Ферменттің сайты

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

Қазақстан Республикасы Білім және ғылым министрлігі

әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті

Биология және биотехнология факультеті

Молекулалық биология және генетика кафедрасы

«Генетикалық инженерия »

Рестрикциялық эндонуклеазалар

Орындаған: Махашбай Асылзат Талғатқызы, 3 курс 18-42к

Алматы 2021ж

Реферат

Жұмыстың көлемі: 12 бет

Жұмыстың мақсаты:

Рестрикциялық эндонуклеазар түсінігін қарастыру;
Рестриктазалар қызметі мен классификациясына шолу жасау.

Жұмыстың міндеті:

Рестрикциялық эндонуклеазалар қызметін бөліп қарау

Тірексөздер: рестрикция, рестриктаза, рекомбинация, лигаза, гендік инженерия

Мазмұны

І. Кіріспе 4

ІІ. Негізгі бөлім

Рестрикциялық эндонуклеазалар 5

Рестрикция классификациясы8

Рестриктазалар номенклатурасы 10

ІІІ. Қорытынды 11
IV. Пайдаланылған әдебиеттер 12

І . Кіріспе

Генетикалық рекомбинацияның мәні - екі хромосоманың өзара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан көп тұкым қуатын анықтауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына әкеп соғатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті түрде сүтқоректілердің жыныс клеткалары пайда болғанда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендсрімен алмасады (кроссинговер - айқасу кұбылысы) . Осы алмасулар ұрпақтарға берілетін тұқым қуатын белгілердің араласуын түсіндіруге мүмкіндік береді.

Гендер алмасуын, сондай-ақ клеткаға “бөтен” геиді енгізуді генетикалық рекомбинация арқылы in vitro - организмнен тыс жасауға болады.

1972 жылы П. Бергтің лабораториясында (АҚШ, Станфорд университеті) ең бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның құрамына лямбда (X) бактериофагының геномы мен 5″ К40 вирус геномы кірді. [2]

Организмнен тыс рекомбинация әдісі, әр түрдің ДНҚ-ларын (табиғи немесе жасанды) бөліп алып, оларды бір-бірімен қосуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ-ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді. Рекомбинантты ДНК-ні құрастыру пайдаланылатын ферменттерді мынадай топқа бөлуге болады:

• ДНК-ге комплементарлы ДНК тізбектерін синтездейтін ферменттер: ДНК полимераза

• РНК-ге комплементарлы ДНҚ тізбектерін синтездейтін ферменттер: кері транскриптаза

• ДНК тізбектердің синтезін бастайтын (инициациялайтын) ферменттер: праймаза

• ДНК фрагменттерін қосатын ферменттер: ДНК - лигаза

• ДНК фрагменттері ұштарының құрылысын өзгертуге мүмкіндік беретін ферменттер: терминалдық трансфераза, поли-А-полимераза

• ДНК фрагменттерін түзуді катализдейтін ферменттер: рестриктазалар.

ІІ. Негізгі бөлім

Рестрикциялық эндонуклеазалар

Прокариоттық клеткалар бөтен ДНК-ны қабылдамай оны қайшы секілді қиып тастайды. Ол процесті рестрикция деп атайды. Ондай реакцияны катализдейтін ферменттерді рестрицияның эндонуклеазалы немесе рестриктазалар деп атайды.

1962 ж. Швейцариялық В. Арбер ішек таяқшасаның штаммдарында рестрикциялық жүйелердің болатынын анықтады. Онымен қоса ол рестриктазалар тек бөтен ДНК-ні ыдыратып, өз ДНКөсіне метилдеу арқылы тимейтіні табылды. 1970 ж. американдық ғалым Г. Смит Haomophilus influenzae ферментті бөліп алып, оның әсер ету механизмін зерттеген. 1971ж. американдық Д. Натанс рестриктаза көмегімен вирустың ДНК-ні жасау үшін қолдана бастады. Сондықтан рестриктаза гендік инженерида негзгі құрал болып есептеледі. 1

90 жылға дейін рестриктазалардың 500 аса түрі табылды. Олардың ДНҚ-нің әр жерінен қиятын орны немесе сайты бар.

Рестриктаза ЖНҚ-нің қос спиралінің тек арнаулы ретніде төрттен алтыға де інгі негіздерден тұратын бөлігін қыя алады. Ол арнаулы бөліктің ерекшелігі сол, оны ортадаға нүктемен 180 айналдырып керісінше оқыса да, мағынасы өзгермейді. Бұны екінші қатардағы симметриялық осі деп сипаттайды. Екінші сөзбен айтқанда оны плиндрон деп атайды. Екінші ерекшелігі - клетканың өз ДНҚ- сына рестриктаза тиіспецді, өйткені фермент қиятын сайты метилденген. Сондықтан рестриктзалар тек метилденбеген бөтен ДНҚ-ні бөлшектеп ыдыратады.

Гендік инженерияда қолданылатын рестриктазалардың сайты ДНҚ-нің әр жерінде жіне әр түрлі екені төмендегі кейбір ферменттердің тізімі көрсетеді.

Рестиктаза

Ферменттің сайты

Рестиктаза:

Hind III

BanH I

PSY I

ECOR Y

BSNR I

SANJA

Ферменттің сайты:

ААГЦТТ

- --
-- --

ТТЦГАА

ГГАТЦЦ

. . .

. . .

ЦЦТАГГ

ЦТЦГАГ

. . .

. . .

ГАГЦТЦ

ГАТАТЦ

. . .

. . .

ЦТАТАГ

ГГЦЦ

. . .

ЦЦГГ

ГАТЦ

. . .

ЦТАГ

Әр түрлі микроорганизмдерден бөлінген кейбір ферменттердің сайты бірдей болып шықты. Ондай ферменттерді изошизомералар деп атайды. Жоғарыдағы тізімдегі рестриктазалардан көрінгендей сайттардың нуклеотидтері 4-тен 6- ға дейін болады. 4 нуклеотидтерден тұратын сайттар 6 нуклеотидті сайттарға қарағанда ДНҚ бойында 15 есе жиі болуы мүмкін. Сондықтан генді бүлдіріп алмас үшін ммандар 6-сайттық рестриктазаларды пайдаланады. Гендік инженерияда «жабысқақ» ұштарды түзейтін рестриктазаларды да жиі қолданадды, өйткені «жабысқақ» ұшты ДНҚ-нің бөліктерін рекомбинанттық молекулаларды жасауға өте қолайлы.

Табиғатта рестриктазалардың басқа екі түрлі тобы болады. Оларды І және ІІІ топтар (гендәк инженерияда тек ІІ топты қолданады) бар. Олардың құрылысы күрделі келеді. Екі типті активтық орталықтары бар: модификациялайтын (немесе метилдейтін) және АТФ- қа тәуелді рестиктациялық эндонуклеаздық бөліктер.

Әрбір рестрикмент ферменті тек бір немесе бірнеше рестрикциялық орындарды таниды. Ол өзінің мақсатты дәйектілігін тапқан кезде, рестрикция ферменті ДНҚ молекуласында екі тізбекті кесінді жасайды. Әдетте, кесу шектеу аймағында немесе оның жанында орналасады және ұқыпты және болжамды түрде жүреді.

Рестрикциялық ферменттің ДНҚ тізбегін қалай танитынына және бөлетіндігіне мысал ретінде зертханаларда қолданылатын кең таралған рестрикменттік фермент - Eco RI қарастырайық. Eco RI келесі бөлімде қысқартылады:

EcoRI осы сайтты танып, оны анықтаған кезде, оны әрдайым ерекше үлгіде жасайды, нәтижесінде бір тізбекті ДНҚ «асып» кетеді:

Егер ДНҚ-ның басқа бөлігі қабаттасып тұрса (мысалы, оны EcoRI-мен кесіп тастаған болса), үстіңгі қабатты комплементарлы жұптастыру арқылы бір-біріне жабыстыруға болады. Осы себепті, бір тізбекті шығыңқыларды қалдыратын ферменттер жабысқақ ұштар түзеді деп саналады. Жабысқақ ұштар клондау үшін пайдалы, өйткені олар екі ДНҚ бөлігін біріктіреді және оларды ДНҚ-лигаза көмегімен байланыстыруға болады.

Барлық шектеу ферменттері жабысқақ ұштарды түзбейді. Олардың кейбіреулері мақсатты реттіліктің дәл ортасында кесілген және шығыңқы жерлер қалдырмайтын «доғал тістер». Sma I шектеу ферменті - кескіннің мысалы:

Доғал ұштары бар фрагменттерді ДНҚ-лигаза көмегімен бір-бірімен байланыстыруға болады. Алайда, доғал ұшты фрагменттерді байланыстыру қиынырақ (лигация реакциясы аз тиімді және сәтсіздікке ұшырауы ықтимал), өйткені ДНҚ молекулаларын позицияда ұстайтын бір тізбекті шығыңқылар жоқ.

Рестрикция классификациясы

II типті ферменттер

II типті ферменттер ДНҚ-ны олардың танылу дәйектілігіне жақын немесе шегінде белгілі бір позицияларда кеседі. Олар дискреттік реструкция фрагменттері мен гельдің нақты жолақ үлгілерін шығарады және зертханада күнделікті ДНҚ анализі мен гендерді клондау үшін қолданылатын жалғыз класс болып табылады. II типті ферменттер - бұл бір-бірімен байланысқан ақуыздар тұқымдасы емес, алуан түрлі типтегі байланыспаған ақуыздардың жиынтығы. II типтегі ферменттер көбінесе аминқышқылдарының бір-бірінен және кез-келген басқа белоктардан ерекшеленетіні соншалық, олар тез дамитын ақуыздар класын білдіреді, олар көбінесе паразит-иесінің өзара әрекеттесуіне қатысады. [3]

Көбінесе II типті ферменттер

HhaI (NEB # R0139), HindIII (NEB # R0104) және NotI (NEB # R0189) сияқты ең көп таралған II типті ферменттер, олар ДНҚ-ны тану дәйектіліктерінде бөледі. Осы түрдегі ферменттер коммерциялық негізде қол жетімді болып табылады. Көбісі симметриялы ДНҚ тізбектерін таниды, өйткені олар гомодимерлер ретінде ДНҚ-мен байланысады, бірақ кейбіреулері (мысалы, BbvCI (NEB # R0601) : CCTCAGC) асимметриялық ДНҚ тізбектерін таниды, өйткені олар гетеродимерлер ретінде байланысады. Кейбір ферменттер бір-бірімен сабақтас тізбектерді таниды (мысалы, EcoRI (NEB # R0101) : GAATTC), онда тану дәйектілігінің екі гемиситі іргелес, ал басқалары үзілісті дәйектіліктерді таниды (мысалы, BglI (NEB # R0144) : GCCGGC), қандай жартылай учаскелер бөлінген. Бөлінгенде әрбір кесудің бір жағында 3'-гидроксил, екінші жағында 5'-фосфат қалады. Оларға белсенділік үшін магний ғана қажет, ал сәйкесінше модификациялаушы ферменттер үшін тек S-аденозилметионин қажет. Олар әдетте кішігірім, олардың саны 200-350 амин қышқылдарының аралығында. [3]

Келесі ең кең таралған II типті ферменттер, әдетте «IIS типі» деп аталады, FokI (NEB # R0109) және AlwI (NEB # R0513), оларды тану ретінен тыс бір жағында. Бұл ферменттер мөлшері бойынша аралық, ұзындығы 400-650 аминқышқылдары және олар үздіксіз және асимметриялы тізбектерді таниды. Олар екі түрлі домендерден тұрады, бірі ДНҚ-ны байланыстыруға, ал екіншісі ДНҚ-ны бөлшектеуге арналған. Олар көбінесе ДНҚ-мен мономерлер ретінде байланысады, бірақ жақын орналасқан фермент молекулаларының бөліну домендерін азайту арқылы ДНҚ-ны кооперативті түрде біріктіреді деп саналады. Осы себепті кейбір IIS типті ферменттер бірнеше тану орындары бар ДНҚ молекулаларында әлдеқайда белсенді. [3]

IIG ферменттерінің типі

IIG типтегі рестрикциялық ферменттер, ІІ типті ферменттердің үшінші негізгі түрі - ұзындығы бойынша 850-1250 аминқышқылдарының үлкен аралас рестрикциялық және модификациялы ферменттері, оларда екі ферменттік белсенділік бір белок тізбегінде болады. Бұл ферменттер оларды тану дәйектіліктерінен тыс бөлінген және оларды сабақтас тізбектерді танитындар қатарына жатқызуға болады (мысалы, AcuI (NEB # R0641) : CTGAAG) және тек бір жағынан бөлінеді; және үзілісті тізбекті танитындар (мысалы, BcgI (NEB # R0545) : CGATGC) және тану ретін қамтитын кішкене фрагментті босатып, екі жағынан да жабысады. Бұл ферменттердің аминқышқылдарының тізбегі әртүрлі, бірақ олардың ұйымдастырылуы сәйкес келеді. Оларға ДНҚ модификациясының доменімен біріктірілген N-терминалды ДНҚ-ны бөлу домені және C-терминалын құрайтын немесе жеке суббірлік ретінде ұсынылатын ДНҚ тізбегінің спецификасының бір немесе екі домені жатады. Бұл ферменттер өздерінің субстраттарымен байланысқан кезде ДНҚ-ны бөліп алу үшін не шектеу режиміне, не оны метилдеу үшін модификация режиміне ауысады. [3]

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.