Trichoderma жүйесінің дамуы және морфологиялық сипаттамасы
МАЗМҰНЫ
КІРІСПЕ
3
1.
Trichoderma жүйесінің дамуы және морфологиялық
сипаттамасы
5
1.1
Trichoderma метаболиттері
14
1.2
Trichoderma целлюлазды кешенінің сипаттамасы
16
ЗЕРТТЕУ ОБЬЕКТІЛЕРІ МЕН ӘДІСТЕРІ
2.
Фитопатогенді микроорганизмдерді биобақылау агенттері
ретінде Trichoderma түрлері
20
2.1
Trichoderma саңырауқұлақтардың зең қоздырғышы ретінде
22
2.2
Trichoderma тектес саңырауқұлақтардың адамға әсері
23
2.3
Өсімдіктермен өзара әрекеттесу
26
2.4
Trichoderma ферментативті белсенділігін анықтау
27
2.5
Trichoderma тектес саңырауқұлақтардың липолитикалық
әсері
29
НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ
3
Trichoderma өнеркәсіптік қолдану
36
Trichoderma ферменттерін өнеркәсіптік қолдану. Trichoderma
целлюлизін қолдану
36
3.1
Тоқыма және тамақ өнеркәсібінде Trichoderma ферменттерін қолдану
37
3.2
Trichoderma негізінде биофунгицидтерді өндіру және
қолдану
40
3.3
Зерттеу объектісі мен әдістері және нәтижелер мен
талқылаулар
42
ҚОРЫТЫНДЫ
48
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР
49
КІРІСПЕ
Қазіргі уақытта ең көп зерттелетін саңырауқұлақтардың бірі Trichoderma. Trichoderma-бұл генетикалық банкте, кем дегенде, бір генмен ұсынылған және көптеген түрлері екі немесе одан да көп гендердің тізбектілігімен ұсынылған жалғыз түрі. Бұл қызығушылықтың себебі - үлкен практикалық және экологиялық тектестің маңыздылығы. Триходерма түрлері
- бұл целлюлоза, хитиназалар, пектиназалар, ксиланаздар, серинге тәуелді протеиназалар және т.б. целлюлоза, қағаз және тамақ өнеркәсібінде, жуғыш заттарды өндіруде, алкоголь өндірісінде және целлюлозасы бар қалдықтарды глюкозаға айналдыруда қолданылады, жемшөп қоспалары және тоқыма өнеркәсібі.Осындай антибиотиктер, токсиндер және саңырауқұлақтар ферменттерінің негізінде ауруларды биологиялық бақылауға және өсімдіктердің өсуін ынталандыруға, трансгенді өсімдіктерді өсіруге арналған препараттар алынады. Триходерма сонымен қатар топырақты биологиялық тазарту және қалдықтарды компосттау үшін қолданылады. Trichoderma spp- тің басқа да қасиеттері белгілі. Осылайша, триходерманың өнеркәсіпте өсетін саңырауқұлақтарға әсер ететіні және құрылыс құрылыстарына зиян келтіретіні анықталды. Олар иммунитеті төмен адамдарда аллергия мен терең микоздар тудыруы мүмкін.
Зерттеу тақырыбының өзектілігі:
Trichoderma түрлерін зерттеу адам қызметінде оларды пайдалануға байланысты үлкен практикалық және теориялық қызығушылық тудырады. Бұл саңырауқұлақтарды кеңінен қолдану олардың экологиялық ерекшеліктерін, түрлік әртүрлілігін, биотопиялық таралуын, бәсекелестік өзара қарым-қатынастарын және географиялық таралуын егжей-тегжейлі зерттеуді талап етеді. Бұл тектес саңырауқұлақтар табиғатта кең таралған және көптеген субстраттарда кездеседі, бірақ көбінесе топырақта және өлі ағашта. Олар микроорганизмдер қоғамдастығында маңызды рөл атқарады және адам қызметінің көптеген салаларында қолданылады. Бұл түрлердің түрлері целлюлозолитикалық және басқа да кейбір ферменттерді алу үшін, өсімдіктер ауруларын биологиялық бақылау және топырақты биологиялық тазарту үшін пайдаланылады.
Trichoderma тектес микромицеттер целлюлоза ферментінің белсенді продуценті болып табылады және өсімдіктердің жасушалық қабырғаларының терең деструкциясына қабілетті, сондай-ақ жекелеген қиын ыдырайтын өсімдік полисахаридтері: целлюлоза, гемицеллюлоза, пектин мономерлік қалыптарға дейін. Қазіргі уақытта лигнин биодеградациясындағы осы ферменттердің үлкен рөліне байланысты микромицет фенолоксидазалары белсенді зерттеледі.
Зерттеу мақсаты: Trichoderma микроскопиялық саңырауқұлағының целлюлозолитикалық қасиеттерін анықтап зерттеу
Негізгі міндеттері: Trichoderma саңырауқұлағының қоректік ортасын өсіру;
Trichoderma саңырауқұлағының Ph температурасының аэрация әсерін зерттеу;
Trichoderma ферментативті белсенділігін анықтау.
Ғылыми жаңашылдығы және практикалық маңыздылығы Trichoderma resei мицелиалды саңырауқұлақтарын зерттеу Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия Ұлттық университетінің Микробиология және биотехнология кафедрасында жүргізілді.
Саңырауқұлақтың дақылдарын Петри ыдысында келесі құрамы бар картоп-глюкозалы агарда, картоп сорпасы - 200гл,агар - 2, стрептомицин - 1 өсірді. Саңырауқұлақ дақылдарын қоректік ортаға инокулирлеу Петри тостағандарынан Петри ілгіш жүргізді.Саңырауқұлақты өсіру үшін гуминді заттарды бөлгеннен кейін целлолигнин шымтезек қолданылды, олар сілтілі экстракция әдісімен NaOH ерітіндісімен (гидромодуль 1:100) 60 мин ішінде алынды.Сығынды центрифугалау арқылы бөліп, қалған целлолигнин шымтезек тазартылған сумен жуады.
1 Trichoderma жүйесінің дамуы және морфологиялық сипаттамасы
Микота патшалығы өкілдерін зерттеудің қазіргі кезеңінде Триходерма тектілігі геномика 1 және протеомика2 тұрғысынан қарастырылады. Жалпы мағынада геномика жүйелі тәсіл арқылы тірі организмдер туралы ақпарат алу және оны кең көлемде қолдануға болатын ғылым деп анықталған. Он жыл бұрын геномика гендердің сандық зерттеулерін, реттеуіш және кодталмайтын сиквенс пен геномдарды талдауды қамтиды. Қазіргі уақытта геномика геномдарды карталаудан және секвенирлеуден геном функциясына көшуге ұшырайды. Бұл байланысты көрсету үшін геномды талдау қазір құрылымдық динамикаға (гендер туралы ақпаратты жинақтау және талдау) және
функционалдық геномикаға (гендер қызметі туралы ақпаратты жинақтау және талдау) бөлінеді. Функционалды геномиканың мақсаты - көптеген гендер туралы мүмкіндігінше тез және тез ақпарат алу.Геномдық ақпарат биотехнология үшін қызықты жаңа гендерді табу үшін әсіресе маңызды.Нақты таксономиялық топтарды анықтау Триходерма штамдарын анықтаудағы негізгі фактор болып табылады. Бұл осы тұқымның генетикалық әртүрлілігіне негізделген жаңа технологияларды дамытуға мүмкіндік береді. Алайда, Trichoderma тұқымдасының көп компонентті және күрделі болуы түрдің биологиясын түсінуді қиындатады және коммерциялық мақсатта қолдануға әсер етеді [1]. Жоғарыда айтылғандай, Триходерма тұқымының саңырауқұлақтары қазіргі уақытта ең көп зерттелген саңырауқұлақтардың бірі болып табылады. Сондықтан Триходерма тұқымының молекулярлық таксономиясы басқа саңырауқұлақтар ұрпағының таксономиясына қарағанда көп зерттелген (1-2 кесте). Audik және Claverie жағдайларды, даму кезеңдерін, ағзалардың ерекшелігін немесе ұлпалардың ерекшелігін ескере отырып, cDNA популяцияларында кездейсоқ таңдау арқылы гендік экспрессияны зерттеу үшін
сандық геномика терминін қолданған алғашқы зерттеушілер болды. компьютерлік мәліметтер базасы. Жалпы мағынада, сандық геномика терминін тәуелсіз классикалық арнайы эксперименттер нәтижесінде мәліметтер базасында жиналған тізбектіліктер арасындағы мәліметтердің үлгісі ретінде түсіну керек.
Кесте 1
Әртүрлі саңырауқұлақтар үшін орнатылған ITS сиквенс саны
Организм Тектілік саны
Сиквенс саны
Саңырауқұлақтар
42402
Fusarium
1714
Aspergillus
1260
Trichoderma
1016
Neurospora
580
Colletotrichum
527
Кесте 2
2002 жылғы желтоқсанға дейін деректер базасында қол жетімді Trichoderma сиквенсінің жалпы саны
Сиквенс
типтері
Әдістері
Сиквенс сандары
Қолжетімділік
EST
(Genencor)
Жоғары
өнімділік
11050
Жартылай
EST
(NewBioTechnic)
Жоғары
өнімділік
1300*
-
EST (USP)a
Жоғары
өнімділік
1200*
+
ITS
Классикалық
1016
+
Патент
Классикалық
99
+
Гидролаздар
Классикалық
148
+
Басқалар
Классикалық
56
+
Trichoderma сандық геномикасының компьютерлік деректерін талдау:
а) Триходерма тектес саңырауқұлақтар белсенді қолданылады және белсенді зерттеу объектісі болып табылады. Триходермамен салыстырғанда PubMed-те тек кейбір саңырауқұлақтар жиі айтылады. Fungal International Initiative (PFI) ұсынылған 15 саңырауқұлақтардың тек 9 түрі t.reesei және T. harzianum қарағанда әдебиетте жиі кездеседі. Геномика саласындағы жұмыстардың үлкен санына қарамастан, компьютерлік деректер базасында "сиквенс"саны шектеулі. Trichoderma бойынша көптеген жұмыстар коммерциялық пайдалануға немесе физиологияға және биохимияға арналған;
б) жұмыста ұсынылған ДНҚ тізбектерін талдау Trichoderma текті таксономиялық зерттеу ғылымның белсенді саласы болып табылатынын көрсетті. 1319 триходерма қатарынан 1016 рет ішкі транскрипцияланған ITS тізбегіне жататыны көрсетілді. 2006 жылға қарай GenBank-та 70 000-нан астам қайталанбас триходерма тізбегі ұсынылуы мүмкін. Trichoderma тегінің таксономиясын зерттеу қазіргі кезеңде геномика мен протеомикамен қатар, осы саңырауқұлақтардың полимерлерді гидролиздеу қабілетіне байланысты. 1994 жылы геном тұжырымдамасының лингвистикалық баламасы ретінде пайда болған протеомика термині жасуша өмірінде геномдар қызметінде көрінетін және өзгертілетін ақуыздардың толық жиынтығын сипаттау үшін қолданылады. Бұл термин сонымен бірге белгілі бір уақытта жасушада пайда болған ақуыздар жиынтығын сипаттау үшін әмбебап мағынада қолданылады. Вайнштейн (1998) протеомика (ақуызды білдіру), транскриптомика (РНҚ және ген экспрессиясы) және метаболизм (метаболиттер мен метаболикалық желілер) сияқты ғылыми бағыттарды білдіретін омика терминін ұсынды. Гендік өнімдер мен реттеуіш сиквенстердің кешенді өзара іс-қимылын белгілеу үшін эксперименттік тәсілдер шешуші фактор болып табылады. Протеомика протеоманы зерттеуді, ақуыздарды бөлудің кеңейтілген технологиясын қолдана отырып, оларды анықтау, ұялы процестердің интегралды көрінісін қалыптастыру үшін, мысалы, өрнек деңгейлері, постлотрациялық модификация, ақуыздардың өзара әрекеттесуін қамтиды. Протеомика жасушалық ақуыздардың жіктелуі мен сипаттамасын қамтиды, әртүрлі физиологиялық жағдайларда экспрессия вариациясын және ақуыздардың өзара әрекеттесуін зерттейді, түрлі метаболикалық процестерде ақуыздардың қызметін анықтайды [2]. Осылайша, протеомика барлық биологиялық процестерді түсіну үшін іргелі білім береді. Протеомикалық технологияны қолдану ұлғайды, өйткені генетикалық өзгерістер мен қоршаған орта жағдайларының әсерін екі өлшемді ақуыз электрофорезі арқылы алынған гельдерге байқауға болады. Тазартылған ақуыздарды пептидтердің жаппай саусақ ізі арқылы немесе электро-спрей, масс-спектрометрия немесе Эрдман микроскигі арқылы бөлуге және тексеруге болады.
Кесте 3
Гидролитикалық ферменттер, мәліметтер базасындағы олардың гендері
Полимер
Ген фермент
N*
1
2
3
Хитин
Chit42 (эндохитиназа)
64
Chit33 (эндохитиназа)
2
Nag1 (хитобиозидаза)
2
Nag2 (хитобиозидаза)
2
Exc1 (экзохитиназа)
1
Exc2 (экзохитиназа)
1
Ech2
2
Ech3
2
Ech3B
2
Cht1
3
Cht2
2
Chit33 (эндохитиназа)
2
Chit36Y
2
Chit-VIRI
1
Chit-P
1
Chit-HAM
1
Chit-HAR2
1
Chit-HAR3
1
Chit-G2
1
Глюкан
Bgn1 (эндо-β-1,3-глюканаза)
1
Bgn2 (эндо-β-1,3-глюканаза)
1
Bgn3 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
Gluc78 (экзо-β-1,3-глюканаза)
2
B16-1 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
B16-2 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
B16-3 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
3-ші кестенің жалғасы
1
2
3
Целлюлоза
Cbh1 (β-1,4-глюкан-целлобиогидролаза)
7
Cbh2 (β-1,4-глюкан-целлобиогидролаза)
6
Cel2A (β-1,4-эндоглюканаза)
2
EglI (β-1,4-эндоглюканаза)
1
EglII (β-1,4-эндоглюканаза)
1
EglIII (β-1,4-эндоглюканаза)
1
EglIV (β-1,4-эндоглюканаза)
1
Мутан
β-1,3-глюканаза
3
Ксилан
Xyl1 (β-ксиланаза)
2
Xyn2 (β-ксиланаза)
2
Xyn3 (β-ксиланаза)
1
Эндо-β-1,4-ксиланаза)
1
β-глюкуронидаза
1
β-L-арабинофуранозидаза
1
Trichoderma литикалық және антагонистік белсенділігі жасушадан тыс гидролазаларды, оның ішінде эндохитиназа, β-n-ацетилгексоаминидаз, протеаздар, хитин-1,4-β-хитобиозидазалар, эндо - және экзо-β-1,3-глюканаза, липаза, ксиланаза, маннаназа, пектиназа, пектинлиаза, амилаза, фосфолипаза, РНК, ДНҚ және т.б. кодталатын бірнеше гендермен қамтамасыз етіледі. Триходерма гендерінің қалған тізбегін мәліметтер базасында ұсынылған белгілі бірізділік негізінде функционалды топтарға бөлуге болады (1-сурет).
