ДНҚ молекуласын енгізу

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 27 бет
Таңдаулыға:

ДӘРІС 1 КІРІСПЕ. ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯНЫҢ НЕГІЗГІ ПРИНЦИПТЕРІ. ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯДА ҚОЛДАНЫЛАТЫН НЕГІЗГІ ФЕРМЕНТТЕР.

Мақсаты: Гендік инженерия ғылымының даму тарихы мен пәні, мақсаты мен міндеттерімен танысу

Кілтті сөздер: Генетикалық инженерия, рекомбинантты ДНҚ, клон, бөгде ген.

Дәрістің негізгі сұрақтары

1. Гендік инженерия ғылымының даму тарихы

2. Гендік инженерия пәні, мақсаты мен міндеттері

3. Генетикалық және гендік инженерия

4. Рестрикциялық ферменттер (эндонуклеазалар) . Рестриктизалалық ферменттердің ашылуы. Рестриктизалалық ферменттердің типтері. Рестрикция -модификация жүйесі

5. Кері транскриптаза немесе ревертаза ферменті

6. ДНҚ лигаза

Қысқа мазмұны:

1. Гендік инженерия молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Бұл атаудың екі түрі қол-данылады: “генетикалық инженерия” және “ген инженериясы”. Соңғы кезде “генетикалық инженерия” жалпылама түрде колданылып жүр, ген инженериясы да осының ішіне кіреді.

Молекулалық биология ғылыми жетістіктерінің нәтижесінде пайда болған ген инженериясы организмнің бағалы қасиетін сақтап қана қоймай оған жаңа әрі саналы қасиет те бере алады. “Инженерия” деген атау құрастыру деген мағынаны білдіреді. Яғни ген инженериясы дегенді ген кұрастыру деп түсіну қажет. Ген инженериясының дәуірі басталмай тұрып 1969 жылы Г. Корана нуклеотидтерді белгілі бір жүйемен орналасқан ДНҚ синтезінің методологиясын жасап берген. Жекеленген дербес амин қышқылы - ашытқының аланиндік тРНҚ-ның бастауыш жүйесі ашылғаннан кейін Г. Корана химиялық жолмен осы РНҚ-ның көлемі 77 полинуклеотидтен тұратын кодтық бөлігін синтездеді. Кейіннен 1979 жылы осы лабораторияда ішек таяқшасының тирозиндік тРНҚ-сы синтезделді және ол Т4 бактериофагының құрамына енгізіліп, бактерияның клеткасында жұмыс істеді.

Ген инженериясының дүниеге келген уақыты 1972 жыл деп есептеледі. Сол жылы Т. Берг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмнің ДНҚ-ларының фрагменттерінен жаңа гибридтік ДНҚ құрастырды. Бірақ маймылдың рак вирусының, бактериофагтың және ішек бактериясының гендік ДНҚ-ларынан құрастырылған ол гибридтік ДНҚ-ның клетка ішінде ойдағыдай жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, себебі құрамында рак вирусының нуклеин қышқылы болғандықтан ғалымдар тәуекелге бармады.

Клеткада жұмыс істей алатын гибридтік ДНҚ-ны 1973-74 жылдары С. Коэн мен Г. Бойер құрастырды. Олар басқа организмнен бөліп алған ДНҚ фрагментін (генін) бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Ол плазмидадағы бөтен гендердің алғаш рет жаңа организм ішінде жұмыс істей алатынын көрсетті. Соның артынша-ақ дүние жүзінің көптеген лабораторияларында жұмыс істей алатын әр түрлі плазмидалар алынды. Совет елінде ондай бөтен гені бар плазмида академик А. А. Баевтың басшылығымен жасалды.

2. Гендік инженерия деп рекомбинантты ДНҚ-лар жасап, оларды басқа тірі клеткаларға енгізуді айтады.

Ген инженериясы шешетін мәселелер:

1) генді химиялық немесе ферментті қолдану жолымен синтездеу;

2) әр түрлі орғанизмнен алынған ДНҚ фрагменттерін бір-бірімен жалғастыру (ДНҚ рекомбинантгарын алу) ;

3) бөтен генді жаңа клеткага векторлық ДНҚ аркылы жеткізу және олардың қызмет жасауын қамтамасыз ету;

4) клеткаларға гендерді немесе генетикалық жүйелерді енгізу және бөтен белокты синтездеу;

5) бөтен генге ие болған клеткаларды таңдап бөліп алу жолдарын ашу.

