Өсімдіктерді микроклональды көбейту биотехнологиясы

Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 35 бет
Таңдаулыға:

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫҢ БІЛІМ ЖӘНЕ
ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ

ӘЛ- ФАРАБИ АТЫНДАҒЫ ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІНІҢ

Биология факультеті

Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасы

Бітіру жұмысы

шИЕНІ МИКРОКЛОНАЛЬДЫ КӨБЕЙТУ
Орындаған 4 курс студенті _________________________ Исмаил С.И.
(күні, қолы)

Ғылыми жетекшілері
б.ғ.д., профессор Атабаева С.Д.
(күні, қолы)
ҚР БҒМ ҰБО
ӨББИ гермоплазманы
криосақтау лаб.
б.ғ.к. ___________________________ Ковальчук И.Ю.
(күні, қолы)

Нормабақылаушы
б.ғ.к., ассистент _____ _____ ____________________ Оразова С.Б.
(күні, қолы)

кафедра меңгерушісінің
рұқсатымен қорғауға жіберілді
б.ғ.д., профессор _______________________________ Карпенюк Т.А.
(күні, қолы)

Алматы, 2010
МАЗМҰНЫ

КІРІСПЕ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .3

1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4
1.1Өсімдіктерді микроклональды көбейту биотехнологиясы ... ... ... ... ... ... ... 4
1.2 Сүйекті жемісті дақылдарды микроклональды көбейту сатылары және вирустық инфекцияға тексеру ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...5
1.3 In vitro культураға енгізу және сүйекті жемісті дақылдарды
микрокөбейту ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 6
1.4 Микроөркендерді тамырландыру ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..7
1.5 Микроклональды көбейтудің әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..7
1.6 Культивирлеу жағдайы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..8
1.7 Қолтық бүршіктермен көбейту әдісі ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ..8
1.8 Адвентивті бүршіктермен көбейту әдісі ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... .10
1.9 Материалды таңдау және дайындау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 11
1.10 Экпланттардың даму сипаттамасы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...12
1.11 Өркендерді тамырландыру ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .13
1.12 Өсімдіктерді стерильді емес жағдайларға ауыстыру ... ... ... ... ... ... ... ... ..13

2 ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАР ЖӘНЕ ӘДІСТЕРІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...20
2.1 Зерттеу обьектілері мен әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ...20
2.2 Өсімдіктерді асептикалық жағдайға енгізу, микроклональды көбейту әдісі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 21

3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕР МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..24

ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 36

ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ...37

КІРІСПЕ

Тақырыптың өзектілігі: Қазіргі кезде шаруашылығы және оның бір саласы бау-бақша шаруашылығы, сонымен қатар тамақ және өңдеу өнеркәсіптері. Жемісті дақылдардың өндіру эффективтілігін жоғарлату қажет екенін сезінуде. Ауыл шаруашылық өндірісінің интенсификациясы жоғарлату жолдарының бірі отырғызылатын материалды көбейтудің жылдамдатылған биотехнологиялықәдістерін жасау немесе жетілдіру болып табылады.
Бақша шаруашылығында интенсификация жағдайлары мен экологиялық жағдайдың нашарлауы кезінде сауықтылылған, жоғары сапалы, отырғызылатын материал өндіру және жемісті көп беретін сорттар шығарудың эффективті технологияларын жасау маңызды мәнге ие болып отыр. Бұл тәсілдерді бақша шаруашылығына енгізу морфогенетикалық потенциалды жоғарылатып қана қоймай, шаруашылыққа құнды белгілерге ие және қолайсыз факторларға толерантты жаңа сорттарды қысқа мерзімде шығару уақытын жылдамдатады.
Көптеген елдерде (АҚШ, Италия, Ұлыбританияда, Голландия, Жаңа Зеландия, Франция) жемісті және жидекті дақылдардың клональды микрокөбейту әдісін пайдалану арқылы сауықтылырған отырғызылатын материалды шығару өндірісі өнеркәсіптік негізге қойылған. Алайда біздің елімізде өсімдіктердің көптеген түрлерінің көбеюі негізінен лабораториялық сатыда қалып қалады. Сонымен қатар бөліп алынған ұлпалар культурасында көбейту кезінде генотиптердің индивидуальды реакциясы көбейтудің дәстүрлі тәсілдеріне қарағанда күштірек байқалады. Бір форма мен сорттар үшін жасалған культивирлеу жағдайлары басқа өсімдіктерді көбейтуге әрқашан қолданыла бермейді. Осыған байланысты, негізгі технологиялық іn vitro тәсілдерді жетілдіру , жемісті дақылдардың биологиялық ерекшеліктерін ескере отырып, морфогенездің жалпы заңдылықтарын іздеу, олардың регенерациялық потенциалы деңгейін технологиялық және қөбеюі циклі эффективтігін жоғарлату клональды микрокөбейту әдісінің практикалық маңызын жоғарлатуға және оны сауықтырылған отырғызылатын материал алу, селекцияда пайдалануға мүмкіндік береді.
Қазақстанда ең кең таралған және құнды жемісті дақылдың бірі шие болып табылады. Шиенің жемістері биологиялық активті заттар, пектиндер, А, В, С, РР витаминдерді, көмірсу, органикалық және минералды қышқылдардың көзі болып табылады. Құрамында бактерицидті заттар, әртүрлі ферменттер және адамның тіршілігі мен қоректенуінде маңызды орын алатын көптеген компонеттер болады.
Адамның жылына жемістерді пайдалануының минималды нормасы 100кг екені анықталды. Оларды пайдалану адам организмін авитаминз, гастрит, язвалық ауру, асқазан-ішек аурулары, гипертония, жүрек қантамыр аурулары сияқты кең таралған көптеген аурулардан қорғайды, сақтайды.
Жеміс-жидекті культуралар сорттарының сортименті басқа региондардан интродукция есебінен және жергілікті жаңа сорттарды шығару есебінен үнемі өсіп келеді. Әдетте бір сорт бірнеше үлгілермен болады. Клоналды миркокөбейту прогресивті және жеміс-жидекті культуралардың отырғызылатын материалын жылдам көбейту әдісі болып табылады. Бұл әдісті саны аз бастапқы материалдан максималды өсімдік көшірмесін алу үшін пайдаланылады.
Жұмыстың мақсаты: in vitro асептикалық культураға енгізу, микроклоналды көбейту және шиенің әртүрлі сорттарының ризогенез жағдайларын оптимизациялау болды.
Жұмыстың міндеттері:
1.Меристемалық ұлпамен бірге төбе бүршіктерді in vitro асептикалық культураға енгізу және микроөркендердің регенерациясын жүргізудің эффективті тәсілдерін жасау;
2.Өсімдіктерді асептикалық культураға енгізу кезінде сапрофитті микрофлораны тежеу үшін залалсыздандырудың оптимальды жағдайлары мен оптимальды залалсыздандырушы агенттерді таңдау;
3.Шиенің in vitro өсімдіктерін көзге көрінбейтін инфекцияға тексеру;
4.Өсу стимуляторларының шиенің клональды микрокөбеюіне әсер етуін зерттеу.
Осыған байланысты келесі мәселелер шешілді:1) Меристемалық ұлпамен бірге төбе бүршіктерді in vitro асептикалық культураға енгізу және микроөркендердің регенерациясын жүргізудің эффективті тәсілдерін жасау; 2) өсімдіктерді асептикалық культураға енгізу кезінде сапрофитті микрофлораны тежеу үшін залалсыздандырудың оптимальды жағдайлары мен оптимальды залалсыздандырушы агенттерді таңдау ; 3) шиенің in vitro өсімдіктерін көзге көрінбейтін инфекцияға тексеру; 4) өсу стимуляторларының шиенің клональды микрокөбеюіне әсер етуін зерттеу; 5) in vitro микрокөбейту кезіндегі шиенің сорт ерекшеліктерін зерттеу.