Сурет 1 - Геномдық зерттеулер институты (Роквилл, АҚШ) жасаған жіктеуге сәйкес мәліметтер базасында қол жетімді триходерма тізбегінің функционалдығы
Параметрлердің критерийлеріне сәйкес келетін 2500 рет алынды (ең аз тізбектің ұзындығы - 150 нуклеотид). Барлық дәйектемелердің 1011 синглтон, ал 1483 тізбегі 315 кластерлерді құрады. Осылайша, t.harzianum жәнеT. atroviride гендерінің 1326 ішінара сиквенстері алынды. Кластерлер 2-ден 68 ретке дейін, оның ішінде 230 кластың әрқайсысында 2 немесе 4 рет, 51 кластерде 5-тен 8 ретке дейін, ал 15-ке 9-нан 9-ға дейін тізбектелген. BLAST бағдарламасын (Altschul соавт., 1990) пайдаланып, 80-ге тең, EST-тің жалпы саны, ұялы рөлі белгісіз функциясы бар тізбектегі гомология негізінде құрылуы мүмкін, 714 құрады [3]. Қалған реттіліктер (914) не жіктелмейді, не белгісіз функциясы бар тізімдерге гомолог болады немесе мәліметтер қорында көрсетілген көптеген ақуыздарға сәйкес келеді. Белгіленген функциясы бар белоктарды кодтайтын жүйелер NCBI мәліметтер базасындағы ақуыздарға гомологты түрде әр түрлі функционалды топтарға жіктелген (1.2- сурет)..Көптеген транскрипттер ақуыз мен РНҚ синтезіне қатысатын гендік өнімдер болды. Деректер базасында t. harzianum және T. atroviride экспрессияланатын гендерінің 1326 сиквенсі бар. Ең танымал транскрипт өмір сүру гендері тобына жатады.
Кесте 4
Ірі триходерма кластерлері және олардың жартылай қызметі
№
Кластер
Сиквенстер
саны
Деректер базасындағы
мәліметтермен ұқсастығы
1
2
3
4
1
QA
96
1-альфа ұзарту коэффициенті
2
PA
61
Гидрофобиннің ізашарыII (HFBII)
3
WA
34
40S рибосомальный белок S5
4
VA
32
Гипотетикалық консервіленген ақуыз
5
RA
31
Жоқ
6
TA
31
Жоқ
7
SA
29
Стресстік ақуыз DDR48
8
YA
25
Жоқ
9
CB
21
Вакуолярлы АТФаза
10
GB
17
Гистон Н3
11
XX
17
40S40S рибосомалық ақуыз 5S18
12
IF
17
Пептидил изомераза А цитозольді
13
ZA
16
Вакуолярлы АТФаза
14
BB
16
Гистон Н3
15
TE
15
60S рибосомалық ақуыз а4
Сурет 2 - Геномдық зерттеулер институтының (TIGR, Роквилл, АҚШ) классификациясына сәйкес Триходерманың биоконтролды штамдарының
тізбегінің функционалды мақсаты
Қазіргі уақытта геномдарды зерттеу бойынша 379 жоба белгілі. Оның ішінде 55 жоба орындалды, ал 324 жоба орындау кезеңінде. Тек 16 жоба (барлық санының 4%) саңырауқұлақтарға арналған. Аталған жобаларда саңырауқұлақтардың 12 түрі ұсынылған, олардың 7 түрі өсімдіктер мен адамның патогендері болып табылады. Саңырауқұлақ жобалары фитопатогендерге, адамның қоздырғыштары мен сапрофиттерге, триходерма саңырауқұлақтарының геномикасына және EST құруға (көрсетілген тізбекті), жүйелеуге және профильді сәйкестендіруге бағытталған. . Жобалардың бір бөлігін коммерциялық ұйымдар (Испаниядағы NewBioTechnic, АҚШ-тағы Genencor және Финляндиядағы VTT және т.б.) төледі, бұл алынған деректердің биотехнологиялық мәнін көрсетеді [4]. Қазіргі уақытта 30-дан астам жоба бойынша зерттеулер жүргізілуде. Міне, олардың кейбірі:
ДНҚ анализін қолдана отырып, белгілі бір қоршаған орта жағдайларында көрінетін промоторларды анықтау және клондау әдісі жасалды, мысалы глюкоза бар ортада өсу. Авторлар 5 белсенді промоутерлерге патент алды.
Шамберга әріптестерімен EST және microarray ДНҚ талдау көмегімен глюкозаны аэробтық және анаэробтық кәдеге жарату кезінде T. reesei метаболизмін зерттеді. Авторлар көп клеткалы ағзалар глюкозаны ашыту жолымен емес, тыныс алу жолымен кәдеге жаратады деген мәселені шешуге тырысты. S. cerevisiae ашытқыларынан айырмашылығы, саңырауқұлақтар анаэробты жағдайда энергия ала алмайды, бірақ олар аэробты жағдайда глюкозада өсу кезінде АТФ синтездейді. Авторлар T. reesei-де CTK және тыныс алу тізбегі ферменттерін кодтайтын гендердің көрінісі ПВК CTK-ға тотықтырылатын, бірақ ашыту арқылы этанолға айналмайтындай реттелгенін анықтады. Чилаппен бірге (Chellappan et al., 2001) Genencor компаниясымен ынтымақтастықта жаңа t.reesei гендік өнімдерін әзірлеу және алу үшін EST және BAC базасын құру мақсатында жобаны орындады. Жұмыстың нәтижесінде кДНҚ-ның екі кітапханасы құрылды, олардың біреуі целлюлиттік ферменттер өндірісін қоздыратын жағдайда өсетін жасушалардан алынған РНҚ-ға негізделген. Екінші кітапхана 18 түрлі жағдайда өсетін жасушалардан алынған РНҚ-ға негізделген.
T. virens Tv29-8 штаммының биоконтроллерін зерттеу үшін бактериалды жасанды хромосома кітапханасы құрылды, ол T. virusens белгілеген тізбектен 25 есеге асып түсті. Техас университетінің қызметкері Кеннерли жүргізген бұл жұмыс жоғары молекулалы ДНҚ фрагменттерін оқшаулауға, BAC кітапханасын құруға және 10-нан 170 кб-қа дейінгі кірістері бар 12 243 клонды шығаруға әкелді.
Функционалды геномика жобасы әртүрлі салаларда триходерма антагонистік штаммдарының гендік өнімдерін жасауға және қолдануға арналған.
Өнеркәсіп пен ауылшаруашылығына арналған триходерманың антагонистік түрлерінің функционалды геномикасы мен протеомикасы жөніндегі жоба. Жобаны NewBioTechnic (Испания) компаниясы және ЕО елдерінің академиялық топтары қолдады.
Топырақтың патогендік саңырауқұлақтарынан туындаған ауруларды биологиялық бақылау жобасы (Өсімдіктер зертханасы, АҚШ), 2002 - 2007 жж.
Триходерма және Гипокреа тұқымынан алынған бионтролларда қолданылатын саңырауқұлақтардың таксономиясы жобасы (жүйелі ботаника және микология лабораториясы; АҚШ), 2003-2008 жж.
Дәнді, көкөніс және басқа да дақылдардың (Russell Research Center Toxicology and Mycotoxin, USA) 2001-2006 уытты эндофитті саңырауқұлақтарын бақылау.
Биология, биологиялық бақылау және бидай мен арпа тамырлары ауруларын қоздырғыштардың молекулалық генетикасы (Root Disease and Biological Control Research, USA), 2003-2008.
Көңге негізделген органикалық тыңайтқыштарды қолдану бойынша зерттеулер (концерн және өндірістік зерттеулер зертханасы, Жаңартылатын энергия және көңді басқару жөніндегі зерттеулер, АҚШ), 2000 ж.
Биоконтрольдік саңырауқұлақтардың жүйесі Trichoderma және Hypocrea (Systematic Botany and Biology Laboratory; USA, China, France, Австрия), 2003. Stilbohypoxylon Muelleri - Hypocrea stilbohypoxyli және оның анаморфы Trichoderma koningii-ұқсас Пуэрто Рикодан жаңа түрді зерттеу бойынша нәтижелер алынды
Эволюция Trichoderma harzianum ризосферадан өсімдіктің тығын бөлігіне дейін өсуі.
Talaromyces flavus және Trichoderma viride антагонистік белсенділігі Хмелде (USA) Verticillium albo-atrum қарсы, 1999.Глюкозаны жоюға қабілетсіз Trichoderma Reesei Mutants мутантты штаммын алу (USA), 2001 - 2003.
Триходерма вирусидіндегі Fusarium Moliniforme-мен фуманизин B1 басылуы (жүйелі ботаника және микология зертханасы, АҚШ), 1999 ж.
Мақта тұқымын фитопатогенді саңырауқұлақтардан қорғау (Agricultural Research Service; USA), 2002.
Ботриттерден қорғау үшін құлпынай тамырларын триходермамен емдеу.
Гербицидтерді, метилбромиді тұқымдарды микробиологиялық бақылауға ауыстыру (Southern Weed Science Research; USA), 2000-2005.
Trichoderma және Hypocrea тұқымдарының биоконтролды саңырауқұлақтарының жүйеленуі (жүйелі ботаника және микология зертханасы, АҚШ), 2004 ж.Какао өсімдіктерін қорғауға арналған Trichoderma ovalisporum жаңа эндофитті түрлері зерттелуде (Ботаника және микология зертханасы; АҚШ), 2004 ж.
Жәндіктер мен арамшөптермен күресу үшін биологиялық бақылау құралдарын пайдалану, 2001.
Фитопатогенді бактерияларды, саңырауқұлақтарды және мақта нематодын бақылаудың биологиялық, генетикалық және интеграцияланған әдістері, 2002.
Қызыл таңқурай тамырының фитофтороз қоздырғыштарынан интеграцияланған қорғау әдісі ретінде топырақты соляризациялау (Horticultural Crops Research, USA), 2003.
Фунгицидтердің әсері, шай ағашы майы, теңіз балдырлары сығындылары және шірік қоздырғыштарға саңырауқұлақ агенттері және құлпынай өнімі (Үндістан), 2003.
Нигериядағы шампиньондар аурулары.
Жапырақ бетімен өзара әрекеттесуді зерттеу үшін T39 Trichoderma harzianum изоляторын (TRICHODEX) қолдану
Биоконтроль саңырауқұлақтарын іздеу (USA), 1998 - 2001.
Микробты компостинг (Австралия), 2000-2003 жж.
Триходерманың морфологиялық сипаттамасы
Гипокреа тұқымының мүшелері және оның триходерма анаморфі - барлық типтегі тропикалық ормандардың типтік өкілдері (Дружинина және басқалар, 2004). Бұл саңырауқұлақтар ашық түске байланысты оңай анықталады. Hypomyces (Fr.) (Hypocreaceae) тұқымдас түрлерінің көпшілігі өсірілетін және жеуге болатын саңырауқұлақтарға паразиттік етеді. Гипокрея және оныңанаморфты триходерма Pers. көбінесе ылғалды тропикалық және субтропикалық ормандарда ғана емес, сонымен қатар құрғақ қоңыржай және солтүстік аймақтарда, тіпті одан да шыңды жерлерде - алыс солтүстік пен төтенше оңтүстікте кездеседі [5]. Hypocrea телеоморфтарын ағаштан, Ascomycota мүшелерінің мицелиясынан, тірі базидиомицеттерден, ыдыраудың әртүрлі сатыларындағы жеуге болатын саңырауқұлақтардан, көбінесе шөпті субстраттардан кездестіруге болады. Кәдімгі гипокреа мыжылған, ашық түсті немесе боялмаған тығыз строматты құрайды, олардың диаметрі 5 мм-ден асады, дегенмен кейбір түрлер бірнеше сантиметрлік мөлшерде өзек тәрізді, овоидты құрайды. Hypocrea түрі әдетте жалған паренхимадан немесе тығыз гифтерден тұратын тығыз хош иіспен қоршалған перитецияларды қалыптастырумен сипатталады. Hypocrea түрлері дамудың ерте кезеңдерінде бір қабықта болатын бір тартумен 8 аскоспорды құрайды. Аскоспоралар түссіз немесе жасыл, ерте екі дөңгелек, жұмыртқа тәрізді, созылған немесе сына тәрізді аскоспораларға ыдырайды. Әдетте, триходерма түрлері топырақтан оқшауланған, бірақ олар көбінесе ағашқа, мәдени саңырауқұлақтардың қақпақтарына (шляпаларында) ,орман саңырауқұлақтарына шашырайды, мұнда оларды жасыл кондидиялар массасымен оңай анықтауға болады, олар жиі ақ және сары болып келеді. Олар әртүрлі мекендейтін жерлерде кездеседі. Мысалы, саңырауқұлақтарды ғимараттардың ылғалды қабырғаларында, эндофиттер сияқты, ылғалды тропикалық орманның ағаштарынан табуға болады. Trichoderma-топырақ саңырауқұлақтарының биомассасының маңызды бөлігін құрайды.