3. Микроорганизмдер генетикасының екпінді дамуы біздің ғасырымыздың 70-жылдарының бірінші жартысында генетикалық инженерия, ген инженериясы немесе рекомбинатты ДНҚ техникасы деп аталатын жаңа эксперименттік технологияның пайдаболуына әкелді. ТМД елдерінде алғашқы - екі, ал батыста соңғы аталу кең қолдану алды.

Генетикалық инженерия деп in vitro жағдайында функциялық пәрменді генетикалық құрылымдарды (рекомбинантты ДНҚ-ны) құрастыруды және оларды тірі клеткаларға енгізуді түсінеді. «Генетикалық инженерия» және «ген инженериясы» терминдері синоним ретіңде қаралғанмен, олардың мағынасы бірдей емес: генетикалық инженерия - генетикамен байланысқан, ал ген инженериясы - тек генге ғана қатысы бар. Рекомбинантты ДНҚ (рДНҚ) дегеніміз әр текті ДНҚ-лардан құралған (табиғи немесе синтетикалық ДНҚ фрагменттерін жалғастыру арқылы) және клеткаларда репликациялана алатын генетикалық құрылымды түсінеді. Бүл арадан, біз үш терминнің де жалпы анықтамасы бір бағытта екендігін байқауымыз керек, реалдық тұрғыдан олардың мақсаттары. бірдей және қазіргі жаңа биотехнологияның негізгі, әрі перспективалы әдісі болып саналады.

Ген инженериясы мынадай кезеңдерден тұрады: 1) генді (ДНҚ фрагментін) алу; 2) рекомбинантты ДНҚ. молекуласын құрастыру; 3) реципиент клеткасына рекомбинантты ДНҚ молекуласын енгізу; 4) қажет рекомбинантты ДҢҚ молекулалары бар клондарды (бактерияық клеткаларды) ортадан табу.

4. Ген инженериясының немесе рекомбинантты ДНҚ технологиясының қалыптасуы ерекше ферменттер класы - эндонуклеазалардың немесе рестриктазалардың ашылуымен және қолданылуымен байланысты. Рестрикция ферменттерін 1972 ж. В. Арбер бактерия клеткасында ашты. Барлық бактериялар қос тізбекті ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер бөлігін үзе алатын бір немесе бірнеше рестриктазаларды синтездейді. Рестрикция ферменттерінің клеткадағы қызметі - бактерияға енген бөтен ДНҚ молекуласынан қорғау, рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның бактериялық клеткада кебеюіне жол бермейді.

Рестрикция ферменттерін синтездейтін клетканың ДНҚ молекуласы эндонуклеазалардың әсерінен үзілмейді, өйткені бұл клеткалар модификациялау ферменттерін синтездейді, олардың әсерінен ДНҚ-ның құрылымы модификацияланады (өзгереді) - ДНҚ-ның репликациясы кезінде рестриктаза танитын бөліктерге метил тобын (СНз) - жалғайды. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза үзе алмайды. Мұны бактериялардың өзіндік бір иммундьқ жүйесі деп санауға болады. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енгең кейбір қышқылы метилденіп кетеді де, бактериялар осы фагтың әсерінен лизиске ұщырайды. Осы құбылысты-Нобель сыйлығының 1973 ж. лауреаттары - X. Смит, Д. Ңатанс және В. Арбер ашты. Рестрикциялау және метилдеу фөрменттері клетканың модификация-рестрикция жүйесін (МR) - құрайды. 2. Рестриктазалардың негізгі үш типі: I, II және, III белгілі. Барлық рестриктазалар қос спиралды ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер қатарын дәл тани алады. Алайда, рестриктазалардың I типі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны әр қилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II және III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дәл үзе алады. Эндонуклеазалардың I және ІІI типтер құрылымы күрделі және екі модификациялық және АТФ-ға тәуелді эндонуклеазалық активтіліктері бар. Рестрликтазалардың II типі екі жеке белоктардан құралған: рестрициялаушы эндонуклеаза жэне модификациялаушы метилаза. Аталған себептерге байланысты ген инженериясында тек қана рестриктазалардың II типі пайдаланылады. Екінші жағынан; рестриктазаның II типі ғана бірдей нуклеотид тізбектерінің фрагменттері барДНҚ препараттарын алуға және әр түрлі геномдардан алынған фрагменттерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады.

