ДНҚ молекуласын енгізу
ДӘРІС 1 КІРІСПЕ. ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯНЫҢ НЕГІЗГІ ПРИНЦИПТЕРІ. ГЕНДІК ИНЖЕНЕРИЯДА ҚОЛДАНЫЛАТЫН НЕГІЗГІ ФЕРМЕНТТЕР.
Мақсаты: Гендік инженерия ғылымының даму тарихы мен пәні, мақсаты мен міндеттерімен танысу
Кілтті сөздер: Генетикалық инженерия, рекомбинантты ДНҚ, клон, бөгде ген.
Дәрістің негізгі сұрақтары
1.Гендік инженерия ғылымының даму тарихы
2.Гендік инженерия пәні, мақсаты мен міндеттері
3.Генетикалық және гендік инженерия
4.Рестрикциялық ферменттер (эндонуклеазалар). Рестриктизалалық ферменттердің ашылуы. Рестриктизалалық ферменттердің типтері. Рестрикция - модификация жүйесі
5. Кері транскриптаза немесе ревертаза ферменті
6. ДНҚ лигаза
Қысқа мазмұны:
1. Гендік инженерия молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Бұл атаудың екі түрі қол-данылады: "генетикалық инженерия" және "ген инженериясы". Соңғы кезде "генетикалық инженерия" жалпылама түрде колданылып жүр, ген инженериясы да осының ішіне кіреді.
Молекулалық биология ғылыми жетістіктерінің нәтижесінде пайда болған ген инженериясы организмнің бағалы қасиетін сақтап қана қоймай оған жаңа әрі саналы қасиет те бере алады. "Инженерия" деген атау құрастыру деген мағынаны білдіреді. Яғни ген инженериясы дегенді ген кұрастыру деп түсіну қажет. Ген инженериясының дәуірі басталмай тұрып 1969 жылы Г. Корана нуклеотидтерді белгілі бір жүйемен орналасқан ДНҚ синтезінің методологиясын жасап берген. Жекеленген дербес амин қышқылы -- ашытқының аланиндік тРНҚ-ның бастауыш жүйесі ашылғаннан кейін Г. Корана химиялық жолмен осы РНҚ-ның көлемі 77 полинуклеотидтен тұратын кодтық бөлігін синтездеді. Кейіннен 1979 жылы осы лабораторияда ішек таяқшасының тирозиндік тРНҚ-сы синтезделді және ол Т4 бактериофагының құрамына енгізіліп, бактерияның клеткасында жұмыс істеді.
Ген инженериясының дүниеге келген уақыты 1972 жыл деп есептеледі. Сол жылы Т. Берг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмнің ДНҚ-ларының фрагменттерінен жаңа гибридтік ДНҚ құрастырды. Бірақ маймылдың рак вирусының, бактериофагтың және ішек бактериясының гендік ДНҚ-ларынан құрастырылған ол гибридтік ДНҚ-ның клетка ішінде ойдағыдай жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, себебі құрамында рак вирусының нуклеин қышқылы болғандықтан ғалымдар тәуекелге бармады.
Клеткада жұмыс істей алатын гибридтік ДНҚ-ны 1973-74 жылдары С. Коэн мен Г. Бойер құрастырды. Олар басқа организмнен бөліп алған ДНҚ фрагментін (генін) бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Ол плазмидадағы бөтен гендердің алғаш рет жаңа организм ішінде жұмыс істей алатынын көрсетті. Соның артынша-ақ дүние жүзінің көптеген лабораторияларында жұмыс істей алатын әр түрлі плазмидалар алынды. Совет елінде ондай бөтен гені бар плазмида академик А.А. Баевтың басшылығымен жасалды.
2. Гендік инженерия деп рекомбинантты ДНҚ-лар жасап, оларды басқа тірі клеткаларға енгізуді айтады.
Ген инженериясы шешетін мәселелер:
1) генді химиялық немесе ферментті қолдану жолымен синтездеу;
2) әр түрлі орғанизмнен алынған ДНҚ фрагменттерін бір-бірімен жалғастыру (ДНҚ рекомбинантгарын алу);
3) бөтен генді жаңа клеткага векторлық ДНҚ аркылы жеткізу және олардың қызмет жасауын қамтамасыз ету;
4) клеткаларға гендерді немесе генетикалық жүйелерді енгізу және бөтен белокты синтездеу;
5) бөтен генге ие болған клеткаларды таңдап бөліп алу жолдарын ашу.
3. Микроорганизмдер генетикасының екпінді дамуы біздің ғасырымыздың 70-жылдарының бірінші жартысында генетикалық инженерия, ген инженериясы немесе рекомбинатты ДНҚ техникасы деп аталатын жаңа эксперименттік технологияның пайдаболуына әкелді. ТМД елдерінде алғашқы -- екі, ал батыста соңғы аталу кең қолдану алды.
Генетикалық инженерия деп in vitro жағдайында функциялық пәрменді генетикалық құрылымдарды (рекомбинантты ДНҚ-ны) құрастыруды және оларды тірі клеткаларға енгізуді түсінеді. Генетикалық инженерия және ген инженериясы терминдері синоним ретіңде қаралғанмен, олардың мағынасы бірдей емес: генетикалық инженерия -- генетикамен байланысқан, ал ген инженериясы -- тек генге ғана қатысы бар. Рекомбинантты ДНҚ (рДНҚ) дегеніміз әр текті ДНҚ-лардан құралған (табиғи немесе синтетикалық ДНҚ фрагменттерін жалғастыру арқылы) және клеткаларда репликациялана алатын генетикалық құрылымды түсінеді. Бүл арадан, біз үш терминнің де жалпы анықтамасы бір бағытта екендігін байқауымыз керек, реалдық тұрғыдан олардың мақсаттары.бірдей және қазіргі жаңа биотехнологияның негізгі, әрі перспективалы әдісі болып саналады.
Ген инженериясы мынадай кезеңдерден тұрады: 1) генді (ДНҚ фрагментін) алу; 2) рекомбинантты ДНҚ. молекуласын құрастыру; 3) реципиент клеткасына рекомбинантты ДНҚ молекуласын енгізу; 4) қажет рекомбинантты ДҢҚ молекулалары бар клондарды (бактерияық клеткаларды) ортадан табу.
4. Ген инженериясының немесе рекомбинантты ДНҚ технологиясының қалыптасуы ерекше ферменттер класы -- эндонуклеазалардың немесе рестриктазалардың ашылуымен және қолданылуымен байланысты. Рестрикция ферменттерін 1972 ж. В. Арбер бактерия клеткасында ашты. Барлық бактериялар қос тізбекті ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер бөлігін үзе алатын бір немесе бірнеше рестриктазаларды синтездейді. Рестрикция ферменттерінің клеткадағы қызметі -- бактерияға енген бөтен ДНҚ молекуласынан қорғау, рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның бактериялық клеткада кебеюіне жол бермейді.
Рестрикция ферменттерін синтездейтін клетканың ДНҚ молекуласы эндонуклеазалардың әсерінен үзілмейді, өйткені бұл клеткалар модификациялау ферменттерін синтездейді, олардың әсерінен ДНҚ-ның құрылымы модификацияланады (өзгереді) -- ДНҚ-ның репликациясы кезінде рестриктаза танитын бөліктерге метил тобын (СНз)- жалғайды. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза үзе алмайды. Мұны бактериялардың өзіндік бір иммундьқ жүйесі деп санауға болады. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енгең кейбір бактериофагтардыңнуклеин қышқылы метилденіп кетеді де, бактериялар осы фагтың әсерінен лизиске ұщырайды. Осы құбылысты -- Нобель сыйлығының 1973 ж. лауреаттары -- X. Смит, Д. Ңатанс және В. Арбер ашты. Рестрикциялау және метилдеу фөрменттері клетканың модификация-рестрикция жүйесін (МR) -- құрайды.2.Рестриктазалардың негізгі үш типі: I, II және ,III белгілі. Барлық рестриктазалар қос спиралды ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер қатарын дәл тани алады. Алайда, рестриктазалардың I типі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны әр қилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II және III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дәл үзе алады. Эндонуклеазалардың I және ІІI типтер құрылымы күрделі және екі модификациялық және АТФ-ға тәуелді эндонуклеазалық активтіліктері бар. Рестрликтазалардың II типі екі жеке белоктардан құралған: рестрициялаушы эндонуклеаза жэне модификациялаушы метилаза. Аталған себептерге байланысты ген инженериясында тек қана рестриктазалардың II типі пайдаланылады.Екінші жағынан; рестриктазаның II типі ғана бірдей нуклеотид тізбектерінің фрагменттері барДНҚ препараттарын алуға және әр түрлі геномдардан алынған фрагменттерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады.
Рестриктазалардың ІI типінің басым көпшілігі 4 -- 6 н. ж. құралған палиндромды ДНҚ тізбектерін тани алады. Мысалы, Вас. subtilis бактериясының ВsuR1 деп белгіленетін рестриктазасы ДНҚ бөлігін төмендегідей үзе алады:
Әр тізбекті 3' -- ұшына 5′ бағытына қарай көз жүгіртсе, олар бірдей оқылады (ЦЦ ГГ), міне осындай тізбек палиндром деп аталады. Натижнсінде ДНҚ-ның қос тізбегі симметриялы үзіледі. (сілтемемен (стрелка) көрсетілген), сақиналы ДНҚ түзу құрылымға айналады. ДНҚ молекуласының. Соңында жабысқақ ұштар пайда болады, сондықтан олар ешқандай қосымша өңдеусіз бір-бірімен қайтадан қосылуға қабілетті болады. Қазіргі кезде рестриктазалардың II типінің 500-ден астам түрлері белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерден үзе алады. 1973 ж. X. Смит және Д.Натанс рестрикция-модификация жүйе (МК) ферменттерін белгілеу номенклатурасын ұсынды. Көпшіліктің мақұлдауы бойынша туыстың бірінші әрпі және түрдің алғашқы екі әрпінен құралған үш әріп ферменттің шығу көзін көрсетеді. Эндонуклеазаларды -- R,метилазаларды -- М символдарымен белгілейді. Егер клетканың бір типінен екі және одан көп рестрикция ферменттері бөлінгенболса онда оларды рим цифрларымен (I, II, ІІІ т.с.с) нөмірлейді. Осы номенклатура сүйеніп, Е. Соlі рестриктазасы ЕсоRІ, ЕсоRІІ және т, т., ал Вас.subtilis рестриктазасы ВsuRI т.с.с. болып белгіленеді.
3. ДҢҚ тізбегінің үзілуі не симметрияның өсі бойынша жүруі мүмкін, онда доғал ұшты фрагменттер түзіледі (мысалы, Ваll немесе ВsuRI рестриктазалары), не симметрия өсінен біршама қашықтықта өтуі мүмкін, онда шығыңқы жабысқақ 5′ (ЕсоRІ, Ніnd III -- және т. б. рестриктазалар) немесе 3′ (РstІ рестриктазасы) ұштары бар фрагменттер түзіледі.
Әр түрлі рестриктазалардың II типінің ішінен ДНҚ-ның бір нуклеотидтер қатарын танитын екі немесе бірнеше ферменттер кездеседі. Осындай жұп немесе топ эндонуклеазалар изошизомерлер деп аталады. Изошизомерлердің екі түрін ажыратады: нағыз изошизомерия -- ферменттер белгілі бір нуклеотидтер қатарын танып, ДНҚ-ны бір нүктелерде үзеді және жалған изошизомерия -- ферменттер бір нуклеотидтер қатарын тани алға-нымен, оларды әр түрлі үзеді.
Рекомбинантты ДНҢ техникасы үшін алуан түрлі рестрикция ферменттерінің ішінен өздеріне комплементарлы жабысқақ ұштары бар фрагменттер түзейтін рестриктазалар бағалы болып саналады.
5. Кері транскриптаза - ДНҚ тізбегіне комплементарлы мРНҚ транскрипциясына пайдаланылады. Геномы бір-тізбекті РНҚ молекулаларынан тұратын ретровирустарды зерттеу кезінде жасушаішілік даму процесінде ретровирус геномының қос тізбекті ДНҚ түрінде жасуша қожайын хромосомасына интеграциялану стадиясынан өтетіндігі анықталды. 1964 жылы Темин аналық РНҚ негізінде комплементарлы ДНҚ синтездеуге қабілетті , вирус арнайылық қасиетке ие ферменттер туралы гипотезаны ұсынды. Осы ферментті бөліп алуға арналған жұмыстар сәтті аяқталды, 1970 жылы Темин мен Мизутани, және олардан тәуелсіз Балтимор Рауса саркома вирусы вирионының жасушадан тыс препараттарынан қажетті ферментті ашты. Бұл РНҚ-тәуелді ДНҚ-полимераза кері транскриптаза, немесе ревертаза деп аталды.
