Полимеразды тізбекті реакция

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ
ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ АГРАРЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

Реферат

Тақырыбы: ПТР жүргізудің теориялық негіздері.

Орындаған: Бөкеев Шыңғыс
Тексерген: Бименова Ж.
Алматы 2021 жыл

Жоспары
Кіріспе
1. Полимеразды тізбекті реакция.
2. ПТР жүргізудің териялық негіздері.
Қорытынды
Пайдаланылған әдебиеттер тізімі

Кіріспе

Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) - биологиялық материалда (сынамада) нуклеин қышқылының белгілі бір фрагменттерінің (НК) аз концентрациясын едәуір арттыруға мүмкіндік беретін молекулалық биологияның эксперименттік әдісі. ДНҚ-да төрт түрі бар азотты негіздер (аденин, гуанин, тимин және цитозин). Азотты тізбектердің бірінің негіздері азотты негіздерге қосылған қосымша принципке сәйкес сутегі байланысы бар басқа тізбек: аденин қосылады тек тиминмен, гуанинмен-тек цитозинмен. Әр тізбек жаңа тізбекті синтездеуде матрица ретінде қызмет етеді, ал реттілік синтезделген тізбекте ол қосымша негіздердің реттілігімен анықталады тізбектер-матрицалар. ДНҚ тізбегінің асимметриялық ұштары 3' (үш штрих) және 5' (бес штрих) деп аталады. ДНҚ синтезінде тізбектің полярлығы маңызды рөл атқарады (тізбекті ұзарту жаңа нуклеотидтерді бос 3'ұшына қосу арқылы ғана мүмкін болады). Азотты негіздердің әртүрлі түрлері арасындағы сандық қатынастар. ДНҚ нуклеотидтерінің құрамында 1949-1951 жылдары биохимик Э.Чаргафтың тобы тұжырымдалды және "Чаргаф ережелері"деп аталды. Бұл ережелердің мәні келесідей болды: 1. Аденин (а) мөлшері тимин (Т) санына тең, ал гуанин (Г) - цитозин (Ц): А = Т, Г = Ц. 2. Пуриндердің саны пиримидиндердің санына тең: A + G = T + C. Чаргаф ережелері рентгендік құрылымдық талдау деректерімен қатар Дж.Д. ДНҚ құрылымын ашуда шешуші рөл атқарды. Уотсон мен Ф.Крик 1953 жылы. 1955 жылы А. Корнберг ДНҚ полимераза деп аталатын ферментті ашты. Бұл фермент нуклеотидтерді оның 3'ұшына жалғау арқылы ДНҚ тізбегін ұзартуға қабілетті. ПТР-ны ашудың нәтижесі дереу практикалық қолдану болды әдісін. 1985 жылы Саики және оның авторлары сипатталған мақала жариялады β-глобиннің геномдық реттілігін күшейту. Осы сәттен бастап Саны өз жұмысында ПТР қолдану туралы жарияланымдар геометриялық түрде көбейе бастады прогрессия.
ПТР әдісі "Адам геномы"халықаралық бағдарламасының арқасында ерекше қарқынды дамыды. Қазіргі заманғы лазерлік секвенирлеу технологиялары жасалды (ДНҚ нуклеотидтер тізбегін декодтау). Бұл өз кезек биологиялық объектілердің ДНҚ тізбегін қамтитын ақпараттық мәліметтер базасының айтарлықтай өсуіне ықпал етті.
Қазіргі уақытта ПТР-дің әртүрлі модификациялары ұсынылған, микроорганизмдерді анықтау, нүктелерді анықтау үшін тест жүйелерін құру мүмкіндігі көрсетілген мутациялар, әдістің ондаған түрлі қолданылуы сипатталған.