Рестриктазалардың ІI типінің басым көпшілігі 4-6 н. ж. құралған палиндромды ДНҚ тізбектерін тани алады. Мысалы, Вас. subtilis бактериясының ВsuR1 деп белгіленетін рестриктазасы ДНҚ бөлігін төмендегідей үзе алады:

Әр тізбекті 3’- ұшына 5′ бағытына қарай көз жүгіртсе, олар бірдей оқылады (ЦЦ ГГ), міне осындай тізбек палиндром деп аталады. Натижнсінде ДНҚ-ның қос тізбегі симметриялы үзіледі. (сілтемемен (стрелка) көрсетілген), сақиналы ДНҚ түзу құрылымға айналады. ДНҚ молекуласының. Соңында жабысқақ ұштар пайда болады, сондықтан олар ешқандай қосымша өңдеусіз бір-бірімен қайтадан қосылуға қабілетті болады. Қазіргі кезде рестриктазалардың II типінің 500-ден астам түрлері белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерден үзе алады. 1973 ж. X. Смит және Д. Натанс рестрикция-модификация жүйе (МК) ферменттерін белгілеу номенклатурасын ұсынды. Көпшіліктің мақұлдауы бойынша туыстың бірінші әрпі және түрдің алғашқы екі әрпінен құралған үш әріп ферменттің шығу көзін көрсетеді. Эндонуклеазаларды - R, метилазаларды - М символдарымен белгілейді. Егер клетканың бір типінен екі және одан көп рестрикция ферменттері бөлінгенболса онда оларды рим цифрларымен (I, II, ІІІ т. с. с) нөмірлейді. Осы номенклатура сүйеніп, Е. Соlі рестриктазасы ЕсоRІ, ЕсоRІІ және т, т., ал Вас. subtilis рестриктазасы ВsuRI т. с. с. болып белгіленеді.

3. ДҢҚ тізбегінің үзілуі не симметрияның өсі бойынша жүруі мүмкін, онда «доғал» ұшты фрагменттер түзіледі (мысалы, Ваll немесе ВsuRI рестриктазалары), не симметрия өсінен біршама қашықтықта өтуі мүмкін, онда шығыңқы «жабысқақ» 5′ (ЕсоRІ, Ніnd III- және т. б. рестриктазалар) немесе 3′ (РstІ рестриктазасы) ұштары бар фрагменттер түзіледі.

Әр түрлі рестриктазалардың II типінің ішінен ДНҚ-ның бір нуклеотидтер қатарын танитын екі немесе бірнеше ферменттер кездеседі. Осындай жұп немесе топ эндонуклеазалар изошизомерлер деп аталады. Изошизомерлердің екі түрін ажыратады: нағыз изошизомерия - ферменттер белгілі бір нуклеотидтер қатарын танып, ДНҚ-ны бір нүктелерде үзеді және жалған изошизомерия - ферменттер бір нуклеотидтер қатарын тани алға-нымен, оларды әр түрлі үзеді.

Рекомбинантты ДНҢ техникасы үшін алуан түрлі рестрикция ферменттерінің ішінен өздеріне комплементарлы «жабысқақ» ұштары бар фрагменттер түзейтін рестриктазалар бағалы болып саналады.

5. Кері транскриптаза -ДНҚ тізбегіне комплементарлы мРНҚ транскрипциясына пайдаланылады. Геномы бір-тізбекті РНҚ молекулаларынан тұратын ретровирустарды зерттеу кезінде жасушаішілік даму процесінде ретровирус геномының қос тізбекті ДНҚ түрінде жасуша қожайын хромосомасына интеграциялану стадиясынан өтетіндігі анықталды. 1964 жылы Темин аналық РНҚ негізінде комплементарлы ДНҚ синтездеуге қабілетті, вирус арнайылық қасиетке ие ферменттер туралы гипотезаны ұсынды. Осы ферментті бөліп алуға арналған жұмыстар сәтті аяқталды, 1970 жылы Темин мен Мизутани, және олардан тәуелсіз Балтимор Рауса саркома вирусы вирионының жасушадан тыс препараттарынан қажетті ферментті ашты. Бұл РНҚ-тәуелді ДНҚ-полимераза кері транскриптаза, немесе ревертаза деп аталды.