Trichoderma негізгі морфологиялық белгілері:
Колониялардың белгілері, олар әр түрлі болуы мүмкін және әр түрге тән болуы мүмкін (алайда колониялардың пайда болуын анықтау үшін қажетті дәлдікпен сипаттау өте қиын);
Әртүрлі температура кезінде әртүрлі ортадағы дақылдардың өсу қарқыны басқа сипаттамаларға ұқсас түрлерді ажырату кезінде маңызды болуы мүмкін;
Өсірілген конидиофордан немесе найзағайға немесе пустулаға топтастырылған конидиофордан конидиялардың пайда болуы түрлерде тән белгі болып табылады;
Диффузды пигментті, сондай-ақ, Trichoderma жағдайында мұндай пигменттердің түсі нашар өзгереді. Longibrachiatum секциясына қатысты штаммдар, әдетте, бірінші рет анықталғаннан кейін, елеулі жарқын жасыл-сары пигментке ие. Ақшыл жасыл реңктер көптеген түрлерге тән, бірақ ерекшеленбейді. Кейбір түрлер, керісінше, пигменттің толық болмауы арқылы сипатталады, ал қызыл реңктер бірнеше изоляторларда бақылауға болады;
Ортада қалыптасқан тән кристалдары тек Trichoderma aureoviride- байқалады ;
Көгерудің және иілудің нәзік иістері, әдетте, триходерманың әртүрлі штамдарына тән. Кокос иісіне ұқсайтын тән хош иістерді әдетте Trichoderma virideдінің штамдары, кейде Trichoderma atroviride шығарады;Тармақталу түрі және кластидтер мен пустулалардағы конидиофорлардың бірігуі триходерма штамдарын топтар мен түрлер топтары бойынша анықтаудың маңызды белгілері болып табылады;
көп жиналған пустула Pachybasium бөлімінен шыққан көптеген түрлерге тән, бірақ олар басқа топтардың көптеген штамдарында да кездеседі;
кондидиофордың тармақталуы дұрыс бұрмалануы немесе қате болуы мүмкін. Тарамдар кең және түзу немесе тиісінше тар және иілген;
Pachybasium тобынан шыққан кейбір түрлердің конидиофорының апекциясы стерильді процеспен аяқталуы мүмкін, ол келесі түрде болуы мүмкін: түзу, жинақталған және спиральды;
Конидиофорлық субтерминальды жасушалар Гамс (1971 ж.) Анықтағандай, Longibrachiatum бөлімінде триходермада жиі кездесетін афанофиалидтер арқылы қысқа, бүйірлік мойын арқылы конидия түзе алады;
Кондидияның пішіні әртүрлі болуы мүмкін - сферадан эллипске дейін. Триходерма овоидті немесе қысқа цилиндрлік конидиямен, базальды негізі бар, көп немесе аз конустық және қиылған түрінде табылды. Триходермада мүмкін болатын кондидия мөлшерінің өзгеруі аз, алайда туыстас түрлер көбінесе мөлшерінің айтарлықтай айырмашылығымен ажыратылуы мүмкін;
Оптикалық микроскопты қолданған зерттеулерге сәйкес, көптеген түрлердегі конидиалардың беті тегіс, алайда кейбір тегіс конидиялары бар сканерлеуші электронды микроскоппен (SEM) зерттегенде олардың әлсіз өрнектелгені анықталды. T. viride агрегаттарында, сондай-ақ T. Saturnisporum және T. ganense сияқты екі түрде де дөрекі және сулы конидиялардың нұсқалары бар. Конидия көпіршікті болуы мүмкін немесе сыртқы қабырғасының шығуы мүмкін;
Кондидияның пигментациясы да өзгермелі сипатқа ие - түссізден (көп жағдайда ақтан) әр түрлі жасыл түстерге аз сұр немесе қоңырға дейін. Кейбір түрлерде жетілген кондидиялар микроскоппен қаралғанда қара-жасыл түске ие болады.
Хламидоспоралар көптеген түрлерге тән, дегенмен барлық түрлері 10 күн бойы 20 ° C температурада, CMD-де хламидоспоралар түзілмейді. Көбінесе түрлердің көпшілігінде олар сфералық немесе эллипсоидты, термальды және интеркалар, тегіс қабырғалы, түссіз, сарғыш немесе жасыл, диаметрі 6-15 мкм.
stromaticum саңырауқұлақтарында типтік хламидоспоралардан басқа клеткалар ішінде сфералық хламидоспоралар пайда болады. T. virens түрі таза мәдениетте көптеген хламидоспораларды құрайтындығымен ерекшеленеді. Өсіп келе жатқан гипа белгілері аз ғана болады, олар идентификация үшін маңызды. Мысалы, T. stromaticum сияқты түрлердегі хламидоспоралар көп жасушалы болуы мүмкін;
Синанаморфтар әдетте типтік пустулдарды қалыптастыратын кейбір түрлерде қалыптасады. Синанаморфтар Verticillium түрі бар конидиофордың бір түрі бойынша анықталады, оның бұтақ түрі және конидиясы әрбір фиалида ұшында ашық жасыл түсті сұйықтық тамшысында болады. Кандидияның пайда болуына әр түрлі стресс әсер етеді. Мексикалық ғалымдар триходерманың atroviride конидиогенезі мицелийдің зақымдануымен жүретінін анықтады (Эрнандес-Онат, Эррера-Эстрелла, 2006). Басқа зерттеушілер Trichoderma тұқымдасының түрлерінің конидиялар түзілуіне қоршаған ортаның рН-нің әсерін зерттеді (Steyaert et al., 2006).
Trichoderma метаболиттері
In vivo және in vitro тәжірибелерінде Trichoderma метаболизмін зерттеу метаболиттердің тұтас спектрін анықтауға мүмкіндік берді: ферменттер, қышқылдар, өсу факторлары және т. б.
Trichoderma литикалық ферменттері
Триходерма шығаратын ферменттер құрамының күрделілігімен сипатталады. Жабайы штамдардың секрецияға қабілеттілігінің дәлелдері бар: эндохитиназалар, хитобиозидазалар, β-N-ацетилхосаминидазалар, N-ацетил-gal- галактозаминидазалар, β-1,3-глюкозалар, β-1,6-глюканазалар, протеазалар, ДНаздар, α- амилазалар, целлюлазалар, липазалар, маннаназалар, ксиланазалар, уреназдар, РНаздар, пектиназалар, пектин-лязалар, лаказалар, пероксидазалар және мутаназалар [6].
Trichoderma хитинолитикалық, целлюл олитикалық және глюканолитикалық ферменттер сияқты CWDE синтездеу қабілеті бірнеше жыл бұрын сипатталған (Soriente et al., 2006). Trichoderma штаммдарының көпшілігі әлеуетті өсімдіктер антагонист ретінде немесе целлюлолитиктер және гемицеллюлолитиктер ретінде ғылыми әдебиетте сипатталған. Хитиназалар мен глюканазалар жиі олардың саңырауқұлақтардың жасушалық қабырғасының деструкциясына қабілеттері тұрғысынан зерттелді, бірақ басқа энзимдер, протеаздар, липаздар және фосфатаза сияқты жасушалық қабырғаны азғыратын, сондай-ақ осы процеске тартылуы мүмкін. Триходерма түрлерінің көпшілігі сапротрофтар. Әдетте триходерма саңырауқұлақтары жапырақ қоқысы мен мультиді колонизациялайды. Сәтті таралуы үшін субстраттағы көміртектің 1% жеткілікті. Табиғи жағдайда олар көптеген полимерлі субстраттарды тұтынады, олардың арасында целлюлоза және гемицеллюлоза басым болып келеді. Целлюлоза тізбектері-бұл -1,4-гликозидті гомополимерлер, құрамында шамамен 8000-12000 глюкозалық бірліктер бар, олар іс жүзінде ерімейтін кристалдық құрылымды. Целлюлолитикалық ферменттердің үлкен әртүрлілігі культуралды ортаға тиімді құпия және синергиялық жоғары кристалды нативті целлюлозаны.
Гемицеллюлозаның басты ерекшелігі-оның гетерополисахаридті құрамы, ол ксилозамен немесе маннозамен түзілген және арабиноза мен галактоза, сірке және глюкурон қышқылдары сияқты орынбасарларының бүйір тізбектерінен тұратын басты тізбекке негізделген. Пектиндер әдетте әртүрлі тармақталған құрылымдардан тұрады. Глюкоза мен глюко-олигомерлердің пайда болуынаәкелетін целлюлозаның деградациясына қарағанда, гемицеллюлозаның деградациясы гемицеллюлозаның түріне байланысты әртүрлі моно- және дисахаридтердің жиналуына әкеледі. Глюкан, крахмал және ақуыз сияқты басқа полимерлер құрамында кейбір жағдайларда басым болатынына қарамастан қолда бар көміртектің аз ғана бөлігі бар.
Целлюлоза мен гемицеллюлозаның толық деградациясы өнеркәсіптік қызығушылық тудыратын жасушадан тыс ферменттердің көп мөлшерін қажет етеді (Меландер соавт., 2005). Зерттеулер үш өлшемді ақуыз құрылымының биохимиялық қасиеттерін және осы ферменттердің кодтау гендерін оқшаулау мүмкіндігін талап етеді.
Целлюлоза мен гемицеллюлозаның толық тозуы жасушадан тыс энзимдердің көп санын талап етеді, сондықтан өнеркәсіптік қызығушылық бар. Үш өлшемді белокты құрылымның биохимиялық қасиеттерін және осы ферменттердің кодтаушы гендерін бөлу мүмкіндігін зерттеу қажет.
Кесте 5
Гендер Целлюлаз Trichoderma
Целлюлаза
Штамм
Ген
Целлобиогидролаза I
T reesei
сbh1
Целлобиогидролаза II
T. reesei
cbh2
Эндо-β-l,4-Глюканаза I
T. reesei
egl1
T. longibrachiatum
egl1
Эндо-β-l,4-Глюканаза II
T. reesei
egl2
Эндо-β-l,4-Глюканаза III
T. reesei
egl3
Эндо-β-l,4-Глюканаза IV
T. reesei
egl4
Эндо-β-l,4-Глюканаза V
T. reesei
egl5
Глюкозидаза I
T. reesei
bgl1
Trichoderma целлюлазды кешенінің сипаттамасы
Барлық целлюлозалар 1,4 - гликозидті байланыстарға бірдей химиялық ерекшелігі бар, бірақ олар субстраттарға қатынасымен ерекшеленеді. Олар әдетте экзоглюканаза мен эндоглюканазға әсер ету механизмі бойынша бөлінеді. Полисахаридті тізбектің соңынан целлюлобиозды ажырататын
экзоглюканаза немесе целлюлобиогидр олаза (1,4-β-D-глюкан целлюлобиогидролаза, EC 3.2.1.91), әдетте кристалды целлюлозаға жоғары белсенділігі бар. T. reesei екі целлюлобиогидролазды синтездейді: СВН, оның редукциялаушы шеті бар целлюлозды тізбекті және СН II, жиі ұшырайтын целлюлозды тізбекті синтездейді (сурет. 3). Эндоглюканаза (EG) (l,4-β-D- глюкан-4-глюканогидролаза, EC 3.2.1.4) ортасында тізбектің үзілуін жүзеге асырады, осылайша целлюлобиогидролаз.
Эндоглюканазалар целлюлозаның аморфты бөліктерін көреді және целлюлозаға қарағанда, алмастыратын целлюлозаны гидролиздей алады, мысалы, карбоксиметилцеллюлоз және гидроксиметилцеллюлоз. Ақырында- глюкозидазасы целлюлобиозаны және басқа да еритін полисахаридтерді глюкозаға дейін ыдыратады, бұл маңызды қадам болып табылады, өйткені целлюлобиоза соңғы өнім және көптеген целлюлаздың тежегіші.
Гендік инженерия мен құрылымдық биологияның өзара әрекеттесуі қазіргі уақытта целлюлаздық белсенділіктің негізгі механизмдерін түсінудегі елеулі жетістіктердің негізінде жатыр. Ahmed et al., 2005.Амплифицирленген және тазартылған өнімдер SmaI puc18 плазмиды сайтына салынған.
Сурет 3 - Целлюлозаның ферменттік гидролизінің механизмі
Екі целлюлобиогидролаз (CBH) шынжырдың қарама − қарсы ұштарынан жоғары ретсіз кристалды аймақтарға (С), эндоглюканаза (EG) - реттелмеген ауданның ортасында шабуыл жасайды.
R-редукцияланатын ұшы, NR-редукцияланатын ұшы. Құрамында Еxg, egl және bgl гендері бар плазмидтер одан әрі сипаттау үшін E. coli-ге айналды. Ахмед және басқаларымен оқшауланған Trichoderma harzianum E-58-ден алынған целлюлазалардың (экзоглюканазалар (EC; 3.2.1.91), эндоглюканазалар (EC. 3.2.1.4), β-глюкозидазалар) ең жоғары белсенділігі (2005) 2.764, 14.4 және 0.629 болды IU mL-1, сәйкесінше. Саңырауқұлақтың көптеген гидролаздары-каталитикалық аймақ және көмір-байланыстырғыш модуль (СВМ). Бұл ферменттің белсенді орталығы шегіндегі ұзын амин қышқылдық кезектілік, оның конфигурациясы көмір - байланыстырушы белсенділікті қамтамасыз етеді. СИМ бұрын в целлюлоза байланыстырушы аймақ ретінде жіктелген. Алдыңғы зерттеулер каталитикалық домен эллипсоидты бас пішініне ие деп болжайды (3-сурет), ал байланыстырушы каталитикалық домен мен CBD (CBM) арасындағы ұзартылған конформацияны қабылдайды. Көптеген саңырауқұлақ пен бактериальды целлюлозалардың каталитикалық және целлюлозды байланыстырушы домендерінің құрылымдары сәтті анықталды .
Целлюлолитикалық ферменттерді оқшаулау және анықтау үшін иммунологиялық әдістер әлдеқашан кең қолданылған. Антиденелер, әсіресе моноклоналды заттар, целлюлазалардың бірнеше формаларын қалыптастырудағы постсессиондық протеолиздің рөлін зерттеуде өте пайдалы құрал болып табылады. Алайда, әсіресе доменге тән моноклоналды антиденелерді алу айтарлықтай қиындықтармен байланысты. Поликлональды антисерумнан бастап толық көлемді ферментке дейінгі целобиогидролаздың I Trichoderma reesei-нің каталитикалық емес бөлігі үшін антиденелерді дайындаудың қарапайым әдісін ұсынды [7].
Целлюлазалардың каталитикалық доменінің құрылымы
Полипептид αβ-құрылымға изомеразе (TIM) триозофосфаты сияқты салынады, бірақ сегіз β-тізбектің орнына жеті β-тізбекті қамтиды (сурет 4).