1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

1.1 Шиенің жалпы сипаттамасы
Өсімдіктерді микроклональды көбейту арнайы қамтамассыз етілген жағдайларды қажет етеді. Біз зерттеу обьектісі ретінде шиені алып отырмыз.
Шие - көп жылдық, ағаш немесе бұта түрінде өсетін дақыл. Биіктігі 1.5-5 м. Жер үсті бөлігі бір немесе бірнеше сабақтан тұрады. Жеміс беру типіне қарай шиенің барлық сорттарын шартты түрде екі топқа бөлуге болады: Бұта тәрізді (Владимирская, Любская, Щедрая) және сүректі (Жуковская, Гриат, Московский, Тургеневка және тағы басқа ). Шиенің тіршілік барысын да үш кезең болады: өсу, жеміс беру, қурау.
Осы кезеңдердің әрқайсысында бұтақтардың өсу ұзындығы ең алдымен агротехника деңгейіне байланысты болады. Жеміс беру кезеңін ұзарту үшін бұтақ ұзындығын (30-40 см) оптимальды деңгейде ұстап тұру қажет.
Шиенің тамыр жүйесі 20-40 см тереңдікте болады. Шиенің отырғызған кезде 1м жерге 5-6 кг органикалық зат, тыңайтқыштар қосады. Шұңқыр тереңдігі 50-60 см кеңдігі 80 см.
Шиенің жылдам жеміс береді, отырғызылғаннан кейін 4-5 мг жылдары жеміс береді. Шие жыл сайын жеміс салады. Кейбір сорттар жылына 20 кг дейін жеміс бере береді. Шие жел соқпайтын, күн түсетін, жылы жерде өседі. Шие отырғызатын шұқырды күзде дайындайды, көктемде отырғызады. Отырғызылғаннан кейін көп суару керек. Қатты үсік шалса, шиені қырқып тастайды да, ағаш тамырларынан өсіп қайта қалпына келеді.

