Қайталанатын ДНҚ тізбегінен тұратын зондтар

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 12 бет
Таңдаулыға:

Әл-Фараби атындағы Қазақ Ұлттық Университеті
Биология және биотехнология факультеті

СӨЖ
Тақырыбы: Молекулалық-цитогенетикалық әдіс - FISH.

Орындаған: Бисенбаева Б.Ж.
Тексерген: Калимагамбетов А.М.

Алматы, 2020
Жоспар
I Кіріспе
2.1 FISH әдісінің жалпы сипаттамасы
2.2 Дозаны ретроспективті цитогенетикалық бағалау мәселесі
2.3 FlSH-әдісінің молекулалық биологиялық негіздері
2.4 FISH әдісі арқылы анықталатын хромосомалардың аберрациясы
2.5 Хромосомалардың FISH-тіркелетін транслокациялары үшін дозалық қисықтарды құру принциптері
II Негізгі бөлім
III Қорытынды
Пайдаланылған әдебиетКіріспе
In situ флуоресцентті гибридизация, немесе FISH әдісі (ағылш. fluorescence in situ hybridization -- FISH) - метафаза хромосомаларында немесе интерфаза ядроларында ДНҚ-ның белгілі бір тізбегінің орналасуын анықтау үшін қолданылатын цитогенетикалық әдіс. Сонымен қатар, FISH әдісін ұлпа үлгісінде нақты мРНҚ-ны анықтау үшін қолданылады. Соңғы жағдайда FISH әдісі жасушалар мен тіндерде ген экспрессиясының кеңістік-уақыттық ерекшеліктерін анықтауға мүмкіндік береді.
FISH әдісі қондыру алдындағы, пренаталдық және постнатальді генетикалық диагностикада, онкологиялық ауруларды диагностикалауда, ретроспективті биологиялық дозиметрияда қолданылады.
Нуклеин қышқылдарын in situ гибридизация әдісі цитологиялық препараттарда белгілі бір сиквенттерді (ДНҚ тізбегіндегі нуклеотидтер тізбегі) локализациялау үшін жасалды. Бұл әдістің салыстырмалы қарапайымдылығы мен тиімділігі оны көптеген скринингтік бағдарламалардың негізін құрайды.
Молекулалық биологияның толық геномдық реттілігі, молекулалық кариотиптеу және ПТР талдау сияқты әдістерін жасаушылар оларды FISH әдістеріне балама ретінде қолданады. Бұрын аталған әдістерде жоқ FISH әдісінің басты артықшылығы - тұқым қуалайтын патологияларды жан-жақты талдау үшін міндетті геномның құрылымдық тұтастығын визуализациялау мүмкіндігі. Гетерохроматиннің транслокациясы мен қайталануына байланысты хромосомалық патологияларды диагностикалау әлі де толық геномдық секвенирлеу сияқты заманауи әдісті қолдану арқылы қол жетімді емес, бірақ FISH-әдісі кезінде оңай жүргізілуі мүмкін.