Полимеразды тізбекті реакция.
Полимеразалық тізбекті реакция (ПТР) -- биологиялық материалдағы анықталатын нуклеин қышқылдарындағы (ДНҚ) аз концентрациялы фрагменттердің айтарлықтай ұлғайтылуын қамтамасыз ететін молекулярлық биологиядағы эксперименталды әдіс.
ДНҚ-ны амплификациялаудан басқа ПТР нуклеин қышқылдарына әр түрлі әсер етуге мүмкіндік береді (мутация, ДНҚ фрагменттерін тұтастыру). Сонымен қатар, ПТР биологиялық және медициналық практикада кеңінен пайдаланылады, мысалы, мирастық немесе инфекциялық ауруларды анықтау, әкелікті орнату, гендерді клондау, жаңа гендерді бөліп шығару, т.б.
ПТР-ды іске асыру
Әдіс нуклеин қышқылының белгілі бір үлескісінің қайталанып отыратын таңдаулы көшірмеленуіне негізделген. Бұл үрдіс ферменттердің көмегімен жасанды жағдайда жүзеге асады (in vitro).
Реакция компоненттері
ПТР-ды ең қарапайым жағдайда жасау үшін келесі компоненттер керек болады:
Амплификация жасалатын ДНҚ үлескісі бар ДНҚ-матрица
Талап етілетін ДНҚ фрагменті әр түрлі тізбектерінің ұштарына комплиментарлы екі праймер
Жоғары температураға тұрақты ДНҚ-полимераза - ДНҚ полимеризациясын катализдейтін фермент.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаттар (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
Полимеразаның қызметіне қажетті Mg2+ иондары
Реакцияға қажетті жағдайларды (pH, ерітіндінің иондық күші) қамтамасыз ететін буферлік ерітінді
Реакция барысы
Әдетте ПТР жүргенде әрбіреуі 3 сатыдан тұратын 25-30 цикл жүзеге асады
Денатурация.
ДНҚ тізбектері таралып, ширатылып кетуі үшін екітізбекті ДНҚ матрицасын 94-96°C-қа дейін 0,5-2 мин қыздырылады. ДНҚ тізбектері арасындағы сутектік байланыстар үзілетіндіктен, бұл кезең денатурация деп аталады.
Суыту.
Тізбектер бөлінген соң, праймерлер байланысу үшін температураны төмендетеді.
Элонгация.
ДНҚ-полимераза матрицалық тізбекті праймерлер арқылы репликациялайды.
Жас ғалым Бауыржан Айтуов қымбат құрылғылардың көмегінсіз-ақ сараптама алудың тың тәсілін ойлап тапты. Ол Жол картасы - 2020 мемлекеттік бағдарламасы негізінде өзінің жеке ғылыми зерттеу орталығын да ашқан. Жұқпалы аурулардың диагностикасын жасауға арналған тест жүйесі де өте тиімді екенін дәлелдеген. Біздің жағдайда қымбат құрылғыны қолдану қажет емес. Бұл сараптама өте тез болады. Мысалы, бір ПЦР-реакциясы 2-3 сағатқа созылса, біздің ПЦР-реакциясы 30 минутты алады. Әр вирустың немесе бактерияның ДНҚсын анықтайтын бұл - ПЦР әдісі. Біз осы әдістемені жетілдіріп, басқа ферменттер қолданып осындай жаңа ПЦР-әдістемесін шығардық, - дейді ғалым
ПТР сатылары:
Денатурация - ДНҚ-ны қос талшықты формасынан бірқалыпты нысанға ауыстыру, егер жоғары температуралардың әсерінен қосымша қосалқы базалық жұптар арасындағы сутегі байланыстары
Күйіп кету - праймерлерді бір жақты ДНҚ мақсатына қосу. Примерлар таңдалған фрагментті шектеп, ДНҚ-ның қарамақарсылығынтолықтыратын етіп таңдалады. Күйіп кету Chargaff's complementarity ережесіне сәйкес жүзеге асырылады.
Ұзарту (синтез) - пракер синтезінен кейін Так полимеразы ДНҚ-ның екінші шоғырлануын примердің 3 'аяғынан аяқтайды.
ПТР диагностика 3 негізгі процедурадан тұрады: зерттелетін материалды дайындау, бұл кезде қоздырғыш ДНК-н немесе РНК-н бөліп алу процесі жүреді.Бұл кезде қоздырғыштың генетикалық материалы ДНК-полимераза ферментінің әсерінен бірнеше рет көбейіп, ДНК фрагменттерінің көшірмелері тіркеледі. Бұл ПТР диагностика кезінде тіпті бактерия немесе вирустардың бірен-саран жасушаларын немесе кейбір қиын жағдайларда, мысалы, антигендік өзгергіштігі өте жоғары немесе жасуша ішінде тіршілік ететін қоздырғыштар да анықталады.
Жиі нақты уақыттық ПТР КРПТР (кері транскрипция) сәйкестендіріледі,бұл аз мөлшерде мРНҚ көлемін өлшеу үшін, зерттеушіге жасушада осы мРНК мазмұны туралы сандық ақпаратты және ген экспрессиясы туралы ақпарат алуға мүмкіндік береді. Реал-тайм ПТР Молекулярлық биологияда реал-тайм ПТР (немесе сандық ПТР, нақты уақыттық ПТР, qPCR, qRT-ПТР) - бір мезгілде берілген ДНҚ молекуласының мөлшерін өлшеу үшін полимеразды тізбекті реакция әдісіне негізделген зертханалық әдіс. Бұл әдіс ПТР-дың жалпы принциптерінде қолданады. Негізгі айырмашылығы, амплификацияланғаннан кейін ДНҚ көлемі нақты уақытта өлшенеді. Сандық көрсеткішті анықтау үшін екі әдіс қолданылады: екі еселенген ДНҚ молекулаларымен араласқан флуоресцентті бояғыштар, гибридизациядан кейін ДНҚ-ның комплементарлы учаскілерімен флуоресценцияланатын модификацияланған олигонуклеотидтер.