1 cурет. Микроклональды көбейту обьектісі - шие

1.1 Өсімдіктерді микроклональды көбейту биотехнологиясы
Өсімдіктерді микроклональды көбейту биотехнологияның негізгі әдістерінің бірі болып табылады. Биотехнология ғылым мен өндірістің биологиялық процестерді және экономикалық маңызды заттарды өндіру үшін өсімдік сорттар ы, жануарлар мен микроорганизм штаммдарын пайдаланатын саласы.
Биотехнология тірі клеткалардан немесе олардың көмегі арқылы адамға қажет. Ғалымдар бактериальды клеткаға белгілі бір бөгде гендерді енгізу тәсілдерін жасауда. Бұл гендік инженерияның негізі болып табылады. Мысалы, ішек таяқшасының көмегімен интерферон белогы мен инсулин , өсу гормоны мен антибиотиктер синтезделеді [3]. Клеткалар, ұлпалар мен мүшелер культуралары әдісі қазіргі кездегі әлемнің барлық елдерінде жалпы қабылданған және қазіргі экология, селекция, генетика мен жалпы биологияның маңызды мәселелері шешуде сәтті қолданылды.
Соңғы кездерде жасанды қоректік орталарда әртүрлі мүшелерді культивирлеу арқылы өсімдіктерді көбейту әдісі кең таралған. Әлемдік селекциялық тәжірибиеде микроклональды көбейтуді жеке сорттар, уникальды формаларды минимальды бастапқы материалдан көбейту үшін сәтті пайдаланады [2]. Қазіргі кезде бөліп алынған ұлпалар әдісімен алма, алмұрт, шие, шабдалы сорттарын көбейтеді. Англия мен АҚШ-та бастапқы материал in vitro жағдайда өсірілген бақтар бар [3].
Дәстүрлі көбейту әдісімен салыстырғанда бірқатар артықшылықтарға ие: көбейтудің жоғары коэффициенті, жыл мезгіліне, ауа райына тәуелсіз жыл бойы көшет алу және әдеттегі әдіспен нашар тамырланатын сорттарды көбейту мүмкіндігі формаларды қажетті белгілері бойынша тікелей in vitro культурада сұрыптау есебінен селекиялық процестер қысқарады. Отырғызылатын материалға қойылатын қазіргі стандарттар олардың вирустық және микоплазмалық инфекциядан сауықтырылуын талап етеді. Бұл жұмысты in vitro культурада жүргізуге болады [4,5].
Микроклонаьды көбейту бірнеше сатылардан тұрады. Бірінші сатының негізгісі, алғашқы эксплантты сұрыптау, оны залалсыздандыру, қоректік ортада экспланттың өсуі мен дамуы үшін культивирлеудің оптимальды жағдайларын таңдау.
Өсімдік ұлпалар культурасы әдісін жасау және жетілдіру салыстырмалы қысқа тарихқа ие. Габарландт (1902ж) ең алғаш ұлпалар культурасы әдісін өсімдік обьектілеріне қолданылып көрді. СССР кезінде микроклональды көбейту бойынша жұмыстар 1944 жылы Тимирязев атындағы өсімдіктер физиологиясы институтында Н.А.Максимова мен А.А.Прокофьевтің жетекшілігімен басталды. Оған әрі бұл жұмыстарды Р.Г.Бутенко жалғастырды. Қазақстанда ұлпа культурасы бойынша жұмыстар 1975 жылдан бас ботаника бағында басталып, кейін молекулярлы биология және биохимия институтында, Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық Университеті мен ботаника институтында жалғастырылды. Қазақстанда биотехнологияның негізін қалаушылар: М.Айтхожин мен І. Рахимбаев болып табылады. Бөліп алынған өсімдік ұлпаларымен мүшелерін сәтті өсірудің ең маңызды жағдайларының бірі-қоректік орта құрамынн даярлау. Бұл мәселені шешуге Гарти мен Уайт, Мурасиге мен Скуг, Гамборг пен Эвелег айтарлықтай өз үлестерін қосты. Соңғы кезде ұлпа культурасы әдісі сирек кездесетін, жоғалып бара жатқан немесе шаруашылыққа құнды жемісті дақылдар, көкөніс, декоративті( сән үшін өсірілетін) өсімдіктердің генофондын сақтап қалу мақсатында вегетативті көбейту үшін қолданылады.

1.2 Жемісті және жидекті дақылдардың микроклональды көбеюі мен ризогенезі
Бақша шаруашылығының интенсификациясы жоғары сапалы сауықтырылған отырғызылған материал өндірудің жаңа эффективті технологияларын жасау қажеттігін анықтайды. Сертификатталған, отырғызылатын материалдан алынған жеміс және жидек дақылдардың өндірістік бақшалардағы генетикалық потенциалын, максималды іске асырып, қатардағы материалды пайдаланған кездегі өнімнен 1,5 есе артық өнім береді. Отырғызылатын материал сапасының жемісті ағаштардың одан арғы жағдайы мен бақшалардың жоғары сапалы отырғызылатын материалын өндірудің қазіргі технологиясында клональды микрокөбейту әдісі ерекше орын алады. Бірқатар елдерде бұл әдіс бақша шаруашылығын практикасында кең таралған және сауықтырылған отырғызылатын материалды өндірісте алу үшін термотерапиямен қатар қолданылады.
Әлемнің көптеген региондарында, сонымен қатар біздің елімізде де алмұрт пен шие басты өндірістік дақылдар болып табылады. Осыған байланысты, негізгі іn vitro технологиялық тәсілдерді жетілдіру, жемісті дақылдардың биологиялық ерекшеліктерін есепке ала отырып, морфогенездің жалпы заңдылықтарын іздеу; олардың регенерациялық потенциялы, көбею циклінің технологиялығы мен эффективтілігі деңгейінің көтерілуі клональды микрокөбейтуі клональды көбейту әдісінің маңыздылығын жоғарылатуға оны сауықтырылған материал өндірісі жүйесі мен селекцияда пайдалануға мүмкіндік береді.
Қазіргі кезде осы берілген дақылдарды клональды микрокөбейту әдісі бойынша белгілі бір нәтижелерге қол жетті. Алайда ризогенез сатысы, әсіресе сүйекті жемісті дақылдар үшін, әлі күнге дейін клональды микрокөбейту технологиясында басты мәселе болып табылады. Бұл іn vitro өндіру нәтижелер төмен көптеген түрлі сорттар культивирлеу кезінде индивидуальды сипаттамаға ие. Және олар бір обьектіден екінші обьектіге ауыстырыла алмауымен байланысты. Сонымен қатар соңғы жылдары біздің елімізде жаңада түрлі сорттар алынып жатыр.
Алма мен шиенің клональды микрокөбейтілуі технологиялық тізбекте ризогенез сатысын жасау және жетілдіру маңызды актуальды мәселе болып табылады және біздің зерттеулеріміздің бағытын анықтайды [6,7].
Экспланттарды іn vitro культураға енгізуде әсер ететін бірінші дәрежелі фактор заласыздандыру болып табылады. 0,4% сынап нитратының ерітіндісін залалсыздандыру экспозициясы 45-50 секунд болғанда, ең тиімді, эффективтізалалсыздандыру жүреді. Бұл 22,5% ға контаминацияны қысқартып, 3-6 минут 6% кальций гипохлорид ерітіндісімен салыстырғанда 20,0% экспланттардың максимальды регенерациясына 80% қол жеткізуге болады.
Алма мен шиені іn vitro культураға енгізудің оптимальды мерзімі өркендердің белсенді өсу фазасына (маусым) сәйкес келеді.Үстіңгі және қолтық бүршіктер тек бір ай культивирленген соң барлық экспланттар дамудың сәйкес келеді.Үстіңгі және қолтық бүршіктер тек бір ай культивирленген соң барлық экспланттар дамудың 3 және 4 фазаларына жетті. Ең жақсы регенерациялық қасиетке өлшемі үлкен(1,5 mm) , ірі экспланттар ие,бұларды бірінші пассажда клондай беруге болады [6].
Экспланттарды іn vitro культураға енгізу мен микроклональды кбейтуге әсер етуші маңызды факторлардың бірі қоректік ортаны дұрыс таңдау болып табылады.
Жүргізілген эксперименттер үшін И.М.Фарузинова ұсынған қоректік орта қолданылады. Бұл орта ауыл шаруашылығында, биотехнологияда, оның ішінде шиені микроклональды көбейту үшін пайдаланылады. Қоректік орта Мурасиге-Скуг ортасының макро және микро тұздарының жартылай концентрациясы негізінде жасалады өсу стимуляторы ретінде ортаға 15-30 тамшы лимонник тұндырмасын қолданылады. Бұл қоректік орта Д.В.Лейн мен А.И.Здруйковский-Рихтер жасаған, шиені биотехнологиялық көбейту үшін қолданылатын белгілі қоректік орталарға қарағанда, бірқатар артықшылықтарға ие [7].
Бұл орталардың кемшіліктері: экспланттар диффиренциясы мен өркендердің дамуының ұзақ периоды, салыстырмалы жоғары емес көбею коэффициенті, қолданылатын өсу стимуляторларының қымбат болуы.
Н.М.Фардзинова ұсынған қоректік ортаның ерекшелігі көбею мерзімінің қысқаруы, қоректік орта бағасының құнының төмендеуі болып табылады.

