын өсіруге қолданылатъш барлық қоректі орталарды екі топқа бөледі: өсу қоректі орталары, жасушалардың тіршілігін және көбеюін қамтамасыз етеді, құрамында 2-10% қан сары суы болады, бастапқы күндері жасушаларды өсіру үшін қолданылады; тіршілігін сақтап тұрушы қоректі орталар, жасушалардың тек тіршілігін сақтайды, көбеюін қамтамасыз етпейді, құрамында сары суы болмайды, жасуша өнімдерін лабораторияда ұзақ сақтау үшін қолданылады.
Дәріс №4 Өсімдік жасушасы және ұлпасының өсінділері
1.Каллустық жасушаның өсу фазалары.
2. Каллустық жасушалар мен ұлпалардын қасиеттері.
1.Каллустық жасуша дегеніміз - ол қолайлы ортада өсірілген өсімдік жасушасы. Каллустық жасушаның өсуі жалпы эволюция заңдылығына сәйкес. Сондықтан каллустық жасушаның өсуі S-тәрізді қиғаштан тұрады (Сакс бойынша өсу қиғашы) және бес фазамен сипатталынады.
Бірінші фаза - латентті фаза немесе лаг-фаза, мұнда жасушалар бөлінуге дайындықта болады.
Екінші фаза - экспоненциальді фаза (логарифмдік фаза) жасушалардың бөлінуі шапшаң түрде жүріп, жас жасушалардың саны артады.
Үшінші фаза - сызықтық фаза, каллустық массанның ұлғаюмен сипатталады.
Төртінші фаза - жасушалардың бәсең өсуі, мұнда жасушалардың бөлінуі күрт төмендейді.
Бесінші фаза - стационарлық фаза мұнда бөлінген жасушалар мен өлі жасушалар саны теңесіп, каллус массасы тұрақты болады. Бұл фазадан кейін каллус өз тіршілігін жояды.
Жасанды қоректік ортада өсірілген каллустық жасушалар мен ұлпаларда, табиғатына тән қасиеттер сақталынады. Мысалы: суыққа төзімділігі, абиотикалық факторларға (температура, тұздануға, фотокезеңдік реакцияларға) төзімділігі, әсіресе басты маңыздылығы - ол екінші метаболиттерді синтездеу қасиеті. Сонымен қатар жалпы каллустық жасушаларға тән қасиеттер мен бірге тек оларға тән ерекшеліктер пайда болады. Ең басты популяциялық ерекшеліктер -физиологиялық асинхрондық және генетикалық гетерогендік.
Физиологиялық асинхрондық - жыныссыздық популяцияның ең жиі кездесетін ерекшелігі. Ол мынаған негізделеді, уақыттың белгілі бір мезгілінде жасушалар әртүрлі өсу фазасында болуы. Мысалы: бір жасушалар бөлінеді, екіншілері өседі, кейбіреулері қартаяды. Сондықтан мұндай ұлпаның физиологиялық жағдайы, жасушалардың көп мөлшері қандай кезеңде болса, сонымен сипатталатын болады.
Физиологиялық асинхрондықтықты келесі себептерге байланысты пайда болады: өсімдіктің генотипіне, түріне, сортына, эксспланттың ерекшелігіне; өсіру жағдайларына (стресстар); эндогенді және экзогенді гормондар мөлшеріне; жасушалар мен клондардың генетикалық гетерогендігіне, сонымен қатар in vitro жағдайында митозда болатын аномалияларға; физикалық факторлардың (температура, сәуле, аэрациялау) әсеріне тәуелді.
Генетикалық гетерогендік - ол сомалық жасушалар популяциясының қасиеттері (геномның тұрақсыздығы, генетикалық гетерогенділігі). Жасуша культураларында әрқашан да полиплоидия, ансуплодия, хромосомалық аберрация, гендік мутациялар пайда болады. Бірақ генетикалық гетерогендікті кемшілік деп қарастыруға болмайды, ол популяцияның арнайы жағдайы деп есептелінеді, сонымен қатар адаптацияланудың негізі болып қарастырылады.
Генетикалық гетерогендіктің пайда болу себептері; алынған материалдың генетикалық гетерогендігі; өсімдіктен алғаш рет бөліп алу кезінде коррелятивті байланыстардың бүзылуы; ортаның компоненттерінің әсері (экзогенді гормондар мутагенді әсер етуі мүмкін); ұзақ уақыт субкультурлау, осы кезде генетикалық өзгеріске ұшыраған каллустық жасушалар жинақталады.
Биология ғылымындағы аса күрделі проблемалардың бірі - ол көп клеткалы организмдердің дамуы. Осы процесті зерттеу үшін, қарапайым модель ретінде жасуша және ұлпа өсінділері қарастырылады. Алғашқы дедифференциалаудан кейін каллустық жасушаның дамуы әртүрлі бағытта жүруі мүмкін. Біріншіден бұл процесс екінші дифференциялау деп қарастырылады. Мұнда каллуста жеке дифференцияланған жасушалар пайда болады. Олардың белгілі бір құрылысы және қызметі болады. Мысалы: эпибласталардың пайда болуы (екінші метаболиттер жинақталынады). Бұл каллустық жасушаның ең қарапайым дифференциялануының күрделі түрі. Ол гистологиялық дифференциялану, бұл каллуста белгілі органдардың (млечники,талшықтар, ксилема элементтері т.б.) түзілуімен сипатталынады. Екінші дифференциялаудың ең күрделі түрі- органогенез, яғни органдардың түзілуі, сомалық эмбриогенезде-сомалық жасушалардан эмбриоидтардың, ұрық тәрізді биполярлы структуралардың пайда болуы.
Дифференциялаудың барлық түрі, тотипотенттік қасиет болғанда ғана жүреді.
Екінші диференциациядан өтетін каллустық жасушалар бірыңғай белгілермен ерекшеленеді. Ондай жасушалар - инициалды-жасушалар- басқа каллустық жасушалардан оқшау, жасушалық қабырғасы жуандаған жасушалар. Сонымен қатар, оларға мына белгілер тән: ядроның ұлғаюы, заттық қордың мол болуы, вакуольдердің өлшемінің азаюы және гексоздар ыдырауының шапшаңдауы.
Дедифференциядан өткеннен кейін жасушалар бірнеше жолдар арқылы дамиды.
Бірінші жол - өсімдіктің екінші регенерациясы, яғни жасуша, ұлпа, органдар деңгейінде дифференциацияның өтуі.
Екінші жол - жасушалардың екінші дифференциялық және регенерациялық қабілетінің жоғалуы, мұнда тұрақты дедиференциация байқалады, яғни жасушалар гормонсыз ортада өсу қабілетіне ие болады (рак жасушаларына айналуы).
Үшінші жол - физиологиялық цикл (қартаюы, өлуі). Бұл кезде жасушалар екіншіі дифференциалаудан өтеді, бірақ морфогенезге әкеліп соқпайды, тек кәрі каллустық жасушалардың пайда болуын тудырады. Каллустық ұлпада морфогенез процесі деп - құрылыстық структуралардың, ретсіз массадан пайда болуын айтады. Морфогенездің негізгі екі түрі бар (сурет 3).
Сомалық эмбрионогенездің органогенезден айырмашылығы меристеманың қандайда болсын бір бөлігінен (тамыр, бүршік) ұрық пайда болып, одан тұтас өсімдік дамиды.
Жеке сомалық жасушаның тұгас өсімдік құрай алатын қабілеті тотипотенттік қасиеті болып саналады.
Сомалық эмбриогенез кезінде инициаль-жасуша зиготаның түзілуінің негізі болады. Инициаль-жасуша біраз уақыт лаг-фазада болады, себебі осы уақытга жылдам бөліну, қайта кұру процестеріне дайындық өтеді.
Сонымен қатар, жасушалар бытырау (дробления) арқылы бөлініп, көп мөлшерде изодиаметрлі жасушалар түзеді. Бұл жасушалар I органогенез процесінде меристема ошағы, ал сомалық эмбрионогенезде - глобулярлы проэмбриоидтар деп аталынады. Глобулярлы проэмбриоидта биполярлы эмбриоидты структуралар дамиды.
Каллусты жасушадан сомалық эмбриоидтардың түзілу кезеңдерінің бірнеше түрлері болады. Солардың кейбір түрлері төменде көрсетіледі: глобулярлы; жүректі; торпеда тәрізді; сомалық ұрық.
Дәріс № 5 Жеке жасушаларды өсіру технологиясы
1. Жеке жасушаларды өсіру.
2. Жеке жасушаларды өсіру үшін колданатын коректі орталардын құрамы.
1.Жасушалық технология саласында аса маңызды бағыт -жеке жасушаларды aлy технологиясы. Жеке келткаларды өсімдіктер, жануарлар мен адам организмдерінен алуға болады. Олардың басты маңызы, жасушалық селекцияда гибридті жасушаларды таңдау және клондау болып табылады. Сонымен қатар оларды генетикалық және физиологиялық зерттеулер үшін қолданады. Мысалы: генетикалық біркелкілікті зертеу үшін, гетерогенді экспланты қолданғаннан, бір жасушаның клонын қолданған оңай.
Бірақ жеке келткаларды өсіру өте қиын, себебі жалғыз жасуша каллустық жасуша өсетін жағдайларда көбеймейді. Сондықтан жалғыз жасушаларды өсіру үшін арнайы әдістер қарастырылады. Олардың барлығы кондицтондық факторларға (бөлінуші жасушалардың метаболиттері) негізделінген. Егер ортаға бір жасушаны немесе олардың аз мөлшерін енгізетін болса, онда жасушалар ортада қажетті затгардың жетіспеушілігінен бөлінбейді. Сондықган да жасушалардың бөлінуіне қажет факторлардың концентрациясын жоғарлатуы қажет. Ол мына әдістер арқылы жүзеге асады:
Няня ұлпалық әдіс-жалғыз жасушалар жанындағы Няня ұлпасынан бөлінген кондициондық факторды қолданады;
ортаны байыту - белсенді бөлініп жатқан жасушалардың ортасын қосу арқылы;
азықтандыру қабаты әдісі - жалғыз жасуша тектес өсімдік жасушалары белсенді бөлініп жатқан суспензиялық ортаны қолдану;
жеке жасушаларды бай қоректік орта бар микротамшыда өсіру.
