Нуклеотидтердің ДНҚ тізбегіндегі орналасу тәртібін анықтау әдістері

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 8 бет
Таңдаулыға:

Қазақстан Республикасының білім және ғылым министрлігі

Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық Университеті

Биология және биотехнология факультеті

Биотехнология кафедрасы

Реферат

Тақырыбы: Нуклеотидтердің ДНҚ тізбегіндегі орналасу тәртібін анықтау әдістері. Максам-Гильберт және Сэнгер әдістері.

Орындаған: Омарғалиева Е. Ж.

БТ18-16

Тексерген: Алтыбаева Н. А.

2020 жыл

Жоспар

Кіріспе
Негізгі бөлім

Нуклеотидтердің ДНҚ тізбегіндегі орналасу тәртібін анықтау әдістері.

Максам-Гильберт және Сэнгер әдістері.

Қорытынды
Пайдаланылған әдебиеттер

Кіріспе

Өткен ғасырдың 50-ші жылдары полипептидтік тізбектегі аминқышқылдарының тізбегін анықтауға мүмкіндік беретін әдістер жасалды. Теориялық тұрғыдан алғанда, бұл қиын емес, өйткені табиғи ақуыздарда кездесетін барлық аминқышқылдары әртүрлі қасиеттерге ие. Генетикалық кодтың оқылуы ашылғаннан кейін ақуыздардағы амин қышқылдары тізбегі бойынша транскриптелген ДНҚ-дағы нуклеотидтер тізбегін қалпына келтіру мүмкіндігі пайда болды. Алайда, генетикалық код дегенеративті, сондықтан аминқышқылдарының тізбегін талдау негізінде алынған ДНҚ-ның бастапқы құрылымы бір мәнді емес.

Әрине, ДНҚ-ның нуклеотидтер тізбегін анықтау көптеген іргелі және қолданбалы тапсырмалар үшін өте маңызды. Бұл ғылымда ерекше орын алады: геномдарды жүйелеу нәтижелерін талдау үшін іс жүзінде жаңа ғылым - биоинформатика құрылды. Секвенирлеуді қазір молекулалық биологтар, генетиктер, биохимиктер, микробиологтар, ботаниктер, зоологтар және эволюционистер қолданады: қазіргі заманғы жүйенің барлығы дерлік оның нәтижелеріне негізделген. Жүйелілік медицинада тұқым қуалайтын ауруларды іздеу және инфекцияны зерттеу әдісі ретінде кеңінен қолданылады.

Нуклеотидтердің ДНҚ тізбегіндегі орналасу тәртібін анықтау әдістері.

Максам-Гильберт және Сэнгер әдістері.

Қазіргі уақытта қалыпты ұзындықтағы ДНҚ - ның кез-келген сегментінің нуклеотидтер тізбегін дәл анықтау өте маңызды мәселе болып табылады. Про-және эукариоттардың бірнеше жүздеген гендерінің тізбегі анықталған. Геннің реттілігі мен генетикалық кодын біле отырып, ол кодтайтын ақуыздың аминқышқылдарының тізбегін анықтау оңай. Бұрын ақуыздың құрылымын анықтау үшін оқшауланған және тазартылған ақуызға мұқият және көп уақытты қажет ететін талдау жасау керек еді, ал қазір ақуыздың құрылымын нуклеотидтер тізбегі арқылы тікелей реттілікке қарағанда анықтау оңайырақ. Егер ақуыздың реттілігін анықтау бірнеше айға, тіпті жылдарға созылса, онда ДНҚ-ның реттілгі бірнеше аптадан кейін анықталуы мүмкін. Сонымен, 2000 жылы Адам геномы секвенирленді, бірақ бұл жағдайда біз тек нуклеотидтердің тізбегін анықтау туралы айтып отырмыз, өйткені геномның жеке бөлімдерінің генетикалық құрылымы мен функциялары әлі анықталмаған, бұл неғұрлым күрделі міндет.

Өткен ғасырдың 60-жылдарының аяғында Ф. Сэнгер РНҚ полимеразасын қолдана отырып, ДНҚ матрицасынан алынған РНҚ секвенирлеу әдісін жасады. Осы әдісті қолдана отырып, Ш. Вейсман мен В. Фирс 1976 жылдың аяғында ұзындығы 5200 нуклеотидті жұптан асатын SV40 ДНҚ молекуласының жартысынан көбінің тізбегін анықтай алды. Келесі қадам ДНҚ-ны тікелей секвенирлеу әдістерін жасау болды.

ДНҚ-ны тікелей ферментативті секвенирлеудің алғашқы әдісі 1975 жылы Ф. Сэнгер мен Д. Коулсон ұсынған әдіс болды ("плюс минус" әдісі) . Полимеразды көшіру реакциясында матрица ретінде ДНҚ - ның бір тізбекті фрагменті, синтетикалық олигонуклеотидтер немесе шектеуші эндонуклеаздардың гидролизі нәтижесінде алынған табиғи субфрагменттер, ал фермент ретінде Escherichia coli полимераза I (Poll) Кленов ДНҚ фрагменті қолданылды.

Бұл әдіс екі кезеңнен тұрды. Алдымен, шектеулі жағдайларда (dNTP) барлық төрт түрінің қатысуымен лимеразды реакция жүргізілді (олардың бірі фосфаттың а-позициясы бойынша белгіленген), матрицалық фрагментті толық емес көшіретін өнімдер жиынтығын алу. Қоспа байланыссыз dNTP-ден тазартылып, сегіз бөлікке бөлінді. Содан кейін "плюс" жүйесінде төрт реакция нуклеотидтердің төрт түрінің әрқайсысының қатысуымен, "минус" жүйесінде-олардың әрқайсысы болмаған кезде жүргізілді. Нәтижесінде, "минус" жүйеде терминация осы типтегі dNTP алдында, ал " плюс " жүйесінде одан кейін пайда болды.

Осылайша алынған Сегіз үлгі электрофорез арқылы бөлінді, сигналды "оқыды" және бастапқы ДНҚ тізбегін анықтады. Осылайша, 5386 нуклеотидті жұптардан тұратын фХ174 қысқа ДНҚ секвенирленді.

1977 жылы Ф. Сэнгер ферментативті жүйелеудің тағы бір әдісін ұсынды, ол трифосфаттардың аналогтарын (Терминаторлар әдісі) тоқтату әдісі деп аталды. Неғұрлым қуатты және технологиялық, біршама өзгертілген бұл әдіс әлі де қолданылады.

Бұл әдіс сонымен қатар Escherichia coli I-нің ДНҚ полимераза Кленова фрагменті арқылы ферментативті көшіруге негізделген. Синтетикалық олигонуклеотидтер праймер ретінде қолданылды. Синтездің нақты мерзімі реакция қоспасына dNTP-нің төрт түрінен басқа (біреуі фосфаттың а-позициясы бойынша радиоактивті түрде белгіленген), сонымен қатар 2', 3'- (ddATP ddTTPddCTP немесе ddGTP) қосылуы арқылы қамтамасыз етілді, ол ажырап келе жатқан ДНҚ тізбегіне қосыла алады, бірақ 3'OH тобының болмауына байланысты одан әрі көшіруді қамтамасыз етпейді. dNTP/ddNTP концентрациясының қатынасы әр түрлі ұзындықтағы ДНҚ көшірмелерін алу үшін эксперименталды түрде таңдалды.

Осылайша, зерттелетін ДНҚ фрагментінің бастапқы құрылымын анықтау үшін төрт көшіру реакциясын жүргізу қажет болды: әр реакцияда терминаторлардың бір түрі болады. Осыдан кейін алынған өнімдер көрші жолдарда полиакриламидті гель арқылы жолақтардың орналасуы бойынша нуклеотидтер тізбегін анықтайды.

Сэнгер секвенаторынан шыққан кезде ДНҚ-ның қысқа бөліктері, яғни ридтар (reads) алынады. Биоинформатика үшін екі нәрсе маңызды: біріншіден, ридтардың (reads) ұзындығы қандай, екіншіден, оларда қандай және қаншалықты қателіктер жиі болуы мүмкін. Осы критерийлер бойынша Сэнгерлік ридтар өте жақсы: ұзындығы-мыңға жуық нуклеотидтер, ал сапасы 700-800 нуклеотидтерден кейін ғана айтарлықтай төмендей бастайды.

Ф. Сэнгердің айтуы бойынша жүйелеу процесінің өзі сапаның төмендеу әсерін анықтайды: массасы 700 молекуланы массасы 701-ден массасы 5-тен 6-ға қарағанда ажырату қиын. Тағы бір жағымсыз әсер: егер геномда нуклеотидтің бір түрінен тұратын ұзын тізбек болса, онда оның ұзындығын дәл анықтау қиын (барлық аралық массалар бірдей пробиркаға түседі, олардың кейбіреулері кездеспеуі мүмкін, бір-бірімен бірігіп кетуі мүмкін және т. б. ) . Дегенмен, Сэнгер секвенирациясы өте ұзақ зерттеулермен керемет нәтиже береді. Арзан, дәл, сондай-ақ автоматтандырудың салыстырмалы қарапайымдылығы бұл әдісті ДНҚ нуклеотид қалдықтарының тізбегін анықтайтын "алтын стандарт" етеді. Ал Адам геномын алғаш рет ашқан Сэнгер секвенирациясының көмегімен болды. Ф. Сэнгер бойынша секвенирлеу бүгінде қолданылады, бірақ ол басқа әдістермен алмастырылуда.

1976 жылы А. Максам мен У. Гилберт ДНҚ фрагментінің белгілі бір химиялық деградациясына негізделген, бір ұшынан радиоактивті түрде таңбаланған - химиялық деградация әдісі жасалды. Белгіленген ДНҚ препараты төрт аликвотқа бөлінді және әрқайсысы төрт негіздің біреуін немесе екеуін өзгертетін реагентпен өңделді. Авторлар диметилсульфатпен пурин негіздерін өзгертуді ұсынды. Бұл жағдайда аденин қалдықтары азот бойынша 3-позицияда, гуанин-азот бойынша 7-позицияда метилденеді. ДНҚ үлгісін тұз қышқылымен 0°C температурада өңдеу метиладениннің бөлінуіне әкеледі. Сілтілі ортада 90°C температурада кейінгі инкубация ДНҚ-ның қант қалдығы-фосфат тізбегінің негізгі бөліну орындарында ажырауына әкеледі. Пиперидинмен өңдеу метилгуаниннің қалдықтары бойынша үлгінің гидролизіне әкеледі. Пиримидин негіздері гидразинмен өзгертіледі. Егер реакция тұзсыз ортада жүргізілсе, онда цитозин де, тимидин де өзгертіледі; егер өңдеу 2М NaCl қатысуымен жүргізілсе, онда тек цитозин өзгертіледі. ДНҚ тізбегін фрагменттерге бөлу пиперидинмен жүзеге асырылады. Полиакриламидті гельдегі электрофорез зерттелетін фрагменттің толық құрылымын қалпына келтіруге мүмкіндік береді.

Айта кету керек, ғылыми қауымдастық бұл жұмыстарды жоғары бағалады және 1980 жылы химия саласындағы Нобель сыйлығы У. Гилбертке - химиялық деградация арқылы ДНҚ - ны секвенирлеу әдістерін жасағаны үшін, Ф. Сэнгерге-ферментативті құрылым арқылы ДНҚ-ны секвенирлеу әдістерін жасағаны үшін берілді.

Секвенирлеу (ағылш. sequence - "реттілік") - ДНҚ молекуласында нуклеотидтер тізбегін құруға мүмкіндік беретін әдістердің жалпы атауы.

Максам-Гилберт Әдісі -ДНҚ-ны химиялық деградация арқылы секвенирлеу әдісі нақты реактивтердің әсерінен таңбаланған ДНҚ фрагментінің шектеулі бөлінуіне негізделген. Бұл әдісті жүйелеудің міндетті шарты-ДНҚ фрагментінің болуы, тек бір ұшымен белгіленеді. Нуклеотидтер тізбегін анықтау-кейінгі авторадиографиядағы ПААГ-дағы ЭФ әдісі.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.