Ең егжей-тегжейлі зерттелген -құстар ретровирусының ревертазасы. Әрбір вирионда осы ферменттің, шамамен, 50 молекуласы бар. Кері транскриптаза екі суббірліктерден тұрады - a (65 кДа) және b (95 кДа), эквимолярлы мөлшерде болатын. Кері транскриптаза кем дегенде үш ферменттік активтілікке ие:

1) ДНҚ полимеразалық, аналық ретінде РНҚ ны және ДНҚны да пайдаланатын;

2) H РНКазалық активтілік, РНК-ДНК гибриді ішіндегі РНҚ-ны гидролиздейтін, бірақ бір немесе екі тізбекті РНҚ-ны емес;

3) ДНК эндонуклеазалық активтілік.

Алғашқы екі активтілік вирустық ДНҚ синтезіне керек, ал эндонуклеаза вирустық ДНҚ-ның қожайын жасушасы геномына интеграциялануына маңызды болуы мүмкін. Тазартылған кері транскриптаза ДНҚ-ны аналық РНҚ негізінде де және аналық ДНҚ негізінде де синтездейді. Синтезтеуді бастау үшін ревертазаға, басқа да полимеразалар секілді, қысқа қос тізбекті бөлік (праймер) қажет. Праймер ретінде процесс кезінде жаңа түзілген тізбекпен ковалентті байланысатын бір тізбекті РНҚ немесе ДНҚ сегменттері қолданыла алады.

Кері транскриптазаны мүмкіндігінше аналық РНҚ-ның комплементарлы ДНҚ-ға(кДНҚ) транскрипциясы үшін пайдаланады. Кері транскрипция реакциясын рнказалық активтілікті тежейтін ингибиторларды қолдана отырып, арнайы таңдалған жағдайда жүргізеді. Осылайша, мақсатты РНҚ молекулаларының толық көлемді ДНҚ- көшірмелерін алуға болады. поли (A) -құрамды аРНҚ кері транскриптазасы кезінде праймер ретінде олиго (dT), ал З'-поли (А) соңы жоқ РНҚ молекуларына зерттеліп отқан РНҚ-ның 3'- соңына комплементарлы, химиялық синтезделген олигонуклеотидтер пайдаланады. аРНҚ негізінде комплементарлы ДНҚ тізбегін синтездеп және РНҚ-ны ыдыратқан соң (әдетте сілтілік өңдеу пайдаланылады), ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезін жүзеге асырады. Ревертазалардың бір тізбекті кДНҚ-ның 3 'соңында өз-өзіне комплементарлы, праймер қызметін жүзеге асыра алатын шпилькалар түзе алу қабілеті қолданылады.

Матрица болып кДНҚ-ның бірінші тізбегі қызмет атқарады. Бұл реакцияны ревертаза немесе E. coli ДНҚ-полимераза I ферменті де жүргізуі мүмкін. Осы екі ферменттің қосындысы арқылы толық қос тізбекті кДНҚ молекулалардың пайда болу санын арттыруға болатыны көрсетілген. Синтез аяқталған соң кДНҚның бірінші және екінші тізбектері, екінші тізбекті синтездеу кезінде праймер ретінде қызмет атқарған шпилька ілгекпен ковалентті байланысқан болып қала береді. Бұл ілгекті арнайы біртізбекті нуклеин қышқылдары бөліктерін жоятын эндонуклеаза S1 арқылы ыдыратады. Пайда болған ұштары әрқашан тік бола бермейді, және клондау тиімділігін арттыру үшін оларды әрі қарай E. coli ДНҚ-полимераза I Кленова фрагменті көмегімен тік ұш алу мақсатында жөндейді. Алынған қостізбекті кДНҚ-ны клондаушы векторларға енгізуге, гибридті ДНК молекулалары құрамында көбейтуге және одан әрі зерттеулер үшін пайдалануға болады.

6. ДНҚ лигаза - ДНҚ-ның бос ұштарын бір-біріне жалғайтын фермент. Бұл фермент қалыпты клеткаларда ДНҚ синтезіне және репарация (қалпына келу) процестеріне қатысады, яғни ДНҚ молекуласының біраз бүлінген жерлерін қалпына келтіруге қатысады.

1961 жылы Мезельсон мен Вейгл I фагы негізінде рекомбинация ажыраудан және ДНҚ молекулаларының қайта қосылуынан тұратынын көрсетті. Бұл ДНҚ фрагменттерін тігуге қатысатын ферментті іздеуге бастама болды. 1967 жылы осындай ферменттер табылды және ДНК лигаза деп аталды. Ол екі тізбекті нуклеин қышқылы молекуласында фосфодиэфирлі байланыстың синтезін катализдейді.