Ең егжей-тегжейлі зерттелген -құстар ретровирусының ревертазасы. Әрбір вирионда осы ферменттің, шамамен, 50 молекуласы бар. Кері транскриптаза екі суббірліктерден тұрады - a (65 кДа) және b (95 кДа), эквимолярлы мөлшерде болатын. Кері транскриптаза кем дегенде үш ферменттік активтілікке ие:
1) ДНҚ полимеразалық, аналық ретінде РНҚ ны және ДНҚны да пайдаланатын;
2) H РНКазалық активтілік, РНК-ДНК гибриді ішіндегі РНҚ-ны гидролиздейтін, бірақ бір немесе екі тізбекті РНҚ-ны емес;
3) ДНК эндонуклеазалық активтілік.
Алғашқы екі активтілік вирустық ДНҚ синтезіне керек, ал эндонуклеаза вирустық ДНҚ-ның қожайын жасушасы геномына интеграциялануына маңызды болуы мүмкін. Тазартылған кері транскриптаза ДНҚ-ны аналық РНҚ негізінде де және аналық ДНҚ негізінде де синтездейді. Синтезтеуді бастау үшін ревертазаға, басқа да полимеразалар секілді, қысқа қос тізбекті бөлік (праймер) қажет. Праймер ретінде процесс кезінде жаңа түзілген тізбекпен ковалентті байланысатын бір тізбекті РНҚ немесе ДНҚ сегменттері қолданыла алады.
Кері транскриптазаны мүмкіндігінше аналық РНҚ-ның комплементарлы ДНҚ-ға(кДНҚ) транскрипциясы үшін пайдаланады. Кері транскрипция реакциясын рнказалық активтілікті тежейтін ингибиторларды қолдана отырып, арнайы таңдалған жағдайда жүргізеді. Осылайша, мақсатты РНҚ молекулаларының толық көлемді ДНҚ- көшірмелерін алуға болады. поли (A) - құрамды аРНҚ кері транскриптазасы кезінде праймер ретінде олиго (dT), ал З'-поли (А) соңы жоқ РНҚ молекуларына зерттеліп отқан РНҚ-ның 3'- соңына комплементарлы, химиялық синтезделген олигонуклеотидтер пайдаланады. аРНҚ негізінде комплементарлы ДНҚ тізбегін синтездеп және РНҚ-ны ыдыратқан соң (әдетте сілтілік өңдеу пайдаланылады), ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезін жүзеге асырады. Ревертазалардың бір тізбекті кДНҚ-ның 3 'соңында өз-өзіне комплементарлы, праймер қызметін жүзеге асыра алатын шпилькалар түзе алу қабілеті қолданылады.
Матрица болып кДНҚ-ның бірінші тізбегі қызмет атқарады. Бұл реакцияны ревертаза немесе E.coli ДНҚ-полимераза I ферменті де жүргізуі мүмкін. Осы екі ферменттің қосындысы арқылы толық қос тізбекті кДНҚ молекулалардың пайда болу санын арттыруға болатыны көрсетілген. Синтез аяқталған соң кДНҚның бірінші және екінші тізбектері, екінші тізбекті синтездеу кезінде праймер ретінде қызмет атқарған шпилька ілгекпен ковалентті байланысқан болып қала береді. Бұл ілгекті арнайы біртізбекті нуклеин қышқылдары бөліктерін жоятын эндонуклеаза S1 арқылы ыдыратады. Пайда болған ұштары әрқашан тік бола бермейді, және клондау тиімділігін арттыру үшін оларды әрі қарай E.coli ДНҚ-полимераза I Кленова фрагменті көмегімен тік ұш алу мақсатында жөндейді. Алынған қостізбекті кДНҚ-ны клондаушы векторларға енгізуге, гибридті ДНК молекулалары құрамында көбейтуге және одан әрі зерттеулер үшін пайдалануға болады.
6. ДНҚ лигаза - ДНҚ-ның бос ұштарын бір-біріне жалғайтын фермент. Бұл фермент қалыпты клеткаларда ДНҚ синтезіне және репарация (қалпына келу) процестеріне қатысады, яғни ДНҚ молекуласының біраз бүлінген жерлерін қалпына келтіруге қатысады.
1961 жылы Мезельсон мен Вейгл I фагы негізінде рекомбинация ажыраудан және ДНҚ молекулаларының қайта қосылуынан тұратынын көрсетті. Бұл ДНҚ фрагменттерін тігуге қатысатын ферментті іздеуге бастама болды. 1967 жылы осындай ферменттер табылды және ДНК лигаза деп аталды. Ол екі тізбекті нуклеин қышқылы молекуласында фосфодиэфирлі байланыстың синтезін катализдейді.
Басқаша айтқанда, ДНҚ лигазалар қант қалдықтары арасында байланыс түзе отырып, қатар орналасқан нуклеотидтерді тігеді. ДНҚ лигазалар ДНҚ репарация процестерінде, ДНҚ репликация процестеріне - ДНК тізбегінің екі еселенуіне өте қажет.
ДНҚ лигазаның екі түрі бар , олар кофакторға қажеттілігі және әсер ету әдісі бойынша ерекшеленеді. E.coli ДНҚ лигазасы кофактор ретінде дифосфопиридиннуклеотидті, ал T4 фагы лигазасы Мg2 + бар ортада АТФ пайдаланады. T4 фалы лигазасы әмбебап, ол жабысқақ ұштарды тігумен қоса, қостізбекті ДНҚ фрагменттерін тік ұштармен қосылу реакциясын катализдейді. Ол жиі пайдаланылады.
Талқылау үшін сұрақтар:
Гендік инженерияның негізгі принциптері, болуының алғы шарттары.
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыруда қолданылатын ферменттер. Рестрикциялаушы эндонуклеаза және ДНҚ лигаза ферменттері. Олардың классификациясы және қасиеттерін көрсетіңіз
ДНҚ және РНҚ матрицасында ДНҚ молекуласының синтезделуін катализдейтін ферменттер: ДНҚ полимераза мен ревертаза ферменттері және олардың гендік инженерияда қолданылу аясын көрсетіңіз
ДНҚ фрагменттерінің соңдарын модификациялаушы терминальді трансфераза, полинуклеотид киназа, сілтілі фосфатаза, поли А-полимераза және олардың гендік инженерияда қолданылу аясын көрсетіңіз
Ұсынылған әдебиеттер:
С.Н. Щелкунов "Генетическая инженерия", СУИ, Новосибирск - 2004.
Б. Глик, Дж. Пастернак "Молекулярная биотехнология. Принципы и применение", М., "Мир", 2002.
ДӘРІС 2 E.COLI ГРАМТЕРІС БАКТЕРИЯСЫНЫҢ ГЕНДІК ИНЖЕНЕРЛІК ЖУЙЕСІ
Мақсаты: Прокариот жүйесінде бөгде генді клондаудың принциптері мен артықшылық кемшіліктерімен танысу
Дәрістің негізгі сұрақтары
1. Гендік инженериядағы генді алу әдістері: Генді тікелей бөлу әдісі, Генді синтездеудің химиялық әдісі, Ферменттік (энзимдік) әдіс.
2.Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру
3. Прокариот жүйелерінде клондаудық молекулалық векторлары. трансформацияланған клеткалар скринингі.
4. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын клондау әдістемелері.
5. Прокариот гендерінің экспрессиясының реттелуі
Қысқа мазмұны:
1. Гендік инженериядағы генді алу әдістері. Генді алудың үш әдісі бар: табиғи генді тікелей бөлу (сирек мүмкіндік), химиялық және ферменттіксинтез. Табиғи генетикалық материалдан -- ДНҚ-дан арнайы ферменттердің (рестрикциялық эндонуклеазалардың) көмегімен қажет ген кесіліп алынады. Бұл әдістің елеулі кемшіліктері бар. Біріншіден, ДНҚ-дан қажет генді танып, кесе алатын ферментті таңдап алу қиын.Фермент тенді әрқашанда наңтьі шекарасыпда емес әр қилы үзеді: не геннің екі жағынан артық нуклеотидтерді үзуі, не түгел үзбеуі мүмкің, мұндай ДНҚ фрагментерінің қызметі жеткіліксіз, сондықтаноларды пайдалану мүмкінболмайды. Екіншіден, эукариоттық организм геномының экзон-интрондыққұрылысы, олардың гендерін бактерияларға енгізгенде функциялық тұрғыдан қиындық туғызады, өйткені бактериялық клеткада сплайсинг процесі (ин-трондардың кесілуі) өтпейді. Үшіншіден, егер ген барлық ДНҚ-ның аз ғана бөлігін құраса, онда оны бөлу мен анықтауда елеулі қиындықтар пайда болады. Сондықтан бұл әдіс негізінен генетикалық эксперименттер талабына сәйкес вирус пен бактериялардың генін бөлуде қолданылады.
Генді-синтездеудің химиялық әдісі. Бұл әдістербелоктың немесе полипептидтің бірінші құрылымы ( амин қышқылдар қатары) белгілі болса, оның генінің нуклеотидтер қатары химиялық жолмен синтезделеді. Берілген нуклеотидтер тізбегі бойынша ДНҚ - синтездеу әдісін 1969 жылы, ген инженериясының дәуірі басталмаған кезде-ақ, Г. Корана ұсынған болатын. Ашытқы тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 н. ж. құралған. Алдымен, ұзындығы 5 -- 12 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа фрагменттері синтезделді,онан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) әсерімен бір-бірімен қосылды. Алайда, алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының клеткасына енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші элементтер -- промотор және терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г. Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-ының генін синтездей алды. Геннің ұзындығы 126 н. ж. тең болды, оған 52 н. ж. құралған промотор, 21 н. ж. -- терминатор және ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ және ТТАА) жалғанды. Нәтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы Е. Со1і клеткасына енгізгенде олар өз функциясын көрсете алды. Қазіргі уақытта Г. Корана өңдеген әдістер бірқатар жасанды гендерді синтездеу үшін қолданылады. Осындай жолмен адамның -- инсулин және интерферон, адам мен жануарлардың -- энкефалин және бардикинин гормондарының функциялы гендері синтезделді. Қазіргі кезде гендерді автоматты синтездейтін құралдар бар. 1980 ж. Итакура алғаш өзінің құрамында алдын ала берілген тізбек бойынша 6 сағ. ішінде 12-мүшелік олигонуклеотидті синтездеуге қабілетті автоматтың жұмысын компьютер бақылады. Мұндай жабдықтардың 1982 жылғы бағасы 36000 -- 39500 долларға тең болатын. Егер 1979 жылы 120 н. ж. генді синтездеу үшін екі жыл керек болса, ал 1981 ж. бұл мақсатқа үш-аң күнде жетуге болады.
Генді синтездеудің ферменттік (энзимдік) әдісі. Генді синтездеудің үшінші әдісі кеңінен таралған және кейін рекомбинанты ДНҚ күйінде бір, кейде көп клеткалы организмдерде көбейетін гендердің негізгі шығу көзі болып саналады. Оның мәніферменттік синтез арқылыгенді алудан тұрады және төмендегіге саяды. Ең алдымен, клеткалардан (мұнда, қажет геннің активтілігі жоғары болуы керек) информациялық (матрицалық) РНҚ (иРНҚ) молекулаларын бөліп алады, олардың арасында генкоделейтін иРНҚ бар, міне осы иРНҚ-ны бөлу қажет. Бұдан кейін кері транскриптаза (ревертаза) ферментінің көмегімен бөлінгениРНҚ-да комплементарлыДНҚ (кДНҚ) синтезделеді. Кері транскрипцияпроцесінде матрицалық иРНҚ-да кДНҚ-ның синтезі басталуы үшін иРНҚ-ның 3' -- ұшына комплементарлы ашытқы,-олигонуклеотид (қысқа тізбек) қажет. Жаңа кДНҚ тізбегі синтезделуі үшін тағы Мg иондары мен дезоксинуклеозидтрифосфаттар керек. Жаңа кДНҚ синтезделіп біткеннен кейін, оны тазалап, ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін матрица ретін де пайдаланады. Ол үшін ортаға ревертазаны немесе ДНҚ- -полимеразаны (бактериялардан алынған) қосады. ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезі басталуы үшін олигонуклөотид (ДНҚ-ның 3' -- ұшына комплементарлы) керек, әйтпесе кДНҚ-ның 3' -- ұшы белгісіз себептермен шпилькалы кұрылым түзейді, осы құрылым екінші ДНҚ-ның синтезін инициациялай алады. ДНҚ-ының екінші тізбегі синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ-ымен қосылған бөлігі (шпилькалы) нуклеаза 51 ферментінің әсері арқылы ажырайды, нәтижесінде қос тізбекгі геналынады, оңы қос тізбекті комплементарлы ДНҚ (қт-кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің әсерімен гидролизденеді, ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның әсерімен ыдырайды. Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бактерия клеткасына енгізбестен бұрын, оларға реттеуші элементтер жалғайды. Прокариоттарда сплайсинг өтпейтінін ескерсек, онда генді ферменттік жолмен синтездеу үшін матрица ретінде гяРНҚ-ны емес, жетіл-ген иРНҚ пайдалану керек.
2. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру. Генетикалық инженерияның негізгі мағынасы болып рекомбинантты ДНҚ системасын құрастыру міндеті саналады. Рекомбинатты ДНҚ деп in vitro жағдайында шығу көзі бойынша әр түрлі кез келген екі немесе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны түсінеді. Рекомбинантты ДНҚ-ның қарапайым құрамы бөтен ДНҚ мен вектордан тұрады.
Генетикалық инженерияның формалды тұрғыдан дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі, осы жылы II. Бэрг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмдердің -- маймылдың рак вирусының, фагтың және бактериялық плазмиданың (вектордың) -- ДНҚ фрагменттерінен бірінші рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Дегенмен, бұл ДНҚ-ның клеткада жұмысістей алатындығы тексерілмеді, өйткені құрамында рак вирусының гені болғандықтан П. Бэрг тәуекелге бармады. Дәл осы кезде
Лобан да осындай рекомбинантты ДНҚ молекуласын алу мүмкіндігін көрсетті. Бұл кезде рестриктазалар және оның қасиеттері ашылған болатын. 1973 ж. С. Коэн және Г. Бойер плазмида негізінде векторларды құрастыру үшін рестриктазаларды пайдалану керектігін алғаш түсінді. Олар 1974 ж. клеткада кәдімгідей жұмыс істей алатын рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ құрастыру жолдары жаңа ғылыми дәйектермен толтырылды және жетілді, ал олардың негізгі принциптері II. Лобан жәно С. Коэн ндеяларына сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың ең кең таралған әдісі рестриктазаларды қолдануға сүйенеді. Ол жабысқақ ұштар әдісі деп аталады.Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де (бөтен ДНҚ үзіндісі де) және векторда бір рестрикциялық ферменттің көмегімен үзіледі, нәтижесінде олардың ұштары бір-біріне комплементарлы, яғни жабысқақ болғандықтан гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен оңай бірігеді. `Жабысқақ ұштар әдісі өзі танитын ДНҚ бөлігін симметрия өсінен біршама қашықтықта үзетіп рестриктазаларға сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ-ны жабысқақ ұштар әдісі бойынша құрастырудың жақсы жақтары және кемшіліктері бар. Алынған гибридтік ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатынбөліктердің қалпына келуі әдістіңжақсы жағын сипаттайды.Бұл бөтен ДНҚ фрагментін осы рестриктазаныңәсерімен салыстырмалы оңай бөліп алуға мүмкіндік береді. Ал, рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің - жабысқақ ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияланып (қайтадан бірігуі) кетуі әдістің кемшілігін көрсетеді. Осының нәтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бөлігі ендірмелермен емес, өз ұштарымен тікелей әрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса бірнеше біріккен бөтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іріктеу жұмысын асыру керек.
Бұдан басқа бұл әдістің күрделілігі бар: рестриктаза танитын нүктелер эксперимент үшін ыңғайлы бөлікте орналаспауы мүмкін, мысалы, олар қажет геннің ішіне локализацияланады. ДНҚ-ның кез келген ұшын плазмидамен рекомбинациялау үшін пайдалануға мүмкіндік туғызатын басқа әдістер де бар.
Гомополимерлі ұштар әдісінде немесе конекторлық симметрия өсімен үзетін рестриказа арқылы алынған ДНҚ фрагменттерінің доғал ұштарына (шығыңқы бір тізбекті бөлігі жоқ) терминалдық трансфераза ферментінің көмегімен гомонуклеотидтер, мысалы ДНҚ-ның 3' -- ұштарына поли (Т) немесе поли (Ц), ал векторлық ДНҚ-ның 3' -- ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады. Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін (бетен ДНҚ және вектор) бір ортаға қосса, олар комплементарлы жұп негіздерін түзеп, оңай бір молекулаға бірігеді. Немесе ДНҚ фрагментіне де, вектордың ұшына да синтетикалық қос тізбек (линкер) жалғайды. Сонан соң линкерді танитын және оны жабысқақ етіп рестриктазамен үзеді. Осылайша бұл жолмен де жабысқақ ұштар алынады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың бұл әдісі Лобан-Берг идеясына сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі -- доғал ұштарды жалғау (тігу). Оның, негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ-лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл әдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі тізбекті араларына ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл әдісті пайдалану өте ыңғайлы.
Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың қаралған үш әдісінің бірнеше модификациялары (өзгешеліктері) бар және де ген мен векторлық молекуланың ерекшелігіне байланысты методологиясы әртүрлі болуы мүмкін.Көпшілік жағдайда линкер технологиясы қолданылады.
3. Прокариот жүйелерінде клондаудық молекулалық векторлары. Ген инженериясының маңызды мақсаты синтезделген немесе бөлінген генді клеткаға тасымалдау саналады. Бұл мақсат ДНҚ-ның векторлық молекулалары немесе қысқаша векторлар (тасымалдаушы немесе тасығыш) көмегімен іске асады.
Вектор деп бөтен генетикалық материалды (ДНҚ фрагментін) клеткаға (реципиенттің) тасымалдауға қабілетті ДНҚ молекуласын айтады. ДНҚ молекуласын векторсыз, мысалы, бактериялық клеткаға енгізсе, онда оларды бактериялық ферменттер ыдыратып жібереді. Кейбір жағдайда ДНҚ сақталуы мүмкін, бірақ клетканың бөлінуінде олар тұқым қуаламайды. Осындай жағдай болмас үшін векторлық молекулалар қолданылады. Век-торлар -- ген тасығыштар, ал вектор деген сөздің өзі бағыттағыш деген мағынаны білдіреді. Сонымен бірге, векторларды рекомбинантты ДНҚ-ның міндетті бөлігі деп түсіну керек. Векторларды эксперименттік жолмен құрастырады және оларға мынадай талаптар қойылады: 1) вектор клетка ішіне өзімен бірге бөтен генді алып кірген соң, репликациялана (көбейе) алатын болуы керек, сонда ғана ол келесі ұрпаққа тұқым қуалай алады, ол үшін векторға ДНҚ репликациясын бастайтын ерекше нуклеотидтер тізбегіненгізеді; 2) құрамындарестриктазалар танып, үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек, әйтпесе векторға ДНҚ фрагментін енгізу мүмкін емес;3) оның, бір немесе бірнеше таңбаланған гендері (маркерлері) болуы керек, солтаңбалар бойынша қажетгеннің қайсы клетканың (реципиенттік) ішіне енгенін анықтайды; 4) вектордың, клетка ішіндегі копиялары (көшірмелері) жеткілікті мөлшерде болуы керек. Ген инженериясында векторлық молекуланың шығу козі болып бактериялық плазмидалар мен вирустар (әсіресе фагтар) саналады. Плазмида және фагтар негізінен бірінші талапқа сай келеді, ал, оларды келесі талаптарға сай келтіру үшін қосымша генетикалық өндеу жүмысын жүргізу керек.
Жоғарыда аталған векторларға қойылған талаптарға сәйкес кез келген генетикалық құрылым, басқа жағынан кез келген плазмида мен фагтар ген тасығыш бола алмайды. Ген инженериясында қолданылатын векторларды үш топқа бөлуге болады: 1) плазмидалар;2) бактериофагтар; 3) космидтер және фазмидтер. Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ технологиясында алғашқы екі векторлар типі жиі пайдаланылады, егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда ген клеткаға трансформация типімен енеді, ал бактериофаг (фаг лямбда)қолданылса, онда ген клеткаға трансдукция типімен енеді.
Плазмидалық векторлар. Вектор ретінде мөлшері 15 -- 20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмидалар бактериялардың хромосомадан тыс генетикалық элементі екендігін және олардың сипаттамасын біз қарастырған болатынбыз. Плазмидалық векторлар генді бактерияларға тасымалдап, оның тиімді жұмысын қамтамасыз ете алады.
Генетикалықинженерияда Е. Соlі бактериясыүшін көптеген векторлық плазмидалар құрастырылды. Олардың ішінен әсіресе СоlЕ1 плазмидасының туындылары кең таралды. Ф. Болваржәне Р. Родригес құрастырған осындай плазмида -- рВR322бірнеше мың жұпнегіздерден (4362 н. ж.) құралған. Бүл плазмидада антибиотиктер -- ампициллин мен тетрациклинге төзімділіктің гендері бар және бірнеше рестриктазалар үзе алатын сайттары (нуклеотидтік нүктелері) бар рВR322 плазмиданың құрамында екі плазмида (рМВ1 және рSС101) және Тn З транспозоны бар. Ампициллинге тұрақтылықтың генінде Pst1 рестриктазасына арналған сайтқа және тетрациклинге тұрақтылық генінде ВаmН1 және SaL1 рестриктазаларына арналған қос сайтқа мән беріңіз. Осындай рестрикциялық сайттарда екі антибиотиктерге төзімділік гендерінің болуы қажет ДНҚ-сы (бөтен ДНҚ-сы) бар плазмидаларды сұрыптап алуға мүмкіндік береді.
Плазмиданы Ваm1 рестриктазасымен үзеді де, босаған орынға бөтен ДНҚ молекуласын (олар да, алдын ала Ваm1 рестриктазасымен үзіледі) жалғайды, нәтижесінде рекомбинантты плазмида тетрациклинді ортада өсе алмайды, өйткені плазмиданың tet генінің біртұтастығы бұзылған. Керісінше, плазмида ампицилинді ортада өсе алады, міне, осындай ортада көбейетін бактериялардан қажет генді оңай табуға болады. Бұл арада, вектор антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша таңбаланды.
pBR322 векторынан басқа СоlЕ1 плазмидасы негізінде бірнеше векторлар құрастырылған.Басқа плазмидалар (рSC101 т. б.) негізінде алынған векторлар да белгілі.
СolЕ1 плазмидасы негізінде құрастырылған вектордың кемшілігі де бар: бөтен ДНҚ-ның молекулалық массасы артқан сайын рекомбинанттардың саны (копиялары) азая түседі. Осы себептен ұзын ДНҚ фрагменттерінің (10 мың. н.ж. асатын) клондарын алу үшін фагтық векторларды, космид және фазмидтерді пайдаланады.
4. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын клондау әдістемелері. Рекомбинантты. ДНҚ-ны клеткаға енгізу. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілі векторға байланысты. Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда енгізу трансформация типімен, егер фаг қолданылса, онда трансфекция (клетканың фаг ДНҚ-сы арқылы инфекциялануы) типімен өтеді. Трансформация мен трансфекцияның жалпы жолы бактерия клеткасын кальций тұздарымен(Са С12) өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындығына негізделеді. Экзогенді (бөтен) ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала СаСІ2-мен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 104 -- 105 плазмиданың біреуі ғана клетканың ішіне енеді яғнибактериялардың азғантай бөлігі ғана трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады. Әдетте, модификацияланбаған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метилденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жіберетінін біз білеміз.Ал, клеткаға рекомбинантты ДНҚ молекуласының көп мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктаазлары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар кесіп үлгірмеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп -- модификацияланып кетеді. Ғалымдар генетикалық инженерия тәжірибелерінде рестрикциялық ферменттері жоқ бактериялық клеткаларды жиі қолданады. Мұндай рестрикцияланбайтын клеткаларда әдетте модификациялаушы ферменттер де жоқ болады.
5. Прокариот гендерінің экспрессиясының реттелуі. Прокариоттар гендері жұмыс істеуінің немесе экспрессиясының механизмі бүгінгі күні жақсы зерттелген және Е. СоІі бактериясы мен кейбір оның фагтарын көпжылдық іргелі молекулалық-биологиялық зерттеулер арқасында түсінікті бола бастады. Алдымен, прокариоттық геннің экспрессиясы деп осы генде иРНҚ синтезделуін (транскрипция кезеңі) және иРНҚ-ның рибосомадағы трансляциясын (белок синтезін) түсінетінін еске түсірейік.Белок синтезінің бірінші кезеңі -- трапскрипцияның инициация процесінде РНҚ-полимераза ферменті промотор деп аталатын ДНҚ-ның ерекше бөлігін тануы керек, тек сонда ғана ДНҚ-ның қос тізбегі ажырап, иРНҚ синтсзделуі бастала алады. Демек, адам немесе жануар генінің бактерия клеткасында жұмыс істеп, қажет биотехнологиялық өнім (белок) түзуі үшін, ең алдымен, оның алдында бактериялық РНҚ-полимераза байланыса алатын прокариоттық күшті промотор болуы керек.