ПТР жүргізудің териялық негіздері.
Тізбекті полимеразды реакция (полимераза цепная реакция) - бұл молекулалық биологияның экспериментальді әдісі, биологиялық материалда (сынамада) нуклеин қышқылының (ДНҚ, РНҚ) белгілі фрагменттерінің аз концентрациясын көбірек игеру.
ПТР-(полимеразды тізбекті реакцияны) ең алғаш 1983 жылы американдық ғалым К.Мюллис ашқан және ол осы ашқан жаңалығы үшін Нобель сыйлығына ие болған.. Оның мақсаты ДНҚ ферментті полимеразаның көмегімен ДНҚ-ны амплицирлеу және ДНҚ-ң алғашқы молекуласының барысымен көптеп екі еселенуі.
ПТР диагностика көптеген ауруларды анықтау үшін қазіргі заманға сай жылдам және нақты әдіс болып табылады. ПТР диагностика жұқпалы аурулар қоздырғышын басқа әдістермен (иммунологиялық, бактериологиялық, микроскопиялық) анықтау мүмкін болмаған жағдайда қолданылады.
ПТР қолдану аясы. Қазіргі таңда ПТР-ны :
Археологияда,
Сот медициналық сараптамасында,
Генетикада әкесін анықтауда,
Жұқпалы аурулар қоздырғышын анықтауда қолданады.
ПТР-әмбебап әдіс. ПТР-диагностика сонымен қатар әмбебап әдіс, себебі бөтен ДНКны әр түрлі биологиялық материалдардан - шырыш, зәр, қан, қақырық, эпителиалді жасушалар қырындысынан анықтауға мүмкіндік береді. ПТР диагностика жыныстық жолмен таралатын аурулар, әсіресе, жасырын немесе созылмалы - хламидиоз, уреплазмоз, гонорея, гарднереллез, микоплазматикалық инфекцияларды анықтауда кеңінен орын алған. Себебі, аталған аурулардың қоздырғыштарын зертхана жағдайында қарапайым жолмен өсіріп бөліп алу өте қиын және серологиялық реакцияларда антиденелер аз анықталады. Сондай-ақ, ПТР диагностиканың көмегімен папиллома вирусын, вирусты гепатиттерді анықтауға болады.ПТР диагностика сонымен қатар генетикалық дактилоскопия, пренаталдық диагностика және т.б. жүргізуге зор мүмкіндік береді.
ПТР диагностика ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.