Тәжірибеде жеке жасушаларды өсірудің маңызы оларды қазіргі күнгі талапқа сай әртүрлі технологияда қолдану. Медицина саласында гибридті жасушаларды алу болып саналады. Әсіресе гибридомды технологияны атап өтуімізге болады, себебі қазіргі күні біздің елімізде де гибридті жасушаларды қолдану арқылы көптеген гылыми жаңалықтар бар. Жеке жасушаларды клондау арқылы, ерекше биопрепараттарды алуға болады. Ол препараттар зілді ісікті (рак), кеңінен таралған инфекциялық ауруларға диагноз қою үшін кеңінен қолданылады.
Биология саласында жеке жасушаларды өсіру өсімдіктердің гибридті жасушаларын алуға, оларды зертгеуге толық мүмкіндік береді.
Оқшауланған жасушалар мен ұлпалар көп компонентті қоректік орталарда өсіріледі. Олардың кұрамы алуан түрлі болуы мүмкін, бірақ міндетті түрде өсімдіктерге қажетті макро-микроэлементтер, көмірсулар, витаминдер, фитогормондар және олардың жасанды аналогтары болуы қажет. Көмірсулар (көбінесе сахароза немесе глюкоза) қандайда бір қоректі ортаның құрамында 2-3% мөлшердей болады. Олар қоректі компоненттер ретінде өте қажет, себебі көптеген каллустық ұлпалар хлорофилдың болмауынан автотрофты қоректенуге қабілетті емес. Сондықтан оларды күн сәулесі аздап түсетін немесе қараңғы жағдайда өсіреді. Тек мандрагора, амарант және кейбір өсімдіктердің каллустық ұлпасы жарық жерде өседі. Қоректік орталардың құрамында міндетті түрде ауксиндар мен цитокининдер болуы керек, себебі ауксиндер эксплант жасушаларының дедифференциялануын тудырса, ал цитокининдер жасушаның бөлінуін туындырады.
Қоректі орталардың құрамында нитраттардың, амоний, калий, фосфат иондарының көп мөлшерде болуы жасушалардың жылдам өсуін қамтамасыз етеді. Ал қоректі заттардың жетіспеушілігі жасушалардыңщ өсуін және екінші метаболиттердің синтезін бәсеңдетеді.
Дара қабатты каллустық ұлпаны өсіру үшін қолданылатын қоректік орталарды дайындау кезінде теңіз балдырларынан алынатын тазартылған агар-агар - полисахаридты қолданады. Кеңінен қолданылатын қоректі орталар 5 - кестеде келтіріледі.
Мурасиг және Скуг ортасы - ең жан-жақты орта. Ол каллустың түзілуі үшін, каллустың ретсіз өсуін қамтамасыз ету, сондай-ақ көптеген өсімдіктердің морфогенезін индукциялау үшін қажет.
Гамборг және Эвелег ортасы бұршақты, дәнді өсімдіктердің жасушалары мен ұлпасын өсіруге өте қолайлы. Уайт ортасы тамырдың дамуын және регенерациядан кейін, сабақгың қалыпты дамуы қамтамасыз етеді, ал Нич және Нич ортасы тозаңдық өсінділерінде андрогенезді индукциялайды.
Бүгінгі таңда кейбір өнеркәсіптер, дайын ұнтақ түрінде Мурасиг-
Скуга, Уайт, Хеллер орталарын шығарады. Бұл орталардың құрамында барлық қажетті заттар болады, тек өсуді реттеуші факторлар: сахароза және агар болмайды. Егер, зерттеу барысында қоректі ортадағы компоненттердің мөлшерін өзгерткен кезде, сахароза мен агардың қажеттілігі шамалы болады.
Дәріс № 6 Жасушалар мен ұлпаларды өсіруге қойылатын талаптар.
1. Жасушалар мен ұлпаларды өсіруге қойылатын талаптар
2. Өсінділерді ұзақ өсіру
1.Оқшауланған (изолированные) жасуша мен ұлпаларды стерильді жағдайда, жасанды қоректі орталарда өсіру (in vitro) - оқшауланған ұлпаларды өсіру әдісі деп аталады.
Барлық биосистеманың өсінділеріне бірыңғай талаптар қойылады.
Асептика. Жасуша мен ұлпаларды бөліп алу және өсіру арнайы боксте, бөлмелерде стерильді құрал - жабдықгарды қолдану арқылы өтуі қажет. Жасушалар және ұлпалармен in vitro жүргізілет жұмыстардың барлығы асептикалық ламинар - бокста немесе асептикалы бөлмелерде атқарылады. Асептикалық бөлмелері ультракүлгін шамдардың көмегімен залалсыздандырылып, онда стерильді киімдермен жұмыс жасайды. Жұмыс үстелдері және құралдар жұмыс жасар алдында қосымша спиртпен сүртіледі.
Фольгаға оралған таза ыдыстармен құралдарды, қағаздарды, мақтаны кептіру шкафтарында құрғақ ыстықтың әсерімен 160°С температурасында 1,5-2 сағат залалсыздандырады. Қоректі орталар мен ерітінділер автоклавттың (120°С, 15-20 мин) көмегімен залалсыздандырылуы қажет. Егер автоклавтау кезінде қоректік орталардың құрамында жылдам ыдырайтын заттар болатын болса, оларды бактериалық сүзгі арқылы залалсыдандырады.
Қоректі орталар. Оқшауланған жасушалар мен ұлпаларды көп компонентті қоректі орталарда өсіреді. Олар құрамы бойынша бір-бірінен айырмашылығы бар болады, бірақ барлығының құрамында биосистемаларға қажет макро-және микроэлементтер, көмір сулар, витаминдер болуы қажет. Сонымен қатар адам мен жануарлардың оқшауланған жасушалары мен ұлпаларына сарысу, ал өсімдіктер культураларына фитогормондар қажет.
Қоректі ортаның құрамында нитратар, калийдің аммониясы, фосфат иондары неғұрлым көп болса, соғұрлым жасушалар саны жылдам көбейеді. Ортада қоректі заттардың тапшы болуы, жасушалардың өсуін және екінші метаболизмді тежейді.
Физмкалық факторлар. Жасушалар мен ұлпалардың in vitro өсуінде физикалық факторлардың (сәуле, температура, аэрация, ылғалдылық) әсері зор.
Сәуле. Көптеген каллусты жасушалар жарық аз түсетін немесе қараңғы жағдайларда өседі, себебі олардың фотосинтездік қабілеті болмайды. Оған қарамастан сәуле морфогенезді және екінші синтезді шапшаңдатушы фактор ретінде қарастырылуы мүмкін. Сондықтан сәуле көзі ретінде люминесцентті шамдарды қолданады.
Температура, Жануарлар жасушалаларының температуралық көрсеткіштегі олардың алу көзіне байланысты.
Каллустық өсінділер үшін 26°С оптимальды температура болып саналады. Кейбір өсімдіктердің каллустары 32°С температурада жақсы өседі. Бірақ морфогенездің индукциясы төменгі температураларда өтеді (18-20°С). In vitro-жағдайында температураның жасушалардың метаболизміне қалай әсер ететіндігі аз зерттелген.
Аэрациялау. Суспензиялық өсінділерді өсіру кезінде аэрацияның маңызы зор. Әсіресе үлкен көлемді ферментерларда жасушаларды өсіру кезінде, оларды ауамен қамтамасыз ету өте қажет.
Жасушаларды кішкене көлемді ыдыстарда (колбада) өсірген кезде, оларды үнемі шайқау арқылы аэрациялайды.
Ылғалдылық. Өсінділер өсетін жерлерде ылғалдылық 60-70 болуы керек. Сонымен қатар жасушалар мен ұлпаларды өсіру көптеген факторларға тікелей бағынышты, олардың әсерлері толық анықталмаған. Сондықтан жасушалардың жаңа түрін өсіру ортасына енгізген кезде, олардың өсуіне және физиологиялық қасиеттеріне физикалық факторлардың қалай әсер ететіндігін зерттеу қажет.
2.Жасушалық технология саласында жасушаларды in vitro өсіру ғана емес, сонымен қатар оқшауланған жасушаларды ұзақ сақтауға да көп көңіл бөлінеді.
Лабораторияларда жасуша өсінділерінің тіршілігін, үнемі пассаж (қайталап егу) жасау арқылы сақтап отырады. Пассаж жасау үшін, дара қабаты толық дамыған, 2-3 тәулік жасы бар жасуша өсіндісін таңдап алады. Қоректі ортаны бөліп алғаннан кейін жасушалық дара қабатты жылы күйіндегі 0,02 % версен ерітіндісімен толық жабады. Версеннің әсерінен жасушалар домалақтанып, шыны бетінен босайды. Босаған жасушаларды жайып бөліп алып, қалған жасушаларға өсу қоректі ортасын қосып (80-200 мың жасушаға 1 мл), термостатта 37°С температурасында 3-4 тәулік дара қабат түзілгенше өсіреді. Жасушаларды өсіру үшін қолданылатын қоректі орталардың түрі жасушалардың шығу тегіне байланысты болады.
Жасуша өсінділерін үнемі қайталап егу арқылы олардың тіршілігі сақталынады.
Жасуша өсінділерін өсіру кезінде арнайы жағдай жасап қана қоймай, сонымен қатар ыдыстарды да дайындай білу қажет. Қолданылатын ыдыстың сапасы жасушаларды жасанды орталарда өсіру кезінде өте маңызды. Сондықтан қолданылатын ыдыстар стерильді, майсыздандырылған, токсигендік қасиетінің болмауы. Жасуша өсінділерін өсіргенде, пассаж жасалғанда аса көңіл аударатын мәселе - ол қолданылатын судың сапасы.
Лабораторияларда дистилденген бидистилденген, немесе
деионизацияланған сулар қолданылады.
Жасушалық биотехнологияда қолданылатын жасуша өсінділерін жиі консервілеу арқылы сақтауға болады. Себебі жасуша өсінділерін пассаж жасау арқылы сақтаған кезде, олардың бактериялармен ластануы және генетикалық өзгерістер тууы мүмкін.
Дәріс №7 Сомалық будандастырудың генетикалық негіздері
1. Сомалық будандастырудың генетикалық негіздері
1.Сомалық будандастыру дегеніміз - хромосомды, ядро және органеллалар гендерін генетикалық рекомбинацияға шалдықтыру жүйесі. Мысалы: оқшауланған протопластардың құйылып қосылу арқылы жүзеге асыруға болады. Осының нәтижесінде жасушалардың гибридті линиялары және өсімдіктердің сомалық гибридтері пайда болады.