Транскрипцияның жоғары деңгейі плазмидалық репликацияның тұрақсыздығына әкелетін атап өту керек. РНҚ-ның ғана емес, әсіресе көптеген белоктардың мөлшерден тыс синтезделуі клетканың жойылуына әкелуі мүмкін. Осындай жағдай болмас үшін пәрменді транскрипцияланатын геннің соңында трапскрипцияны тиімді терминациялайтын (тежейтін) нүктелер болуы керек. Практикалық мақсат үшін реттелетін транскрипцияны қолдану ыңғайлы.
Ген инженериясында бірнеше күшті промоторлар белгілі: Е. СоІі оперондарының промоторлары -- LacUY5 (лактоза), trp (триптофан) және гибридтік промотор tас (trp -- Lас); лямбда фаг промоторлары -- РR мен РL; т 5, т 7, Х 174 және т. б. фагтардың промоторлары.
Ген жұмысының аяқталуы үшін иРНҚ-ның белокқа трансляциялануы қажет. Прокариоттық және эукариоттық клеткалардың молекулалық-генетикалық құрылымының айырмашылықтарына орай трансляция процесі өтуі үшін де белгілі қиындықтарды жеңуі керек. Бұл айырмашылықтар, атап айтқанда, рибосоманың, әсіресе, белоктың амин қышқылдар тізбегін коделейтін иРНҚ-ның молекулалық-генетикалық құрылымына байланысты. Прокариоттық иРНҚ-ның инициалаушы кодонының (АУГ) алдында (3 -- 12 нуклеотид бұрын) Шайн-Делгарно (SD) тізбегі деп аталатын, 3 -- 9 нуклеотидтерден құралған ерекше бөлігі бар. Бұл тізбек рибосомалық 163 РНҚ-ның 3' -- ұшына комплементарлы болғандықтан иРНҢ-ның рибосомамен байланысуын қамтамасыз етеді.
Сонымен эукариоттық геннің реттеуші бөліктері бактериядан үлкен айырмашылығы бар және оларды бактериялық РНҚ-полимераза мен рибосомалар тани алмайды. Осыған орай, бөтен ген өз қызметін бактерия клетканың ішінде іске асыруы үшін екі жағдайды керек етеді: 1) геннің алдында бактериялық РНҚ-полимераза тани алатын күшті промоторды; 2) иРНҚ трансляциясының инициациясы үшін SD -- тізбегі керек. Қазіргі кезде эукариоттық геннің реттеуші бөлігін бактериялық реттеуші бөліктерімен (промотор және SD -- тізбекпен) алмастыруды мүмкін ететін бірнеше әдістер белгілі.
Бөтен геннің клеткадағы жұмысын іске асырудың екінші жолы -- өзінің реттеуші бөліктері жоқ эукариоттық құрылымды ген функциясы жоғары бактериялық геномның арасына енгізу. Мұнда коделенетін құрылымды ген бактериялық промотормен, SD -- тізбегімен және АТГ инициациялаушы кодонмен жалғанады, нәтижесінде шамалы ғана өзгерген қажет белок бірден синтезделеді.
Бөтен геннің активтілігін клеткада қамтамасыз ету үшін оны бактериялық геннің бірімен (реттеуші бөліктері бар) жалғауға болады. Осындай жолмен 1977 ж. Бойер мен Итакура лактоза промоторын қолданып, сүтқоректілердің соматостатин гормонын Е. Соlі клеткасында синтездей алды. Бұл гормон гипоталамуста өте аз мөлшерде түзіледі және қанға инсулин мен өсу гормонының (соматотропиннің) түсуін реттейді. Оның молекуласы күрделі емес, бар болғаны 14 амин қышқылдарынан құралған, сондықтан соматостатиннің гені өте ұсақ. Осыған байланысты, алдымен, ұзындығы 42 нуклеотидке тең ДНҚ молекулаласын химиялық жолмен синтездейді (гормонның амин қышқылдар қатары белгілі және оның әрқайсысының триплетін генетикалық код арқылы табады). Осы синтетикалық генді рВR322 плазмидасына және E. Соlі геномының -- галактозидаза геннің соңына біріктіру үшін қосымша қысқа линкер тізбектерін (рестриктазалық жабысқақ ұштар) жалғады. Нәтижесінде синтетикалық қос тізбектің ұзындығы 52 жұп нуклеотидке тең болды: геннің N -- ұшында метионинді коделейтін АТГ кодоны және ЕсоR1 рестриктазасы жабысқақ ұштар етіп, үзе алатын ААТТ тізбегі бар, ал С -- ұшында екі стоп-кодон орналасты. ДНҚ-ның осы бөлігінпромоторы және операторы бар -- галактозидаза генінің бөлігіне жалғап, олардың барлығын вектор -- рВR322 плазмидасына біріктірді. Осындай біріктірудің нәтижесінде гибридті ген алынды, мұнда -- галактозидаза гені бөлігінің С -- ұшы соматостатин генімен ауыстырылды. Бактериялык -- галактозидаза гені мен соматостатин генінің арасында метионин кодоны орналасқан. Бұл гибридтің транскрипциясы мен трансляциясы -- галактозидазаның реттеуші элементтерінің арқасында іске асты. Осындай -- галактозидазаның рекомбинантты гені өзінің Е. Соlі клеткасына трансформацияланғаннан кейін өз жұмысын тамаша іске асыра алады. Нәтижесінде гибридті белок синтезделді, мұнда соматостатин -- галактозидазалық бөліктен метионин арқылы жекеленеді. Жай химиялық қосылыс -- бромциан (ВrСN) -- белоктарды метионин бойынша ажыратады. Соматостатиннің өзінде метионин қалдығы жоқ болғандықтан, оны таза күйінде жеке фракцияға бөлуге болады.
Көпшілік жағдайда, белок цитоплазмада түзілгеннен соң клетканың мембранасы арқылы оның сыртына тасымалдануы керек. Бұл үшін геннің N -- ұшында клеткалық мембранаға жақындығы бар ерекше тізбек орналасуы қажет. Бұдан басқа эукариоттардың бірқатар белоктары синтезделу аяқталғаннан кейін полиглюколизденеді: белокқа полисахаридтің қысқа тізбегі жалғанады, бұл оның активтілігіне және клетка ішінде тасымалдануына әсер етеді. Қазіргі кезде бактериялық клеткада белоктарды глюкозалау өте қиын. Бір тәуірі, көптеген белоктар (интерферон және т. б.) полисахаридтік жалғану болмаса да активтілігін жоғалтпайды. Егер мұндай модификациялық өзгеріс қажет болса, онда генді эукариоттар клеткасына енгізуге тура келеді. Бұдан бөлек, бактериялық клеткада эукариоттық геннің интрон бөліктерін үзе алатын ферменттік жүйе жоқ. Осыған орай прокариоттар ген инженериясында сплайсингтен өткен эукариоттық иРНҚ ғана пайдаланылады. Эукариоттық генді эукариоттық клеткаларға немесе организмге енгізіп, оның өнімін алу биотехнологияның болшақтағы маңызды мақсаты болып саналады.
Антидене иммундық жүйемен шығарылатын ақуыздар, олар бөтен патогендік агенттердің, ақуыздардың (антигендер) әсерін тежейді. Иммуноблотинг -- мунохимия әдісі, кейінгі кездерде антидененің бөлек антигендермен байланысын іздеуге қолданылып жүр. Бұл үшін антигендерді полиакриламид гелінде электрофорезбен бір-бірінен бөледі, бөлек антигендерді гелден арнайы жинақтағышқа кешіреді, оған зерттелетін: қан сарысуын қосады да, байланысқа түскен антиденелерді иммунофермент әдісімен анықтайды. Бұл ғылыми зерттеулерде де және вирус ауруларына диагноз қоюда да қолданылады (Мысалы адамның иммунды тапшылық вирусын зерттеуде). Иммуноблотинг алдын ала белгілі емес көп компонентті қоспада құралатын антигендерді идентификациялау жәнесипаттау үшін иммуноблотингті қолданады. Иммуноблотингті жүргізгенде антигендердің күрделі қоспасын бастапқы гель- электрофорезге жібереді, содан соң фракцияланған паптидтерді арнайы антисарысу көмегімен жеке паптидтерді идентификациялау үшін нитроцеллюлозада бетіне ауыстырады. Натрий децилсульфаты бар немесе изоэлектірлік фокустау үшін гельде алдын ала бөлу жүргізіп, антигендердің көлемі жөнінде және изоэлектірлік нүктесі туралы мәлімет алуға болады. Сонымен қатар олардың арасындағы ұқсастық туралы да деректер алуға болады. Кейбір жағдайда гельдегі электрофорез және блоттинг процедурасы нәтижесінде антигеннің кейбір эпитоптары бұзылып арнайы антигендер мен антиденелердің байланысу қабілетін жоғалтатындай етіп денатурациялайды. Мұндай жағдайда блотинг орнына яғни қандай антиген антиденелермен байланысқанын бекіту үшін иммунопреципитатция қолданған жөн. Берілген әдісті ерігіш және мембрандық антигендерді анықтау үшін қолдануға болады.
Иммунологиялық әдіс геннің өнімі белок құрамы мәлім болса қолданылады. Бұл әдіс белоққа антизаттар синтездей алу мүмкіншілігіне сүйенеді. Алдымен рекомбинатты молекулалар бар клетка шоғырын агардың үстінде лизиске ұшырайды, Онан соң поливинил пластинкасына антизаттарды бекітіп, антиген ( геннің өнімі) антизат байланысу реакциясын жүргізеді. Антизаттар тек өзіне сәйкес белоктармен ғана байланысады. Перти шынысындағы белоктың яғни өажет геннің орнын радиоактивті элементпен белгіленген антизаттар арқылы табады. Полимерлі пластинкада радиоактивті бөліктердің орналасу тәртібі бойынша активті гендері бар бактериялар шоғырын табуға болады.
Талқылау үшін сұрақтар:
Генді боліп алу әдістері: табиғи, химиялық және ферментативтік әдістер және олардың артықшылықтары мен кемшіліктерін көрсетіңіз
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру әдістері: рестриктаца-лигазалық және коннекторлық әдістер мен линкерлерге сипаттама беріңіз
Бактериялық плазмидаларға жалпы түсінік және олардың вектор ретінде қолданылуы үшін қойылатын шарттарды көрсетіңіз
рBR322 плазмидалық векторының құрылысы және аталмыш вектор негізіндегі клондаудың жалпы бейнесі
l - бактериофаг геномы негізіндегі векторлар. l - бактериофагының литикалық және лизогениялық даму жолдарын сипаттаңыз
Космидті векторлар мен фазмиданың конструкцисы мен сыйымдылығы, олардың клетакаға ену және даму ерекшеліктерін көрсетіңіз
Рекомбинантты ДНҚ-ны прокариот жуйелеріне трансформациялау әдістерін сипаттаңыз.
Трансформацияланған клеткаларды фенотиптік селекция әдісі көмегімен анықтау және селективті және репортерлік маркерлік гендерге сипаттама беріңіз
Ұсынылған әдебиеттер:
С.Н. Щелкунов "Генетическая инженерия", СУИ, Новосибирск - 2004.
Б. Глик, Дж. Пастернак "Молекулярная биотехнология. Принципы и применение", М., "Мир", 2002.
ДӘРІС 3 S.CEREVISIAE АШЫТҚЫ КЛЕТКАЛАРЫНЫҢ ГЕНДІК-ИНЖЕНЕРИЯЛЫҚ ЖҮЙЕСІ.
Мақсаты: S.cerevisiae ашытқы клеткаларының гендік-инженериялық жүйесімен танысу
Дәрістің негізгі сұрақтары
Сахаромицет - ашытқыларының генетикалық ұйымдасуы.
Ашытқы клеткаларының плазмидалық трансформациясы.
S. cerevisiae молекулалық векторлары. Интеграция векторлары. Клондаушы векторлар. Жасанды УАС хромосомасы
Қысқа мазмұны:
Осы уақытқа дейін біз эукариоттың ген клонын бактерия клеткасында көбеюін қарастырдық. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын тікелей эукариоттар, әсіресе сүтқоректі жануарлар клеткаларына енгізіп, оның өнімін алудың болашақтағы маңызы өте зор. Эукариоттар клеткаларында ген клонын көбейтудің басты проблемаларының бірі -- векторлық молекулалар. Генді эукариоттық векторға енгізу техникасының негізі бактериялық клеткадағыдай. Алайда, эукариоттық векторлардың өзі бактериялық векторлардан айырмашылықтары бар. Әлбетте, мұндай векторлардың рестриктазалар ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Мақсаты: Гендік инженерия ғылымының даму тарихы мен пәні, мақсаты мен міндеттерімен танысу
Кілтті сөздер: Генетикалық инженерия, рекомбинантты ДНҚ, клон, бөгде ген.