Басқаша айтқанда, ДНҚ лигазалар қант қалдықтары арасында байланыс түзе отырып, қатар орналасқан нуклеотидтерді тігеді. ДНҚ лигазалар ДНҚ репарация процестерінде, ДНҚ репликация процестеріне - ДНК тізбегінің екі еселенуіне өте қажет.

ДНҚ лигазаның екі түрі бар, олар кофакторға қажеттілігі және әсер ету әдісі бойынша ерекшеленеді. E. coli ДНҚ лигазасы кофактор ретінде , ал T4 фагы лигазасы Мg2 + бар ортада АТФ пайдаланады. T4 фалы лигазасы әмбебап, ол жабысқақ ұштарды тігумен қоса, қостізбекті ДНҚ фрагменттерін тік ұштармен қосылу реакциясын катализдейді. Ол жиі пайдаланылады.

Талқылау үшін сұрақтар:

Гендік инженерияның негізгі принциптері, болуының алғы шарттары.
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыруда қолданылатын ферменттер. Рестрикциялаушы эндонуклеаза және ДНҚ лигаза ферменттері. Олардың классификациясы және қасиеттерін көрсетіңіз
ДНҚ және РНҚ матрицасында ДНҚ молекуласының синтезделуін катализдейтін ферменттер: ДНҚ полимераза мен ревертаза ферменттері және олардың гендік инженерияда қолданылу аясын көрсетіңіз
ДНҚ фрагменттерінің соңдарын модификациялаушы терминальді трансфераза, полинуклеотид киназа, сілтілі фосфатаза, поли А-полимераза және олардың гендік инженерияда қолданылу аясын көрсетіңіз

Ұсынылған әдебиеттер:

С. Н. Щелкунов “Генетическая инженерия”, СУИ, Новосибирск - 2004.
Б. Глик, Дж. Пастернак “Молекулярная биотехнология. Принципы и применение”, М., “Мир”, 2002.

ДӘРІС 2 E. COLI ГРАМТЕРІС БАКТЕРИЯСЫНЫҢ ГЕНДІК ИНЖЕНЕРЛІК ЖУЙЕСІ

Мақсаты: Прокариот жүйесінде бөгде генді клондаудың принциптері мен артықшылық кемшіліктерімен танысу

Дәрістің негізгі сұрақтары

1. Гендік инженериядағы генді алу әдістері: Генді тікелей бөлу әдісі, Генді синтездеудің химиялық әдісі, Ферменттік (энзимдік) әдіс.

2. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру

3. Прокариот жүйелерінде клондаудық молекулалық векторлары. трансформацияланған клеткалар скринингі.

4. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын клондау әдістемелері.

5. Прокариот гендерінің экспрессиясының реттелуі

Қысқа мазмұны:

1. Гендік инженериядағы генді алу әдістері. Генді алудың үш әдісі бар: табиғи генді тікелей бөлу (сирек мүмкіндік), химиялық және ферменттіксинтез. Табиғи генетикалық материалдан - ДНҚ-дан арнайы ферменттердің (рестрикциялық эндонуклеазалардың) көмегімен қажет ген «кесіліп» алынады. Бұл әдістің елеулі кемшіліктері бар. Біріншіден, ДНҚ-дан қажет генді танып, кесе алатын ферментті таңдап алу қиын. Фермент тенді әрқашанда наңтьі шекарасыпда емес әр қилы үзеді: не геннің екі жағынан артық нуклеотидтерді үзуі, не түгел үзбеуі мүмкің, мұндай ДНҚ фрагментерінің қызметі жеткіліксіз, сондықтаноларды пайдалану мүмкінболмайды. Екіншіден, эукариоттық организм геномының экзон-интрондыққұрылысы, олардың гендерін бактерияларға енгізгенде функциялық тұрғыдан қиындық туғызады, өйткені бактериялық клеткада сплайсинг процесі (ин-трондардың кесілуі) өтпейді. Үшіншіден, егер ген барлық ДНҚ-ның аз ғана бөлігін құраса, онда оны бөлу мен анықтауда елеулі қиындықтар пайда болады. Сондықтан бұл әдіс негізінен генетикалық эксперименттер талабына сәйкес вирус пен бактериялардың генін бөлуде қолданылады.