Алғашқы рет жасанды түрде протопластардың жабысуын 1970 жылы Коккинг өзінің әріптестерімен дәлелдеген болатын.
Сомалық будандастыру нәтижесінде жаңа генотиптер, өсімдіктердің жаңа түрлері туды. Сомалық будандастыру термині алғашқы рет 1974 жылы Дж. Мельхерсом енгізді. Оның мағынасы- сомалық жасушалар протопластарының қосылуы.
Жоғарғы организмдер жасушаларын, бір-біріне Сендай вирусыньн көмегімен қосады. Себебі оның әсері цитоплазмалық мембрана белогінің гидролизмен тікелей байланысты.
Өсімдіктер, бактериялар және саңырауқұлақтар жасушаларын сомалық гибридтеу алдында, бірінші жасуша қабырғасын ыдыратып протопласқа айналдырады. Сондықтан жасушалық қабырғаны ферменттердің әсерімен ыдыратады.
Тәжірибеде жасуша қабырғасына бірнеше әдістер арқылы әсер етеді:
бактериялық жасушалар үшін лизоцим қолданылады;
саңырауқұлақтар жасушалары үшін, ұлудың зимолиазасы қолданады;
өсімдіктер жасушалары үшін, саңырауқұлақтар ферменттері (целлюлаза, гемицеллюлаза және пектиназа) қолданылады.
Сомалық гибридтеудің өзіндік ерекшелігі бар. Біріншіден - бұлі процесс, қандай да болсын будандастыру түріне және гендерді әртүрлі таксономиялық топтарға тасымалдауға тәуелді. Екіншіден протопластардың қосылуы кезінде, жасушалардың ата-аналық цитоплазма гендері араласады (жынысты будандастыру кезінде бұл болмайды).
Протопластардың өздігінен қосылуы өте сирек байқалатын жайт. Бұл процестің механизмі толық зерттелмеген. Протопластардың беткі қабаты теріс зарядталынған, олардың бір-бірімен жабысуын тудыру үшін, беткі қабаттық зарядты алу қажет. Бүгінгі күні тиімді фюзогені (электр зарядын алу) ретінде полиэтиленгликоль (ПЭГ) және рН 9-Ш кальций иондарының жоғары концентрациялы ерітінділері қолданылады. Егер гипотеза ретінде протопластардың жабысуын түсіндіретін болсақ, ол былай болады: ПЭГ-ні қолданған кезде, осы заттың жоғары концентрациясы (20-30 %) протопластар арасындағы бос суды сіңіріп, олардың жабысуын тудырады.
Сонымен қатар физикалық фактордың да көмегімен протопластардың жабысуын тудыруға болады. Электр тоғының әсерінен диэлектрофорез пайда болады. Бұл кезде протопластар полярлы беттерімен бір-біріне қосылады. Осы кезде тоқ импульсінің әсерінен
саңылаулар пайда болып, протопластар араласады.
Алынған гибрдтерді скринингтен (алынған клондарды тотальді түрде тексеру) өткізеді: фенотиптік ерекшеліктерін ескеру; гибридтер қана тірі қалатын селективті жағдайлар жасау.
Сомалық будандастыру келесі мүмкіндіктерді туғызады:
* филогенді бөгде топтарды будандастыруға болады. Мысалы, сомалық будандастырудың нәтижесінде жемісті, тұрақты фенотиптік қасиеті бар, түр аралық темекінің, картоптың, капустаның турнепспен қосылу гибридтері алынды;
* асимметриялық гибридтерді алу-ол гибридтің бір ата-анасының толық гендер жиынтығына, ал екіншісінің жартылай гендер жиынтығына ие болуы.
* бірнеше ата-аналық гендердің қосылуы арқылы гибридтерді алу.
* әр түрлі қасиеттері бар жасушалардың қосылуы.
Сомалық гибридтердің генотипі генетикалық өзгерістерге әкеліп соғатын, көптеген жағдайлардың нәтижесі болып саналады.
Екі протопласт қосылғаннан кейін, бір-біріне тәуелсіз ядролардың, хлоропластардың, митохондрялардың қосылуы және генетикалық информацияның алмасуы жүреді. Кейбір уақытта ядролардың, органеллалардың қосылуы болмау да мүмкін. Бір-біріне жабысқан митоз түріндегі протопластарды өсірген кезде, ядроның және басқа органоидтардың сегрегациясы (шығаруы) байқалады, сонымен қатар хромосомдардың жартылай элиминациясы, селективті (таңдаулы) түрде бір ата-ананың органоидтары көбейеді. Сомалық будандастыру кезінде жоғарыда көрсетілген процестермен қатар мынандай өзгерістер жүреді: генетикалық тұрақсыздық, мутациялық процестер және жасушаларға тән генетикалық өзгерістер.
Ю.Ю.Глеб жүргізген эксперименттердің нәтижесін қорытындылай отыра мынандай тұжырым жасалауға болады: - Протопластардың құйылып қосылуы арқылы өсімдіктерді габридтеген кезде, екі ата-ананың ядролық генетикалық детерминаттары, сондай-ақ тек бір жақтың белгілері тұқым қуалайды(сурет 10).
Сомалық будандастыру цитоплазмалық гетерозиготаларды алу әдісі болып саналады.
Сомалық гибридтерде пластоманың белгілерінің толық косегрегациясы болады, пластоманың генетикалық рекомбинациясы өте сирек болатын жағдай, ал керісінше митохондрияларда рекомбинатты ДНҚ түрлері жоғарғы жылдамдықпен пайда болады. Митохондрион сомалық гибридтерде, пластомалардан тәуелсіз сегрегацияға ұшырайды.
Аналық протопластардың ішінен бірең-сараң гетерокариондарды және гибридтерді алу өте қиынға соғады. Сондықтан гибридтерді алғаш сұрыптау жұмысы, жеңіл модель, өсімдік - регенеранттарын қолданып, мутацияның комплементарлық принциптеріне негізделе отыра өткізілді.
Генетикалық комплементация - гибридтегі гендердің байланысуы арқасында, ақаулы гендердің (дефектные гены) қызметі қалпына келеді (сурет 11).
Физиологиялық комплементация - гибридті жасушалардың өсіндіде көбеюі мен өсуі (морфогенез), себебі бұл жағдайда аналық жасушалар өсіп дамымайды.
Э. Кокинг физиологиялық комплементацияны былай дәлелдеді:
бірінші өсіндіде аналық жасушаларды өсіре отыра, бір аналық жасушалардың мұндай жағдайда өсе алатындығын, ал екінші аналық жасушалардың өсе алмайтындығы эерттелді. Содан кейін жасушалар суспензиясын біртіндеп қоректі орталарға енгізеді, бұл кезде бір аналықтың жасушалары өліп, тек гибридті жасушалар көбейеді.
Физиологиялық комплементацияны өткізу үшін алдын ала улардың әсерімен протопластарды инактивтейді. Жасушалардың қасиетін басқа улармен инактивтелген жасушалармен қосу арқылы қалпына келтіруге болады, яғни биохимиялық комплементацияны жүргізу болып қарастырылады.
Сомалық жасушаларды будандастыру, сұрыптау процесінің жаңа технологиясы болып саналады. Бұл жынысты жолмен будандастырылмайтын өсімдік түрлерін алуға мүмкіндік туғызады.
Егер жынысты гибридтеуді жүргізуге болатын сомалық жасушалардың артықшылығы - екі аналық жасушаларының ядродан тыс гендеріне ие болуы болып саналады.
Сомалық жасушалардың тәжірибеде кеңінен қолданылуы түраралық, бір тұқымдастар ішінде гибридтерді алу болып саналады.
Аса маңызды жұмыстар Nicotiana, Solatium, Datura түраралық габридтерді алу болды. Сомалық жасушаларды гибридтеу арқылы картоптың бағалы түрлері алынды. Мысалы: картоптың мәдени және жабайы түрлерін сомалық гибридтеу арқылы шаруашылыққа қолайлы түрі алынып, сұрыптандыру жұмыстары жүргізілді. Бірақ сұрыптануды ұзақ уақыт жүргізу салдарынан, жабайы белгілері басым картоп түрі ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
1. Биотехнологияның дамуы.
2. Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
Биотехнологияның пайда болуы және дамуы микроорганизмдерді қолдануға тікелей байланысты. Осыдан 6000 жыл бұрын көне Египет елдерінде және XIX ғасырдың ортасында Еуропа елдерінде микроорганизмдерді нан, қышқылды-сүт тағамдарын дайындау, спиртгі және т.б. алу үшін кеңінен қолдана бастады. Ерте заманнан дәстүрлі технологияда қолданылып келе жатқан микроорганизмдерге қарағанда, жоғарғы сатыдағы организмдердің жасушалық өсінділері биотехнологияның жаңа объектісі болып саналады. Олардың тіршілігіне негізделе отыра, биологиялық белсенді заттар, вакциналар, моноклональды антиденелер өндіріледі.
Жасушалық биотехнология -биотехнологияның аса маңызды бағыттарының бірі болып саналады. Ол негізінде жаңа объект -оқшауланған жасушаларды қолдануға бағытталған, яғни эукариоттық организмдердің жасушаларын немесе ұлпаларын, сонымен қатар өсімдік жасушаларының ғажайып қасиеті - тотипотенттікке негізделген. Бұл саладағы жетістіктер глобальды теориялық және тәжірибелік тапсырмаларды шешуге зор мүмкіндік туғызды. Осыған байланысты фундаментальды ғылымдар саласында мынандай күрделі дағдарыстар шешімін тапты: ұлпалардағы жасушалардың өзара байланысы, жасушаның дифференциялануы, морфогенез, жасушалардың тотипотенттігінің жүзеге асуы, рак жасушаларының пайда болуы және т.б. Тәжірибелік мақсаттарға қол жеткізу барысында: селекцияға, жануарлар жасушасын колдана отырып, дәрі-дәрмектік биопрепараттар және өсімдіктерден көп мөлшерде бағалы биологиялық метаболиттерді алуға, атап айтқанда, арзан дәрі-дәрмектер, сонымен қатар вируссыз өсімдіктерді өсіру, олардың клондық көбеюіне және т.б. аса көңіл аударылып отыр.