Дәрістің негізгі сұрақтары
1.Гендік инженерия ғылымының даму тарихы
2.Гендік инженерия пәні, мақсаты мен міндеттері
3.Генетикалық және гендік инженерия
4.Рестрикциялық ферменттер (эндонуклеазалар). Рестриктизалалық ферменттердің ашылуы. Рестриктизалалық ферменттердің типтері. Рестрикция - модификация жүйесі
5. Кері транскриптаза немесе ревертаза ферменті
6. ДНҚ лигаза
Қысқа мазмұны:
1. Гендік инженерия молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Бұл атаудың екі түрі қол-данылады: "генетикалық инженерия" және "ген инженериясы". Соңғы кезде "генетикалық инженерия" жалпылама түрде колданылып жүр, ген инженериясы да осының ішіне кіреді.
Молекулалық биология ғылыми жетістіктерінің нәтижесінде пайда болған ген инженериясы организмнің бағалы қасиетін сақтап қана қоймай оған жаңа әрі саналы қасиет те бере алады. "Инженерия" деген атау құрастыру деген мағынаны білдіреді. Яғни ген инженериясы дегенді ген кұрастыру деп түсіну қажет. Ген инженериясының дәуірі басталмай тұрып 1969 жылы Г. Корана нуклеотидтерді белгілі бір жүйемен орналасқан ДНҚ синтезінің методологиясын жасап берген. Жекеленген дербес амин қышқылы -- ашытқының аланиндік тРНҚ-ның бастауыш жүйесі ашылғаннан кейін Г. Корана химиялық жолмен осы РНҚ-ның көлемі 77 полинуклеотидтен тұратын кодтық бөлігін синтездеді. Кейіннен 1979 жылы осы лабораторияда ішек таяқшасының тирозиндік тРНҚ-сы синтезделді және ол Т4 бактериофагының құрамына енгізіліп, бактерияның клеткасында жұмыс істеді.
Ген инженериясының дүниеге келген уақыты 1972 жыл деп есептеледі. Сол жылы Т. Берг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмнің ДНҚ-ларының фрагменттерінен жаңа гибридтік ДНҚ құрастырды. Бірақ маймылдың рак вирусының, бактериофагтың және ішек бактериясының гендік ДНҚ-ларынан құрастырылған ол гибридтік ДНҚ-ның клетка ішінде ойдағыдай жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, себебі құрамында рак вирусының нуклеин қышқылы болғандықтан ғалымдар тәуекелге бармады.
Клеткада жұмыс істей алатын гибридтік ДНҚ-ны 1973-74 жылдары С. Коэн мен Г. Бойер құрастырды. Олар басқа организмнен бөліп алған ДНҚ фрагментін (генін) бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Ол плазмидадағы бөтен гендердің алғаш рет жаңа организм ішінде жұмыс істей алатынын көрсетті. Соның артынша-ақ дүние жүзінің көптеген лабораторияларында жұмыс істей алатын әр түрлі плазмидалар алынды. Совет елінде ондай бөтен гені бар плазмида академик А.А. Баевтың басшылығымен жасалды.
2. Гендік инженерия деп рекомбинантты ДНҚ-лар жасап, оларды басқа тірі клеткаларға енгізуді айтады.
Ген инженериясы шешетін мәселелер:
1) генді химиялық немесе ферментті қолдану жолымен синтездеу;
2) әр түрлі орғанизмнен алынған ДНҚ фрагменттерін бір-бірімен жалғастыру (ДНҚ рекомбинантгарын алу);
3) бөтен генді жаңа клеткага векторлық ДНҚ аркылы жеткізу және олардың қызмет жасауын қамтамасыз ету;
4) клеткаларға гендерді немесе генетикалық жүйелерді енгізу және бөтен белокты синтездеу;
5) бөтен генге ие болған клеткаларды таңдап бөліп алу жолдарын ашу.
3. Микроорганизмдер генетикасының екпінді дамуы біздің ғасырымыздың 70-жылдарының бірінші жартысында генетикалық инженерия, ген инженериясы немесе рекомбинатты ДНҚ техникасы деп аталатын жаңа эксперименттік технологияның пайдаболуына әкелді. ТМД елдерінде алғашқы -- екі, ал батыста соңғы аталу кең қолдану алды.
Генетикалық инженерия деп in vitro жағдайында функциялық пәрменді генетикалық құрылымдарды (рекомбинантты ДНҚ-ны) құрастыруды және оларды тірі клеткаларға енгізуді түсінеді. Генетикалық инженерия және ген инженериясы терминдері синоним ретіңде қаралғанмен, олардың мағынасы бірдей емес: генетикалық инженерия -- генетикамен байланысқан, ал ген инженериясы -- тек генге ғана қатысы бар. Рекомбинантты ДНҚ (рДНҚ) дегеніміз әр текті ДНҚ-лардан құралған (табиғи немесе синтетикалық ДНҚ фрагменттерін жалғастыру арқылы) және клеткаларда репликациялана алатын генетикалық құрылымды түсінеді. Бүл арадан, біз үш терминнің де жалпы анықтамасы бір бағытта екендігін байқауымыз керек, реалдық тұрғыдан олардың мақсаттары.бірдей және қазіргі жаңа биотехнологияның негізгі, әрі перспективалы әдісі болып саналады.
Ген инженериясы мынадай кезеңдерден тұрады: 1) генді (ДНҚ фрагментін) алу; 2) рекомбинантты ДНҚ. молекуласын құрастыру; 3) реципиент клеткасына рекомбинантты ДНҚ молекуласын енгізу; 4) қажет рекомбинантты ДҢҚ молекулалары бар клондарды (бактерияық клеткаларды) ортадан табу.
4. Ген инженериясының немесе рекомбинантты ДНҚ технологиясының қалыптасуы ерекше ферменттер класы -- эндонуклеазалардың немесе рестриктазалардың ашылуымен және қолданылуымен байланысты. Рестрикция ферменттерін 1972 ж. В. Арбер бактерия клеткасында ашты. Барлық бактериялар қос тізбекті ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер бөлігін үзе алатын бір немесе бірнеше рестриктазаларды синтездейді. Рестрикция ферменттерінің клеткадағы қызметі -- бактерияға енген бөтен ДНҚ молекуласынан қорғау, рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның бактериялық клеткада кебеюіне жол бермейді.
Рестрикция ферменттерін синтездейтін клетканың ДНҚ молекуласы эндонуклеазалардың әсерінен үзілмейді, өйткені бұл клеткалар модификациялау ферменттерін синтездейді, олардың әсерінен ДНҚ-ның құрылымы модификацияланады (өзгереді) -- ДНҚ-ның репликациясы кезінде рестриктаза танитын бөліктерге метил тобын (СНз)- жалғайды. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза үзе алмайды. Мұны бактериялардың өзіндік бір иммундьқ жүйесі деп санауға болады. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енгең кейбір бактериофагтардыңнуклеин қышқылы метилденіп кетеді де, бактериялар осы фагтың әсерінен лизиске ұщырайды. Осы құбылысты -- Нобель сыйлығының 1973 ж. лауреаттары -- X. Смит, Д. Ңатанс және В. Арбер ашты. Рестрикциялау және метилдеу фөрменттері клетканың модификация-рестрикция жүйесін (МR) -- құрайды.2.Рестриктазалардың негізгі үш типі: I, II және ,III белгілі. Барлық рестриктазалар қос спиралды ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер қатарын дәл тани алады. Алайда, рестриктазалардың I типі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны әр қилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II және III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дәл үзе алады. Эндонуклеазалардың I және ІІI типтер құрылымы күрделі және екі модификациялық және АТФ-ға тәуелді эндонуклеазалық активтіліктері бар. Рестрликтазалардың II типі екі жеке белоктардан құралған: рестрициялаушы эндонуклеаза жэне модификациялаушы метилаза. Аталған себептерге байланысты ген инженериясында тек қана рестриктазалардың II типі пайдаланылады.Екінші жағынан; рестриктазаның II типі ғана бірдей нуклеотид тізбектерінің фрагменттері барДНҚ препараттарын алуға және әр түрлі геномдардан алынған фрагменттерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады.
Рестриктазалардың ІI типінің басым көпшілігі 4 -- 6 н. ж. құралған палиндромды ДНҚ тізбектерін тани алады. Мысалы, Вас. subtilis бактериясының ВsuR1 деп белгіленетін рестриктазасы ДНҚ бөлігін төмендегідей үзе алады:
Әр тізбекті 3' -- ұшына 5′ бағытына қарай көз жүгіртсе, олар бірдей оқылады (ЦЦ ГГ), міне осындай тізбек палиндром деп аталады. Натижнсінде ДНҚ-ның қос тізбегі симметриялы үзіледі. (сілтемемен (стрелка) көрсетілген), сақиналы ДНҚ түзу құрылымға айналады. ДНҚ молекуласының. Соңында жабысқақ ұштар пайда болады, сондықтан олар ешқандай қосымша өңдеусіз бір-бірімен қайтадан қосылуға қабілетті болады. Қазіргі кезде рестриктазалардың II типінің 500-ден астам түрлері белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерден үзе алады. 1973 ж. X. Смит және Д.Натанс рестрикция-модификация жүйе (МК) ферменттерін белгілеу номенклатурасын ұсынды. Көпшіліктің мақұлдауы бойынша туыстың бірінші әрпі және түрдің алғашқы екі әрпінен құралған үш әріп ферменттің шығу көзін көрсетеді. Эндонуклеазаларды -- R,метилазаларды -- М символдарымен белгілейді. Егер клетканың бір типінен екі және одан көп рестрикция ферменттері бөлінгенболса онда оларды рим цифрларымен (I, II, ІІІ т.с.с) нөмірлейді. Осы номенклатура сүйеніп, Е. Соlі рестриктазасы ЕсоRІ, ЕсоRІІ және т, т., ал Вас.subtilis рестриктазасы ВsuRI т.с.с. болып белгіленеді.
3. ДҢҚ тізбегінің үзілуі не симметрияның өсі бойынша жүруі мүмкін, онда доғал ұшты фрагменттер түзіледі (мысалы, Ваll немесе ВsuRI рестриктазалары), не симметрия өсінен біршама қашықтықта өтуі мүмкін, онда шығыңқы жабысқақ 5′ (ЕсоRІ, Ніnd III -- және т. б. рестриктазалар) немесе 3′ (РstІ рестриктазасы) ұштары бар фрагменттер түзіледі.
Әр түрлі рестриктазалардың II типінің ішінен ДНҚ-ның бір нуклеотидтер қатарын танитын екі немесе бірнеше ферменттер кездеседі. Осындай жұп немесе топ эндонуклеазалар изошизомерлер деп аталады. Изошизомерлердің екі түрін ажыратады: нағыз изошизомерия -- ферменттер белгілі бір нуклеотидтер қатарын танып, ДНҚ-ны бір нүктелерде үзеді және жалған изошизомерия -- ферменттер бір нуклеотидтер қатарын тани алға-нымен, оларды әр түрлі үзеді.
Рекомбинантты ДНҢ техникасы үшін алуан түрлі рестрикция ферменттерінің ішінен өздеріне комплементарлы жабысқақ ұштары бар фрагменттер түзейтін рестриктазалар бағалы болып саналады.
5. Кері транскриптаза - ДНҚ тізбегіне комплементарлы мРНҚ транскрипциясына пайдаланылады. Геномы бір-тізбекті РНҚ молекулаларынан тұратын ретровирустарды зерттеу кезінде жасушаішілік даму процесінде ретровирус геномының қос тізбекті ДНҚ түрінде жасуша қожайын хромосомасына интеграциялану стадиясынан өтетіндігі анықталды. 1964 жылы Темин аналық РНҚ негізінде комплементарлы ДНҚ синтездеуге қабілетті , вирус арнайылық қасиетке ие ферменттер туралы гипотезаны ұсынды. Осы ферментті бөліп алуға арналған жұмыстар сәтті аяқталды, 1970 жылы Темин мен Мизутани, және олардан тәуелсіз Балтимор Рауса саркома вирусы вирионының жасушадан тыс препараттарынан қажетті ферментті ашты. Бұл РНҚ-тәуелді ДНҚ-полимераза кері транскриптаза, немесе ревертаза деп аталды.
Ең егжей-тегжейлі зерттелген -құстар ретровирусының ревертазасы. Әрбір вирионда осы ферменттің, шамамен, 50 молекуласы бар. Кері транскриптаза екі суббірліктерден тұрады - a (65 кДа) және b (95 кДа), эквимолярлы мөлшерде болатын. Кері транскриптаза кем дегенде үш ферменттік активтілікке ие:
1) ДНҚ полимеразалық, аналық ретінде РНҚ ны және ДНҚны да пайдаланатын;
2) H РНКазалық активтілік, РНК-ДНК гибриді ішіндегі РНҚ-ны гидролиздейтін, бірақ бір немесе екі тізбекті РНҚ-ны емес;
3) ДНК эндонуклеазалық активтілік.