Сурет 4 - Molscript Kraulis (1991) бағдарламасының көмегімен алынған CBHI T. Reesei интактілі аймақ құрылымының схемасы. Туннельдің белсенді учаскесінің орналасқан жері Жұлдызшамен белгіленген. Линкерлік пептид екі функционалдық аймақтың физикалық байланысын бейнелеу үшін үлгілендірілген
Сурет 5 - T. reesei каталитикалық домендер туннельдерінің жалпы құрылымы мен белсенді учаскесінің сұлбасы
(А) және (В). Екінші құрылым қара-сұр түспен боялған, β-тізбектер көрсеткілермен, α - спираль - спиральдармен берілген. Екі ақуыз үшін туннельдердің белсенді сайттары көрсетілген, олардың гидрофильді беттерінің көлденең қимасы.
CBNII белсенді қуысы дисульфидті көпірлермен тұрақтандырылған екі беткейден құрылған туннельде локализацияланған. 20Ǻ туннель бүкіл каталитикалық доменнен өтеді және оның соңынан бір целлюлоза тізбегін орналастыруға қабілетті. 6-шы отбасының эндоглюканазаларында каталитикалық орталықтың белсенді аймағынан өтетін туннель болады. Бұл белсенді орталықтың ұқсас құрылымы бар эндоцеллюлазаны целлюлоза тізбегінің ортасында байланыстыруға мүмкіндік береді, ал экзоглюканазалар целлюлоза тізбегінің ұштарымен тек өзектеріндегі туннель тереңдігіне тең болады .
T. reesei CBHI каталитикалық доменінің кристалдық құрылымы ядросында ұзын туннель бар. T. reesei-ден алынған эндоглюканаза EGI экзок және эндоглюканазалар құрылымындағы негізгі айырмашылықты растайтын белсенді аймаққа ие.
Гликозилгидролаздың үшөлшемді құрылымдарын салыстырғанда, олардың белсенді аймақтарын Катализ механизміне немесе ферменттің кеңістіктік құрылымына қарамастан үш негізгі классқа бөлуге болады. Қалта немесе кратер түріндегі белсенді аймақ β-глюкозидаза, глюкоамилаза және β- амилаза сияқты ферменттерге тән, олар көмірдің соңынан моносахаридтерді гидролизациялайды. Белсенді орталықтың бұл түрі тізбектердің бірнеше қол жетімді ұштарын қамтитын нативті кристалды целлюлоза сияқты субстраттар үшін оңтайлы емес. Моносахарлар қалдықтарының көп санын байланыстыратын ұзын белсенді аймақ осы мақсаттар үшін оңтайлы болып табылады. Опциялардың бірі СВН және СВНІІ T. reesei және кейбірбактериялық целлобиогидролаз үшін жоғарыда көрсетілген туннельде жасырын белсенді аймақ болып табылады [8]. Басқа нұсқада белсенді аймақты қалыптастыратын қысқа ілмектер ферменттің бетінде ойпатты құрайды. Мұндай механизм α-амилаза, эндоцеллюлаза, ксиланаза.
2 Фитопатогенді микроорганизмдерді биобақылау агенттері ретінде Trichoderma түрлері
Trichoderma тектес саңырауқұлақтар тіршілік әрекетін бәсеңдетуге қабілетті фитопатогенді саңырауқұлақтар, сондықтан өсімдік ауруларын қоздырғыштарды бақылау үшін коммерциялық агенттер ретінде кеңінен қолданылады.
Фитопатогендерді қолдану санын биологиялық реттеу
Триходерма жанама түрде пайда болуы мүмкін: а) қоректік заттар мен кеңістік үшін бәсекелестік нәтижесінде; б) фитопатогендік споралардың (фунгистаз) өсуіне жол бермейтін метаболиттерді синтездейтін немесе қарсы тұра алатын BCA қабілетінің нәтижесінде; г) жасуша патогенін жою мүмкіндігі (антибиотик); д) ризосфераны өзгерту мүмкіндігі - қоздырғыштар өсіп кетпеуі үшін топырақты қышқылдандыру. Төменгі оттек топырағынан бөлінген
Trichoderma lignorum (түрдің ескірген атауы берілген, бәлкім, Trichoderma asperellum) аймағында Fusarium culmorum және F.avenaceum өсімдіктердің тамыр шірік қоздырғыштарына қатысты орташа фунгицидтік белсенділігі және бактерияға қарсы қасиеттердің тар спектрі бар. Орталық Сібірдің топырағынан Trichoderma asperellum сондай-ақ Fusarium spp өсімдіктерінің зақымдануын төмендетті.
Түрлердің көптігін биологиялық бақылау фитопатогендік микроорганизм мен BCA-ның тікелей өзара әрекеттесуінен де пайда болуы мүмкін, бұл микопаразитизмде де, физикалық байланыста болу және гидролитикалық ферменттер синтезі және ферменттермен синергетикалық әсер ететін токсинді қосылыстар мен антибиотиктердің әсерінен болуы мүмкін.
Фитопатогенді микроорганизмдермен Trichoderma өзара әрекеттесуінің теріс түрінің механизмі генетикалық деңгейде жеткіліксіз зерттелмеген. молекулалық-генетикалық деңгейде биобақылау механизмін сипаттау үшін экспрессияланатын гендердің деректер базасын құруға әрекет жасады. Бұл үшін Trichoderma harzianum үшін EST gag генінің бірізділігі зерттелді. Кднк анонимді клондарды ішінара секвенирлеу кеңінен қолданылады. Генді сәйкестендіру әдісімен. 3298 кездейсоқ клонның Trichoderma harzianum мицелиясынан бөлінген ДНК талдауының негізінде кДНК арнайы кітапханасы құрылды [12].
Реттілік секвенирленді және салыстыру
EST тізбектерімен. Белгілі гендермен 2174 клондарда гомология анықталды және EST-те танымал 451 клон бар. Олар көптеген ферменттерге, құрылымдық белоктарға және реттегіш факторларға гомологиялық екенін көрсетті. Мицелий гендерінің едәуір бөлігі биобақылау қасиеттерін көрсету үшін Trichoderma-да болуы тиіс фунгицидтердің микопаразитизмі мен синтезіне байланысты процестерге қатысты. Осылайша алынған нәтижелер T.harzianum мысалында Trichoderma мицелийіндегі гендер экспрессиясын зерттеу үшін EST талдауын табысты қолдануды ұсынады. Бұл биоконтроль ферментативті гидролиз ғана емес, бұрын болжанғандай, әр түрлі жасушалық процестердің нәтижесі болып табылады. Зерттеулер, кем дегенде, бір ферменттер кешені - хитиназ - фитопатогендермен Trichoderma теріс өзара әрекеттесуінде басты рөлдердің бірін атқаратынын растайды.
Микопаразитизм
Микопаразитизм-бір саңырауқұлақтың басқасына тікелей шабуыл. Бұл бірнеше кезеңдерді қамтитын күрделі процесс: хемотропизм, тану, шабуыл, иесінің торына ішінара ену және оны өлтіру. Trichoderma штамдары саңырауқұлақтардың көп мөлшерде паразиттеніп, оларды танып және оларда өсіп келе жатқан тікелей биобақылауды жүзеге асыра алады. Сезімталдық жасушалық қабырғаны бұзатын ферменттердің экспрессиясының жоғарылауымен байланысты, негізінен, хитиназ, глюканаз және протеаз. Trichoderma түрлі штаммдарының индукция механизмі әртүрлі. Саңырауқұлақтар экзохитиназа тұрақты төмен деңгейде құпия болып саналады. Хитиназа жасушалық тозған жағдайда саңырауқұлақтардың қабырғалары, олардың эндохитиназа индукциялайтын олигомерлер босатылады және шабуыл басталады.
Микопаразитизм кезеңдері
Хемотропизм. Позитивті химотропизм ұлғаюды білдіреді
химиялық ынталандыру 1981 жылы Chet және әріптестері триходерма саңырауқұлақтарын қашықтықта анықтайтындығын көрсетті. Микопаразиттік гипа ерекше жолмен тарала бастайды, ал бұтақтар саңырауқұлақтарға қарай өседі. Триходерманың химиялық градиенттің айқын өсуіне қарамастан, аминқышқылдары мен қанттан басқа өсуді тудыратын басқа заттар жоқ хабарлады. Осылайша, қоздырғыштардың әр хост саңырауқұлақтарына тән екендігі әлі анық емес. Химотропизм кейбір антагонистік артықшылықтар береді деп қабылданды. Алайда, химотропизм микопаразитизмнің маңызды сатысы болып саналмайды.
Тану. Trichoderma барлық эксперименттерде ерекше
саңырауқұлақтарға қатысты антагонизм. Тәжірибе нәтижелері екеуінің де молекулалық тануы антагонизм процесінің алдындағы маңызды кезеңді білдіретін идеяға әкелді. Мұндай тану физикалық (тигмотропизм) немесе химиялық (хемотропизм) болуы мүмкін. Хемотропизм - деп бұл жерде иесі мен паразит жасушаларының бетінде орналасқан комплементарлы молекулалар арасындағы гидрофобтық өзара әрекеттесуді білдіреді.
Лектиндер - бұл жасушаларды жабыстыратын және жасушадан тыс жасушалармен өзара әрекеттесуге қатысатын қантты байланыстыратын ақуыздар немесе гликопротеидтер. Көрсетілген Р.Солани гипофизінде O типті эритроциттерді ерекше байланыстыратын, бірақ А немесе В типті жасушаларды байланыстырмайтын лектиндер бар.Галактоза мен фукоза, бірақ басқа қанттар емес, агглютинацияны басады. Алынған нәтижелер R.solani лекторлары Trichoderma саңырауқұлақтарымен ерте өзара әрекеттесуге қатысады деп болжауға мүмкіндік берді, егер олардың жасушалық қабырғаларында фукоза және галактоза сияқты өзара әрекеттесу сайттары болса, осы лектиндерге тән. Trichoderma жасушалық қабырғалары шын мәнінде галактоза бар. Шамасы, R. solani гифіндегі лектиндер қабілетті.
Қойма саңырауқұлақтарының мицелийін бекіту және ендіру.
Танылғаннан кейін, триходерма гипалары қабылдаушы құрылымды және аппрессор тәрізді құрылымдарды құра отырып, қабылдаушы гипаға қосылады. Әрі қарай, паразиттік гипа негізгі гипааны қоршап алады. Амператор тәрізді құрылымдар негізгі клеткаға енеді, өйткені оларда глицерин сияқты жоғары мөлшерде осмотикалық ерітінділер болады. Мысалы, эксперименттерде in vivo- да қарсы дақыл әдісі бойынша,осы құбылысты көрсету гифтер суреттелген 3.1 және 7 суреттерінде көрсетілген микопаразиттер R. solani гипофиясын қоршайды. T. harzianum кондидиясы стерильді топырақта өніп, топырақта негізгі мицелияға қарай өсетін мицелий түзетіні анықталды. Саңырауқұлақтармен байланысқан кезде паразиттік гипа негізгі гифаны қоршап алып, типтік аппресория түзді. Топырақтағы паразиттік қатынастардың интенсивтілігі екі мәдениеттің қарама-қарсы сынағымен салыстырғанда төмен болды, мүмкін бұл Trichoderma өсуін қолдайтын топырақтағы қоректік заттардың төмен концентрациясына байланысты.
Сурет 7 - Микопаразитикалық өзара әрекеттесу. Гиф сканерлеу электронды
Микрофотография. Trichoderma, Rhizoctonia solani қоршаған. Хемотропизм( А), тану және бекіту (Б)
Trichoderma саңырауқұлақтардың зең қоздырғышы ретінде
1985 жылы Солтүстік Ирландия, Шотландия және Англияда шампиньондар өсіру бойынша фермаларда жасыл зең індеті кеңінен таралған, содан кейін Германияға жетті және кейіннен Еуропада. Канада фермаларының 50% - ы, жасыл зеңмен байланысты проблемалар 2000 жылға дейін сақталды. Компост жұғу кезеңінде базидиомицет өнімінің шығыны 15-тен 40% - ға дейін өсті. Кейбір аудандарда зейнетақы шығыны 100% - ға дейін өсті және фермерлер бизнестен айрылды. Қазіргі уақытта шығындар 5% құрайды. Түрлі балық өсіру шаруашылықтарында залалданған субстрат пайызы өзгерді
0-ден 85% - ға дейін. Тек Ирландияда ғана Trichoderma Th2 патогенді биотипінің жоғалуы 1986 жылы 1 млн.фунт құрады.
Trichoderma агрессивті биотиптері-өсірілетін саңырауқұлақтардың антагонистері-қоршаған ортадан жапырақтың шірік қоздырғыштары ретінде бөлініп алынған болатын. Trichoderma патогенді түрлері тежелді Agaricus өсіру үшін пайдаланылатын компост автохтонды бактериялардың тіршілік әрекеті патогендердің жаңа жағдайларға тез бейімделуіне ықпал етті.
Патогендік триходерманың түрлері ингибирленген
Agaricus өсіру үшін қолданылатын компосттың автохтонды бактерияларының өмірлік белсенділігі, бұл қоздырғыштардың жаңа жағдайларға тез бейімделуіне ықпал етті.
Триходерманың патогенді түрлерін анықтау
Инфекцияның алғашқы белгілері пайда болған кезде Рифай кілтін қолдану арқылы морфологиялық әдістердің көмегімен Trichoderma 7 түрі анықталды. Бөлінген түрлер 11 таксонға бөлінген, оның ішінде T.harzianum бар 4 биотип бар. Олардың үшеуі (Th1, Th2 Th3) Англия мен Ирландияда табылды. Бұрын Еуропадан шыққан Trichoderma harzianum және Америкадан Th4 биотиптері молекулалық әдістерді қолдана отырып Trichoderma aggressivum f ретінде анықталды. Еuropaeum және T. aggressivum f. agressivum, сәйкесінше. T. agressivum f-тің биологиялық формалары. agressivium және T. aggressivum f. Europaeum бір-бірінен және триходерманың басқа түрлерінен морфологиялық, мәдени және молекулалық сипаттамаларында ерекшеленді. Биотиптер Th1 және Th3 T. harzianum және T. atroviride болып анықталды. T. aggressivum f. aggressivum және T.aggressivum f. europaeum биологиялық нысандары морфологиялық, мәдени және молекулалық белгілері бойынша бір-бірінен және басқа Trichoderma түрлерінен ерекшеленді. Th1 және Th3 биотиптері T. harzianum және T. atroviride ретінде анықталды.