Жасушаларды организмнен тыс өсіруге болатыны туралы идеялар XIX ғасырдың аяғында байқала бастады. XIX ғасырдың аяғы мен XX ғасырдың басында неміс ғалымы X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Харбеландт (1902) өсімдіктер ұлпасы мен органдарының сахароза сіңдірілген сорғыш қағазда өсуін шапшаңдатуға алғашқы рет қадам жасады. Ешқандай нәтиже шықпаса да, бұл жүргізген жұмыстардың зор маңызы болды. Бұл зерттеулерде байқалған идеялар сол замандағы ғылымның дамуын анықтады және ондаған жылдардан соң олардың дұрыстығы дәлелденді. Ал жануарлар жасушасын жасанды қоректі ортада өсіру алғашқы per XX гасырдың басында жүргізілді. Зерттеушілер көп уақытқа дейін, өсімдік жасушаларын жасанды ортада өсіру барысында тиісті нәтиже ала алмады. Бұл салада алғашқы жетістіктер өткен ғасырдың 30-шы жылдарында алынып, сол ғасырдың 60-70-ші жылдарында өсімдіктер және жануарлар жасушаларын өсіру бағыты қарқындап дамыды.
XX ғасырдың 70-ші жылдарында жасушалық өсіндіні өсіруде маңызды жетістіктерге қол жеткізілді. Бұл кезде өсімдіктер протопластарын бөліп алу әдістері ойлап шығарылды, сонымен қатар сомалық жасушаларды будандастыру ашылды. Жоғарғы өсімдіктердің оқшауланған протопластары мен жакуарлардың жасушалық өсінділері, будандастыру және оларға генетикалық бөгде зат (жасушалық органеллалар, бактериялар) енгізу арқылы жасушалық конструкторлық объектіге айналды. Жасушалық конструкторлық әдістерді қолдану өсіндідегі продуценттік жасушалардың қасиеттерін жақсартуды көздейді, ал өсімдіктер жасушаларын қолданған кезде, жаңа қасиеті бар (өсімдік жасушасының тотипотенттігіне негізделген) өсімдіктердің түрін алуға мүмкіндік туғызады.
Қазіргі күні биотехнологияның үздіктері болып, АҚШ және Япония елдері саналады, бұл елдерде ауылшаруашылық, фармацевтік, тағам және өндірістік биотехнология салалары өте жақсы дамыған. Ал ферменттік препараттарды, аминқышқылдарын, белокты, дәрі-дәрмектерді өндіру бойынша, көп жетістіктермен көш ілгері дамыған болып Еуропа елдер (Германия, Франция, Ұлыбритания) және Ресей саналады. Бұл елдерде биотехнология жаңа техника және жоғарғы технологияның қолдануымен, тағы да биотехнологияның салаларындағы қарқынды түрде орындалған фундаментальды және тәжірибелік зерттеулерімен сипатталады.
Қазақстанда биотехнология саласының дамуы жасушалық өсінділермен тікелей байланысты. Қазақстан ғалымдары А.Қ. Бұлашев, Қ.Қ. Мұқанов және т.б гибридомды технологиясының негізінде көптеген антигендерге моноклональды антиденелерді алуды жүзеге асырды. Бүгінгі күні А.Қ. Бұлашев басқарған авторлар тобы өндіретін бруцеллез, туберкулез, лептоспироз және т.б антигендерге арналған моноклональды антиденелер тәжірибеде кеңінен қолданылады.
XX ғасырдың соңы, XXI ғасырдың басы, жасушалық биотехнологияның жаңа жетістіктерімен адам баласын таң қалдырады. Ерекше орын алатын сала ол - гибридомды технология. Моноклональды антиденелерді қолдана отырып, тек инфекциялық және рак ауруларын анықтап ғана қоймай, сонымен қатар лейкоз, гепатит В және стрептококкалық ауруларын емдеуге болады. Медициналық тәжірибеде фетальды жасушаларды, орталық жүйке жүйесінің және қалқанша без ақауларын емдеу үшін кеңінен қолданады. Жасушалық биотехнологияның табыстары биология, биохимия, медицина, ветеринария және т.б. салаларында кеңінен қолданылады.
Биотехнологияның болашағын және оның адам өміріндегі маңызын, жапон профессоры К. Сакагучи былай сипаттайды: ... не қаласаңыз соны микроорганизмдерден таба аласыз, олар ешқашан сізді алдамайды... Жануарлар мен өсімдіктер жаоушаларының күрделі, әлі толық зерттелмеген тұқым қуалау аппаратына әрекет жасау, биотехнологияның қолдану салаларын кеңейтеді және оның принципиальді басқа бағыттарын тудырады.
2 Жасушалық биотехнологияның негізгі бағыттары
Жасушалық биотехнолгияның негізі - жеке бөлініп алынған жасуша және ұлпа өсінділері. Клеткаларды толық меңгеру үшін оларды өсімдіктер, жануарлар мен адам организмдерінен бөліп алу және оларға организмнен тыс өсу үшін қолайлы жағдай жасау қажет. Жеке бөлініп алынған жасушалар мен ұлпаларды жасанды қоректі орталарда асептік жағдайда өсіру (in vitro) биотехнологияда кеңінен қолданылады.
Жалпы биотехнологиялық процестер жасанды ортада өсірілген микроорганизмдердің, өсімдіктердің, жануарлар мен адамдардың жасушалары және ұлпаларының биосинтетикалық потенпиалына негізделеді. Қазіргі уақытта бүкіл әлемде биотехнологияның дамуына көп көңіл аударылады, себебі басқа технологиялармен салыстырғанда биотехнологияның көп артықшылығы бар: биотехнологиялық процестер энергияны аз мөлшерде қажет етеді; ешқандай қалдықсыз; экологиялық таза технология. Бүгінгі таңдағы биологиялық технология, тек алдыңғы қатарлы жоғары технологиялық құрал-жабдықтарды қолдану арқылы жүзеге асады, сонымен қатар оның тағы бір ерекшелігі - зерттеулер климаттық жағдайларға тәуелсіз және шағын орын ала отырып, жыл бойы жүргізіледі. Осындай ерекшеліктермен жасуша мен ұлпа өсінділерінің технологиясы сипатталады.
Жасуша және ұлпа өсінділері адам тіршілігіне қажетті үш бағытта қолданылады.
Бірінші багыт:
:: жеке бөлініп алынған жасушалардан медицина және парфюмерияға, косметикаға қажетті екінші метаболиттік- өнімдер (алколоидтар, стериодтар, гликозидтер, гормондар, эфирлік майлар т.б.) алу;
:: жасушалық технологияның негізінді қажетті медициналық препараттар алынады (диосгенин, аймолин);
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, тағам өнеркәсібіне қажетті биологиялық қоспалар мен препараттарды алу.
Екінші багыт:
:: жасуша өсінділерін өсімдіктерді вирустық және басқа да агенттерден сауықтыру үшін қолдану;
:: өсімдіктердің микрокөбеюі арқылы бір жылда жалғыз меристемадан жүз мың өсімдіктерді алуға болады;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, адам мен жанурлардың инфекциялық ауруларына қарсы вакциналарды алу;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, инфекциялы ауруларды анықтау үшін қолданылатын диагностикумдарды алу.
Үшінші багыт:
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, селекциялық жұмыстардың нәтижесінде жылдам өсетін, қолайсыз факторларға төзімді өсімдіктерді алу;
:: оқшауланған протопластарды қоса (құйлып қосылу) отыра, өсімдіктердің жаңа түрін алу;
:: гендік инженерияға негізделіп, протопластарға бөгде генді енгізе отыра, тұқымқуалаушылық қасиеті бар өсімдіктер алуға болады;
:: жасуша өсінділерін қолдана отырып, вирустық аурулардың патогенезін толық зерттеуге болады;
:: жасушаларды организмнен тыс (in vitro) пробиркада үрықтандыру.
Дәріс № 2 Жасушалық биотехнологияның негізі - жасуша өсіндісі
1. Жасуша өсіндісі ұғымы.
2. Жасушалық өсінділердің классификациясы.
3. Жасушалық линиялардың кейбір танымалы түрлері
Жасушалық технологияның негізі - жануарлар мен өсімдіктерден алынатын жасуша өсінділері.
Жасуша өсіндісі дегеніміз - ол биосистема жасушаларының организмнен тыс (in vitro) жасанды ортада өсіп көбеюі.
Жасуша өсіндісін өсіру әдістемесі жиырмасыншы ғасырдың 40-шы жылдарынан кейін өркендеп дами бастады. Ол антибиотиктардың ашылуымен тікелей байланысты, себебі антибиотиктарды қолдана отыра, жасуша өсінділерінің бактериялармен ластануына кедергі жасауға болады. Сонымен қатар жасушалық биотехнологияның дамуына өз үлесін тигізген. Коккингтың (1960) жеке жасушаларды бөліп алу және өсіру әдістемелерін табуы, ал Зиммерманның (1984) оқшауланған протопластарды электрдің көмегімен қосу туралы ғылыми ашуы болды.
Жасуша өсінділерінің ашылуы көптеген глобальді, теориялық және тәжірибелік проблемаларды шешуге мүмкіндік туғызды. Фундаментальдік ғылымдар саласында өте күрделі жайт - ұлпалардағы жасушалардың өзара қатынасын, жасушалық дифференциялауды, морфогенезді анықтауға, жасушалардың тотипотентігінің жүзеге асуына және ракты жасушалардың пайда болу механизмін зерттеуге мүмкіндік жасады.
Тәжірибелік салада аса көңіл аударылатын бағыттар: селекция; көп мөлшерде биологиялық заттарды алу; вируссыз өсімдіктерді өсіру; өсімдіктердің клондық көбеюі; өсімдік, жануарлар мен адамдардың жеке жасушаларын өсіру.
Жасуша өсінділерінің көздері ол биосистемалар: өсімдік, жануарлар және адам жасушалары мен ұлпалары (сурет 2).
Жасуша өсіндісін жануар мен адамның кез келген органы мен ұлпасынан алуға болады. Бірақ эмбрионнан алынған жасуша өсіндісі өзінің шапшаң өсу қабілетімен ерекшеленеді. Көбінесе осы мақсатпен жануарлар эмбрионының бүйрегі, терісі, тимусы және т.б. органдары мен ұлпалары алынады.
1966 жылы ұлпалық өсінділерге бірыңғайланған терминология қабылданды. Оның негізгі тәртібі төменде көрсетіледі. Ұлпа өсіндісі - бұл жүйеде көп жасушалы организмнен бөлініп алынған жасушалар, ұлпалар және органдар 24 сағат тіршілігін сақтап, in vitro жағдайда көбейе алады. Биологиялық объектінің түріне байланысты келесі түрлерге жіктелінеді: 1) жасушалар өсіндісі - бұл термин, in vitro жасушалардың өсуін көрсетеді, бірақ өсіндіде жасушалар ұлпа түзбейді; j 2) ұлпа немесе органдар өсіндісі - бұл термин ұлпаның, орган ұрықтары мен мүшелерінің кұрылыстық дифференциясын сақтай отыра, in vitro өсуін қолдауды білдіреді.
Биологиялық тәжірибеде қолданылатын жасушалық өсінділердің классификациясы:
Каллустық жасуша - жасанды ортада өсірілетін өсімдік жасушасының басты түрі. Каллустық жасуша-бөліну арқылы каллустық ұлпаны немесе каллусты түзеді. Осы процесс жоғарғы өсімдіктерге тән жасушалық дифференциялануды көрсетеді. Каллусты алу үшін өсімдіктің әртүрлі мүшелерінің кесіндісін (эксплант) жасанды ортада in vitro өсіреді.
Алгашқы жасуша өсіндісі - ол тікелей организмнен алынып, in vitro өсірілген жасушалар (3-5 тәулікте пайда болады). Мұндай өсіндіні адам мен жануардың кез келген органынан немесе ұлпасынан алуға болады.
Жоғарыда көрсетілгендей, алғашқы жасуша өсіндісін эмбрион органдары мен ұлпаларынан алған жөн, себебі эмбрион жасушалары жасанды ортада жылдам көбейеді. Осы мақсатпен көбінесе тауық эмбрионы, сүткоректілердің эмбрионынан және төлдерден алынатын бүйректер, тері, тимус қолданылады.
Субкультуралар - ол алғашқы жасуша өсіндісінен бірінші пассаж (қайталап егу) жасалғаннан кейін алынады (2-3 тәулікте пайда болады), көптеген жасушалық линиялардан тұрады.
Субкультураны барлық алғашқы жасуша өсінділерінен алуға болады. Өзінің биологиялық қасиеті бойынша алғашқы жасуша өсіндісінен қалыспайды, сонымен қатар олар экономиялық жағынан тиімді. Субкультураны 2-5 пассаж жасау арқылы алады, кейбір өте сирек жағдайларда 8-10 пассажға дейін жасалады.
Қайталап өсірілген жасуша өсінділері - ол, организмнен тыс шексіз өсуге қабілетті жасуша өсінділері. Тұрақты өсінді деп - ол үш күн сайын, кемінде 70 ретке дейін пассаж жасалынған, қайталап өсірілген жасушаны айтады. Қайталап өсірілген жасуша өсіндісінде жасушаның пішіндері бірдей, құрамы гетероплоидты (алғашқы жасуша өсіндісінде ол диплоидты), олардың кейбіреулерінің онкогендік қасиеттері бар. Осыған байланысты мұндай жасуша өсінділері адамдардың вирустық ауруларына қарсы вакциналарды алу үшін қолданылмайды.
Қайталап өсірілген жасуша өсінділерінің артықшылығы: оларды дайындау оңай және арзан, олардың көптеген вирустарға, сезімтал болуында (вирустарды анықтау үшін қолданылады). Олардың кемшілігі қатерлі ісікті тудыру қасиеті болып саналады.
Диплоидты жасуша өсінділері дегеніміз морфологиялық бірқалыпты жасушалар популяциялары. Бұл жасуша өсіндісінің тіршілігі шектеулі, пассаж кезінде өзінің кариотипін сақтап қалады, контаминанттардан таза. Диплоидты жасуша өсінділерін алғашқы жасуша өсіндісінен алады, олардың кайталап өсірілген жасушалардан айырмашылығы диплоидты кұрамын сақтап қалуы және тіршілігінің шекті болуында. Пассаж саны 40-60 болады, содан кейін бөлінуші жасушалар саны күрт азайып, олар өледі.
Диплоидты жасуша өсінділерінің артықшылығы: 10-12 күн ауыстырылмаған қоректі ортада тіршілігін сақтай алады, жұмасына бір рет қоректі ортасын ауыстырған кезде тіршілігін 4 жұма сақтайды.
Өсіру тәсіліне байланысты жасуша өсінділері екі түрге бөлінеді: дара қабатты жасуша өсінділері; суспензиялық жасуша өсінділері.
Дара қабатты жасуша өсіндісі деп қоректі ортаның беткі қабатында пайда болған жасуша өсіндісін айтамыз.
Организмнің көптеген жасушалары суспензиялық ортада өсуге қалыптаспаған, сондықтан да оларды өсіру үшін қатты бетті орта қажет. Ең алғаш рет, жасушаларды өсіру әдісі пайда болған кезде, оларды плазманың бетінде өсірді, бүгінгі күні жасушаларды өсіру үшін шыны, палстиктен жасалған ыдыстар қолданылады. Жасушалар өсу үшін өздеріне қоректік заттарды қажет етеді.
Суспензиялық жасуша өсіндісі дегеніміз жасушалардың бос кеңістікте өсіп-көбеюі. Мұндaй жасуша өсіндісін алу үшін суспензияны үнемі араластырып отыру қажет. Қазіргі күні суспензиялық жасушаларды алу толық дамыған, соның нәтижесінде белгілі бір қасиеттері негізделінген жасушаларды алуға болады.
Сүтқоректілердің көптеген жасушалары белгілі бөліну дәрежесінен кейін тіршілігін жояды. Мысалы: адамның тері жасушалары тіршілігін жойғанға дейін 50-100 рет бөлінеді. Мынандай тұжырым, жасуша өсіндісіндегі өсу шектілігі, жануардың тіршілігінің шектілігімен тығыз байланысты. Себебі жылдам қартаятын және өлетін ауру организмнен алынған жасушалардың тіршілігі қысқа. Кейбір уақытта өсіндіде, кенеттен мутантты жасушалар пайда болады, олардың тіршілігі шексіз. Мұндай жасушалар үздіксіз көбейіп, жасушалық линия түзеді, 2-ші кестеде тәжірибеде жиі қолданылатын жасушалық линиялар түрлері сипатталған. Бұл жасушалар қатты бетте өседі, дара қабат түзгеннен
Кесте 2- Жасушалық линиялардың кейбір танымалы түрлері
Жасушалық линия
Жасуша түрі, алынған организм
3Т3
Фибробласт (тышқан)
ВНК 21
Фибробласт( сириялық атшалман)
Hela
Эпителия жасушасы (адам)
PTK 1
Эпителия жасушасы (кенгуралық егеу құйрық)
L6
Миобласт ( егеу құйрық)
PC 12
Хромаффиндік жасуша (егеу құйрық)
SP 2
Плазматикалыұ жасуша (тышқан)
кейін өз тіршіліктерін жояды. Жоғарыда сипатталып өткен жасушалық линиялардың маңызы, олар бір түрлі жасушалардың алыну көзі болып саналады. Сонымен қатар мұндай жасушалар - 70° С, активті түрде өте ұзақ сақталады. Жасушалық линиялардың бір тектес болуын клондау әдісі арқылы нығайтуға болады. Клон - дегеніміз бір жасушадан туындаған жасушалар популяциясы.
Дәріс № 3 Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын қоректі орталармен ерітінділер
1. Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын ерітінділердің түрлері.
2. Жануарлар жасушаларын өсіру үшін қолданылатын қоректі орталардын құрамы.
1.Жиырмасыншы ғасырдың 70-ші жылдары жасуша өсіндісін алу аса маңызды ғылыми жаңалықтардың бірі болды. Ол кезде көптеген ғалымдар, жасушалардың организмнен тыс өсуін ғылым мен сиқырдың әрекеттесуі деп қарастырды. Жасушалық биотехнологияның өркеңдеп дамуы, көптеген сұрақтардың жауабын тауып түсіндіре білді.
Плазманың орнына пластмасалы табақшалар мен құрамында белгілі бір мөлшерде тұз қоспалары, аминқышқылдар және витаминдер бар қоректі орталар қолданыла бастады. Бірақ ол кезде қоректі орталардың құрамында, толық тазармаған: жылқы сарысуы, тауық эмбриондарының өңделмеген экстрактары, сондай ақ бұзау эмбрионының сарысуы секілді биологиялық заттар болды, Көптеген қарапайым жасуша өсінділері үшін мұндай қоректі орталар бүгінгі күнге дейін қолданылып келеді.
Жасушалар дайындалған қоректі орталар енгізгеннен кейін, оларға температуралық қолайлы жағдай жасау қажет. Жасушалар пластмасты ыдыстың қабырғасына жабысып, бөлінуді бастайды. Қолайлы ортада жасушалар өскенде: адаптациялық, логарифмдік өсу, стационарлық және ескіру (жасушаларың өлуі) түрінде бірнеше фазадан өтеді. Көбею арқылы жасушалар пластмасаның бетіне жайылады, оны толық жапқан кезде бір-бірімен байланысып бөлінуін тоқтатады (контакты ингибиция). Ыдыстың бетінде бір жасушаның өсіндісі көбінесе 3-5 тәулік арасында түзіледі, түзілу жылдамдығы келесі жағдайларға байланысты болады: ұлпаның түріне; оны алған сүтқоректінің, өсімдіктің жасына; қоректі ортаның сапасына; егу кездегі жасушалар мөлшеріне (концентрациясына) және т.б. факторларға байланысты.
Жасуша өсіндісін дайындау кезінде қолданылатын ерітінділер үш топқа бөлінеді:
жасуша өсіндісін дайындауға қажетті ерітінділер;
жасушалар тіршілігін in vitro жағдайында сақтайтын ерітінділер;
жасушаларды егуді қамтамасыз ететін ерітінділер.
Жасуша өсінділерін дайындаған кезде Хенкс және Эрла ерітінділері кеңінен қолданылады. Олар бидистелденген суда әртүрлі тұздар мен глюкоза қосьш дайындалады.
Тұзды ерітінділер қоректі орталарды дайындау үшін қолданылады. Себебі олар рН-тың тұрақтылығын, жасушаларға қажетті осмостық қысымды қамтамасыз етеді және бейорганикалық заттардың концентрациясын тұрақтайды. Сонымен қатар оларды жасушаларды дайындау кезінде шаюға, жасушаларды сұйылтуға қолданады (кесте 3).
Жасушаларды өсіру кезінде, жасуша аралық заттарды ыдырату үшін ферментті ерітінділер қолданылады. Жасуша өсіндісін өсіру үшін қолданылатын қоректі орталар табиғи және жасанды (синтетикалық жоне жартылай синтетикалық) болып екіге бөлінеді.
Кесте 3- Хенке және Эрла ерітінділерінің құрамы
Ерітінділер
Су (1 л)
Тұздар
Басқа қосылыстар
Хенке
Бидистилденген
NaCl, KCl; MgSo4, CaCl2, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3
Глюкоза, фенолрот
Эрла
Би дистилденген
NaCl, KCl; MgSo4, CaCl2, Na2HPO4, NaHCO3
глюкоза
2.Табиғи қоректі орталар трды ерітінділерден, адам немесе жануар сары суларынан, ұлпалық экстрактан, амниондық сұйықтықтан тұрады.
Жасушалық биотехнология саласында жасанды қоректі орталар кеңінен қолданылады.
Жартылай жасанды қоректі орталарға әртүрлі белокты препараттардың ферментті підролизаттары жатады: лактальбуминнің гидролизаты, бұлшық ет гидролизаты, гемгидролизаты және т.б.
Кеңінен қолданылатын синтетикалық қоректі орталарға 199 ортасы және Игла ортасы жатады. Олардың құрамына 60 артық компоненттер кіреді: 20 аминқышқылдары, 17 витаминдер, нуклеин қышқылының компоненттері, липидтер көздері, 8 минералды тұздар және басқа да заттар болады (кесте 4). Синтетикалық қоректі орталарды, тұзды ерітінділерде жоғарыдағы химиялық заттарды белгілі мөлшерде еріту жолымен дайындайды.
Барлық қоректі орталардың құрамына, оның рН анықтау және бақылау үшін 0,002% фенол қызыл индикаторының ерітіндісін қосады. рН төмендегенде ортаның түсі сарғыштанады, бұл жасушалар метаболизмінің өнімдерімен ортаның қышқылдануының көрсеткіші. Мұндай жағдайда қоректі ортаны ауыстырады. Индикаторлардың көмегімен қоректі орталарға баға беруге болады.
Тұзды ерітінділердің және қоректі орталардың рН реттеу үшін 7,5% бикарбонат натрий және 3% сірке қышқылы ірітінділері қолданылады.
Жануарлар және адам жасушаларын өсіруге қолданылатъш барлық қоректі орталарды екі топқа бөледі: өсу қоректі орталары, жасушалардың тіршілігін және көбеюін қамтамасыз етеді, құрамында 2-10% қан сары суы болады, бастапқы күндері жасушаларды өсіру үшін қолданылады; тіршілігін сақтап тұрушы қоректі орталар, жасушалардың тек тіршілігін сақтайды, көбеюін қамтамасыз етпейді, құрамында сары суы болмайды, жасуша өнімдерін лабораторияда ұзақ сақтау үшін қолданылады.
Дәріс №4 Өсімдік жасушасы және ұлпасының өсінділері
1.Каллустық жасушаның өсу фазалары.
2. Каллустық жасушалар мен ұлпалардын қасиеттері.
1.Каллустық жасуша дегеніміз - ол қолайлы ортада өсірілген өсімдік жасушасы. Каллустық жасушаның өсуі жалпы эволюция заңдылығына сәйкес. Сондықтан каллустық жасушаның өсуі S-тәрізді қиғаштан тұрады (Сакс бойынша өсу қиғашы) және бес фазамен сипатталынады.
Бірінші фаза - латентті фаза немесе лаг-фаза, мұнда жасушалар бөлінуге дайындықта болады.
Екінші фаза - экспоненциальді фаза (логарифмдік фаза) жасушалардың бөлінуі шапшаң түрде жүріп, жас жасушалардың саны артады.
Үшінші фаза - сызықтық фаза, каллустық массанның ұлғаюмен сипатталады.
Төртінші фаза - жасушалардың бәсең өсуі, мұнда жасушалардың бөлінуі күрт төмендейді.
Бесінші фаза - стационарлық фаза мұнда бөлінген жасушалар мен өлі жасушалар саны теңесіп, каллус массасы тұрақты болады. Бұл фазадан кейін каллус өз тіршілігін жояды.
Жасанды қоректік ортада өсірілген каллустық жасушалар мен ұлпаларда, табиғатына тән қасиеттер сақталынады. Мысалы: суыққа төзімділігі, абиотикалық факторларға (температура, тұздануға, фотокезеңдік реакцияларға) төзімділігі, әсіресе басты маңыздылығы - ол екінші метаболиттерді синтездеу қасиеті. Сонымен қатар жалпы каллустық жасушаларға тән қасиеттер мен бірге тек оларға тән ерекшеліктер пайда болады. Ең басты популяциялық ерекшеліктер -физиологиялық асинхрондық және генетикалық гетерогендік.
Физиологиялық асинхрондық - жыныссыздық популяцияның ең жиі кездесетін ерекшелігі. Ол мынаған негізделеді, уақыттың белгілі бір мезгілінде жасушалар әртүрлі өсу фазасында болуы. Мысалы: бір жасушалар бөлінеді, екіншілері өседі, кейбіреулері қартаяды. Сондықтан мұндай ұлпаның физиологиялық жағдайы, жасушалардың көп мөлшері қандай кезеңде болса, сонымен сипатталатын болады.
Физиологиялық асинхрондықтықты келесі себептерге байланысты пайда болады: өсімдіктің генотипіне, түріне, сортына, эксспланттың ерекшелігіне; өсіру жағдайларына (стресстар); эндогенді және экзогенді гормондар мөлшеріне; жасушалар мен клондардың генетикалық гетерогендігіне, сонымен қатар in vitro жағдайында митозда болатын аномалияларға; физикалық факторлардың (температура, сәуле, аэрациялау) әсеріне тәуелді.
Генетикалық гетерогендік - ол сомалық жасушалар популяциясының қасиеттері (геномның тұрақсыздығы, генетикалық гетерогенділігі). Жасуша культураларында әрқашан да полиплоидия, ансуплодия, хромосомалық аберрация, гендік мутациялар пайда болады. Бірақ генетикалық гетерогендікті кемшілік деп қарастыруға болмайды, ол популяцияның арнайы жағдайы деп есептелінеді, сонымен қатар адаптацияланудың негізі болып қарастырылады.
Генетикалық гетерогендіктің пайда болу себептері; алынған материалдың генетикалық гетерогендігі; өсімдіктен алғаш рет бөліп алу кезінде коррелятивті байланыстардың бүзылуы; ортаның компоненттерінің әсері (экзогенді гормондар мутагенді әсер етуі мүмкін); ұзақ уақыт субкультурлау, осы кезде генетикалық өзгеріске ұшыраған каллустық жасушалар жинақталады.
Биология ғылымындағы аса күрделі проблемалардың бірі - ол көп клеткалы организмдердің дамуы. Осы процесті зерттеу үшін, қарапайым модель ретінде жасуша және ұлпа өсінділері қарастырылады. Алғашқы дедифференциалаудан кейін каллустық жасушаның дамуы әртүрлі бағытта жүруі мүмкін. Біріншіден бұл процесс екінші дифференциялау деп қарастырылады. Мұнда каллуста жеке дифференцияланған жасушалар пайда болады. Олардың белгілі бір құрылысы және қызметі болады. Мысалы: эпибласталардың пайда болуы (екінші метаболиттер жинақталынады). Бұл каллустық жасушаның ең қарапайым дифференциялануының күрделі түрі. Ол гистологиялық дифференциялану, бұл каллуста белгілі органдардың (млечники,талшықтар, ксилема элементтері т.б.) түзілуімен сипатталынады. Екінші дифференциялаудың ең күрделі түрі- органогенез, яғни органдардың түзілуі, сомалық эмбриогенезде-сомалық жасушалардан эмбриоидтардың, ұрық тәрізді биполярлы структуралардың пайда болуы.
Дифференциялаудың барлық түрі, тотипотенттік қасиет болғанда ғана жүреді.
Екінші диференциациядан өтетін каллустық жасушалар бірыңғай белгілермен ерекшеленеді. Ондай жасушалар - инициалды-жасушалар- басқа каллустық жасушалардан оқшау, жасушалық қабырғасы жуандаған жасушалар. Сонымен қатар, оларға мына белгілер тән: ядроның ұлғаюы, заттық қордың мол болуы, вакуольдердің өлшемінің азаюы және гексоздар ыдырауының шапшаңдауы.
Дедифференциядан өткеннен кейін жасушалар бірнеше жолдар арқылы дамиды.
Бірінші жол - өсімдіктің екінші регенерациясы, яғни жасуша, ұлпа, органдар деңгейінде дифференциацияның өтуі.
Екінші жол - жасушалардың екінші дифференциялық және регенерациялық қабілетінің жоғалуы, мұнда тұрақты дедиференциация байқалады, яғни жасушалар гормонсыз ортада өсу қабілетіне ие болады (рак жасушаларына айналуы).
Үшінші жол - физиологиялық цикл (қартаюы, өлуі). Бұл кезде жасушалар екіншіі дифференциалаудан өтеді, бірақ морфогенезге әкеліп соқпайды, тек кәрі каллустық жасушалардың пайда болуын тудырады. Каллустық ұлпада морфогенез процесі деп - құрылыстық структуралардың, ретсіз массадан пайда болуын айтады. Морфогенездің негізгі екі түрі бар (сурет 3).
Сомалық эмбрионогенездің органогенезден айырмашылығы меристеманың қандайда болсын бір бөлігінен (тамыр, бүршік) ұрық пайда болып, одан тұтас өсімдік дамиды.
Жеке сомалық жасушаның тұгас өсімдік құрай алатын қабілеті тотипотенттік қасиеті болып саналады.
Сомалық эмбриогенез кезінде инициаль-жасуша зиготаның түзілуінің негізі болады. Инициаль-жасуша біраз уақыт лаг-фазада болады, себебі осы уақытга жылдам бөліну, қайта кұру процестеріне дайындық өтеді.
Сонымен қатар, жасушалар бытырау (дробления) арқылы бөлініп, көп мөлшерде изодиаметрлі жасушалар түзеді. Бұл жасушалар I органогенез процесінде меристема ошағы, ал сомалық эмбрионогенезде - глобулярлы проэмбриоидтар деп аталынады. Глобулярлы проэмбриоидта биполярлы эмбриоидты структуралар дамиды.
Каллусты жасушадан сомалық эмбриоидтардың түзілу кезеңдерінің бірнеше түрлері болады. Солардың кейбір түрлері төменде көрсетіледі: глобулярлы; жүректі; торпеда тәрізді; сомалық ұрық.
Дәріс № 5 Жеке жасушаларды өсіру технологиясы
1. Жеке жасушаларды өсіру.
2. Жеке жасушаларды өсіру үшін колданатын коректі орталардын құрамы.
1.Жасушалық технология саласында аса маңызды бағыт -жеке жасушаларды aлy технологиясы. Жеке келткаларды өсімдіктер, жануарлар мен адам организмдерінен алуға болады. Олардың басты маңызы, жасушалық селекцияда гибридті жасушаларды таңдау және клондау болып табылады. Сонымен қатар оларды генетикалық және физиологиялық зерттеулер үшін қолданады. Мысалы: генетикалық біркелкілікті зертеу үшін, гетерогенді экспланты қолданғаннан, бір жасушаның клонын қолданған оңай.
Бірақ жеке келткаларды өсіру өте қиын, себебі жалғыз жасуша каллустық жасуша өсетін жағдайларда көбеймейді. Сондықтан жалғыз жасушаларды өсіру үшін арнайы әдістер қарастырылады. Олардың барлығы кондицтондық факторларға (бөлінуші жасушалардың метаболиттері) негізделінген. Егер ортаға бір жасушаны немесе олардың аз мөлшерін енгізетін болса, онда жасушалар ортада қажетті затгардың жетіспеушілігінен бөлінбейді. Сондықган да жасушалардың бөлінуіне қажет факторлардың концентрациясын жоғарлатуы қажет. Ол мына әдістер арқылы жүзеге асады:
Няня ұлпалық әдіс-жалғыз жасушалар жанындағы Няня ұлпасынан бөлінген кондициондық факторды қолданады;
ортаны байыту - белсенді бөлініп жатқан жасушалардың ортасын қосу арқылы;
азықтандыру қабаты әдісі - жалғыз жасуша тектес өсімдік жасушалары белсенді бөлініп жатқан суспензиялық ортаны қолдану;
жеке жасушаларды бай қоректік орта бар микротамшыда өсіру.
Тәжірибеде жеке жасушаларды өсірудің маңызы оларды қазіргі күнгі талапқа сай әртүрлі технологияда қолдану. Медицина саласында гибридті жасушаларды алу болып саналады. Әсіресе гибридомды технологияны атап өтуімізге болады, себебі қазіргі күні біздің елімізде де гибридті жасушаларды қолдану арқылы көптеген гылыми жаңалықтар бар. Жеке жасушаларды клондау арқылы, ерекше биопрепараттарды алуға болады. Ол препараттар зілді ісікті (рак), кеңінен таралған инфекциялық ауруларға диагноз қою үшін кеңінен қолданылады.
Биология саласында жеке жасушаларды өсіру өсімдіктердің гибридті жасушаларын алуға, оларды зертгеуге толық мүмкіндік береді.
Оқшауланған жасушалар мен ұлпалар көп компонентті қоректік орталарда өсіріледі. Олардың кұрамы алуан түрлі болуы мүмкін, бірақ міндетті түрде өсімдіктерге қажетті макро-микроэлементтер, көмірсулар, витаминдер, фитогормондар және олардың жасанды аналогтары болуы қажет. Көмірсулар (көбінесе сахароза немесе глюкоза) қандайда бір қоректі ортаның құрамында 2-3% мөлшердей болады. Олар қоректі компоненттер ретінде өте қажет, себебі көптеген каллустық ұлпалар хлорофилдың болмауынан автотрофты қоректенуге қабілетті емес. Сондықтан оларды күн сәулесі аздап түсетін немесе қараңғы жағдайда өсіреді. Тек мандрагора, амарант және кейбір өсімдіктердің каллустық ұлпасы жарық жерде өседі. Қоректік орталардың құрамында міндетті түрде ауксиндар мен цитокининдер болуы керек, себебі ауксиндер эксплант жасушаларының дедифференциялануын тудырса, ал цитокининдер жасушаның бөлінуін туындырады.
Қоректі орталардың құрамында нитраттардың, амоний, калий, фосфат иондарының көп мөлшерде болуы жасушалардың жылдам өсуін қамтамасыз етеді. Ал қоректі заттардың жетіспеушілігі жасушалардыңщ өсуін және екінші метаболиттердің синтезін бәсеңдетеді.
Дара қабатты каллустық ұлпаны өсіру үшін қолданылатын қоректік орталарды дайындау кезінде теңіз балдырларынан алынатын тазартылған агар-агар - полисахаридты қолданады. Кеңінен қолданылатын қоректі орталар 5 - кестеде келтіріледі.
Мурасиг және Скуг ортасы - ең жан-жақты орта. Ол каллустың түзілуі үшін, каллустың ретсіз өсуін қамтамасыз ету, сондай-ақ көптеген өсімдіктердің морфогенезін индукциялау үшін қажет.
Гамборг және Эвелег ортасы бұршақты, дәнді өсімдіктердің жасушалары мен ұлпасын өсіруге өте қолайлы. Уайт ортасы тамырдың дамуын және регенерациядан кейін, сабақгың қалыпты дамуы қамтамасыз етеді, ал Нич және Нич ортасы тозаңдық өсінділерінде андрогенезді индукциялайды.
Бүгінгі таңда кейбір өнеркәсіптер, дайын ұнтақ түрінде Мурасиг-
Скуга, Уайт, Хеллер орталарын шығарады. Бұл орталардың құрамында барлық қажетті заттар болады, тек өсуді реттеуші факторлар: сахароза және агар болмайды. Егер, зерттеу барысында қоректі ортадағы компоненттердің мөлшерін өзгерткен кезде, сахароза мен агардың қажеттілігі шамалы болады.
Дәріс № 6 Жасушалар мен ұлпаларды өсіруге қойылатын талаптар.
1. Жасушалар мен ұлпаларды өсіруге қойылатын талаптар
2. Өсінділерді ұзақ өсіру
1.Оқшауланған (изолированные) жасуша мен ұлпаларды стерильді жағдайда, жасанды қоректі орталарда өсіру (in vitro) - оқшауланған ұлпаларды өсіру әдісі деп аталады.
Барлық биосистеманың өсінділеріне бірыңғай талаптар қойылады.
Асептика. Жасуша мен ұлпаларды бөліп алу және өсіру арнайы боксте, бөлмелерде стерильді құрал - жабдықгарды қолдану арқылы өтуі қажет. Жасушалар және ұлпалармен in vitro жүргізілет жұмыстардың барлығы асептикалық ламинар - бокста немесе асептикалы бөлмелерде атқарылады. Асептикалық бөлмелері ультракүлгін шамдардың көмегімен залалсыздандырылып, онда стерильді киімдермен жұмыс жасайды. Жұмыс үстелдері және құралдар жұмыс жасар алдында қосымша спиртпен сүртіледі.
Фольгаға оралған таза ыдыстармен құралдарды, қағаздарды, мақтаны кептіру шкафтарында құрғақ ыстықтың әсерімен 160°С температурасында 1,5-2 сағат залалсыздандырады. Қоректі орталар мен ерітінділер автоклавттың (120°С, 15-20 мин) көмегімен залалсыздандырылуы қажет. Егер автоклавтау кезінде қоректік орталардың құрамында жылдам ыдырайтын заттар болатын болса, оларды бактериалық сүзгі арқылы залалсыдандырады.
Қоректі орталар. Оқшауланған жасушалар мен ұлпаларды көп компонентті қоректі орталарда өсіреді. Олар құрамы бойынша бір-бірінен айырмашылығы бар болады, бірақ барлығының құрамында биосистемаларға қажет макро-және микроэлементтер, көмір сулар, витаминдер болуы қажет. Сонымен қатар адам мен жануарлардың оқшауланған жасушалары мен ұлпаларына сарысу, ал өсімдіктер культураларына фитогормондар қажет.
Қоректі ортаның құрамында нитратар, калийдің аммониясы, фосфат иондары неғұрлым көп болса, соғұрлым жасушалар саны жылдам көбейеді. Ортада қоректі заттардың тапшы болуы, жасушалардың өсуін және екінші метаболизмді тежейді.
Физмкалық факторлар. Жасушалар мен ұлпалардың in vitro өсуінде физикалық факторлардың (сәуле, температура, аэрация, ылғалдылық) әсері зор.
Сәуле. Көптеген каллусты жасушалар жарық аз түсетін немесе қараңғы жағдайларда өседі, себебі олардың фотосинтездік қабілеті болмайды. Оған қарамастан сәуле морфогенезді және екінші синтезді шапшаңдатушы фактор ретінде қарастырылуы мүмкін. Сондықтан сәуле көзі ретінде люминесцентті шамдарды қолданады.
Температура, Жануарлар жасушалаларының температуралық көрсеткіштегі олардың алу көзіне байланысты.
Каллустық өсінділер үшін 26°С оптимальды температура болып саналады. Кейбір өсімдіктердің каллустары 32°С температурада жақсы өседі. Бірақ морфогенездің индукциясы төменгі температураларда өтеді (18-20°С). In vitro-жағдайында температураның жасушалардың метаболизміне қалай әсер ететіндігі аз зерттелген.
Аэрациялау. Суспензиялық өсінділерді өсіру кезінде аэрацияның маңызы зор. Әсіресе үлкен көлемді ферментерларда жасушаларды өсіру кезінде, оларды ауамен қамтамасыз ету өте қажет.
Жасушаларды кішкене көлемді ыдыстарда (колбада) өсірген кезде, оларды үнемі шайқау арқылы аэрациялайды.
Ылғалдылық. Өсінділер өсетін жерлерде ылғалдылық 60-70 болуы керек. Сонымен қатар жасушалар мен ұлпаларды өсіру көптеген факторларға тікелей бағынышты, олардың әсерлері толық анықталмаған. Сондықтан жасушалардың жаңа түрін өсіру ортасына енгізген кезде, олардың өсуіне және физиологиялық қасиеттеріне физикалық факторлардың қалай әсер ететіндігін зерттеу қажет.
2.Жасушалық технология саласында жасушаларды in vitro өсіру ғана емес, сонымен қатар оқшауланған жасушаларды ұзақ сақтауға да көп көңіл бөлінеді.