2.1 FISH әдісінің жалпы сипаттамасы
FISH әдісінің бірінші кезеңінде зондтардың құрылуы жүреді. Зондтың мөлшері гибридизация белгілі бір сайтта жүруі үшін жеткілікті үлкен болуы, бірақ гибридизация процесіне кедергі келтірмеу үшін тым үлкен емес болуы керек. Нақты локустарды анықтаған кезде немесе тұтас хромосомаларды бояған кезде будандастыру қоспасына кесілмеген ДНҚ қайталауын қосу арқылы бірегей емес қайталанатын ДНҚ тізбегі бар ДНҚ сынамаларын гибридизациялауды бұғаттау керек. Егер ДНҚ зонд екі тізбекті ДНҚ болса, онда будандастырмас бұрын оны денатурациялау керек.
Келесі кезеңде интерфаза ядролары немесе метафаза хромосомалары дайындалады. Жасушалар субстратқа бекітіледі, содан кейін ДНҚ денатурациясы жүзеге асырылады. Хромосомалардың немесе ядролардың морфологиясын сақтау үшін денатурация формамидтің қатысуымен жүзеге асырылады, бұл денатурация температурасын 70 °C дейін төмендетеді.
Әрі қарай, зондтар препаратқа қосылып, шамамен 12 сағат гибридизацияланады. Содан кейін барлық гибридті емес зондтарды алып тастау үшін жуудың бірнеше кезеңдері жүзеге асырылады.
Байланысқан ДНҚ зондтарын визуализациялау флуоресцентті микроскоптың көмегімен жүзеге асырылады.
In situ флуоресценттік гибридизация кезінде комплементарлық нысаналармен байланысатын ДНҚ-зондтарды (ДНҚ-сынамаларды) пайдаланады. ДНҚ зондтарының құрамына флюорофорлармен (тікелей белгілеу) немесе биотин немесе дигоксигенин (жанама белгілеу) сияқты конъюгаттармен белгіленген нуклеозидтер кіреді. Тікелей белгілеу кезінде мақсатты байланысқан ДНҚ зондын гибридизациялау аяқталғаннан кейін бірден флуоресцентті микроскоппен байқауға болады. Жанама таңбалау жағдайында қосымша бояу процедурасы қажет, оның барысында биотин флуоресцентті-таңбаланған авидинмен немесе стрептавидинмен, ал дигоксигенинмен -- флуоресцентті-таңбаланған антиденелермен анықталады. ДНҚ сынамаларын таңбалаудың жанама нұсқасы қосымша реактивтер мен уақытты қажет етсе де, бұл әдіс молекулада 3-4 флюорохромды антидене немесе авидин молекулаларының болуына байланысты әдетте жоғары сигнал деңгейіне қол жеткізуге мүмкіндік береді. Сонымен қатар, жанама таңбалау жағдайында сигналдың каскадты күшеюі мүмкін.