Th2 вируленттілігін анықтау үшін зертханалық және далалық зерттеулер.
In vitro тәжірибесі Th2 және басқа компосттан оқшауланған түрлердің вируленттілігін салыстыру үшін жүргізілді. Отарлау 5 балдық жүйенің көмегімен бағаланды. 1- деңгей өсудің шектеулі болғанын және инокулятта байқалғанын білдірді; 5 -деңгей компосттың толық өнуін білдірді. Нәтижелер Th2 ең вирустық таксон болып табылатынын көрсетті (Th4-пен салыстырғанда). Th2-ді отарлау деңгейі Th3 үшін 1,25 балл деңгейімен және Th1 және басқакомпост микроорганизмдерімен 1 балл деңгейімен салыстырғанда 3,56 балл құрады. Th2 колонизациясының деңгейі 27 ° C-қа дейін жоғарылап, 18 ° C немесе 22 ° C төмендеді. 30 ° C температурада, тіпті Th1 қауіпті бола бастады. Th2 тек автоклавта немесе микротолқынды компостта дамиды деп көрсетілген. Алайда, Себи (Seaby) Th2 дақылын, Agaricus жоқ компостта, тіпті егіс түйіршіктері болмаған кезде де дами алатынын анықтады [13].
2.2 Trichoderma тектес саңырауқұлақтардың адамға әсері
Триходерма түрлері иммунологиялық тұрғыдан патогенді деп танылады. Trichoderma тұқымының сапрофитті түрлері арасында кейбір изоляторлар адамдардардың тыныс алу жолдарында жоғары аллергиялық аурулар тудырады, мысалы, t.viride. Триходерманың кейбір өкілдері,әсіресе T. viride, T. koningii,
T. longibrachiatum перитониттің қоздырғыштары болып табылады. Олар гематологиялық қатерлі ісігі бар немесе трансплантация кезінде перитониттермен және иммундық сезімтал пациенттердің инфекцияларымен ассоциацияланған ұзақ амбулаториялық перитониялық диализге қатысатын органдар. T. longibrachiatum - бұл жұқпалы ауру үдерісінің негізгі қатысушысы болып табылады. Лейкемиямен ауыратын науқаста T. viride туындаған, ол өлімге әкелетін өкпе инфекциясы екендігі дәлелденген. Бұл штамм жіті миелоидты лейкемия химиотерапиясын бастан өткерген 54 жастағы пациенттің ағзасынан бөлінген. Дене үшін ингибиторлық минималды концентрация келесідей болды: амфотерицин (0,25 Ag мл) және вориконазол (2 Ag мл). Триходерма тұқымына кіретін саңырауқұлақтар үлкен қауіп тудырады. Қазіргі заманғы қалалар бұл топырақ пен атмосфераның физика-химиялық қасиеттерімен, жануарлар, өсімдіктер, микроорганизмдер қауымдастықтарымен, техногендік материалдардан көптеген құрылымдардың болуы және аймақтық биогеоценоздардан қоршаған ортаның жоғары ластануымен ерекшеленетін арнайы экожүйелер. Қалаларда, әдетте, жылы климаттық жағдайлар жасалады, атмосфералық ауа көміртек ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
КІРІСПЕ
3
1.
Trichoderma жүйесінің дамуы және морфологиялық
сипаттамасы
5
1.1
Trichoderma метаболиттері
14
1.2
Trichoderma целлюлазды кешенінің сипаттамасы
16
ЗЕРТТЕУ ОБЬЕКТІЛЕРІ МЕН ӘДІСТЕРІ
2.
Фитопатогенді микроорганизмдерді биобақылау агенттері
ретінде Trichoderma түрлері
20
2.1
Trichoderma саңырауқұлақтардың зең қоздырғышы ретінде
22
2.2
Trichoderma тектес саңырауқұлақтардың адамға әсері
23
2.3
Өсімдіктермен өзара әрекеттесу
26
2.4
Trichoderma ферментативті белсенділігін анықтау
27
2.5
Trichoderma тектес саңырауқұлақтардың липолитикалық
әсері
29
НӘТИЖЕЛЕР ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ
3
Trichoderma өнеркәсіптік қолдану
36
Trichoderma ферменттерін өнеркәсіптік қолдану. Trichoderma
целлюлизін қолдану
36
3.1
Тоқыма және тамақ өнеркәсібінде Trichoderma ферменттерін қолдану
37
3.2
Trichoderma негізінде биофунгицидтерді өндіру және
қолдану
40
3.3
Зерттеу объектісі мен әдістері және нәтижелер мен
талқылаулар
42
ҚОРЫТЫНДЫ
48
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР
49
КІРІСПЕ
Қазіргі уақытта ең көп зерттелетін саңырауқұлақтардың бірі Trichoderma. Trichoderma-бұл генетикалық банкте, кем дегенде, бір генмен ұсынылған және көптеген түрлері екі немесе одан да көп гендердің тізбектілігімен ұсынылған жалғыз түрі. Бұл қызығушылықтың себебі - үлкен практикалық және экологиялық тектестің маңыздылығы. Триходерма түрлері
- бұл целлюлоза, хитиназалар, пектиназалар, ксиланаздар, серинге тәуелді протеиназалар және т.б. целлюлоза, қағаз және тамақ өнеркәсібінде, жуғыш заттарды өндіруде, алкоголь өндірісінде және целлюлозасы бар қалдықтарды глюкозаға айналдыруда қолданылады, жемшөп қоспалары және тоқыма өнеркәсібі.Осындай антибиотиктер, токсиндер және саңырауқұлақтар ферменттерінің негізінде ауруларды биологиялық бақылауға және өсімдіктердің өсуін ынталандыруға, трансгенді өсімдіктерді өсіруге арналған препараттар алынады. Триходерма сонымен қатар топырақты биологиялық тазарту және қалдықтарды компосттау үшін қолданылады. Trichoderma spp- тің басқа да қасиеттері белгілі. Осылайша, триходерманың өнеркәсіпте өсетін саңырауқұлақтарға әсер ететіні және құрылыс құрылыстарына зиян келтіретіні анықталды. Олар иммунитеті төмен адамдарда аллергия мен терең микоздар тудыруы мүмкін.
Зерттеу тақырыбының өзектілігі:
Trichoderma түрлерін зерттеу адам қызметінде оларды пайдалануға байланысты үлкен практикалық және теориялық қызығушылық тудырады. Бұл саңырауқұлақтарды кеңінен қолдану олардың экологиялық ерекшеліктерін, түрлік әртүрлілігін, биотопиялық таралуын, бәсекелестік өзара қарым-қатынастарын және географиялық таралуын егжей-тегжейлі зерттеуді талап етеді. Бұл тектес саңырауқұлақтар табиғатта кең таралған және көптеген субстраттарда кездеседі, бірақ көбінесе топырақта және өлі ағашта. Олар микроорганизмдер қоғамдастығында маңызды рөл атқарады және адам қызметінің көптеген салаларында қолданылады. Бұл түрлердің түрлері целлюлозолитикалық және басқа да кейбір ферменттерді алу үшін, өсімдіктер ауруларын биологиялық бақылау және топырақты биологиялық тазарту үшін пайдаланылады.
Trichoderma тектес микромицеттер целлюлоза ферментінің белсенді продуценті болып табылады және өсімдіктердің жасушалық қабырғаларының терең деструкциясына қабілетті, сондай-ақ жекелеген қиын ыдырайтын өсімдік полисахаридтері: целлюлоза, гемицеллюлоза, пектин мономерлік қалыптарға дейін. Қазіргі уақытта лигнин биодеградациясындағы осы ферменттердің үлкен рөліне байланысты микромицет фенолоксидазалары белсенді зерттеледі.
Зерттеу мақсаты: Trichoderma микроскопиялық саңырауқұлағының целлюлозолитикалық қасиеттерін анықтап зерттеу
Негізгі міндеттері: Trichoderma саңырауқұлағының қоректік ортасын өсіру;
Trichoderma саңырауқұлағының Ph температурасының аэрация әсерін зерттеу;
Trichoderma ферментативті белсенділігін анықтау.
Ғылыми жаңашылдығы және практикалық маңыздылығы Trichoderma resei мицелиалды саңырауқұлақтарын зерттеу Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия Ұлттық университетінің Микробиология және биотехнология кафедрасында жүргізілді.
Саңырауқұлақтың дақылдарын Петри ыдысында келесі құрамы бар картоп-глюкозалы агарда, картоп сорпасы - 200гл,агар - 2, стрептомицин - 1 өсірді. Саңырауқұлақ дақылдарын қоректік ортаға инокулирлеу Петри тостағандарынан Петри ілгіш жүргізді.Саңырауқұлақты өсіру үшін гуминді заттарды бөлгеннен кейін целлолигнин шымтезек қолданылды, олар сілтілі экстракция әдісімен NaOH ерітіндісімен (гидромодуль 1:100) 60 мин ішінде алынды.Сығынды центрифугалау арқылы бөліп, қалған целлолигнин шымтезек тазартылған сумен жуады.
1 Trichoderma жүйесінің дамуы және морфологиялық сипаттамасы
Микота патшалығы өкілдерін зерттеудің қазіргі кезеңінде Триходерма тектілігі геномика 1 және протеомика2 тұрғысынан қарастырылады. Жалпы мағынада геномика жүйелі тәсіл арқылы тірі организмдер туралы ақпарат алу және оны кең көлемде қолдануға болатын ғылым деп анықталған. Он жыл бұрын геномика гендердің сандық зерттеулерін, реттеуіш және кодталмайтын сиквенс пен геномдарды талдауды қамтиды. Қазіргі уақытта геномика геномдарды карталаудан және секвенирлеуден геном функциясына көшуге ұшырайды. Бұл байланысты көрсету үшін геномды талдау қазір құрылымдық динамикаға (гендер туралы ақпаратты жинақтау және талдау) және
функционалдық геномикаға (гендер қызметі туралы ақпаратты жинақтау және талдау) бөлінеді. Функционалды геномиканың мақсаты - көптеген гендер туралы мүмкіндігінше тез және тез ақпарат алу.Геномдық ақпарат биотехнология үшін қызықты жаңа гендерді табу үшін әсіресе маңызды.Нақты таксономиялық топтарды анықтау Триходерма штамдарын анықтаудағы негізгі фактор болып табылады. Бұл осы тұқымның генетикалық әртүрлілігіне негізделген жаңа технологияларды дамытуға мүмкіндік береді. Алайда, Trichoderma тұқымдасының көп компонентті және күрделі болуы түрдің биологиясын түсінуді қиындатады және коммерциялық мақсатта қолдануға әсер етеді [1]. Жоғарыда айтылғандай, Триходерма тұқымының саңырауқұлақтары қазіргі уақытта ең көп зерттелген саңырауқұлақтардың бірі болып табылады. Сондықтан Триходерма тұқымының молекулярлық таксономиясы басқа саңырауқұлақтар ұрпағының таксономиясына қарағанда көп зерттелген (1-2 кесте). Audik және Claverie жағдайларды, даму кезеңдерін, ағзалардың ерекшелігін немесе ұлпалардың ерекшелігін ескере отырып, cDNA популяцияларында кездейсоқ таңдау арқылы гендік экспрессияны зерттеу үшін
сандық геномика терминін қолданған алғашқы зерттеушілер болды. компьютерлік мәліметтер базасы. Жалпы мағынада, сандық геномика терминін тәуелсіз классикалық арнайы эксперименттер нәтижесінде мәліметтер базасында жиналған тізбектіліктер арасындағы мәліметтердің үлгісі ретінде түсіну керек.
Кесте 1
Әртүрлі саңырауқұлақтар үшін орнатылған ITS сиквенс саны
Организм Тектілік саны
Сиквенс саны
Саңырауқұлақтар
42402
Fusarium
1714
Aspergillus
1260
Trichoderma
1016
Neurospora
580
Colletotrichum
527
Кесте 2
2002 жылғы желтоқсанға дейін деректер базасында қол жетімді Trichoderma сиквенсінің жалпы саны
Сиквенс
типтері
Әдістері
Сиквенс сандары
Қолжетімділік
EST
(Genencor)
Жоғары
өнімділік
11050
Жартылай
EST
(NewBioTechnic)
Жоғары
өнімділік
1300*
-
EST (USP)a
Жоғары
өнімділік
1200*
+
ITS
Классикалық
1016
+
Патент
Классикалық
99
+
Гидролаздар
Классикалық
148
+
Басқалар
Классикалық
56
+
Trichoderma сандық геномикасының компьютерлік деректерін талдау:
а) Триходерма тектес саңырауқұлақтар белсенді қолданылады және белсенді зерттеу объектісі болып табылады. Триходермамен салыстырғанда PubMed-те тек кейбір саңырауқұлақтар жиі айтылады. Fungal International Initiative (PFI) ұсынылған 15 саңырауқұлақтардың тек 9 түрі t.reesei және T. harzianum қарағанда әдебиетте жиі кездеседі. Геномика саласындағы жұмыстардың үлкен санына қарамастан, компьютерлік деректер базасында "сиквенс"саны шектеулі. Trichoderma бойынша көптеген жұмыстар коммерциялық пайдалануға немесе физиологияға және биохимияға арналған;
б) жұмыста ұсынылған ДНҚ тізбектерін талдау Trichoderma текті таксономиялық зерттеу ғылымның белсенді саласы болып табылатынын көрсетті. 1319 триходерма қатарынан 1016 рет ішкі транскрипцияланған ITS тізбегіне жататыны көрсетілді. 2006 жылға қарай GenBank-та 70 000-нан астам қайталанбас триходерма тізбегі ұсынылуы мүмкін. Trichoderma тегінің таксономиясын зерттеу қазіргі кезеңде геномика мен протеомикамен қатар, осы саңырауқұлақтардың полимерлерді гидролиздеу қабілетіне байланысты. 1994 жылы геном тұжырымдамасының лингвистикалық баламасы ретінде пайда болған протеомика термині жасуша өмірінде геномдар қызметінде көрінетін және өзгертілетін ақуыздардың толық жиынтығын сипаттау үшін қолданылады. Бұл термин сонымен бірге белгілі бір уақытта жасушада пайда болған ақуыздар жиынтығын сипаттау үшін әмбебап мағынада қолданылады. Вайнштейн (1998) протеомика (ақуызды білдіру), транскриптомика (РНҚ және ген экспрессиясы) және метаболизм (метаболиттер мен метаболикалық желілер) сияқты ғылыми бағыттарды білдіретін омика терминін ұсынды. Гендік өнімдер мен реттеуіш сиквенстердің кешенді өзара іс-қимылын белгілеу үшін эксперименттік тәсілдер шешуші фактор болып табылады. Протеомика протеоманы зерттеуді, ақуыздарды бөлудің кеңейтілген технологиясын қолдана отырып, оларды анықтау, ұялы процестердің интегралды көрінісін қалыптастыру үшін, мысалы, өрнек деңгейлері, постлотрациялық модификация, ақуыздардың өзара әрекеттесуін қамтиды. Протеомика жасушалық ақуыздардың жіктелуі мен сипаттамасын қамтиды, әртүрлі физиологиялық жағдайларда экспрессия вариациясын және ақуыздардың өзара әрекеттесуін зерттейді, түрлі метаболикалық процестерде ақуыздардың қызметін анықтайды [2]. Осылайша, протеомика барлық биологиялық процестерді түсіну үшін іргелі білім береді. Протеомикалық технологияны қолдану ұлғайды, өйткені генетикалық өзгерістер мен қоршаған орта жағдайларының әсерін екі өлшемді ақуыз электрофорезі арқылы алынған гельдерге байқауға болады. Тазартылған ақуыздарды пептидтердің жаппай саусақ ізі арқылы немесе электро-спрей, масс-спектрометрия немесе Эрдман микроскигі арқылы бөлуге және тексеруге болады.