Алғашқы екі активтілік вирустық ДНҚ синтезіне керек, ал эндонуклеаза вирустық ДНҚ-ның қожайын жасушасы геномына интеграциялануына маңызды болуы мүмкін. Тазартылған кері транскриптаза ДНҚ-ны аналық РНҚ негізінде де және аналық ДНҚ негізінде де синтездейді. Синтезтеуді бастау үшін ревертазаға, басқа да полимеразалар секілді, қысқа қос тізбекті бөлік (праймер) қажет. Праймер ретінде процесс кезінде жаңа түзілген тізбекпен ковалентті байланысатын бір тізбекті РНҚ немесе ДНҚ сегменттері қолданыла алады.
Кері транскриптазаны мүмкіндігінше аналық РНҚ-ның комплементарлы ДНҚ-ға(кДНҚ) транскрипциясы үшін пайдаланады. Кері транскрипция реакциясын рнказалық активтілікті тежейтін ингибиторларды қолдана отырып, арнайы таңдалған жағдайда жүргізеді. Осылайша, мақсатты РНҚ молекулаларының толық көлемді ДНҚ- көшірмелерін алуға болады. поли (A) - құрамды аРНҚ кері транскриптазасы кезінде праймер ретінде олиго (dT), ал З'-поли (А) соңы жоқ РНҚ молекуларына зерттеліп отқан РНҚ-ның 3'- соңына комплементарлы, химиялық синтезделген олигонуклеотидтер пайдаланады. аРНҚ негізінде комплементарлы ДНҚ тізбегін синтездеп және РНҚ-ны ыдыратқан соң (әдетте сілтілік өңдеу пайдаланылады), ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезін жүзеге асырады. Ревертазалардың бір тізбекті кДНҚ-ның 3 'соңында өз-өзіне комплементарлы, праймер қызметін жүзеге асыра алатын шпилькалар түзе алу қабілеті қолданылады.
Матрица болып кДНҚ-ның бірінші тізбегі қызмет атқарады. Бұл реакцияны ревертаза немесе E.coli ДНҚ-полимераза I ферменті де жүргізуі мүмкін. Осы екі ферменттің қосындысы арқылы толық қос тізбекті кДНҚ молекулалардың пайда болу санын арттыруға болатыны көрсетілген. Синтез аяқталған соң кДНҚның бірінші және екінші тізбектері, екінші тізбекті синтездеу кезінде праймер ретінде қызмет атқарған шпилька ілгекпен ковалентті байланысқан болып қала береді. Бұл ілгекті арнайы біртізбекті нуклеин қышқылдары бөліктерін жоятын эндонуклеаза S1 арқылы ыдыратады. Пайда болған ұштары әрқашан тік бола бермейді, және клондау тиімділігін арттыру үшін оларды әрі қарай E.coli ДНҚ-полимераза I Кленова фрагменті көмегімен тік ұш алу мақсатында жөндейді. Алынған қостізбекті кДНҚ-ны клондаушы векторларға енгізуге, гибридті ДНК молекулалары құрамында көбейтуге және одан әрі зерттеулер үшін пайдалануға болады.
6. ДНҚ лигаза - ДНҚ-ның бос ұштарын бір-біріне жалғайтын фермент. Бұл фермент қалыпты клеткаларда ДНҚ синтезіне және репарация (қалпына келу) процестеріне қатысады, яғни ДНҚ молекуласының біраз бүлінген жерлерін қалпына келтіруге қатысады.
1961 жылы Мезельсон мен Вейгл I фагы негізінде рекомбинация ажыраудан және ДНҚ молекулаларының қайта қосылуынан тұратынын көрсетті. Бұл ДНҚ фрагменттерін тігуге қатысатын ферментті іздеуге бастама болды. 1967 жылы осындай ферменттер табылды және ДНК лигаза деп аталды. Ол екі тізбекті нуклеин қышқылы молекуласында фосфодиэфирлі байланыстың синтезін катализдейді.
Басқаша айтқанда, ДНҚ лигазалар қант қалдықтары арасында байланыс түзе отырып, қатар орналасқан нуклеотидтерді тігеді. ДНҚ лигазалар ДНҚ репарация процестерінде, ДНҚ репликация процестеріне - ДНК тізбегінің екі еселенуіне өте қажет.
ДНҚ лигазаның екі түрі бар , олар кофакторға қажеттілігі және әсер ету әдісі бойынша ерекшеленеді. E.coli ДНҚ лигазасы кофактор ретінде дифосфопиридиннуклеотидті, ал T4 фагы лигазасы Мg2 + бар ортада АТФ пайдаланады. T4 фалы лигазасы әмбебап, ол жабысқақ ұштарды тігумен қоса, қостізбекті ДНҚ фрагменттерін тік ұштармен қосылу реакциясын катализдейді. Ол жиі пайдаланылады.
Талқылау үшін сұрақтар:
Гендік инженерияның негізгі принциптері, болуының алғы шарттары.
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыруда қолданылатын ферменттер. Рестрикциялаушы эндонуклеаза және ДНҚ лигаза ферменттері. Олардың классификациясы және қасиеттерін көрсетіңіз
ДНҚ және РНҚ матрицасында ДНҚ молекуласының синтезделуін катализдейтін ферменттер: ДНҚ полимераза мен ревертаза ферменттері және олардың гендік инженерияда қолданылу аясын көрсетіңіз
ДНҚ фрагменттерінің соңдарын модификациялаушы терминальді трансфераза, полинуклеотид киназа, сілтілі фосфатаза, поли А-полимераза және олардың гендік инженерияда қолданылу аясын көрсетіңіз
Ұсынылған әдебиеттер:
С.Н. Щелкунов "Генетическая инженерия", СУИ, Новосибирск - 2004.
Б. Глик, Дж. Пастернак "Молекулярная биотехнология. Принципы и применение", М., "Мир", 2002.
ДӘРІС 2 E.COLI ГРАМТЕРІС БАКТЕРИЯСЫНЫҢ ГЕНДІК ИНЖЕНЕРЛІК ЖУЙЕСІ
Мақсаты: Прокариот жүйесінде бөгде генді клондаудың принциптері мен артықшылық кемшіліктерімен танысу
Дәрістің негізгі сұрақтары
1. Гендік инженериядағы генді алу әдістері: Генді тікелей бөлу әдісі, Генді синтездеудің химиялық әдісі, Ферменттік (энзимдік) әдіс.
2.Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру
3. Прокариот жүйелерінде клондаудық молекулалық векторлары. трансформацияланған клеткалар скринингі.
4. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын клондау әдістемелері.
5. Прокариот гендерінің экспрессиясының реттелуі
Қысқа мазмұны:
1. Гендік инженериядағы генді алу әдістері. Генді алудың үш әдісі бар: табиғи генді тікелей бөлу (сирек мүмкіндік), химиялық және ферменттіксинтез. Табиғи генетикалық материалдан -- ДНҚ-дан арнайы ферменттердің (рестрикциялық эндонуклеазалардың) көмегімен қажет ген кесіліп алынады. Бұл әдістің елеулі кемшіліктері бар. Біріншіден, ДНҚ-дан қажет генді танып, кесе алатын ферментті таңдап алу қиын.Фермент тенді әрқашанда наңтьі шекарасыпда емес әр қилы үзеді: не геннің екі жағынан артық нуклеотидтерді үзуі, не түгел үзбеуі мүмкің, мұндай ДНҚ фрагментерінің қызметі жеткіліксіз, сондықтаноларды пайдалану мүмкінболмайды. Екіншіден, эукариоттық организм геномының экзон-интрондыққұрылысы, олардың гендерін бактерияларға енгізгенде функциялық тұрғыдан қиындық туғызады, өйткені бактериялық клеткада сплайсинг процесі (ин-трондардың кесілуі) өтпейді. Үшіншіден, егер ген барлық ДНҚ-ның аз ғана бөлігін құраса, онда оны бөлу мен анықтауда елеулі қиындықтар пайда болады. Сондықтан бұл әдіс негізінен генетикалық эксперименттер талабына сәйкес вирус пен бактериялардың генін бөлуде қолданылады.
Генді-синтездеудің химиялық әдісі. Бұл әдістербелоктың немесе полипептидтің бірінші құрылымы ( амин қышқылдар қатары) белгілі болса, оның генінің нуклеотидтер қатары химиялық жолмен синтезделеді. Берілген нуклеотидтер тізбегі бойынша ДНҚ - синтездеу әдісін 1969 жылы, ген инженериясының дәуірі басталмаған кезде-ақ, Г. Корана ұсынған болатын. Ашытқы тРНҚ-ның гені осылай синтезделді. Бұл ген 77 н. ж. құралған. Алдымен, ұзындығы 5 -- 12 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ-ның қысқа фрагменттері синтезделді,онан соң олар арнайы ферменттің (лигаза) әсерімен бір-бірімен қосылды. Алайда, алғаш синтезделген бұл генді ішек таяқшасының клеткасына енгізген кезде жұмыс істей алмады, өйткені онда реттеуші элементтер -- промотор және терминация бөліктері жоқ болатын. Кейін, 1976 ж. Г. Корана қызметкерлерімен тирозиннің тРНҚ-ының генін синтездей алды. Геннің ұзындығы 126 н. ж. тең болды, оған 52 н. ж. құралған промотор, 21 н. ж. -- терминатор және ұштарына тетрануклеотидтер (ААТТ және ТТАА) жалғанды. Нәтижесінде, осы генді бактериофаг арқылы Е. Со1і клеткасына енгізгенде олар өз функциясын көрсете алды. Қазіргі уақытта Г. Корана өңдеген әдістер бірқатар жасанды гендерді синтездеу үшін қолданылады. Осындай жолмен адамның -- инсулин және интерферон, адам мен жануарлардың -- энкефалин және бардикинин гормондарының функциялы гендері синтезделді. Қазіргі кезде гендерді автоматты синтездейтін құралдар бар. 1980 ж. Итакура алғаш өзінің құрамында алдын ала берілген тізбек бойынша 6 сағ. ішінде 12-мүшелік олигонуклеотидті синтездеуге қабілетті автоматтың жұмысын компьютер бақылады. Мұндай жабдықтардың 1982 жылғы бағасы 36000 -- 39500 долларға тең болатын. Егер 1979 жылы 120 н. ж. генді синтездеу үшін екі жыл керек болса, ал 1981 ж. бұл мақсатқа үш-аң күнде жетуге болады.
Генді синтездеудің ферменттік (энзимдік) әдісі. Генді синтездеудің үшінші әдісі кеңінен таралған және кейін рекомбинанты ДНҚ күйінде бір, кейде көп клеткалы организмдерде көбейетін гендердің негізгі шығу көзі болып саналады. Оның мәніферменттік синтез арқылыгенді алудан тұрады және төмендегіге саяды. Ең алдымен, клеткалардан (мұнда, қажет геннің активтілігі жоғары болуы керек) информациялық (матрицалық) РНҚ (иРНҚ) молекулаларын бөліп алады, олардың арасында генкоделейтін иРНҚ бар, міне осы иРНҚ-ны бөлу қажет. Бұдан кейін кері транскриптаза (ревертаза) ферментінің көмегімен бөлінгениРНҚ-да комплементарлыДНҚ (кДНҚ) синтезделеді. Кері транскрипцияпроцесінде матрицалық иРНҚ-да кДНҚ-ның синтезі басталуы үшін иРНҚ-ның 3' -- ұшына комплементарлы ашытқы,-олигонуклеотид (қысқа тізбек) қажет. Жаңа кДНҚ тізбегі синтезделуі үшін тағы Мg иондары мен дезоксинуклеозидтрифосфаттар керек. Жаңа кДНҚ синтезделіп біткеннен кейін, оны тазалап, ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін матрица ретін де пайдаланады. Ол үшін ортаға ревертазаны немесе ДНҚ- -полимеразаны (бактериялардан алынған) қосады. ДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезі басталуы үшін олигонуклөотид (ДНҚ-ның 3' -- ұшына комплементарлы) керек, әйтпесе кДНҚ-ның 3' -- ұшы белгісіз себептермен шпилькалы кұрылым түзейді, осы құрылым екінші ДНҚ-ның синтезін инициациялай алады. ДНҚ-ының екінші тізбегі синтезделіп болғаннан кейін, оның алғашқы кДНҚ-ымен қосылған бөлігі (шпилькалы) нуклеаза 51 ферментінің әсері арқылы ажырайды, нәтижесінде қос тізбекгі геналынады, оңы қос тізбекті комплементарлы ДНҚ (қт-кДНҚ) деп атайды. РНҚ жіпшелері сілтінің әсерімен гидролизденеді, ал олигонуклеотидтер аталған нуклеазаның әсерімен ыдырайды. Кері транскриптаза ферменті арқылы синтезделген гендерді бактерия клеткасына енгізбестен бұрын, оларға реттеуші элементтер жалғайды. Прокариоттарда сплайсинг өтпейтінін ескерсек, онда генді ферменттік жолмен синтездеу үшін матрица ретінде гяРНҚ-ны емес, жетіл-ген иРНҚ пайдалану керек.
2. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру. Генетикалық инженерияның негізгі мағынасы болып рекомбинантты ДНҚ системасын құрастыру міндеті саналады. Рекомбинатты ДНҚ деп in vitro жағдайында шығу көзі бойынша әр түрлі кез келген екі немесе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны түсінеді. Рекомбинантты ДНҚ-ның қарапайым құрамы бөтен ДНҚ мен вектордан тұрады.
Генетикалық инженерияның формалды тұрғыдан дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі, осы жылы II. Бэрг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмдердің -- маймылдың рак вирусының, фагтың және бактериялық плазмиданың (вектордың) -- ДНҚ фрагменттерінен бірінші рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Дегенмен, бұл ДНҚ-ның клеткада жұмысістей алатындығы тексерілмеді, өйткені құрамында рак вирусының гені болғандықтан П. Бэрг тәуекелге бармады. Дәл осы кезде
Лобан да осындай рекомбинантты ДНҚ молекуласын алу мүмкіндігін көрсетті. Бұл кезде рестриктазалар және оның қасиеттері ашылған болатын. 1973 ж. С. Коэн және Г. Бойер плазмида негізінде векторларды құрастыру үшін рестриктазаларды пайдалану керектігін алғаш түсінді. Олар 1974 ж. клеткада кәдімгідей жұмыс істей алатын рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырды. Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ құрастыру жолдары жаңа ғылыми дәйектермен толтырылды және жетілді, ал олардың негізгі принциптері II. Лобан жәно С. Коэн ндеяларына сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың ең кең таралған әдісі рестриктазаларды қолдануға сүйенеді. Ол жабысқақ ұштар әдісі деп аталады.Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де (бөтен ДНҚ үзіндісі де) және векторда бір рестрикциялық ферменттің көмегімен үзіледі, нәтижесінде олардың ұштары бір-біріне комплементарлы, яғни жабысқақ болғандықтан гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен оңай бірігеді. `Жабысқақ ұштар әдісі өзі танитын ДНҚ бөлігін симметрия өсінен біршама қашықтықта үзетіп рестриктазаларға сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ-ны жабысқақ ұштар әдісі бойынша құрастырудың жақсы жақтары және кемшіліктері бар. Алынған гибридтік ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатынбөліктердің қалпына келуі әдістіңжақсы жағын сипаттайды.Бұл бөтен ДНҚ фрагментін осы рестриктазаныңәсерімен салыстырмалы оңай бөліп алуға мүмкіндік береді. Ал, рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің - жабысқақ ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияланып (қайтадан бірігуі) кетуі әдістің кемшілігін көрсетеді. Осының нәтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бөлігі ендірмелермен емес, өз ұштарымен тікелей әрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса бірнеше біріккен бөтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іріктеу жұмысын асыру керек.
Бұдан басқа бұл әдістің күрделілігі бар: рестриктаза танитын нүктелер эксперимент үшін ыңғайлы бөлікте орналаспауы мүмкін, мысалы, олар қажет геннің ішіне локализацияланады. ДНҚ-ның кез келген ұшын плазмидамен рекомбинациялау үшін пайдалануға мүмкіндік туғызатын басқа әдістер де бар.
Гомополимерлі ұштар әдісінде немесе конекторлық симметрия өсімен үзетін рестриказа арқылы алынған ДНҚ фрагменттерінің доғал ұштарына (шығыңқы бір тізбекті бөлігі жоқ) терминалдық трансфераза ферментінің көмегімен гомонуклеотидтер, мысалы ДНҚ-ның 3' -- ұштарына поли (Т) немесе поли (Ц), ал векторлық ДНҚ-ның 3' -- ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады. Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін (бетен ДНҚ және вектор) бір ортаға қосса, олар комплементарлы жұп негіздерін түзеп, оңай бір молекулаға бірігеді. Немесе ДНҚ фрагментіне де, вектордың ұшына да синтетикалық қос тізбек (линкер) жалғайды. Сонан соң линкерді танитын және оны жабысқақ етіп рестриктазамен үзеді. Осылайша бұл жолмен де жабысқақ ұштар алынады. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың бұл әдісі Лобан-Берг идеясына сүйенеді.
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі -- доғал ұштарды жалғау (тігу). Оның, негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ-лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл әдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі тізбекті араларына ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл әдісті пайдалану өте ыңғайлы.
Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың қаралған үш әдісінің бірнеше модификациялары (өзгешеліктері) бар және де ген мен векторлық молекуланың ерекшелігіне байланысты методологиясы әртүрлі болуы мүмкін.Көпшілік жағдайда линкер технологиясы қолданылады.
3. Прокариот жүйелерінде клондаудық молекулалық векторлары. Ген инженериясының маңызды мақсаты синтезделген немесе бөлінген генді клеткаға тасымалдау саналады. Бұл мақсат ДНҚ-ның векторлық молекулалары немесе қысқаша векторлар (тасымалдаушы немесе тасығыш) көмегімен іске асады.
Вектор деп бөтен генетикалық материалды (ДНҚ фрагментін) клеткаға (реципиенттің) тасымалдауға қабілетті ДНҚ молекуласын айтады. ДНҚ молекуласын векторсыз, мысалы, бактериялық клеткаға енгізсе, онда оларды бактериялық ферменттер ыдыратып жібереді. Кейбір жағдайда ДНҚ сақталуы мүмкін, бірақ клетканың бөлінуінде олар тұқым қуаламайды. Осындай жағдай болмас үшін векторлық молекулалар қолданылады. Век-торлар -- ген тасығыштар, ал вектор деген сөздің өзі бағыттағыш деген мағынаны білдіреді. Сонымен бірге, векторларды рекомбинантты ДНҚ-ның міндетті бөлігі деп түсіну керек. Векторларды эксперименттік жолмен құрастырады және оларға мынадай талаптар қойылады: 1) вектор клетка ішіне өзімен бірге бөтен генді алып кірген соң, репликациялана (көбейе) алатын болуы керек, сонда ғана ол келесі ұрпаққа тұқым қуалай алады, ол үшін векторға ДНҚ репликациясын бастайтын ерекше нуклеотидтер тізбегіненгізеді; 2) құрамындарестриктазалар танып, үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек, әйтпесе векторға ДНҚ фрагментін енгізу мүмкін емес;3) оның, бір немесе бірнеше таңбаланған гендері (маркерлері) болуы керек, солтаңбалар бойынша қажетгеннің қайсы клетканың (реципиенттік) ішіне енгенін анықтайды; 4) вектордың, клетка ішіндегі копиялары (көшірмелері) жеткілікті мөлшерде болуы керек. Ген инженериясында векторлық молекуланың шығу козі болып бактериялық плазмидалар мен вирустар (әсіресе фагтар) саналады. Плазмида және фагтар негізінен бірінші талапқа сай келеді, ал, оларды келесі талаптарға сай келтіру үшін қосымша генетикалық өндеу жүмысын жүргізу керек.
Жоғарыда аталған векторларға қойылған талаптарға сәйкес кез келген генетикалық құрылым, басқа жағынан кез келген плазмида мен фагтар ген тасығыш бола алмайды. Ген инженериясында қолданылатын векторларды үш топқа бөлуге болады: 1) плазмидалар;2) бактериофагтар; 3) космидтер және фазмидтер. Қазіргі кезде рекомбинантты ДНҚ технологиясында алғашқы екі векторлар типі жиі пайдаланылады, егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда ген клеткаға трансформация типімен енеді, ал бактериофаг (фаг лямбда)қолданылса, онда ген клеткаға трансдукция типімен енеді.
Плазмидалық векторлар. Вектор ретінде мөлшері 15 -- 20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмидалар бактериялардың хромосомадан тыс генетикалық элементі екендігін және олардың сипаттамасын біз қарастырған болатынбыз. Плазмидалық векторлар генді бактерияларға тасымалдап, оның тиімді жұмысын қамтамасыз ете алады.
Генетикалықинженерияда Е. Соlі бактериясыүшін көптеген векторлық плазмидалар құрастырылды. Олардың ішінен әсіресе СоlЕ1 плазмидасының туындылары кең таралды. Ф. Болваржәне Р. Родригес құрастырған осындай плазмида -- рВR322бірнеше мың жұпнегіздерден (4362 н. ж.) құралған. Бүл плазмидада антибиотиктер -- ампициллин мен тетрациклинге төзімділіктің гендері бар және бірнеше рестриктазалар үзе алатын сайттары (нуклеотидтік нүктелері) бар рВR322 плазмиданың құрамында екі плазмида (рМВ1 және рSС101) және Тn З транспозоны бар. Ампициллинге тұрақтылықтың генінде Pst1 рестриктазасына арналған сайтқа және тетрациклинге тұрақтылық генінде ВаmН1 және SaL1 рестриктазаларына арналған қос сайтқа мән беріңіз. Осындай рестрикциялық сайттарда екі антибиотиктерге төзімділік гендерінің болуы қажет ДНҚ-сы (бөтен ДНҚ-сы) бар плазмидаларды сұрыптап алуға мүмкіндік береді.
Плазмиданы Ваm1 рестриктазасымен үзеді де, босаған орынға бөтен ДНҚ молекуласын (олар да, алдын ала Ваm1 рестриктазасымен үзіледі) жалғайды, нәтижесінде рекомбинантты плазмида тетрациклинді ортада өсе алмайды, өйткені плазмиданың tet генінің біртұтастығы бұзылған. Керісінше, плазмида ампицилинді ортада өсе алады, міне, осындай ортада көбейетін бактериялардан қажет генді оңай табуға болады. Бұл арада, вектор антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша таңбаланды.
pBR322 векторынан басқа СоlЕ1 плазмидасы негізінде бірнеше векторлар құрастырылған.Басқа плазмидалар (рSC101 т. б.) негізінде алынған векторлар да белгілі.
СolЕ1 плазмидасы негізінде құрастырылған вектордың кемшілігі де бар: бөтен ДНҚ-ның молекулалық массасы артқан сайын рекомбинанттардың саны (копиялары) азая түседі. Осы себептен ұзын ДНҚ фрагменттерінің (10 мың. н.ж. асатын) клондарын алу үшін фагтық векторларды, космид және фазмидтерді пайдаланады.
4. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын клондау әдістемелері. Рекомбинантты. ДНҚ-ны клеткаға енгізу. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілі векторға байланысты. Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда енгізу трансформация типімен, егер фаг қолданылса, онда трансфекция (клетканың фаг ДНҚ-сы арқылы инфекциялануы) типімен өтеді. Трансформация мен трансфекцияның жалпы жолы бактерия клеткасын кальций тұздарымен(Са С12) өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындығына негізделеді. Экзогенді (бөтен) ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала СаСІ2-мен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 104 -- 105 плазмиданың біреуі ғана клетканың ішіне енеді яғнибактериялардың азғантай бөлігі ғана трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады. Әдетте, модификацияланбаған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метилденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жіберетінін біз білеміз.Ал, клеткаға рекомбинантты ДНҚ молекуласының көп мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктаазлары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар кесіп үлгірмеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп -- модификацияланып кетеді. Ғалымдар генетикалық инженерия тәжірибелерінде рестрикциялық ферменттері жоқ бактериялық клеткаларды жиі қолданады. Мұндай рестрикцияланбайтын клеткаларда әдетте модификациялаушы ферменттер де жоқ болады.
5. Прокариот гендерінің экспрессиясының реттелуі. Прокариоттар гендері жұмыс істеуінің немесе экспрессиясының механизмі бүгінгі күні жақсы зерттелген және Е. СоІі бактериясы мен кейбір оның фагтарын көпжылдық іргелі молекулалық-биологиялық зерттеулер арқасында түсінікті бола бастады. Алдымен, прокариоттық геннің экспрессиясы деп осы генде иРНҚ синтезделуін (транскрипция кезеңі) және иРНҚ-ның рибосомадағы трансляциясын (белок синтезін) түсінетінін еске түсірейік.Белок синтезінің бірінші кезеңі -- трапскрипцияның инициация процесінде РНҚ-полимераза ферменті промотор деп аталатын ДНҚ-ның ерекше бөлігін тануы керек, тек сонда ғана ДНҚ-ның қос тізбегі ажырап, иРНҚ синтсзделуі бастала алады. Демек, адам немесе жануар генінің бактерия клеткасында жұмыс істеп, қажет биотехнологиялық өнім (белок) түзуі үшін, ең алдымен, оның алдында бактериялық РНҚ-полимераза байланыса алатын прокариоттық күшті промотор болуы керек.