2.2 Дозаны ретроспективті цитогенетикалық бағалау мәселесі
Радиациялық оқиғаларға байланысты биологиялық "дозиметрия" тәсілі ретінде хромосомалардың аберрациясын талдауды пайдалану бойынша хромосомаларды бояудың классикалық әдісі арқылы әсер етуден кейін жақын арада жедел сәулелену дозасын индикациялауға ғана емес, сонымен қатар алынған дозаларды ретроспективті бағалау үшін түрлі цитогенетикалық тәсілдерді қолдану мүмкіндіктеріне де көп көңіл бөлінеді.
Сәулеленуден кейін уақыт өте келе жойылатын немесе сақталатын потенциалдық қабілеті бойынша хромосомалардың аберрациясының барлық түрлерін сәйкесінше тұрақсыз (дицентриктер және басқа да көпцентриктер, центрлік және ацентрлік сақиналар, жұптасқан ацентрлік фрагменттер, хроматидті аберрациялар) және тұрақты (өзара транслокация немесе симметриялы алмасу; парацентрлік және перицентрлік инверсиялар) деп бөлуге болады. Тарихи тұрғыдан, хромосомаларды талдау үшін алдымен олардың біртекті түсінің "классикалық" әдісі жасалды, бұл негізінен тұрақсыз аберрацияларды және ішінара тұрақты аберрацияларды тіркеуді қамтамасыз етеді. Оларды толық анықтау үшін G - және FISH (fluorescence in situ hybridization) -- хромосомаларды бояу қолданылады.
Хиросима мен Нагасакидің (1945 ж.) атом бомбалары кезінде зардап шеккен жапондардан алынған материалда сәулеленуден кейін алыс уақыт ішінде перифериялық қан лимфоциттерінің культурасына цитогенетикалық зерттеу жүргізілді. Бұл кезде хромосомалардың классикалық, G- және FISH бояулары қолданылды. Жапондық әріптестердің зерттеу нәтижесінде тұрақты қайта құруды әртүрлі жолдармен анықтау мүмкіндіктері туралы қорытынды жасағанын атап өткен жөн. Олар, егер біз G-бояуымен анықталған радиациялық индукцияланған транслокациялардың санын 100%-ға алсақ, онда бүкіл геномды қайта санағаннан кейін бір түсті FISH-әдісі хромосомалардың тұрақты қайта құрылуының бірдей жиілігін беретінін көрсетті. Классикалық әдісті қолдана отырып, транслокациялардың шамамен 20% тіркеуге болады. Егер бірдей біркелкі бояумен қосымша кариотиптеу жүзеге асырылса, онда тиісті қайта құрудың тағы 50% - ын анықтауға болады, сондықтан транслокациялардың 30% - ы ескерілмейді, бұл соншалықты жаман емес. Алайда, дұрыс кариотиптеу деп белгілі топтарға хромосомалардың көп бөлігін бөлуді ғана емес, жеке хромосома жұптарын анықтау әрекеті түсініледі. Топтар бойынша стандартты кариотиптеу кезінде әртүрлі авторлардың деректері бойынша классикалық әдісті қолданған жағдайда транслокацияларды анықтау FlSH-тіркелетін транслокациялардың геномдық жиілігімен салыстырғанда 10% немесе 29% - дан аспайды.
Хромосомалардың G-бояу әдісіне келетін болсақ, ол салыстырмалы түрде толық кариотиптеуді қамтамасыз етсе де, ол өте көп уақытты қажет етеді және жоғары білікті кадрларды қажет етеді. Сондықтан радиациялық цитогенетикада сирек қолданылады. FlSH әдісі дозаны ретроспективті бағалау үшін ең қолайлы болып саналады. Қазіргі уақытта ең көп қолданылатыны - "бір түсті" FlSH, онда кез-келген үш жұп үлкен хромосома бір флуоресцентті бояумен боялған. Алайда, FlSH бояуының бұл нұсқасында осы үш жұп хромосома арасындағы қайта құру көрінбейді, ал қосымша қайта құру санын есепке алу төмен дозалар аймағында әдістің сезімталдығын арттыруы мүмкін.

2.3 FlSH-әдісінің молекулалық биологиялық негіздері
FISH-әдісі сәйкес келетін буферде қыздырғанда бөлу (балқу) және комплементарлы азотты негіздер арасындағы сутектік байланыстарды жою және қалпына келтіру есебінен ерітінді салқындатылған кезде қайта біріктіру (гибридизация) үшін кез-келген мөлшердегі екі комплементарлы ДНҚ тізбегінің негізгі қасиетіне негізделген. 1969 жылы тритий немесе басқа изотоптармен белгіленген ДНҚ сынамаларын қолдана отырып, кейіннен авторадиографиямен in situ будандастыру (ISH) әдісі ұсынылды. Алайда бірқатар практикалық қиындықтар мен радиациялық қауіпсіздік режимін сақтау қажеттілігіне байланысты бұл әдістемелік тәсіл цитогенетикалық талдауда кеңінен қолданылмады. Сондықтан радиоактивті белгіні флуоресценттікке ауыстыру үлкен прогрессивті қадам болды, оны әртүрлі авторлар атап өтті.
ДНҚ сынамаларының (зондтардың) мөлшері қазіргі уақытта қойылған міндеттерге байланысты әр түрлі болуы мүмкін: 1000 жұп нуклеотидтен миллиондаған жұп нуклеотидке дейін, бұл ретте нысана ретінде жеке гендер мен хромосомалардың учаскелері, сондай-ақ тұтас хромосомалар мен біртұтас геномдар қызмет ете алады.
Бекітілген жеріне байланысты ДНҚ-зондтарын келесі топтарға бөлуге болады:
1. Хромосомалық зондтар (хромосомалардың немесе олардың үлкен бөліктерінің толық боялған зондтары, мысалы, қысқа және ұзын иықтар) -- Whole Chromosome Painting (WCP). Олар ДНҚ-ның олигонуклеотидті фрагменттерінің жиынтығы, кез-келген хромосоманы бүкіл ұзындығы бойымен немесе қысқа немесе ұзын иықтан кіші аймақтарға дейін біркелкі жабады. Олар екі хромосомалық гомологта гибридизациялайды және әр түрлі күрделіліктегі хромосомалық қайта құруды (транслокация және т.б.) анықтайтын метафаза хромосомаларында ғана қолданылады.
2. Қайталанатын ДНҚ тізбегінен тұратын зондтар.
2а. Центромерлі зондтар (хромосомалық нумена-торалар) -- Chromosome Enumerator Probe (CEP): негізінен хромосомалардың центромералық және мақсатты гетерохроматинді бөліктерінде орналасқан тандемді альфа және бета - сателиттік қайталануларға толық немесе салыстырмалы түрде тән. Сонымен қатар, хромосомалардың 5 және 9, 13 және 21-ші, сондай-ақ 14 және 22-ші жұптарының арасындағы центрлік ДНҚ тізбегінде минималды айырмашылықтар бар. Негізінен анеуплоидияны метафазаларда да, негізінен интерфаза ядроларында да тіркеу, қарама-қарсы жыныстағы реципиентке трансплантациялау кезінде сүйек кемігінің жынысын анықтау, сондай-ақ маркерлік хромосомалардың шығу тегін анықтау үшін қолданылады.
2б. Субтеломер (теломер) зондтар-Sub-telomer specific. Теломерлер эукариоттық хромосомалардың соңын білдіреді және оларды қорғау, репликация және тұрақтандыру үшін маңызды.
3. Локусқа тән зондтар - Locus specific Identificator (LSI). Бұл үлгілер қалыпты және патологиялық гендердің көшірмелерінің болуын немесе болмауын бағалауға мүмкіндік беретін белгілі бір хромосомалық аймақтарға тән.
FISH талдауының әртүрлі нұсқаларын жүзеге асыру процедурасындағы негізгі міндет, әрине, әртүрлі технологиялардың көмегімен жасалуы мүмкін ДНҚ-ның хромосомаларға тән тізбегін алу болып табылады. Көптеген FISH зерттеулерінде зерттелетін реттілік (локусқа тән зондтар) белгілі болған кезде клондалған ДНҚ қолданылады. Бұл тәсіл көбінесе жеке (түпнұсқа) ДНҚ зондтарын жасау үшін жеке зертханаларда қолданылады. Коммерциялық препараттарды өндіруде, әдетте, аз уақытты қажет ететін цитофлуорометрия сортермен бірге қолданылады, бұл жеке хромосомаларды метафаза қоспасынан ажыратуға мүмкіндік береді. Осы аспаптар кешенінің жұмысы кезінде боялған флюорохромды хромосома лазерлермен сәулеленуден туындаған оның жарқыл деңгейі бойынша және ол орналасқан электрлік зарядталған микрокапль бағыты бойынша тиісті қабылдағышқа берілген траектория бойынша сәйкестендіріледі. Жеке хромосомаларды оқшаулаудың бұл әдісі өте тиімді және өнімді болды. Жеке хромосомалардың бөлінген ДНҚ-ны ұзындығы 200-ден бірнеше мың базалық жұптарға бөлу үшін белгілі бір шектер қолданылады. Алынған ДНҚ фрагменттеріне әмбебап праймер -- ДНҚ-ның белгілі бір консервативті тізбегін толықтыратын синтетикалық олигонуклеотидтер қосылады, содан кейін алынған материалды стандартты полимеразды тізбекті реакцияда (ПТР) күшейтеді. Бұл әдіс бір жасушаны қолданған кезде де ДНҚ-ны ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.