Кесте 3
Гидролитикалық ферменттер, мәліметтер базасындағы олардың гендері
Полимер
Ген фермент
N*
1
2
3
Хитин
Chit42 (эндохитиназа)
64
Chit33 (эндохитиназа)
2
Nag1 (хитобиозидаза)
2
Nag2 (хитобиозидаза)
2
Exc1 (экзохитиназа)
1
Exc2 (экзохитиназа)
1
Ech2
2
Ech3
2
Ech3B
2
Cht1
3
Cht2
2
Chit33 (эндохитиназа)
2
Chit36Y
2
Chit-VIRI
1
Chit-P
1
Chit-HAM
1
Chit-HAR2
1
Chit-HAR3
1
Chit-G2
1
Глюкан
Bgn1 (эндо-β-1,3-глюканаза)
1
Bgn2 (эндо-β-1,3-глюканаза)
1
Bgn3 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
Gluc78 (экзо-β-1,3-глюканаза)
2
B16-1 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
B16-2 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
B16-3 (эндо-β-1,6-глюканаза)
2
3-ші кестенің жалғасы
1
2
3
Целлюлоза
Cbh1 (β-1,4-глюкан-целлобиогидролаза)
7
Cbh2 (β-1,4-глюкан-целлобиогидролаза)
6
Cel2A (β-1,4-эндоглюканаза)
2
EglI (β-1,4-эндоглюканаза)
1
EglII (β-1,4-эндоглюканаза)
1
EglIII (β-1,4-эндоглюканаза)
1
EglIV (β-1,4-эндоглюканаза)
1
Мутан
β-1,3-глюканаза
3
Ксилан
Xyl1 (β-ксиланаза)
2
Xyn2 (β-ксиланаза)
2
Xyn3 (β-ксиланаза)
1
Эндо-β-1,4-ксиланаза)
1
β-глюкуронидаза
1
β-L-арабинофуранозидаза
1
Trichoderma литикалық және антагонистік белсенділігі жасушадан тыс гидролазаларды, оның ішінде эндохитиназа, β-n-ацетилгексоаминидаз, протеаздар, хитин-1,4-β-хитобиозидазалар, эндо - және экзо-β-1,3-глюканаза, липаза, ксиланаза, маннаназа, пектиназа, пектинлиаза, амилаза, фосфолипаза, РНК, ДНҚ және т.б. кодталатын бірнеше гендермен қамтамасыз етіледі. Триходерма гендерінің қалған тізбегін мәліметтер базасында ұсынылған белгілі бірізділік негізінде функционалды топтарға бөлуге болады (1-сурет).
Сурет 1 - Геномдық зерттеулер институты (Роквилл, АҚШ) жасаған жіктеуге сәйкес мәліметтер базасында қол жетімді триходерма тізбегінің функционалдығы
Параметрлердің критерийлеріне сәйкес келетін 2500 рет алынды (ең аз тізбектің ұзындығы - 150 нуклеотид). Барлық дәйектемелердің 1011 синглтон, ал 1483 тізбегі 315 кластерлерді құрады. Осылайша, t.harzianum жәнеT. atroviride гендерінің 1326 ішінара сиквенстері алынды. Кластерлер 2-ден 68 ретке дейін, оның ішінде 230 кластың әрқайсысында 2 немесе 4 рет, 51 кластерде 5-тен 8 ретке дейін, ал 15-ке 9-нан 9-ға дейін тізбектелген. BLAST бағдарламасын (Altschul соавт., 1990) пайдаланып, 80-ге тең, EST-тің жалпы саны, ұялы рөлі белгісіз функциясы бар тізбектегі гомология негізінде құрылуы мүмкін, 714 құрады [3]. Қалған реттіліктер (914) не жіктелмейді, не белгісіз функциясы бар тізімдерге гомолог болады немесе мәліметтер қорында көрсетілген көптеген ақуыздарға сәйкес келеді. Белгіленген функциясы бар белоктарды кодтайтын жүйелер NCBI мәліметтер базасындағы ақуыздарға гомологты түрде әр түрлі функционалды топтарға жіктелген (1.2- сурет)..Көптеген транскрипттер ақуыз мен РНҚ синтезіне қатысатын гендік өнімдер болды. Деректер базасында t. harzianum және T. atroviride экспрессияланатын гендерінің 1326 сиквенсі бар. Ең танымал транскрипт өмір сүру гендері тобына жатады.
Кесте 4
Ірі триходерма кластерлері және олардың жартылай қызметі
№
Кластер
Сиквенстер
саны
Деректер базасындағы
мәліметтермен ұқсастығы
1
2
3
4
1
QA
96
1-альфа ұзарту коэффициенті
2
PA
61
Гидрофобиннің ізашарыII (HFBII)
3
WA
34
40S рибосомальный белок S5
4
VA
32
Гипотетикалық консервіленген ақуыз
5
RA
31
Жоқ
6
TA
31
Жоқ
7
SA
29
Стресстік ақуыз DDR48
8
YA
25
Жоқ
9
CB
21
Вакуолярлы АТФаза
10
GB
17
Гистон Н3
11
XX
17
40S40S рибосомалық ақуыз 5S18
12
IF
17
Пептидил изомераза А цитозольді
13
ZA
16
Вакуолярлы АТФаза
14
BB
16
Гистон Н3
15
TE
15
60S рибосомалық ақуыз а4
Сурет 2 - Геномдық зерттеулер институтының (TIGR, Роквилл, АҚШ) классификациясына сәйкес Триходерманың биоконтролды штамдарының
тізбегінің функционалды мақсаты
Қазіргі уақытта геномдарды зерттеу бойынша 379 жоба белгілі. Оның ішінде 55 жоба орындалды, ал 324 жоба орындау кезеңінде. Тек 16 жоба (барлық санының 4%) саңырауқұлақтарға арналған. Аталған жобаларда саңырауқұлақтардың 12 түрі ұсынылған, олардың 7 түрі өсімдіктер мен адамның патогендері болып табылады. Саңырауқұлақ жобалары фитопатогендерге, адамның қоздырғыштары мен сапрофиттерге, триходерма саңырауқұлақтарының геномикасына және EST құруға (көрсетілген тізбекті), жүйелеуге және профильді сәйкестендіруге бағытталған. . Жобалардың бір бөлігін коммерциялық ұйымдар (Испаниядағы NewBioTechnic, АҚШ-тағы Genencor және Финляндиядағы VTT және т.б.) төледі, бұл алынған деректердің биотехнологиялық мәнін көрсетеді [4]. Қазіргі уақытта 30-дан астам жоба бойынша зерттеулер жүргізілуде. Міне, олардың кейбірі:
ДНҚ анализін қолдана отырып, белгілі бір қоршаған орта жағдайларында көрінетін промоторларды анықтау және клондау әдісі жасалды, мысалы глюкоза бар ортада өсу. Авторлар 5 белсенді промоутерлерге патент алды.
Шамберга әріптестерімен EST және microarray ДНҚ талдау көмегімен глюкозаны аэробтық және анаэробтық кәдеге жарату кезінде T. reesei метаболизмін зерттеді. Авторлар көп клеткалы ағзалар глюкозаны ашыту жолымен емес, тыныс алу жолымен кәдеге жаратады деген мәселені шешуге тырысты. S. cerevisiae ашытқыларынан айырмашылығы, саңырауқұлақтар анаэробты жағдайда энергия ала алмайды, бірақ олар аэробты жағдайда глюкозада өсу кезінде АТФ синтездейді. Авторлар T. reesei-де CTK және тыныс алу тізбегі ферменттерін кодтайтын гендердің көрінісі ПВК CTK-ға тотықтырылатын, бірақ ашыту арқылы этанолға айналмайтындай реттелгенін анықтады. Чилаппен бірге (Chellappan et al., 2001) Genencor компаниясымен ынтымақтастықта жаңа t.reesei гендік өнімдерін әзірлеу және алу үшін EST және BAC базасын құру мақсатында жобаны орындады. Жұмыстың нәтижесінде кДНҚ-ның екі кітапханасы құрылды, олардың біреуі целлюлиттік ферменттер өндірісін қоздыратын жағдайда өсетін жасушалардан алынған РНҚ-ға негізделген. Екінші кітапхана 18 түрлі жағдайда өсетін жасушалардан алынған РНҚ-ға негізделген.
T. virens Tv29-8 штаммының биоконтроллерін зерттеу үшін бактериалды жасанды хромосома кітапханасы құрылды, ол T. virusens белгілеген тізбектен 25 есеге асып түсті. Техас университетінің қызметкері Кеннерли жүргізген бұл жұмыс жоғары молекулалы ДНҚ фрагменттерін оқшаулауға, BAC кітапханасын құруға және 10-нан 170 кб-қа дейінгі кірістері бар 12 243 клонды шығаруға әкелді.
Функционалды геномика жобасы әртүрлі салаларда триходерма антагонистік штаммдарының гендік өнімдерін жасауға және қолдануға арналған.
Өнеркәсіп пен ауылшаруашылығына арналған триходерманың антагонистік түрлерінің функционалды геномикасы мен протеомикасы жөніндегі жоба. Жобаны NewBioTechnic (Испания) компаниясы және ЕО елдерінің академиялық топтары қолдады.
Топырақтың патогендік саңырауқұлақтарынан туындаған ауруларды биологиялық бақылау жобасы (Өсімдіктер зертханасы, АҚШ), 2002 - 2007 жж.
Триходерма және Гипокреа тұқымынан алынған бионтролларда қолданылатын саңырауқұлақтардың таксономиясы жобасы (жүйелі ботаника және микология лабораториясы; АҚШ), 2003-2008 жж.
Дәнді, көкөніс және басқа да дақылдардың (Russell Research Center Toxicology and Mycotoxin, USA) 2001-2006 уытты эндофитті саңырауқұлақтарын бақылау.
Биология, биологиялық бақылау және бидай мен арпа тамырлары ауруларын қоздырғыштардың молекулалық генетикасы (Root Disease and Biological Control Research, USA), 2003-2008.
Көңге негізделген органикалық тыңайтқыштарды қолдану бойынша зерттеулер (концерн және өндірістік зерттеулер зертханасы, Жаңартылатын энергия және көңді басқару жөніндегі зерттеулер, АҚШ), 2000 ж.
Биоконтрольдік саңырауқұлақтардың жүйесі Trichoderma және Hypocrea (Systematic Botany and Biology Laboratory; USA, China, France, Австрия), 2003. Stilbohypoxylon Muelleri - Hypocrea stilbohypoxyli және оның анаморфы Trichoderma koningii-ұқсас Пуэрто Рикодан жаңа түрді зерттеу бойынша нәтижелер алынды
Эволюция Trichoderma harzianum ризосферадан өсімдіктің тығын бөлігіне дейін өсуі.
Talaromyces flavus және Trichoderma viride антагонистік белсенділігі Хмелде (USA) Verticillium albo-atrum қарсы, 1999.Глюкозаны жоюға қабілетсіз Trichoderma Reesei Mutants мутантты штаммын алу (USA), 2001 - 2003.
Триходерма вирусидіндегі Fusarium Moliniforme-мен фуманизин B1 басылуы (жүйелі ботаника және микология зертханасы, АҚШ), 1999 ж.
Мақта тұқымын фитопатогенді саңырауқұлақтардан қорғау (Agricultural Research Service; USA), 2002.
Ботриттерден қорғау үшін құлпынай тамырларын триходермамен емдеу.
Гербицидтерді, метилбромиді тұқымдарды микробиологиялық бақылауға ауыстыру (Southern Weed Science Research; USA), 2000-2005.
Trichoderma және Hypocrea тұқымдарының биоконтролды саңырауқұлақтарының жүйеленуі (жүйелі ботаника және микология зертханасы, АҚШ), 2004 ж.Какао өсімдіктерін қорғауға арналған Trichoderma ovalisporum жаңа эндофитті түрлері зерттелуде (Ботаника және микология зертханасы; АҚШ), 2004 ж.
Жәндіктер мен арамшөптермен күресу үшін биологиялық бақылау құралдарын пайдалану, 2001.
Фитопатогенді бактерияларды, саңырауқұлақтарды және мақта нематодын бақылаудың биологиялық, генетикалық және интеграцияланған әдістері, 2002.
Қызыл таңқурай тамырының фитофтороз қоздырғыштарынан интеграцияланған қорғау әдісі ретінде топырақты соляризациялау (Horticultural Crops Research, USA), 2003.
Фунгицидтердің әсері, шай ағашы майы, теңіз балдырлары сығындылары және шірік қоздырғыштарға саңырауқұлақ агенттері және құлпынай өнімі (Үндістан), 2003.
Нигериядағы шампиньондар аурулары.