Транскрипцияның жоғары деңгейі плазмидалық репликацияның тұрақсыздығына әкелетін атап өту керек. РНҚ-ның ғана емес, әсіресе көптеген белоктардың мөлшерден тыс синтезделуі клетканың жойылуына әкелуі мүмкін. Осындай жағдай болмас үшін пәрменді транскрипцияланатын геннің соңында трапскрипцияны тиімді терминациялайтын (тежейтін) нүктелер болуы керек. Практикалық мақсат үшін реттелетін транскрипцияны қолдану ыңғайлы.
Ген инженериясында бірнеше күшті промоторлар белгілі: Е. СоІі оперондарының промоторлары -- LacUY5 (лактоза), trp (триптофан) және гибридтік промотор tас (trp -- Lас); лямбда фаг промоторлары -- РR мен РL; т 5, т 7, Х 174 және т. б. фагтардың промоторлары.
Ген жұмысының аяқталуы үшін иРНҚ-ның белокқа трансляциялануы қажет. Прокариоттық және эукариоттық клеткалардың молекулалық-генетикалық құрылымының айырмашылықтарына орай трансляция процесі өтуі үшін де белгілі қиындықтарды жеңуі керек. Бұл айырмашылықтар, атап айтқанда, рибосоманың, әсіресе, белоктың амин қышқылдар тізбегін коделейтін иРНҚ-ның молекулалық-генетикалық құрылымына байланысты. Прокариоттық иРНҚ-ның инициалаушы кодонының (АУГ) алдында (3 -- 12 нуклеотид бұрын) Шайн-Делгарно (SD) тізбегі деп аталатын, 3 -- 9 нуклеотидтерден құралған ерекше бөлігі бар. Бұл тізбек рибосомалық 163 РНҚ-ның 3' -- ұшына комплементарлы болғандықтан иРНҢ-ның рибосомамен байланысуын қамтамасыз етеді.
Сонымен эукариоттық геннің реттеуші бөліктері бактериядан үлкен айырмашылығы бар және оларды бактериялық РНҚ-полимераза мен рибосомалар тани алмайды. Осыған орай, бөтен ген өз қызметін бактерия клетканың ішінде іске асыруы үшін екі жағдайды керек етеді: 1) геннің алдында бактериялық РНҚ-полимераза тани алатын күшті промоторды; 2) иРНҚ трансляциясының инициациясы үшін SD -- тізбегі керек. Қазіргі кезде эукариоттық геннің реттеуші бөлігін бактериялық реттеуші бөліктерімен (промотор және SD -- тізбекпен) алмастыруды мүмкін ететін бірнеше әдістер белгілі.
Бөтен геннің клеткадағы жұмысын іске асырудың екінші жолы -- өзінің реттеуші бөліктері жоқ эукариоттық құрылымды ген функциясы жоғары бактериялық геномның арасына енгізу. Мұнда коделенетін құрылымды ген бактериялық промотормен, SD -- тізбегімен және АТГ инициациялаушы кодонмен жалғанады, нәтижесінде шамалы ғана өзгерген қажет белок бірден синтезделеді.
Бөтен геннің активтілігін клеткада қамтамасыз ету үшін оны бактериялық геннің бірімен (реттеуші бөліктері бар) жалғауға болады. Осындай жолмен 1977 ж. Бойер мен Итакура лактоза промоторын қолданып, сүтқоректілердің соматостатин гормонын Е. Соlі клеткасында синтездей алды. Бұл гормон гипоталамуста өте аз мөлшерде түзіледі және қанға инсулин мен өсу гормонының (соматотропиннің) түсуін реттейді. Оның молекуласы күрделі емес, бар болғаны 14 амин қышқылдарынан құралған, сондықтан соматостатиннің гені өте ұсақ. Осыған байланысты, алдымен, ұзындығы 42 нуклеотидке тең ДНҚ молекулаласын химиялық жолмен синтездейді (гормонның амин қышқылдар қатары белгілі және оның әрқайсысының триплетін генетикалық код арқылы табады). Осы синтетикалық генді рВR322 плазмидасына және E. Соlі геномының -- галактозидаза геннің соңына біріктіру үшін қосымша қысқа линкер тізбектерін (рестриктазалық жабысқақ ұштар) жалғады. Нәтижесінде синтетикалық қос тізбектің ұзындығы 52 жұп нуклеотидке тең болды: геннің N -- ұшында метионинді коделейтін АТГ кодоны және ЕсоR1 рестриктазасы жабысқақ ұштар етіп, үзе алатын ААТТ тізбегі бар, ал С -- ұшында екі стоп-кодон орналасты. ДНҚ-ның осы бөлігінпромоторы және операторы бар -- галактозидаза генінің бөлігіне жалғап, олардың барлығын вектор -- рВR322 плазмидасына біріктірді. Осындай біріктірудің нәтижесінде гибридті ген алынды, мұнда -- галактозидаза гені бөлігінің С -- ұшы соматостатин генімен ауыстырылды. Бактериялык -- галактозидаза гені мен соматостатин генінің арасында метионин кодоны орналасқан. Бұл гибридтің транскрипциясы мен трансляциясы -- галактозидазаның реттеуші элементтерінің арқасында іске асты. Осындай -- галактозидазаның рекомбинантты гені өзінің Е. Соlі клеткасына трансформацияланғаннан кейін өз жұмысын тамаша іске асыра алады. Нәтижесінде гибридті белок синтезделді, мұнда соматостатин -- галактозидазалық бөліктен метионин арқылы жекеленеді. Жай химиялық қосылыс -- бромциан (ВrСN) -- белоктарды метионин бойынша ажыратады. Соматостатиннің өзінде метионин қалдығы жоқ болғандықтан, оны таза күйінде жеке фракцияға бөлуге болады.
Көпшілік жағдайда, белок цитоплазмада түзілгеннен соң клетканың мембранасы арқылы оның сыртына тасымалдануы керек. Бұл үшін геннің N -- ұшында клеткалық мембранаға жақындығы бар ерекше тізбек орналасуы қажет. Бұдан басқа эукариоттардың бірқатар белоктары синтезделу аяқталғаннан кейін полиглюколизденеді: белокқа полисахаридтің қысқа тізбегі жалғанады, бұл оның активтілігіне және клетка ішінде тасымалдануына әсер етеді. Қазіргі кезде бактериялық клеткада белоктарды глюкозалау өте қиын. Бір тәуірі, көптеген белоктар (интерферон және т. б.) полисахаридтік жалғану болмаса да активтілігін жоғалтпайды. Егер мұндай модификациялық өзгеріс қажет болса, онда генді эукариоттар клеткасына енгізуге тура келеді. Бұдан бөлек, бактериялық клеткада эукариоттық геннің интрон бөліктерін үзе алатын ферменттік жүйе жоқ. Осыған орай прокариоттар ген инженериясында сплайсингтен өткен эукариоттық иРНҚ ғана пайдаланылады. Эукариоттық генді эукариоттық клеткаларға немесе организмге енгізіп, оның өнімін алу биотехнологияның болшақтағы маңызды мақсаты болып саналады.
Антидене иммундық жүйемен шығарылатын ақуыздар, олар бөтен патогендік агенттердің, ақуыздардың (антигендер) әсерін тежейді. Иммуноблотинг -- мунохимия әдісі, кейінгі кездерде антидененің бөлек антигендермен байланысын іздеуге қолданылып жүр. Бұл үшін антигендерді полиакриламид гелінде электрофорезбен бір-бірінен бөледі, бөлек антигендерді гелден арнайы жинақтағышқа кешіреді, оған зерттелетін: қан сарысуын қосады да, байланысқа түскен антиденелерді иммунофермент әдісімен анықтайды. Бұл ғылыми зерттеулерде де және вирус ауруларына диагноз қоюда да қолданылады (Мысалы адамның иммунды тапшылық вирусын зерттеуде). Иммуноблотинг алдын ала белгілі емес көп компонентті қоспада құралатын антигендерді идентификациялау жәнесипаттау үшін иммуноблотингті қолданады. Иммуноблотингті жүргізгенде антигендердің күрделі қоспасын бастапқы гель- электрофорезге жібереді, содан соң фракцияланған паптидтерді арнайы антисарысу көмегімен жеке паптидтерді идентификациялау үшін нитроцеллюлозада бетіне ауыстырады. Натрий децилсульфаты бар немесе изоэлектірлік фокустау үшін гельде алдын ала бөлу жүргізіп, антигендердің көлемі жөнінде және изоэлектірлік нүктесі туралы мәлімет алуға болады. Сонымен қатар олардың арасындағы ұқсастық туралы да деректер алуға болады. Кейбір жағдайда гельдегі электрофорез және блоттинг процедурасы нәтижесінде антигеннің кейбір эпитоптары бұзылып арнайы антигендер мен антиденелердің байланысу қабілетін жоғалтатындай етіп денатурациялайды. Мұндай жағдайда блотинг орнына яғни қандай антиген антиденелермен байланысқанын бекіту үшін иммунопреципитатция қолданған жөн. Берілген әдісті ерігіш және мембрандық антигендерді анықтау үшін қолдануға болады.
Иммунологиялық әдіс геннің өнімі белок құрамы мәлім болса қолданылады. Бұл әдіс белоққа антизаттар синтездей алу мүмкіншілігіне сүйенеді. Алдымен рекомбинатты молекулалар бар клетка шоғырын агардың үстінде лизиске ұшырайды, Онан соң поливинил пластинкасына антизаттарды бекітіп, антиген ( геннің өнімі) антизат байланысу реакциясын жүргізеді. Антизаттар тек өзіне сәйкес белоктармен ғана байланысады. Перти шынысындағы белоктың яғни өажет геннің орнын радиоактивті элементпен белгіленген антизаттар арқылы табады. Полимерлі пластинкада радиоактивті бөліктердің орналасу тәртібі бойынша активті гендері бар бактериялар шоғырын табуға болады.
Талқылау үшін сұрақтар:
Генді боліп алу әдістері: табиғи, химиялық және ферментативтік әдістер және олардың артықшылықтары мен кемшіліктерін көрсетіңіз
Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру әдістері: рестриктаца-лигазалық және коннекторлық әдістер мен линкерлерге сипаттама беріңіз
Бактериялық плазмидаларға жалпы түсінік және олардың вектор ретінде қолданылуы үшін қойылатын шарттарды көрсетіңіз
рBR322 плазмидалық векторының құрылысы және аталмыш вектор негізіндегі клондаудың жалпы бейнесі
l - бактериофаг геномы негізіндегі векторлар. l - бактериофагының литикалық және лизогениялық даму жолдарын сипаттаңыз
Космидті векторлар мен фазмиданың конструкцисы мен сыйымдылығы, олардың клетакаға ену және даму ерекшеліктерін көрсетіңіз
Рекомбинантты ДНҚ-ны прокариот жуйелеріне трансформациялау әдістерін сипаттаңыз.
Трансформацияланған клеткаларды фенотиптік селекция әдісі көмегімен анықтау және селективті және репортерлік маркерлік гендерге сипаттама беріңіз
Ұсынылған әдебиеттер:
С.Н. Щелкунов "Генетическая инженерия", СУИ, Новосибирск - 2004.
Б. Глик, Дж. Пастернак "Молекулярная биотехнология. Принципы и применение", М., "Мир", 2002.
ДӘРІС 3 S.CEREVISIAE АШЫТҚЫ КЛЕТКАЛАРЫНЫҢ ГЕНДІК-ИНЖЕНЕРИЯЛЫҚ ЖҮЙЕСІ.
Мақсаты: S.cerevisiae ашытқы клеткаларының гендік-инженериялық жүйесімен танысу
Дәрістің негізгі сұрақтары
Сахаромицет - ашытқыларының генетикалық ұйымдасуы.
Ашытқы клеткаларының плазмидалық трансформациясы.
S. cerevisiae молекулалық векторлары. Интеграция векторлары. Клондаушы векторлар. Жасанды УАС хромосомасы
Қысқа мазмұны:
Осы уақытқа дейін біз эукариоттың ген клонын бактерия клеткасында көбеюін қарастырдық. Рекомбинантты ДНҚ молекулаларын тікелей эукариоттар, әсіресе сүтқоректі жануарлар клеткаларына енгізіп, оның өнімін алудың болашақтағы маңызы өте зор. Эукариоттар клеткаларында ген клонын көбейтудің басты проблемаларының бірі -- векторлық молекулалар. Генді эукариоттық векторға енгізу техникасының негізі бактериялық клеткадағыдай. Алайда, эукариоттық векторлардың өзі бактериялық векторлардан айырмашылықтары бар. Әлбетте, мұндай векторлардың рестриктазалар ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz