Белок мөлшерін Брэдфорд әдісі арқылы анықтау

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 5 бет
Таңдаулыға:

Тақырыбы: Белок мөлшерін Брэдфорд әдісі арқылы анықтау.

Сұрақтар:
1. Калибровты график алу үшін қанша өлшем нүктелері қажет
2. Брэдфорд әдістемесінің принципі
3. Белок мөлшерін анықтаудың тура және жанама әдістемелерінің айырмашылығын көрсетіңіз
4. Белок концентрациясын анықтау әдістемелеріне сипаттама беріңіз.

Жауаптары:
2.
Брэдфорд ақуыздық талдауы. Марион М. Брэдфорд 1976 жылы ақуыздық талдауды жасаған. Бұл ерітіндідегі ақуыздың концентрациясын өлшеу үшін қолданылатын жылдам және дәл спектроскопиялық аналитикалық процедура. Реакция өлшенген белоктардың аминқышқылдарының құрамына байланысты.
Принципі:
Брэдфорд ақуызының колориметриялық анализі Coomassie Brilliant Blue G-250 оптикалық тығыздығының өзгеруіне негізделген. Coomassie Brilliant Blue G-250 бояғышы үш түрінде шығарылады: анионды (көк), бейтарап (жасыл) және катионды (қызыл). Қышқыл жағдайда бояғыштың қызыл формасы зерттелетін ақуызбен байланысып көк түрге айналады. Егер байланыстыратын ақуыз болмаса, ерітінді қоңыр болып қалады.
Бояғыш ван-дер-Ваальс күші мен аминостоппен электростатикалық өзара әрекеттесудің арқасында белоктың карбоксил тобымен күшті ковалентті емес кешен түзеді. Бұл кешеннің пайда болу кезінде Кумасси бояғышының қызыл формасы алдымен ақысыз электронды иондалатын ақуыз топтарына береді, бұл ақуыздың табиғи күйінің бұзылуын тудырады және нәтижесінде гидрофобты қалталарын ашады.

Ақуыздың үшінші реттік құрылымындағы бұл қалталар бояғыштың полярлы емес аймағымен бояғыштың теріс зарядының қасында оң амин топтарын орналастыратын бірінші байланыс байланысы (ван-дер-Ваальс күштері) арқылы байланысады. Байланысты олардың арасындағы екінші байланыс әрекеттестігі, иондық өзара әрекеттесу одан әрі күшейтеді. Ақуыздармен байланысуы Кумасси бояғышының көк түрін тұрақтандырады; Осылайша, ерітіндіде болатын комплекс мөлшері ақуыз концентрациясының өлшемі болып табылады және оны оптикалық тығыздықты өлшеу арқылы анықтауға болады.

3.
Бредфордтың басқа протеиндік талдаулардан айырмашылығы, ақуыз сынамаларында болуы мүмкін натрий, калий немесе тіпті сахароза сияқты көмірсулар сияқты әртүрлі химиялық қосылыстар аз әсер етеді. Ерекшеліктер - жуғыш заттың жоғары концентрациясы.
Тағы бір кедергі протеин үлгісін дайындауда қолданылатын буферден болуы мүмкін. Буфердің жоғары концентрациясы буферден конъюгацияланған негіз арқылы ерітіндіден бос протондардың сарқылуына байланысты ақуыз концентрациясын асыра бағалауға әкеледі. Егер ақуыздың төмен концентрациясы қолданылса (кейіннен буфер), бұл кедергі болмайды.

Түссіз қосылыстың оптикалық тығыздығын өлшеу үшін Брэдфорд анализін жүргізу керек. Триптофан, тирозин және фенилаланин сияқты хош иісті сақиналардың болуына байланысты белоктар сияқты кейбір түссіз қосылыстарды 280 нм-де анықтауға болады, бірақ егер бұл аминқышқылдардың ешқайсысы болмаса, оптикалық тығыздықты 280 нм-де өлшеуге болмайды.

Брэдфорд әдісінің кемшіліктері.
1. Брэдфорд анализі қысқа диапазонда сызықтық сипатқа ие, әдетте 0 мкг мл-ден 2000 мкг мл-ге дейін, бұл көбінесе талдау алдында үлгіні сұйылтуды қажет етеді. Осы сұйылтуды жасаған кезде бір сұйылтудың қателігі келесі сұйылтуларға қосылады, нәтижесінде әрқашан дәл бола алмайтын сызықтық қатынас пайда болады.
2. Бұл әдістегі реактивтер пробиркаларды бояуға бейім. Пробиркаларды қайталап қолданбаңыз, себебі дақ оптикалық тығыздығының көрсеткішіне әсер етуі мүмкін. Бұл әдіс уақытты да ескереді. Бірнеше шешім сынақтан өткізілгенде, дәл салыстыру үшін әр үлгінің бір уақытта инкубациялануын қамтамасыз ету қажет.
3. Сызықтықтың көп бөлігі ақуыздың қосылуымен бұзылатын бояудың екі түрлі формасының тепе-теңдігіне байланысты. Брэдфорд талдамасы 595нм сіңіру қабілетін 450 нм-де өлшеу арқылы сызықтық жүреді. Бұл өзгертілген Брэдфорд анализі дәстүрлі әдіске қарағанда шамамен 10 есе сезімтал.
4. Бастапқы Брэдфорд әдісімен ақуыздармен байланысуға қолданылатын Coomassie Blue G250 бояуы аргинин және лизин ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.