Генді-синтездеудің химиялық әдісі. Бұл әдістербелоктың немесе полипептидтің бірінші құрылымы ( амин қышқылдар қатары) белгілі болса, оның генінің нуклеотидтер қатары химиялық жолмен синтезделеді. Берілген нуклеотидтер тізбегі бойынша ДНҚ - синтездеу әдісін 1969 жылы, ген инженериясының дәуірі басталмаған кезде-ақ, Г. Корана ұсынған болатын. Ашытқы тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 н. ж. құралған. Алдымен, ұзындығы 5-12 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа фрагменттері синтезделді, онан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) әсерімен бір-бірімен қосылды. Алайда, алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының клеткасына енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші элементтер - промотор және терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г. Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-ының генін синтездей алды. Геннің ұзындығы 126 н. ж. тең болды, оған 52 н. ж. құралған промотор, 21 н. ж. - терминатор және ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ және ТТАА) жалғанды. Нәтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы Е. Со1і клеткасына енгізгенде олар өз функциясын көрсете алды. Қазіргі уақытта Г. Корана өңдеген әдістер бірқатар жасанды гендерді синтездеу үшін қолданылады. Осындай жолмен адамның - инсулин және интерферон, адам мен жануарлардың - энкефалин және бардикинин гормондарының функциялы гендері синтезделді. Қазіргі кезде гендерді автоматты синтездейтін құралдар бар. 1980 ж. Итакура алғаш өзінің құрамында алдын ала берілген тізбек бойынша 6 сағ. ішінде 12-мүшелік олигонуклеотидті синтездеуге қабілетті автоматтың жұмысын компьютер бақылады. Мұндай жабдықтардың 1982 жылғы бағасы 36000-39500 долларға тең болатын. Егер 1979 жылы 120 н. ж. генді синтездеу үшін екі жыл керек болса, ал 1981 ж. бұл мақсатқа үш-аң күнде жетуге болады.

Генді синтездеудің ферменттік (энзимдік) әдісі. Генді синтездеудің үшінші әдісі кеңінен таралған және кейін рекомбинанты ДНҚ күйінде бір, кейде көп клеткалы организмдерде көбейетін гендердің негізгі шығу көзі болып саналады. Оның мәніферменттік синтез арқылыгенді алудан тұрады және төмендегіге саяды. Ең алдымен, клеткалардан (мұнда, қажет геннің активтілігі жоғары болуы керек) информациялық (матрицалық) РНҚ (иРНҚ) молекулаларын бөліп алады, олардың арасында генкоделейтін иРНҚ бар, міне осы иРНҚ-ны бөлу қажет. Бұдан кейін кері транскриптаза (ревертаза) ферментінің көмегімен бөлінгениРНҚ-да комплементарлыДНҚ (кДНҚ) синтезделеді. Кері матрицалық иРНҚ-да кДНҚ-ның синтезі басталуы үшін иРНҚ-ның 3’- ұшына комплементарлы «ашытқы, »-олигонуклеотид (қысқа тізбек) қажет. Жаңа кДНҚ тізбегі синтезделуі үшін тағы Мg иондары мен керек. Жаңа кДНҚ синтезделіп біткеннен кейін, оны тазалап, ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін матрица ретін де пайдаланады. Ол үшін ортаға ревертазаны немесе ДНҚ-полимеразаны (бактериялардан алынған) қосады. ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезі басталуы үшін олигонуклөотид (ДНҚ-ның 3’- ұшына комплементарлы) керек, әйтпесе кДНҚ-ның 3’- ұшы белгісіз себептермен шпилькалы кұрылым түзейді, осы құрылым екінші ДНҚ-ның синтезін инициациялай алады. ДНҚ-ының екінші тізбегі синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ-ымен қосылған бөлігі (шпилькалы) нуклеаза 51 ферментінің әсері арқылы ажырайды, нәтижесінде қос тізбекгі геналынады, оңы қос тізбекті комплементарлы ДНҚ (қт-кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің әсерімен гидролизденеді, ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның әсерімен ыдырайды. Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бактерия клеткасына енгізбестен бұрын, оларға реттеуші элементтер жалғайды. Прокариоттарда сплайсинг өтпейтінін ескерсек, онда генді ферменттік жолмен синтездеу үшін матрица ретінде гяРНҚ-ны емес, жетіл-ген иРНҚ пайдалану керек.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.