1.3 In vitro жағдайында сүйекті дақылдарды микроклональды көбейтудің ерекшеліктері
Ең алғаш рет микроклональды көбейтуді ХХ ғасырдың 50-ші жылдары француз ғалымы Жорж Морель орхидеялармен жүргізді. Ол өзінің жұмыстарында өсімдіктердің апикальды меристемаларын культивирлеу техникасын пайдаланды. Осы жолмен алынған өсімдіктер вирустық инфекциялардан таза болған.
Біздің елімізде өсімдіктерді меристема әдісімен сауықтыру және клональды көбейту бойынша жұмыстар 60-шы жылдары ҒА КСРО К.А.Тимирязев атындағы өсімдіктер физиологиясы институтында басталды [1]. Микроклональды көбейту-бастапқы эксплантқа генетикалық ұқсас өсімдіктерді іn vitro жағдайда алу ( in vitro жағдайында өсімдіктерді вегетативті көбейту әдісі). Микрокөбейтудің негізі-өсімдіктердің сома клеткасының уникалды қасиеті-тотипотенттік клеткалардың бүтін организмнің генетикалық потенциалын толығымен іске асыру қабілеті [2].
Қазіргі кезде іn vitro жүйеде ауыл шаруашылық дақылдарды микроклональды көбейтудің әр түрлі әдістері актуалды болып отыр.Мысалы: қолтық және адвентивті бүршіктермен көбейту, тікелей емес морфогенез, сомалық эмбриогенез. Бұл әдістерді пайдалану мынандай мүмкіндіктер береді:
- селекциялық процесті жылдамдату, осының нәтижесінде өнім алу мерзімі
0-12 жылдан 2-3 жылға дейін қысқарады;
қысқа мерзім ішінде сауықтырылған, вирустан таза материал, генетикалық
бастапқы өсімдікке ұқсас материал алуға болады,
- лабораториялық жағдайда жұмыс істеп, белсенді өсіп келе жатқан
өсімдіктерді жыл бойы өсіру;
- өсімдіктерді сыртқы ортамен байланыссыз өсіру, яғни мұнда қолайсыз
абиотикалық факторлар әсер етпейді;
аз ауданда өсімдіктердің максималды санын алу;
Қысқа мерзімде қиын көбейетін және вегетативті жолмен көбейе алмайтын өсімдіктер санын көбейту, өсімдік материалын ұзақ уақыт (3жыл) in vitro жағдайында сақтау; (жаңа коректік ортаға көшірмей отырып [3, 4] өсімдіктердің құнды формалары мен жеке мүшелерін ұзақ уақыт сақтайтын банктер құру;
сауықтырылған in vitro материалдарына криосақтау әдістерін жасау [5, 6].

Сүйекті жемісті дақылдарды микроклональды көбейту сатылары және вирустық инфекцияға тексеру
Микроклональды көбейту процесі бірнеше сатылардан тұрады. Олардың негізгі сатылары [7, 10]:
- эксплантты in vitro жағдайға енгізу;
- микрокөбейту;
- микроөркендерді тамырландыру процесі;
- тамырланған өсімдіктердің стерильді жағдайдан стерильді емес жағдайға шығуын іске асыру;
Өсімдіктерді in vitro микрокөбейту әдісінде вируссыз өсімдік материалын жылыжайда вирус тасымалдаушылары жоқ жерде өсіру маңызды кезең болып табылады. In vitro культураға енгізуге қажет экспланттардың донор өсімдіктерін вирусқа, микоплазма және бактериалды инфекцияға ПЦР диагностика немесе молекулалық гибридизация , иммуноферменттік анализ арқылы тексереді [10, 11]
Иммуноферменттік анализ қысқа мерзімді сүйекті дақылдарды зақымдайтын вирустардың көпшілігін анықтауға мүмкіндік береді.Мысалы, алшаның (қара өрік) ергежейлік вирусы, сүйектілердің некрозды сақиналы дақ, қара өріктің потивирусы,черешняның неповирусы. Иммуноферментті анализ арқылы таза клондарды серологиялық тест және индикатор арқылы өсімдіктерді тексереді. Тест нәтижесінде вирустан, патогендерден таза деп көрсетілген өсімдіктер вируссыз базисті клондар деп атайды. Инфекция анықталған жағдайда бастапқы өсімдіктерді қайта сауықтыруға болады. Сүйекті дақылды өсімдіктерді вирустан сауықтыру үшін құрғақ ауамен термотерапия пайдаланады. Хемотерапия қоректік орта құрамына in vitro жағдайда вирустық инфекцияның дамуын тежейтін заттарды қосуға негізделген [11].
Кейде бактериалды микрофлораны анықтау үшін қоректік ортаға әр түрлі органикалық қоспалар, мысалы, сапрофитті микроогранизмдердің дамуына ықпал ететін казеин гидролизаты [7, 12].
Инфекцияның бар жоғын 7-10 күннен соң анықтайды. Таза эксплантарды жаңа қоректік ортаға ары қарай культивирлеу үшін отырғызады. Осы сатыда өсу факторлары қосылмаған қоректік орталарды тәжірибеден сынақтан өткізеді [7].