Лабораторияларда жасуша өсінділерінің тіршілігін, үнемі пассаж (қайталап егу) жасау арқылы сақтап отырады. Пассаж жасау үшін, дара қабаты толық дамыған, 2-3 тәулік жасы бар жасуша өсіндісін таңдап алады. Қоректі ортаны бөліп алғаннан кейін жасушалық дара қабатты жылы күйіндегі 0,02 % версен ерітіндісімен толық жабады. Версеннің әсерінен жасушалар домалақтанып, шыны бетінен босайды. Босаған жасушаларды жайып бөліп алып, қалған жасушаларға өсу қоректі ортасын қосып (80-200 мың жасушаға 1 мл), термостатта 37°С температурасында 3-4 тәулік дара қабат түзілгенше өсіреді. Жасушаларды өсіру үшін қолданылатын қоректі орталардың түрі жасушалардың шығу тегіне байланысты болады.
Жасуша өсінділерін үнемі қайталап егу арқылы олардың тіршілігі сақталынады.
Жасуша өсінділерін өсіру кезінде арнайы жағдай жасап қана қоймай, сонымен қатар ыдыстарды да дайындай білу қажет. Қолданылатын ыдыстың сапасы жасушаларды жасанды орталарда өсіру кезінде өте маңызды. Сондықтан қолданылатын ыдыстар стерильді, майсыздандырылған, токсигендік қасиетінің болмауы. Жасуша өсінділерін өсіргенде, пассаж жасалғанда аса көңіл аударатын мәселе - ол қолданылатын судың сапасы.
Лабораторияларда дистилденген бидистилденген, немесе
деионизацияланған сулар қолданылады.
Жасушалық биотехнологияда қолданылатын жасуша өсінділерін жиі консервілеу арқылы сақтауға болады. Себебі жасуша өсінділерін пассаж жасау арқылы сақтаған кезде, олардың бактериялармен ластануы және генетикалық өзгерістер тууы мүмкін.
Дәріс №7 Сомалық будандастырудың генетикалық негіздері
1. Сомалық будандастырудың генетикалық негіздері
1.Сомалық будандастыру дегеніміз - хромосомды, ядро және органеллалар гендерін генетикалық рекомбинацияға шалдықтыру жүйесі. Мысалы: оқшауланған протопластардың құйылып қосылу арқылы жүзеге асыруға болады. Осының нәтижесінде жасушалардың гибридті линиялары және өсімдіктердің сомалық гибридтері пайда болады.
Алғашқы рет жасанды түрде протопластардың жабысуын 1970 жылы Коккинг өзінің әріптестерімен дәлелдеген болатын.
Сомалық будандастыру нәтижесінде жаңа генотиптер, өсімдіктердің жаңа түрлері туды. Сомалық будандастыру термині алғашқы рет 1974 жылы Дж. Мельхерсом енгізді. Оның мағынасы- сомалық жасушалар протопластарының қосылуы.
Жоғарғы организмдер жасушаларын, бір-біріне Сендай вирусыньн көмегімен қосады. Себебі оның әсері цитоплазмалық мембрана белогінің гидролизмен тікелей байланысты.
Өсімдіктер, бактериялар және саңырауқұлақтар жасушаларын сомалық гибридтеу алдында, бірінші жасуша қабырғасын ыдыратып протопласқа айналдырады. Сондықтан жасушалық қабырғаны ферменттердің әсерімен ыдыратады.
Тәжірибеде жасуша қабырғасына бірнеше әдістер арқылы әсер етеді:
бактериялық жасушалар үшін лизоцим қолданылады;
саңырауқұлақтар жасушалары үшін, ұлудың зимолиазасы қолданады;
өсімдіктер жасушалары үшін, саңырауқұлақтар ферменттері (целлюлаза, гемицеллюлаза және пектиназа) қолданылады.
Сомалық гибридтеудің өзіндік ерекшелігі бар. Біріншіден - бұлі процесс, қандай да болсын будандастыру түріне және гендерді әртүрлі таксономиялық топтарға тасымалдауға тәуелді. Екіншіден протопластардың қосылуы кезінде, жасушалардың ата-аналық цитоплазма гендері араласады (жынысты будандастыру кезінде бұл болмайды).
Протопластардың өздігінен қосылуы өте сирек байқалатын жайт. Бұл процестің механизмі толық зерттелмеген. Протопластардың беткі қабаты теріс зарядталынған, олардың бір-бірімен жабысуын тудыру үшін, беткі қабаттық зарядты алу қажет. Бүгінгі күні тиімді фюзогені (электр зарядын алу) ретінде полиэтиленгликоль (ПЭГ) және рН 9-Ш кальций иондарының жоғары концентрациялы ерітінділері қолданылады. Егер гипотеза ретінде протопластардың жабысуын түсіндіретін болсақ, ол былай болады: ПЭГ-ні қолданған кезде, осы заттың жоғары концентрациясы (20-30 %) протопластар арасындағы бос суды сіңіріп, олардың жабысуын тудырады.
Сонымен қатар физикалық фактордың да көмегімен протопластардың жабысуын тудыруға болады. Электр тоғының әсерінен диэлектрофорез пайда болады. Бұл кезде протопластар полярлы беттерімен бір-біріне қосылады. Осы кезде тоқ импульсінің әсерінен
саңылаулар пайда болып, протопластар араласады.
Алынған гибрдтерді скринингтен (алынған клондарды тотальді түрде тексеру) өткізеді: фенотиптік ерекшеліктерін ескеру; гибридтер қана тірі қалатын селективті жағдайлар жасау.
Сомалық будандастыру келесі мүмкіндіктерді туғызады:
* филогенді бөгде топтарды будандастыруға болады. Мысалы, сомалық будандастырудың нәтижесінде жемісті, тұрақты фенотиптік қасиеті бар, түр аралық темекінің, картоптың, капустаның турнепспен қосылу гибридтері алынды;
* асимметриялық гибридтерді алу-ол гибридтің бір ата-анасының толық гендер жиынтығына, ал екіншісінің жартылай гендер жиынтығына ие болуы.
* бірнеше ата-аналық гендердің қосылуы арқылы гибридтерді алу.
* әр түрлі қасиеттері бар жасушалардың қосылуы.
Сомалық гибридтердің генотипі генетикалық өзгерістерге әкеліп соғатын, көптеген жағдайлардың нәтижесі болып саналады.
Екі протопласт қосылғаннан кейін, бір-біріне тәуелсіз ядролардың, хлоропластардың, митохондрялардың қосылуы және генетикалық информацияның алмасуы жүреді. Кейбір уақытта ядролардың, органеллалардың қосылуы болмау да мүмкін. Бір-біріне жабысқан митоз түріндегі протопластарды өсірген кезде, ядроның және басқа органоидтардың сегрегациясы (шығаруы) байқалады, сонымен қатар хромосомдардың жартылай элиминациясы, селективті (таңдаулы) түрде бір ата-ананың органоидтары көбейеді. Сомалық будандастыру кезінде жоғарыда көрсетілген процестермен қатар мынандай өзгерістер жүреді: генетикалық тұрақсыздық, мутациялық процестер және жасушаларға тән генетикалық өзгерістер.
Ю.Ю.Глеб жүргізген эксперименттердің нәтижесін қорытындылай отыра мынандай тұжырым жасалауға болады: - Протопластардың құйылып қосылуы арқылы өсімдіктерді габридтеген кезде, екі ата-ананың ядролық генетикалық детерминаттары, сондай-ақ тек бір жақтың белгілері тұқым қуалайды(сурет 10).
Сомалық будандастыру цитоплазмалық гетерозиготаларды алу әдісі болып саналады.
Сомалық гибридтерде пластоманың белгілерінің толық косегрегациясы болады, пластоманың генетикалық рекомбинациясы өте сирек болатын жағдай, ал керісінше митохондрияларда рекомбинатты ДНҚ түрлері жоғарғы жылдамдықпен пайда болады. Митохондрион сомалық гибридтерде, пластомалардан тәуелсіз сегрегацияға ұшырайды.
Аналық протопластардың ішінен бірең-сараң гетерокариондарды және гибридтерді алу өте қиынға соғады. Сондықтан гибридтерді алғаш сұрыптау жұмысы, жеңіл модель, өсімдік - регенеранттарын қолданып, мутацияның комплементарлық принциптеріне негізделе отыра өткізілді.
Генетикалық комплементация - гибридтегі гендердің байланысуы арқасында, ақаулы гендердің (дефектные гены) қызметі қалпына келеді (сурет 11).
Физиологиялық комплементация - гибридті жасушалардың өсіндіде көбеюі мен өсуі (морфогенез), себебі бұл жағдайда аналық жасушалар өсіп дамымайды.
Э. Кокинг физиологиялық комплементацияны былай дәлелдеді:
бірінші өсіндіде аналық жасушаларды өсіре отыра, бір аналық жасушалардың мұндай жағдайда өсе алатындығын, ал екінші аналық жасушалардың өсе алмайтындығы эерттелді. Содан кейін жасушалар суспензиясын біртіндеп қоректі орталарға енгізеді, бұл кезде бір аналықтың жасушалары өліп, тек гибридті жасушалар көбейеді.
Физиологиялық комплементацияны өткізу үшін алдын ала улардың әсерімен протопластарды инактивтейді. Жасушалардың қасиетін басқа улармен инактивтелген жасушалармен қосу арқылы қалпына келтіруге болады, яғни биохимиялық комплементацияны жүргізу болып қарастырылады.
Сомалық жасушаларды будандастыру, сұрыптау процесінің жаңа технологиясы болып саналады. Бұл жынысты жолмен будандастырылмайтын өсімдік түрлерін алуға мүмкіндік туғызады.
Егер жынысты гибридтеуді жүргізуге болатын сомалық жасушалардың артықшылығы - екі аналық жасушаларының ядродан тыс гендеріне ие болуы болып саналады.
Сомалық жасушалардың тәжірибеде кеңінен қолданылуы түраралық, бір тұқымдастар ішінде гибридтерді алу болып саналады.
Аса маңызды жұмыстар Nicotiana, Solatium, Datura түраралық габридтерді алу болды. Сомалық жасушаларды гибридтеу арқылы картоптың бағалы түрлері алынды. Мысалы: картоптың мәдени және жабайы түрлерін сомалық гибридтеу арқылы шаруашылыққа қолайлы түрі алынып, сұрыптандыру жұмыстары жүргізілді. Бірақ сұрыптануды ұзақ уақыт жүргізу салдарынан, жабайы белгілері басым картоп түрі ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz