Максам Гильберт әдісі

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 7 бет
Таңдаулыға:

Қазақстан Республика Білім жіне ғылым министрлігі

Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық университеті

Казахский национальный университет им. аль-Фараби

Факультет: Биология және биотехнология

Кафедра: Биотехнология

Реферат

Тақырыбы: ДНҚ молекуласының 1 реттік құрылымын анықтау. Сиквенс әдістері: 1. Максам Гильберт әдісі

2. Сэнгер әдісі

Орындаған: Қарабаев Т.

Алматы 2021

Жоспар

Кіріспе

ДНҚ бастапқы құрылымы. Секвернирлеу

Негізгі бөлім

Максам-Гилберт әдісі
Сэнгер әдісі
Сэнгер секвенирациясының нәтижелері мен қателері
Максам-Гильберт сэнгер әдісіне қарағанда артықшылығы

Қорытынды

Қолданылған интернет ресурстар

ДНҚ құрылымының 3 деңгейі болады:

Бастапқы;
Екінші;
Үшінші.

ДНҚ-ның бастапқы құрылымы-ДНҚ-ның полинуклеотид тізбегіндегі нуклеотидтердің реттілігі. Мономерлі бірліктер - .

Секвенирлеу - нуклеин қышқылдарының реттілігін және олардың бастапқы нуклеотидтер тізбегін анықтау. Бұл ДНҚ молекуласында нуклеотидтер тізбегін құруға мүмкіндік беретін әдістердің жалпы атауы.

ДНҚ-ны ретке келтірудің екі негізгі әдісі бар: химиялық және ферментативті.

Химиялық әдіс немесе Максам-Гилберт химиялық деградация әдісі 1976 жылы Аллан Максам мен Уолтер Гилбертпен жасалған. Оны Максам мен Гилберт ұсынған және олардың есімімен аталған. Әдістің мәні мынада: ДНҚ фрагментінің ұштарының бірі фосфор изотопы 32р көмегімен белгіленеді. Тек бір шеті (3' немесе 5') белгіленеді. Оны нуклеотидтерге "жабыстыруға" болады және нуклеотидтердің әр түрі үшін әртүрлі түстерді таңдауға болады. Реагентке әсер ету концентрациясы мен ұзақтығы нуклеотидтің тек бір түрі өзгертілетін етіп таңдалады (C; C + T; G; G + A) . Белгіленген ДНҚ препараты төрт бөлікке бөлінеді және олардың әрқайсысы төрт негіздің біреуін немесе екеуін бұзатын реагентпен өңделеді, ал реакция шарттары әр ДНҚ молекуласына бірнеше зақым болатындай етіп таңдалады.

Жою 2 кезеңде жүреді. Бірінші кезеңде азотты негіздің модификациясы және оны кейіннен жою жүреді. Екінші кезеңде ДНҚ гидролизі негіздердің бөліну орындарында шығарылады. Пурин негіздері диметилсульфатпен өзгертіледі. Аденин қалдықтары үшінші азот атомында метилденеді, гуанин қалдықтары N7 позициясында болады. Егер бұл модификация 0 ° C температурада 0, 1 М hcl -мен өңделсе, метиладенин бөлінеді. Сілтілік ортада (0, 1 М NaOH) + 90 ° С температурада кейінгі инкубация кезінде негіздердің бөлінген жерлерінде қант-фосфат байланысы бұзылады. Пиримидин негіздері гидразинмен өзгертіледі. Тұзсыз ортада цитозин де, тимин де өзгертіледі; 2 М NaCl болған кезде тек цитозин өзгертіледі. Пиперидинмен әрі қарай өңделгеннен кейін ДНҚ модификация нүктелерінде қиылады. Нәтижесінде таңбаланған фрагменттер жиынтығы, олардың ұзындығы бұзылған базадан молекуланың соңына дейінгі қашықтықпен анықталады. Барлық төрт реакцияда пайда болған фрагменттер төрт іргелес жолда электрофорезге ұшырайды; содан кейін радиоавтография жүргізіледі, ал құрамында радиоактивті затбелгісі бар фрагменттер рентген пленкасында «іздер» қалдырады. Басып шығарулардың орналасуы бойынша, жойылған базаның белгіленген ұшынан қандай қашықтықта орналасқанын және бұл негізді біле отырып, оның орнын анықтауға болады. Егер әрбір төрт нуклеотид үшін флуоресцентті жапсырманың өзіндік түсі таңдалса, онда электрофорез кезінде олар 1 жолға қолданылады. Содан кейін нуклеотидтердің орналасуы әр түрлі түсті штрихтармен белгіленеді және оқу процедурасы автоматтандыруға оңай.

Бұл әдіс оның ғалымдарға бактериялық геном оперонының реттілігін анықтауға мүмкіндік берді. Бүгінде бұл әдіс сирек қолданылады, себебі ол үшін улы реагенттер қажет. Сонымен қатар, бір мезгілде жасалған дидеокси Сангер әдісіне қарағанда автоматтандыру қиынырақ.

Ферментативті әдісті Фредерик Сэнгер 1977 жылы жасаған. «Жіптерді тоқтату» әдісі бойынша ДНҚ полимеразасының қатысуымен праймер мен дезоксинуклеотид трифосфаттарының (datp, dgtp, dctp, dttp) қатысуымен ДНҚ талданатын үлгіде жаңа ДНҚ тізбегінің синтезіне негізделген және әртүрлі флуоресцентті бояғыштармен таңбаланған (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp) біреуін енгізу кезінде синтезделген тізбектің кездейсоқ үзілуіне негізделген. «Тізбекті тоқтату» статистикалық түрде жүретіндіктен, ұзындығы бойынша бір нуклеотидпен ерекшеленетін ДНҚ фрагменттерінің барлық жиынтығы алынады. Содан кейін алынған ДНҚ фрагменттерінің қоспасы жіптерді ажырату үшін формамидпен өңделеді және полиакриламид гелінде капиллярлық электрофорезге ұшырайды, нәтижесінде үзінділер ұзындығы бойынша таралады. Дидеоксинуклеотид фосфаттары таңбаланған бояғыштардың флуоресценциясын қоздыратын лазермен сканерлеп, тізбектердің бастапқы ДНҚ молекуласының нуклеотидтер тізбегін анықтауға болады. Ол бірнеше кезеңнен өтеді:

ДНҚ кесіндісін праймермен будандастыру - бастапқы ДНҚ -ның белгілі бір бөлігін толықтыратын жасанды түрде жасалған реттілік;
ДНҚ -ның ферментативті синтезі;
Праймері бар әр түрлі ұзындықтағы олигонуклеотидтер тізбегінің пайда болуына әкелетін денатурация;
Полиакриламидті гельді электрофорез.

Сэнгер әдісінің классикалық нұсқасында талданатын ДНҚ тізбектерінің бірі ДНҚ полимераза ферментінің комплементарлы тізбегін синтездеу үшін үлгі болып табылады. Бір матрицалы реакция төрт түрлі түтікте жүргізіледі, олардың әрқайсысында:

Праймер- тізбектелетін аймақтың басын толықтыратын шағын бір тізбекті ДНҚ молекуласы. Праймер қажет, себебі ДНҚ полимеразалары тізбектің синтезін «бос кеңістіктен» бастай алмайды, олар келесі нуклеотидті бұрыннан бар 3'-гидроксил (ОН) тобына қосады. Праймер осылайша ДНҚ синтезі үшін «праймер» болып табылады;
Төрт стандартты дезоксинуклеотидтер (datp, dgtp, dctp және dttp) ;
Радиоактивті таңбаланған бірінің (дидеоксинуклеотидтің) аз мөлшері (100 -де 1 концентрацияда), ол синтез кезінде ДНҚ -ға қосылады және реакция өнімдерін кейіннен визуализациялауға мүмкіндік береді.

Неғұрлым заманауи нұсқада дидеоксинуклеотидтер төрт түрлі флуоресцентті бояғыштармен таңбаланған және ПТР бір түтікте орындалады. Содан кейін полиакриламидті гельдегі электрофорез кезінде гельдің белгілі бір жеріндегі лазер сәулесі бояғыштардың флуоресценциясын қоздырады және детектор қазіргі уақытта гель арқылы қандай нуклеотид қозғалатынын анықтайды. Қазіргі заманғы құрылғылар ДНҚ-ны ретке келтіру үшін капиллярлық электрофорезді қолданады.

Қазіргі уақытта полимеразды тізбекті реакция (ПТР) секвенирлеу реакциясы ретінде қолданылады.

ПТР-дан айырмашылығы, тек бір праймер қолданылады, сондықтан ДНҚ тек сызықты түрде күшейтіледі.

1990 жылдардың басынан бастап флуоресцентті бояғыштармен белгіленген дидезоксинуклеозид трифосфаттар қолданылды. Төрт ddntp әрқайсысы басқа бояумен байланысты. Бұл модификация барлық төрт ddntp-ті бір реакциялық ыдысқа қосуға мүмкіндік береді.

Жеке тәсілдерге бөлу және радиоизотоптармен жұмыс істеу қажет емес. Алынған тізбекті бұзу өнімдері капиллярлық электрофорез арқылы бөлініп, флуоресценцияға дейін лазермен қозғалады.

Осылайша, ddntp әр ДНҚ фрагментінің соңында әртүрлі түстердің флуоресценциясын көрсетеді. Бұл флуоресценцияны детектор анықтай алады. Электрофорограммада реттелген ДНҚ тізбегінің негіздерінің тізбегі тікелей көрсетілген.

Соңғы 20 жыл ішінде Сэнгер әдісімен автоматтандырылған реттілік басым болды. Медицинадағы жүйеліліктің дамуы пациенттердің жеке айырмашылықтарын ескеретін және медициналық көмектің сапасын жақсартуға мүмкіндік беретін жеке медицина дәуірінің басталуына жол ашты.

Сэнгер секвенирациясының нәтижелері мен қателері

Сэнгер секвенаторынан шыққан кезде ДНҚ-ның қысқа бөліктері, яғни reads алынады. Биоинформатика үшін екі нәрсе маңызды:

Біріншіден, оқалардың ұзындығы қандай?
Екіншіден, оларда қандай қателіктер болуы мүмкін және қаншалықты жиі.

Осы критерийлер бойынша Сэнгер оқулары өте жақсы: ұзындығы мыңға жуық нуклеотидтер алынады, ал сапасы 700-800 нуклеотидтерден кейін айтарлықтай төмендей бастайды. Алдыңғы бөлімде кездестірген Сэнгердің реттілік процесінің өзі cапаның төмендеу әсерін де анықтайды (массасы 700 молекуланы массасы 701 молекуладан массасы 5 массадан 6 - ға қарағанда ажырату қиын) және тағы бір жағымсыз әсер - егер геномда сол әріптен ұзын тізбек болса ( . . . . . . ), оның қандай ұзындықты дәл анықтау қиын-барлық аралық массалар бір пробиркаға түседі, олардың кейбіреулері кездеспеуі мүмкін, кейбіреулері бір-бірімен біріктірілуі және т. Б. Дегенмен, сэнгеров секвенирациясы өте ұзақ оқулармен жақсы нәтиже береді, содан кейін оларды жинау оңай.

Максам-Гильберт сэнгер әдісіне қарағанда артықшылығы

Алайда, Максам-Гилберт бойынша ДНҚ секвенирлеу әдісінің орталық элементі-ДНҚ-ның белгіленген тізбегінің химиялық деградациясы жылдар бойы өзгерген жоқ. Көптеген зерттеушілер белгілі бір азотты негіздерді түрлендірудің әртүрлі нұсқаларын ұсынғанымен, осы әдістің негізгі арсеналында ең тұрақты нәтижелерді көрсететін 4-6 химиялық реакциялар бар.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.