1.4 In vitro культураға енгізу және сүйекті жемісті дақылдарды микрокөбейту
Сүйекті жемісті дақылдарды клональды микрокөбейту эксплант көзі ретінде әдетте төбе және жанама бүршіктерді , сонымен қатар меристемалық төбеледі де пайдаланады. Төбе меристемаларынбөліп алуды өсімдік материалын сатылы стерильденген соң жалпы қабылданған әдістемелер бойынша жүргізеді [13, 16].
Сүйекті дақылдарды микроклональды көбейтуде әр түрлі қоректік орталар пайдалану: шиені микроклональды көбейту үшін Пмерик, Готре, Уайт, Хеллер орталары [12,17] шие мен қара өрік (слива) Розенберг ортасын (модификацияланған) [18] және қара өрік үшін Лепуабра, В5 орталарын [12,19] пайдаланады. Алайда шие мен черешняны өсіру үшін ең қолайлы қоректік орта Мурасиге-Скуг қоректік ортасы болып табылады [12, 16, 17, 19]. Сүйекті жемісті дақылдарды микроклональды көбейту кезеңіне байланысты қоректік орталарға 0,2-2 мгл концентрацияда 6-бензиламинопурин (6-БАП) қосады.[5, 8, 13, 17]. In vitro культураға енгізу кезінде цитокининнің төмен концентрациясын 0,2 мгл БАП пайдаланады [8, 20]. Қолтық бүршіктердің пролиферациясын өркендердің көп санын алу мақсатымен индукциялау үшін шиені 0,5-2 мгл БАП қосып өсіреді [5, 8, 12, 13, 17].

1.5 Микроөркендерді тамырландыру процесі
Тамырландыру кезеңі ерекше назарды қажет етеді. In vitro тамырландыру процессі сорт ерекшеліктері [5, 20], жүргізілген пассаж саны, ауксин типі мен концентрация мен оны пайдалану тәсіліне байланысты болады [10]. Сүйекті жемісті дақылдарды толық қалыптасқан микроөсімдіктерін алу үшін ортадан 6-БАП алып тастайды,өйткені 6-БАП ризогенез процестерін тежейді. Керісінше ортаға ауксиндер, негізінен β - индолил - 3 май қышқылы ( ИМК) қосады [5, 8, 10, 13, 16, 18]. Қоректік орта құрамындағы ИМКның оптимум концентрациясы 0,5-1 мгл аралығында болады [8, 17, 18]. Ортада 2мгл ИМК болса гипертрофты тамырлар пайда болуын тудырады [17]. Тамыр түзілуін индукциялайтын индукторларда салыстырмалы зерттегенде (ИМК, ИСҚ, нафтил сірке қышқылы(НУК)), 6 мгл концентрацияда ИСҚ-ның белсенділігі анықталды [10]. НСҚ бар ортада шиенің микроқалемшелерінің тамырлануы жоғары болады [8,17].
Сүйекті дақылдардың пробиркадағы өсімдіктерінің эффективті тамырлануында тек стимулятордың типі емес, сонымен қатар оны енгізу, пайдалану мақсатында маңызды орын алады. Ризогендіиндукциялау үшін өркендердістерильді сулы ерітінді де (25-30) мгл алдын ала ИМК-да ұстайды, экспозиция 12-24 сағат [8, 12, 13, 17] жүргізілген эксперименттер микроқалемшелерді ИМК ерітіндісімен өңдеу оны культурада ортаға енгізуден тиімді болғанын көрсетті. Ризогенді индукциялаудың тағы бір әдісі - сүйекті дақылдардың өркендерін құрамында ауксин бар (0,125%- 0,25%) ИМК ұнтағымен [12, 16, 17] және 0,25%-0,5% концентрациядағы ИСҚ [17] өңдеу. Осы гормональды ұнтақты пайдаланғанда, ризогенеиндукторларының жоғары эффективтілігі байқалды [10].
Ризогенез процессі модификацияланған МС және Уайт орталдарында интенсивті жүреді [17]. Басқа мәліметтер бойынша [16] Хеллер ортасы (макроэлементтер, витаминдер қосылған) және екі есе сұйылтылған МС ортасы (мезоинозит қосылмаған, сахароза деңгейі төмендетілген 15 мгл ) қолайлы деп есептеледі. Көп жағдайда сүйекті дақылдардың өркендерін тамырландыру үшін Мурасиге Скуг ортасы пайдаланылады [16-18].

1.6 Микроклональды көбейту әдістері
Өсімдіктер in vitro микроклональды көбейтудің бірнеше әдістері бар:
- Қолтық бүршіктермен көбейту әдісі
- Адвентивті бүршіктермен көбейту әдісі
- Тікелей емес морфогенез
- Сомалық эмбриогенез in vitro регенерацияның кез келген типі үшін Төрт факторлады бөліп қарастыруға болады:
- Генотип, бастапқы өсімдіктің жағдайы;
-Өсіру әдістері мен шарттары;
Қоректік орта құрамы, эксплантты стерильді жағдайға енгізу ерекшеліктері [1]: Микрокөбейту тиімділігіне генотиптің әсері. Өсімдіктердің асептикалық культивирлеу жағдайларына реакциясы сорт ерекшеліктеріне байланысты болады және сүйекті, жемісті дақылдардың әр түрлі регенерациялық қабілетіменен сипатталады [15]. Мысалы, шиенің жаңа сорттарын жылдам көбейту үшін клональды микрокөбейту әдісін пайдаланғанда сорттық ерекшеліктер басымдырақ фактор екені байқалады.
Сорттық ерекшеліктер пролиферация сатысында да, тамыр түзілу сатысында да байқалды [5].
Жемісті дақылдардың бір түрінің әр түрлі реакция болатыны байқалды [15]. Сонымен қатар Cerasus vulgaris, C.maachii,C.frutika,Padus racemosa түрлері арасындағы гибридтерде in vitro ұрық культурасында морфогенетикалық потенциалдың іске асуы негізінен генотиппен аз дәрежеде қоректік орта құрамымен анықталды [14].

1.7 Дақылдандыру жағдайы
Өсімдіктерді микрокөбейтудің сәтті болуы тағы бір факторға байланысты, бұл - культивирлеу жағдайлары: 22-26˚С шие мен черешня үшін [8,17] және қара өрік үшін [14], жарық шие мен черешня үшін 2000-5000лк [8, 10, 17] және қара өрік үшін 3500 лк [9,10] 16 сағат фотопериод. Микроөсімдіктер клима камераларда немесе режимі реттелетін бөлмелерде өсірілуі керек. Шие сорттарында пролиферация сатысында көбею коэффицентінің артуы қоректік орта құрамындағы минералды құрамының кезектесуі мен көк түсті лампаларды пайдалануға мүмкіндік береді [12].
Сүйекті дақылдардың өркендерінің көпшілігі отызға дейін регенеранттар горизонтальды болып тұрғанда түзілуі мүмкін [17]. Алғашқы пассаждарда көбею коэффициентін арттыру үшін бүршіктер мен өркендер болмай-ақ, қоректік ортаға бүтін күйінде отырғызу керек. Осы тәсілді пайдаланғанда көбею коэффициенті бірден артып, сортқа байланысты бір пассажда 40-70 болуы мүмкін.

1.8 Қолтық бүршіктермен көбейту әдісі
Микроклональды көбейтудің ең сенімді әдісі өсімдіктерді қолтық бүршіктері арқылы регенерациялау әдісі болып табылады [9]. Бұл әдістің артықшылығы, бастапқы генотипті жылдам көбейту және бұл кезде фенотиптік, генотиптік тұрақтылық сақталады. In vitro микрокөбейтудің потенциалды мүмкіндіктері қоректік ортаға цтиокининдердің қосылуымен іске асады. Цитокининдер төбе бүршіктің дамуын тежеп, қолтық бүршіктің түзілуін стимулдейді [16].
Шиенің бөліп алынған төбе меристемалары культурасының әдісі бойынша микроклональды көбейту процесінің негізі отырғызылатын материалдың генетикалық біртектілігін қамтамассыз етеді [8].
Алынған in vitro материалдың генетикалық тұрақтылығы көбейту моделіне байланысты тәуелді болады. Сүйекті жемісті өсімдіктерді көбейту процессі қолтық меристемаларының пролиферациясымен байланысты. Генетикалық тұрақтылық - меристеманың ажырамас қасиеті. Меристеманың бұл қасиеті in vitro жағдайында сақталады, егер ол каллус түзілуін тежейтін жағдайда өсірілген болса...Егер каллус түзілуін стимулдейтін орта болса, генетикалық вариабельдік пайда болуы мүмкін [17].
Бұдан да жоғары көбею коэффициетін алу үшін қоректік орталарды каллус ұлпаларының дамуын стимулдейтін ауксин топтарын қосады. Осы препараттардың комбинациясын каллус ұлпаларында органогенезді индукциялау үшін пайдаланады. Каллус жүйесінде өркеннің құрылысы каллус клеткаларының меристематизациясын стимулдей отырып, органогенез процестеріне әсер етуі мүмкін. Клеткалардың пролиферациясың жүргізетін өсу реттегіштерінің концентрациясы өзгерсе, алынатын материалдың генетикалық тұрақтылығына әсер етеді [17].

1.8 Адвентивті бүршіктермен көбейту әдісі. Тікелей емес морфогенез
Адвентивті бүршік деп - тікелей өсімдік клеткасынан, эксплант клеткаларынан пайда болған бүршіктерді айтады [2]. Адвентивті бүршіктер каллус ұлпасынан түзілген меристемалық зоналардан пайда болады. Адвентивті бүршіктер меристемадан да меристемалық емес ұлпаларданда түзіле береді. Адвентивті бүршіктердің түзілуі көптеген өсімдіктерде қоректік ортадағы цитокининдердің ауксиндерге жоғары қатынасымен индукцияланады.
Өркендердің тамыр мен эмбриодтардың экспланттарының сома клеткаларынан регенерациясы тікелей емес регенерация - каллус түзілуі, өркеннің пайда болуы арқылы немесе тікелей регенерация арқылы жүреді [12].
Адвентивті бүршіктер жапырақ, тамыр экспланттарында өсімдіктердің басқада мүшелерінен пайда болады [16-18].
Өркендерді экспланттардан тікелей алуды қөбінесе өсімдіктерді клондау үшін пайдаланады,алайда бұл кезде генетикалық тұрақсыз өсімдіктер пайда болуы мүмкін [2]. Сондықтан өсімдіктерді регенерациялаудың осы әдісін генетикалық әр түрлі өсімдіктерді индукциялау үшін пайдалануға болады.
Регенерант өркендер жапырақтың әр түрлі бөлігінен индукциялануы мүмкін. Алайда жапырақтың сабақ жағының регенерациялық қабілеті жоғары болады. Сонымен қатар, жапырақтардың морфогенетикалық потенциалы олардың сабақтың жоғары жағында орналасуы мен артады. Қосалқы бүршіктер дамып келе жатқан жапырақтың жас меристема ұлпаларынан регенерацияланады. Алайда кәрі жапырақтарды пайдаланғанда генетикалық өзгерген өркендер көбірек пайда болады [11].
Шие, черешня, абрикос, шабдалы секілді сүйекті жемісті культуралардың өркендерінің регенерациясы үшін әр түрлі орталар қолданылады. Мурасиге Скуг, Ллайд-Мак Коун , Драйолер және Куниюки, Курен мен Лепуабр [9].
Шие мен черешняның адвентивті регенерация бойынша эксперименттері үшін көбінесе Ллайд пен Мак Коун, сүйекті өсімдіктер үшін Woody Plant Medium (WPM) қолданылады [13, 14].
Цитокининдердің ішінен негізінен 6-БАП, тидиозурон (TPZ), ауксиндерден - НСК [15], ИМК [16], 2,4 дихлорфенолоксірке қышқылы (2,4 D) [14] пайдаланылады.
Шетел зерттеушілерінің ішінде [12, 13] TPZ мен БАП арқылы өркендердегі регенерация процесін эффективті жүргізу жайында нақты тұжырым жоқ. Эксплант типтерін культивирлеу әдісі туралы пікірлер бір жерден шықпайды.
Регенерация процесінің жоғарғы пайызы черешняның бүтін жапырақ экспланттарында байқалды. Бұл экспланттарда WPM ортасына 2,27 немесе 4,54 мМ TPZ+ 0,27 мМ НСҚ қосып өсірген [14]. Бір жағынан жұмыс барысында БАП TPZ ға қарағанда шие мен черешняның жапырақтарынан регенарация жүргізгенде эффективті екені көрсетіледі. Сонымен қатар БАП 2 мгл және НСҚ 1 млл концетрацияда шие мен черешня үшін өсу реттегіштерінің оптимальды комбинациясы екені анықталды. Регенерацияның көп жиілігі WPM ортасында алынды, алайда бұл МS, QL, DKW орталарына қарағанда каллусогенезді көбірек стимульдейді. Каллус түзілуі эффективтігі жапырақ сегметтерінің жалпы типіне байланысты екені анықталды. Каллус түзілуі бойынша жоғары көрсеткіштер орташа жапырақ сегменттерінде, ал төмен көрсеткіштер төбе сегменттерде, ал тікелей регенерация базалы сегменттерде болады.
Қара шиенің адвентивті регенерациясы көбінесе жапырақ экспланттарының TPZ мен толықтырылған WPM ортасында культивирлегенде жүрді [14].
Жабайы шиенің адвентивті регенерациясы эффективтігіне эксплант мөлшері әжептеуір әсер еткен. Экспланттың өлшемі адвентивті бүршіктердің түзілуінде маңызды орын алатын нәтижелер көрсетті.
Ұзындығы 3-5 мм жапырақтар адвентивті бүршіктерді көбірек түзген. Жабайы шиенің адвентивті регенерациясы үшін 0,54 мМ НСҚ және 4,4 мМ толықтырылған WPM орта қолданылды [15].
Черешняның жапырақ экспланттарын культивирлеуге дейін алдын-ала өңдеу адвентивті бүршіктерді эффективті индукциялайды [12].

1.9 Материалды таңдау және дайындау
Стерильді жағдайда культивирлеу кезінде экспланттар көзі ретінде өсімдіктердің вегетативті және генеративті мүшелерін пайдаланады. Қойылған мақсаттарға байланысты бұл бүршік, сабақтың апикальды ұшы, сабақтың тамырдың тозаңқаптардың бір бөлігі болуы мүмкін. Әдетте микроклональды көбейтуде төбе және бүйір бүршіктерді сонымен қатар меристемалық төбелерді де пайдаланады. Меристемалық төбе өлшемі 200-500 мкм бастапқы жапырақтардан тұрады. Меристемалық төбені 30-40 есе үлкейтетін бинокуляр астында арнайы құралдармен бөліп алады.
Бүршіктерді ашық жерде де, жылыжайдағы өсімдіктерден де алуға активті өсу фазасында алған дұрыс. Өйткені осы периодта алынған материалдың тіршілік қабілеті жоғары болады.
Бүршіктерді бастапқы материалдан бөліп алғаннан кейін сумен жуады. Осының алдында үстінгі жапырақтардан тазартады, құбыр су астында 1-2 сағат тұрады. Кейін дистилденген сумен шаяды.
Материалды сапрофитті микрофлорадан тазартады. Өсімдік обьектілерін стерилизациялау үшін әдетте 0,1% диацид, 0,1% сулема гипохлорит натрий немесе кальций гипохлоридтің ерітінділерін пайдаланады. Обьектіге байланысты қарапайым немесе сатылы стерилизацияны таңдайды. Қарапайым стерилизация дегеніміз - обьектіні бір ғана стерильдеуші агентпен өңдеу. Ал сатылы стерилизация - бірнеше агенттермен өңдеу. Егер қарапайым стерилизация тиімді болмаса, сатылы стерилизацияны пайдаланады. Бұл жағдайда материалды сулема немесе диацид ерітіндісіне салмай тұрып, 0,2% -тік бенлат ерітіндісімен немесе 70% спиртпен өңдейді.
Шие бүршіктерін стерилизациялауды былайша жүргізеді. Материалды сумен шайып болған соң, оны алдын-ала автоклавталған дәке қалталарға салып, сулема немесе диацид ерітіндісіне 9 минут салады. Материалды 20 минут бойы стерильді дистилденген сумен шайып, Петри табақшаларына ауыстырады. Эксплант көзі ретінде 0,8 см сабақ бөлігімен бөліп алынған бүршіктерді пайдаланғанда, культураға енгізу сатысында экспланттардың инфекциялануы 30% құрайды.
Ал меристемалық төбелерді пайдаланғанда инфекция тіпті болмайды.
Стерилизация тиімділігін экспланттардың инфекциялану дәрежесіне қарай бағалайды.
Эксланттарды in vitro культураға енгізу кезінде эксплантатардың сапрофитті микрофлорамен зақымдануын тексеретін тест жүргізу ұсынылады.
Бұл жағдайда эксплататтарды стерилизациядан кейін өсу реттегіштері қосылмаған қоректік ортаға отырғызады.
Кейде бұл қоректік ортаның құрамына тек минеральды тұздар мен қанттар кіруі мүмкін. Микроорганизмдер жылдам өсу үшін мұндай орталарды казеин гидролизатымен 5-10 гл байытады. Осындай орталарда 7-10 күн культивирлегеннен кейін сапрофитті микрофлорамен зақымдалған, инфекцияланған эксплантаттар бірден айқындалады. Таза эксплататтарды ары қарай культивирлеу үшін құрамында компоненттердің барлығы қосылған қоретік ортаға көшірді. Мұндай тәсіл өсу реттегіштері мен кейбір препараттарды (витаминдер, мезоинозит) үнемдеуге мүмкіндік береді.

1.10 Эксплантаттардың даму сипаттамасы
Экспант көзі ретінде алынған меристемалық төбелер жасанды қоректік орталарда культивирлегенде, in vitro жағдайға енгізілгеннен кейін екі аптадан соң дами бастайды. Ең бірінші бастапқы жапырақтар өсе бастайды. Төрт апта бойы культивирлегенде, олардың ұзындығы 0,3-0,5 см, ал ені 0,2-0,4 см-ге жетеді. 4-5 апта арасы өткен соң эксплататтарды жаңа коректік ортаға отырғызады. Бірінші пассаждың көбею коэффициенті барлық зерттелініп отқан сорттарда бірге тең болады, яғни қосымша өркендер түзілмейді. Екінші пассажда қосымша бүршіктер пайда болады, яғни осы пассаждан бастап пролиферация процесі бақыланады. Бұдан кейінгі пассаждарда, қалемшелерде бірнеше бүршіктер мен өркендер пайда болады. Мұндай өркендердің саны бүршіктерден 4-5 есе аз болады. Шие сорттарының ішінде үшінші пассажда өркендер түзуге тек Владимирская сорты қабілетті. Қосымша бүршіктер мен өркендер жапырақ қолтықшасында пайда болады. Барлық зерттелген сорттардың экспланттары төртінші пассаждан кейін өркен түзе бастайды. Осының нәтижесінде өркендер мен бүршіктер санының көбеюі есебінен көбею коэффициентінің артуы бақыланады. Бесінші пассажда көбею коэффициенті өзінің максимальды шегіне жетеді. Алайда тек бір сортта Молодежная көбею коэффициенті біршама төмендейді. Алтыншы пассажда көбею коэффициенті барлық сорттар мен қалемшелерде төмендейді. Тек Молодежная сортында біршама көбейеді. Көбею коэффициентінің төмендеуі түзіліп жатқан өркендер санының кемуі есебінен жүреді. Осылайша культивирлеу процесі көбею коэффициенті пассаж санына байланысты болады. Бесінші пассаждан кейін экспланттардың прлиферацияға қабілеті азаяды.
Алғашқы пассаждарда көбею коэффициентін ұлғайту үшін бүршіктер мен өркендер конгломераттарын жеке бірліктерге ажыратпай, жаңа коректік ортаға отырғызады. Бұл әдісті пайдаланғанда көбею коэффициенті бірден өсіп, бір пассажда 40-70-ке жетуі мүмкін.
Микроклональды көбейту әдісін пайдаланғанда бір пассаждан шие формасына, сортына байланысты тамырлануға қабілетті 5-10 өркен алуға болады.
Осылайша 5 пассаждан көбею коэффициенті 625-10000-ға жетеді. Өркендердің әртүрлі тамырлануын есепке ала отырып (78-96%), пробиркалық өсімдіктердің шығымы 487-600 ден 7800-9600 дана болуы мүмкін.

1.11 Өркендерді тамырландыру
Қоректік орта құрамында қолтық бүршіктері мен өркендердің пролиферациясы үшін қолданылатын 6-бензиламинрпуриннің болуы ризогенез процесін кері ықпадл етеді.
Микроклональды көбейту процесінде толығымен жақсы дамыған өсімдікетер үшін көбейтілген өркендерде тамыр түзілуін индукциялайтын, арнайы культивирлеу фазасын енгізу керек. Арнайы тәжірибелер нәтижесінде ұзындығы 7мм өркендер нашар тамырланатыны анықталды. Бұл өркендер тамырланғанның өзінде өсуі тежеліп, стерильді емес жағдайға көшіргенде төзімсіз болуы мүмкін. Қоректік орта құрамында 6-БАП концентрациясы 1мгл және бұдан да көп болғанда культивирлегенде мұндай өркендердің үлесі 80% -ті құрайды. Ұзындығы 15-20мм өркендер алу үшін, өркендерді 6-БАП концентрациясы төмендетілген (0,1 - 0,2 мгл) қоректік орталарға отырғызу қажет. Мұндай қоректік ортаға отырғызылған бүршіктер мен өркендер 3-5 аптадан кейін қажетті ұзындыққа дейін өседі. Бұл тамырландыру пайызын 2 есе жоғарлатады.
Сынақтан өткен ризогенез индукторлары ішінен ең тиімдісі, эффективтісі - β индолил май қышқылы (ИМҚ). Бұл ризогенез индукторының аппликация тәсілдері әр түрлі болуы ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.