Жапырақ бетімен өзара әрекеттесуді зерттеу үшін T39 Trichoderma harzianum изоляторын (TRICHODEX) қолдану
Биоконтроль саңырауқұлақтарын іздеу (USA), 1998 - 2001.
Микробты компостинг (Австралия), 2000-2003 жж.
Триходерманың морфологиялық сипаттамасы
Гипокреа тұқымының мүшелері және оның триходерма анаморфі - барлық типтегі тропикалық ормандардың типтік өкілдері (Дружинина және басқалар, 2004). Бұл саңырауқұлақтар ашық түске байланысты оңай анықталады. Hypomyces (Fr.) (Hypocreaceae) тұқымдас түрлерінің көпшілігі өсірілетін және жеуге болатын саңырауқұлақтарға паразиттік етеді. Гипокрея және оныңанаморфты триходерма Pers. көбінесе ылғалды тропикалық және субтропикалық ормандарда ғана емес, сонымен қатар құрғақ қоңыржай және солтүстік аймақтарда, тіпті одан да шыңды жерлерде - алыс солтүстік пен төтенше оңтүстікте кездеседі [5]. Hypocrea телеоморфтарын ағаштан, Ascomycota мүшелерінің мицелиясынан, тірі базидиомицеттерден, ыдыраудың әртүрлі сатыларындағы жеуге болатын саңырауқұлақтардан, көбінесе шөпті субстраттардан кездестіруге болады. Кәдімгі гипокреа мыжылған, ашық түсті немесе боялмаған тығыз строматты құрайды, олардың диаметрі 5 мм-ден асады, дегенмен кейбір түрлер бірнеше сантиметрлік мөлшерде өзек тәрізді, овоидты құрайды. Hypocrea түрі әдетте жалған паренхимадан немесе тығыз гифтерден тұратын тығыз хош иіспен қоршалған перитецияларды қалыптастырумен сипатталады. Hypocrea түрлері дамудың ерте кезеңдерінде бір қабықта болатын бір тартумен 8 аскоспорды құрайды. Аскоспоралар түссіз немесе жасыл, ерте екі дөңгелек, жұмыртқа тәрізді, созылған немесе сына тәрізді аскоспораларға ыдырайды. Әдетте, триходерма түрлері топырақтан оқшауланған, бірақ олар көбінесе ағашқа, мәдени саңырауқұлақтардың қақпақтарына (шляпаларында) ,орман саңырауқұлақтарына шашырайды, мұнда оларды жасыл кондидиялар массасымен оңай анықтауға болады, олар жиі ақ және сары болып келеді. Олар әртүрлі мекендейтін жерлерде кездеседі. Мысалы, саңырауқұлақтарды ғимараттардың ылғалды қабырғаларында, эндофиттер сияқты, ылғалды тропикалық орманның ағаштарынан табуға болады. Trichoderma-топырақ саңырауқұлақтарының биомассасының маңызды бөлігін құрайды.
Trichoderma негізгі морфологиялық белгілері:
Колониялардың белгілері, олар әр түрлі болуы мүмкін және әр түрге тән болуы мүмкін (алайда колониялардың пайда болуын анықтау үшін қажетті дәлдікпен сипаттау өте қиын);
Әртүрлі температура кезінде әртүрлі ортадағы дақылдардың өсу қарқыны басқа сипаттамаларға ұқсас түрлерді ажырату кезінде маңызды болуы мүмкін;
Өсірілген конидиофордан немесе найзағайға немесе пустулаға топтастырылған конидиофордан конидиялардың пайда болуы түрлерде тән белгі болып табылады;
Диффузды пигментті, сондай-ақ, Trichoderma жағдайында мұндай пигменттердің түсі нашар өзгереді. Longibrachiatum секциясына қатысты штаммдар, әдетте, бірінші рет анықталғаннан кейін, елеулі жарқын жасыл-сары пигментке ие. Ақшыл жасыл реңктер көптеген түрлерге тән, бірақ ерекшеленбейді. Кейбір түрлер, керісінше, пигменттің толық болмауы арқылы сипатталады, ал қызыл реңктер бірнеше изоляторларда бақылауға болады;
Ортада қалыптасқан тән кристалдары тек Trichoderma aureoviride- байқалады ;
Көгерудің және иілудің нәзік иістері, әдетте, триходерманың әртүрлі штамдарына тән. Кокос иісіне ұқсайтын тән хош иістерді әдетте Trichoderma virideдінің штамдары, кейде Trichoderma atroviride шығарады;Тармақталу түрі және кластидтер мен пустулалардағы конидиофорлардың бірігуі триходерма штамдарын топтар мен түрлер топтары бойынша анықтаудың маңызды белгілері болып табылады;
көп жиналған пустула Pachybasium бөлімінен шыққан көптеген түрлерге тән, бірақ олар басқа топтардың көптеген штамдарында да кездеседі;
кондидиофордың тармақталуы дұрыс бұрмалануы немесе қате болуы мүмкін. Тарамдар кең және түзу немесе тиісінше тар және иілген;
Pachybasium тобынан шыққан кейбір түрлердің конидиофорының апекциясы стерильді процеспен аяқталуы мүмкін, ол келесі түрде болуы мүмкін: түзу, жинақталған және спиральды;
Конидиофорлық субтерминальды жасушалар Гамс (1971 ж.) Анықтағандай, Longibrachiatum бөлімінде триходермада жиі кездесетін афанофиалидтер арқылы қысқа, бүйірлік мойын арқылы конидия түзе алады;
Кондидияның пішіні әртүрлі болуы мүмкін - сферадан эллипске дейін. Триходерма овоидті немесе қысқа цилиндрлік конидиямен, базальды негізі бар, көп немесе аз конустық және қиылған түрінде табылды. Триходермада мүмкін болатын кондидия мөлшерінің өзгеруі аз, алайда туыстас түрлер көбінесе мөлшерінің айтарлықтай айырмашылығымен ажыратылуы мүмкін;
Оптикалық микроскопты қолданған зерттеулерге сәйкес, көптеген түрлердегі конидиалардың беті тегіс, алайда кейбір тегіс конидиялары бар сканерлеуші электронды микроскоппен (SEM) зерттегенде олардың әлсіз өрнектелгені анықталды. T. viride агрегаттарында, сондай-ақ T. Saturnisporum және T. ganense сияқты екі түрде де дөрекі және сулы конидиялардың нұсқалары бар. Конидия көпіршікті болуы мүмкін немесе сыртқы қабырғасының шығуы мүмкін;
Кондидияның пигментациясы да өзгермелі сипатқа ие - түссізден (көп жағдайда ақтан) әр түрлі жасыл түстерге аз сұр немесе қоңырға дейін. Кейбір түрлерде жетілген кондидиялар микроскоппен қаралғанда қара-жасыл түске ие болады.
Хламидоспоралар көптеген түрлерге тән, дегенмен барлық түрлері 10 күн бойы 20 ° C температурада, CMD-де хламидоспоралар түзілмейді. Көбінесе түрлердің көпшілігінде олар сфералық немесе эллипсоидты, термальды және интеркалар, тегіс қабырғалы, түссіз, сарғыш немесе жасыл, диаметрі 6-15 мкм.
stromaticum саңырауқұлақтарында типтік хламидоспоралардан басқа клеткалар ішінде сфералық хламидоспоралар пайда болады. T. virens түрі таза мәдениетте көптеген хламидоспораларды құрайтындығымен ерекшеленеді. Өсіп келе жатқан гипа белгілері аз ғана болады, олар идентификация үшін маңызды. Мысалы, T. stromaticum сияқты түрлердегі хламидоспоралар көп жасушалы болуы мүмкін;
Синанаморфтар әдетте типтік пустулдарды қалыптастыратын кейбір түрлерде қалыптасады. Синанаморфтар Verticillium түрі бар конидиофордың бір түрі бойынша анықталады, оның бұтақ түрі және конидиясы әрбір фиалида ұшында ашық жасыл түсті сұйықтық тамшысында болады. Кандидияның пайда болуына әр түрлі стресс әсер етеді. Мексикалық ғалымдар триходерманың atroviride конидиогенезі мицелийдің зақымдануымен жүретінін анықтады (Эрнандес-Онат, Эррера-Эстрелла, 2006). Басқа зерттеушілер Trichoderma тұқымдасының түрлерінің конидиялар түзілуіне қоршаған ортаның рН-нің әсерін зерттеді (Steyaert et al., 2006).
Trichoderma метаболиттері
In vivo және in vitro тәжірибелерінде Trichoderma метаболизмін зерттеу метаболиттердің тұтас спектрін анықтауға мүмкіндік берді: ферменттер, қышқылдар, өсу факторлары және т. б.
Trichoderma литикалық ферменттері
Триходерма шығаратын ферменттер құрамының күрделілігімен сипатталады. Жабайы штамдардың секрецияға қабілеттілігінің дәлелдері бар: эндохитиназалар, хитобиозидазалар, β-N-ацетилхосаминидазалар, N-ацетил-gal- галактозаминидазалар, β-1,3-глюкозалар, β-1,6-глюканазалар, протеазалар, ДНаздар, α- амилазалар, целлюлазалар, липазалар, маннаназалар, ксиланазалар, уреназдар, РНаздар, пектиназалар, пектин-лязалар, лаказалар, пероксидазалар және мутаназалар [6].
Trichoderma хитинолитикалық, целлюл олитикалық және глюканолитикалық ферменттер сияқты CWDE синтездеу қабілеті бірнеше жыл бұрын сипатталған (Soriente et al., 2006). Trichoderma штаммдарының көпшілігі әлеуетті өсімдіктер антагонист ретінде немесе целлюлолитиктер және гемицеллюлолитиктер ретінде ғылыми әдебиетте сипатталған. Хитиназалар мен глюканазалар жиі олардың саңырауқұлақтардың жасушалық қабырғасының деструкциясына қабілеттері тұрғысынан зерттелді, бірақ басқа энзимдер, протеаздар, липаздар және фосфатаза сияқты жасушалық қабырғаны азғыратын, сондай-ақ осы процеске тартылуы мүмкін. Триходерма түрлерінің көпшілігі сапротрофтар. Әдетте триходерма саңырауқұлақтары жапырақ қоқысы мен мультиді колонизациялайды. Сәтті таралуы үшін субстраттағы көміртектің 1% жеткілікті. Табиғи жағдайда олар көптеген полимерлі субстраттарды тұтынады, олардың арасында целлюлоза және гемицеллюлоза басым болып келеді. Целлюлоза тізбектері-бұл -1,4-гликозидті гомополимерлер, құрамында шамамен 8000-12000 глюкозалық бірліктер бар, олар іс жүзінде ерімейтін кристалдық құрылымды. Целлюлолитикалық ферменттердің үлкен әртүрлілігі культуралды ортаға тиімді құпия және синергиялық жоғары кристалды нативті целлюлозаны.
Гемицеллюлозаның басты ерекшелігі-оның гетерополисахаридті құрамы, ол ксилозамен немесе маннозамен түзілген және арабиноза мен галактоза, сірке және глюкурон қышқылдары сияқты орынбасарларының бүйір тізбектерінен тұратын басты тізбекке негізделген. Пектиндер әдетте әртүрлі тармақталған құрылымдардан тұрады. Глюкоза мен глюко-олигомерлердің пайда болуынаәкелетін целлюлозаның деградациясына қарағанда, гемицеллюлозаның деградациясы гемицеллюлозаның түріне байланысты әртүрлі моно- және дисахаридтердің жиналуына әкеледі. Глюкан, крахмал және ақуыз сияқты басқа полимерлер құрамында кейбір жағдайларда басым болатынына қарамастан қолда бар көміртектің аз ғана бөлігі бар.
Целлюлоза мен гемицеллюлозаның толық деградациясы өнеркәсіптік қызығушылық тудыратын жасушадан тыс ферменттердің көп мөлшерін қажет етеді (Меландер соавт., 2005). Зерттеулер үш өлшемді ақуыз құрылымының биохимиялық қасиеттерін және осы ферменттердің кодтау гендерін оқшаулау мүмкіндігін талап етеді.
Целлюлоза мен гемицеллюлозаның толық тозуы жасушадан тыс энзимдердің көп санын талап етеді, сондықтан өнеркәсіптік қызығушылық бар. Үш өлшемді белокты құрылымның биохимиялық қасиеттерін және осы ферменттердің кодтаушы гендерін бөлу мүмкіндігін зерттеу қажет.
Кесте 5
Гендер Целлюлаз Trichoderma
Целлюлаза
Штамм
Ген
Целлобиогидролаза I
T reesei
сbh1
Целлобиогидролаза II
T. reesei
cbh2
Эндо-β-l,4-Глюканаза I
T. reesei
egl1
T. longibrachiatum
egl1
Эндо-β-l,4-Глюканаза II
T. reesei
egl2
Эндо-β-l,4-Глюканаза III
T. reesei
egl3
Эндо-β-l,4-Глюканаза IV
T. reesei
egl4
Эндо-β-l,4-Глюканаза V
T. reesei
egl5
Глюкозидаза I
T. reesei
bgl1
Trichoderma целлюлазды кешенінің сипаттамасы
Барлық целлюлозалар 1,4 - гликозидті байланыстарға бірдей химиялық ерекшелігі бар, бірақ олар субстраттарға қатынасымен ерекшеленеді. Олар әдетте экзоглюканаза мен эндоглюканазға әсер ету механизмі бойынша бөлінеді. Полисахаридті тізбектің соңынан целлюлобиозды ажырататын
экзоглюканаза немесе целлюлобиогидр олаза (1,4-β-D-глюкан целлюлобиогидролаза, EC 3.2.1.91), әдетте кристалды целлюлозаға жоғары белсенділігі бар. T. reesei екі целлюлобиогидролазды синтездейді: СВН, оның редукциялаушы шеті бар целлюлозды тізбекті және СН II, жиі ұшырайтын целлюлозды тізбекті синтездейді (сурет. 3). Эндоглюканаза (EG) (l,4-β-D- глюкан-4-глюканогидролаза, EC 3.2.1.4) ортасында тізбектің үзілуін жүзеге асырады, осылайша целлюлобиогидролаз.
Эндоглюканазалар целлюлозаның аморфты бөліктерін көреді және целлюлозаға қарағанда, алмастыратын целлюлозаны гидролиздей алады, мысалы, карбоксиметилцеллюлоз және гидроксиметилцеллюлоз. Ақырында- глюкозидазасы целлюлобиозаны және басқа да еритін полисахаридтерді глюкозаға дейін ыдыратады, бұл маңызды қадам болып табылады, өйткені целлюлобиоза соңғы өнім және көптеген целлюлаздың тежегіші.
Гендік инженерия мен құрылымдық биологияның өзара әрекеттесуі қазіргі уақытта целлюлаздық белсенділіктің негізгі механизмдерін түсінудегі елеулі жетістіктердің негізінде жатыр. Ahmed et al., 2005.Амплифицирленген және тазартылған өнімдер SmaI puc18 плазмиды сайтына салынған.
Сурет 3 - Целлюлозаның ферменттік гидролизінің механизмі
Екі целлюлобиогидролаз (CBH) шынжырдың қарама − қарсы ұштарынан жоғары ретсіз кристалды аймақтарға (С), эндоглюканаза (EG) - реттелмеген ауданның ортасында шабуыл жасайды.
R-редукцияланатын ұшы, NR-редукцияланатын ұшы. Құрамында Еxg, egl және bgl гендері бар плазмидтер одан әрі сипаттау үшін E. coli-ге айналды. Ахмед және басқаларымен оқшауланған Trichoderma harzianum E-58-ден алынған целлюлазалардың (экзоглюканазалар (EC; 3.2.1.91), эндоглюканазалар (EC. 3.2.1.4), β-глюкозидазалар) ең жоғары белсенділігі (2005) 2.764, 14.4 және 0.629 болды IU mL-1, сәйкесінше. Саңырауқұлақтың көптеген гидролаздары-каталитикалық аймақ және көмір-байланыстырғыш модуль (СВМ). Бұл ферменттің белсенді орталығы шегіндегі ұзын амин қышқылдық кезектілік, оның конфигурациясы көмір - байланыстырушы белсенділікті қамтамасыз етеді. СИМ бұрын в целлюлоза байланыстырушы аймақ ретінде жіктелген. Алдыңғы зерттеулер каталитикалық домен эллипсоидты бас пішініне ие деп болжайды (3-сурет), ал байланыстырушы каталитикалық домен мен CBD (CBM) арасындағы ұзартылған конформацияны қабылдайды. Көптеген саңырауқұлақ пен бактериальды целлюлозалардың каталитикалық және целлюлозды байланыстырушы домендерінің құрылымдары сәтті анықталды .
Целлюлолитикалық ферменттерді оқшаулау және анықтау үшін иммунологиялық әдістер әлдеқашан кең қолданылған. Антиденелер, әсіресе моноклоналды заттар, целлюлазалардың бірнеше формаларын қалыптастырудағы постсессиондық протеолиздің рөлін зерттеуде өте пайдалы құрал болып табылады. Алайда, әсіресе доменге тән моноклоналды антиденелерді алу айтарлықтай қиындықтармен байланысты. Поликлональды антисерумнан бастап толық көлемді ферментке дейінгі целобиогидролаздың I Trichoderma reesei-нің каталитикалық емес бөлігі үшін антиденелерді дайындаудың қарапайым әдісін ұсынды [7].
Целлюлазалардың каталитикалық доменінің құрылымы
Полипептид αβ-құрылымға изомеразе (TIM) триозофосфаты сияқты салынады, бірақ сегіз β-тізбектің орнына жеті β-тізбекті қамтиды (сурет 4).
Сурет 4 - Molscript Kraulis (1991) бағдарламасының көмегімен алынған CBHI T. Reesei интактілі аймақ құрылымының схемасы. Туннельдің белсенді учаскесінің орналасқан жері Жұлдызшамен белгіленген. Линкерлік пептид екі функционалдық аймақтың физикалық байланысын бейнелеу үшін үлгілендірілген
Сурет 5 - T. reesei каталитикалық домендер туннельдерінің жалпы құрылымы мен белсенді учаскесінің сұлбасы
(А) және (В). Екінші құрылым қара-сұр түспен боялған, β-тізбектер көрсеткілермен, α - спираль - спиральдармен берілген. Екі ақуыз үшін туннельдердің белсенді сайттары көрсетілген, олардың гидрофильді беттерінің көлденең қимасы.
CBNII белсенді қуысы дисульфидті көпірлермен тұрақтандырылған екі беткейден құрылған туннельде локализацияланған. 20Ǻ туннель бүкіл каталитикалық доменнен өтеді және оның соңынан бір целлюлоза тізбегін орналастыруға қабілетті. 6-шы отбасының эндоглюканазаларында каталитикалық орталықтың белсенді аймағынан өтетін туннель болады. Бұл белсенді орталықтың ұқсас құрылымы бар эндоцеллюлазаны целлюлоза тізбегінің ортасында байланыстыруға мүмкіндік береді, ал экзоглюканазалар целлюлоза тізбегінің ұштарымен тек өзектеріндегі туннель тереңдігіне тең болады .
T. reesei CBHI каталитикалық доменінің кристалдық құрылымы ядросында ұзын туннель бар. T. reesei-ден алынған эндоглюканаза EGI экзок және эндоглюканазалар құрылымындағы негізгі айырмашылықты растайтын белсенді аймаққа ие.
Гликозилгидролаздың үшөлшемді құрылымдарын салыстырғанда, олардың белсенді аймақтарын Катализ механизміне немесе ферменттің кеңістіктік құрылымына қарамастан үш негізгі классқа бөлуге болады. Қалта немесе кратер түріндегі белсенді аймақ β-глюкозидаза, глюкоамилаза және β- амилаза сияқты ферменттерге тән, олар көмірдің соңынан моносахаридтерді гидролизациялайды. Белсенді орталықтың бұл түрі тізбектердің бірнеше қол жетімді ұштарын қамтитын нативті кристалды целлюлоза сияқты субстраттар үшін оңтайлы емес. Моносахарлар қалдықтарының көп санын байланыстыратын ұзын белсенді аймақ осы мақсаттар үшін оңтайлы болып табылады. Опциялардың бірі СВН және СВНІІ T. reesei және кейбірбактериялық целлобиогидролаз үшін жоғарыда көрсетілген туннельде жасырын белсенді аймақ болып табылады [8]. Басқа нұсқада белсенді аймақты қалыптастыратын қысқа ілмектер ферменттің бетінде ойпатты құрайды. Мұндай механизм α-амилаза, эндоцеллюлаза, ксиланаза.
2 Фитопатогенді микроорганизмдерді биобақылау агенттері ретінде Trichoderma түрлері
Trichoderma тектес саңырауқұлақтар тіршілік әрекетін бәсеңдетуге қабілетті фитопатогенді саңырауқұлақтар, сондықтан өсімдік ауруларын қоздырғыштарды бақылау үшін коммерциялық агенттер ретінде кеңінен қолданылады.
Фитопатогендерді қолдану санын биологиялық реттеу
Триходерма жанама түрде пайда болуы мүмкін: а) қоректік заттар мен кеңістік үшін бәсекелестік нәтижесінде; б) фитопатогендік споралардың (фунгистаз) өсуіне жол бермейтін метаболиттерді синтездейтін немесе қарсы тұра алатын BCA қабілетінің нәтижесінде; г) жасуша патогенін жою мүмкіндігі (антибиотик); д) ризосфераны өзгерту мүмкіндігі - қоздырғыштар өсіп кетпеуі үшін топырақты қышқылдандыру. Төменгі оттек топырағынан бөлінген
Trichoderma lignorum (түрдің ескірген атауы берілген, бәлкім, Trichoderma asperellum) аймағында Fusarium culmorum және F.avenaceum өсімдіктердің тамыр шірік қоздырғыштарына қатысты орташа фунгицидтік белсенділігі және бактерияға қарсы қасиеттердің тар спектрі бар. Орталық Сібірдің топырағынан Trichoderma asperellum сондай-ақ Fusarium spp өсімдіктерінің зақымдануын төмендетті.
Түрлердің көптігін биологиялық бақылау фитопатогендік микроорганизм мен BCA-ның тікелей өзара әрекеттесуінен де пайда болуы мүмкін, бұл микопаразитизмде де, физикалық байланыста болу және гидролитикалық ферменттер синтезі және ферменттермен синергетикалық әсер ететін токсинді қосылыстар мен антибиотиктердің әсерінен болуы мүмкін.
Фитопатогенді микроорганизмдермен Trichoderma өзара әрекеттесуінің теріс түрінің механизмі генетикалық деңгейде жеткіліксіз зерттелмеген. молекулалық-генетикалық деңгейде биобақылау механизмін сипаттау үшін экспрессияланатын гендердің деректер базасын құруға әрекет жасады. Бұл үшін Trichoderma harzianum үшін EST gag генінің бірізділігі зерттелді. Кднк анонимді клондарды ішінара секвенирлеу кеңінен қолданылады. Генді сәйкестендіру әдісімен. 3298 кездейсоқ клонның Trichoderma harzianum мицелиясынан бөлінген ДНК талдауының негізінде кДНК арнайы кітапханасы құрылды [12].
Реттілік секвенирленді және салыстыру
EST тізбектерімен. Белгілі гендермен 2174 клондарда гомология анықталды және EST-те танымал 451 клон бар. Олар көптеген ферменттерге, құрылымдық белоктарға және реттегіш факторларға гомологиялық екенін көрсетті. Мицелий гендерінің едәуір бөлігі биобақылау қасиеттерін көрсету үшін Trichoderma-да болуы тиіс фунгицидтердің микопаразитизмі мен синтезіне байланысты процестерге қатысты. Осылайша алынған нәтижелер T.harzianum мысалында Trichoderma мицелийіндегі гендер экспрессиясын зерттеу үшін EST талдауын табысты қолдануды ұсынады. Бұл биоконтроль ферментативті гидролиз ғана емес, бұрын болжанғандай, әр түрлі жасушалық процестердің нәтижесі болып табылады. Зерттеулер, кем дегенде, бір ферменттер кешені - хитиназ - фитопатогендермен Trichoderma теріс өзара әрекеттесуінде басты рөлдердің бірін атқаратынын растайды.
Микопаразитизм
Микопаразитизм-бір саңырауқұлақтың басқасына тікелей шабуыл. Бұл бірнеше кезеңдерді қамтитын күрделі процесс: хемотропизм, тану, шабуыл, иесінің торына ішінара ену және оны өлтіру. Trichoderma штамдары саңырауқұлақтардың көп мөлшерде паразиттеніп, оларды танып және оларда өсіп келе жатқан тікелей биобақылауды жүзеге асыра алады. Сезімталдық жасушалық қабырғаны бұзатын ферменттердің экспрессиясының жоғарылауымен байланысты, негізінен, хитиназ, глюканаз және протеаз. Trichoderma түрлі штаммдарының индукция механизмі әртүрлі. Саңырауқұлақтар экзохитиназа тұрақты төмен деңгейде құпия болып саналады. Хитиназа жасушалық тозған жағдайда саңырауқұлақтардың қабырғалары, олардың эндохитиназа индукциялайтын олигомерлер босатылады және шабуыл басталады.
Микопаразитизм кезеңдері
Хемотропизм. Позитивті химотропизм ұлғаюды білдіреді
химиялық ынталандыру 1981 жылы Chet және әріптестері триходерма саңырауқұлақтарын қашықтықта анықтайтындығын көрсетті. Микопаразиттік гипа ерекше жолмен тарала бастайды, ал бұтақтар саңырауқұлақтарға қарай өседі. Триходерманың химиялық градиенттің айқын өсуіне қарамастан, аминқышқылдары мен қанттан басқа өсуді тудыратын басқа заттар жоқ хабарлады. Осылайша, қоздырғыштардың әр хост саңырауқұлақтарына тән екендігі әлі анық емес. Химотропизм кейбір антагонистік артықшылықтар береді деп қабылданды. Алайда, химотропизм микопаразитизмнің маңызды сатысы болып саналмайды.
Тану. Trichoderma барлық эксперименттерде ерекше
саңырауқұлақтарға қатысты антагонизм. Тәжірибе нәтижелері екеуінің де молекулалық тануы антагонизм процесінің алдындағы маңызды кезеңді білдіретін идеяға әкелді. Мұндай тану физикалық (тигмотропизм) немесе химиялық (хемотропизм) болуы мүмкін. Хемотропизм - деп бұл жерде иесі мен паразит жасушаларының бетінде орналасқан комплементарлы молекулалар арасындағы гидрофобтық өзара әрекеттесуді білдіреді.
Лектиндер - бұл жасушаларды жабыстыратын және жасушадан тыс жасушалармен өзара әрекеттесуге қатысатын қантты байланыстыратын ақуыздар немесе гликопротеидтер. Көрсетілген Р.Солани гипофизінде O типті эритроциттерді ерекше байланыстыратын, бірақ А немесе В типті жасушаларды байланыстырмайтын лектиндер бар.Галактоза мен фукоза, бірақ басқа қанттар емес, агглютинацияны басады. Алынған нәтижелер R.solani лекторлары Trichoderma саңырауқұлақтарымен ерте өзара әрекеттесуге қатысады деп болжауға мүмкіндік берді, егер олардың жасушалық қабырғаларында фукоза және галактоза сияқты өзара әрекеттесу сайттары болса, осы лектиндерге тән. Trichoderma жасушалық қабырғалары шын мәнінде галактоза бар. Шамасы, R. solani гифіндегі лектиндер қабілетті.
Қойма саңырауқұлақтарының мицелийін бекіту және ендіру.
Танылғаннан кейін, триходерма гипалары қабылдаушы құрылымды және аппрессор тәрізді құрылымдарды құра отырып, қабылдаушы гипаға қосылады. Әрі қарай, паразиттік гипа негізгі гипааны қоршап алады. Амператор тәрізді құрылымдар негізгі клеткаға енеді, өйткені оларда глицерин сияқты жоғары мөлшерде осмотикалық ерітінділер болады. Мысалы, эксперименттерде in vivo- да қарсы дақыл әдісі бойынша,осы құбылысты көрсету гифтер суреттелген 3.1 және 7 суреттерінде көрсетілген микопаразиттер R. solani гипофиясын қоршайды. T. harzianum кондидиясы стерильді топырақта өніп, топырақта негізгі мицелияға қарай өсетін мицелий түзетіні анықталды. Саңырауқұлақтармен байланысқан кезде паразиттік гипа негізгі гифаны қоршап алып, типтік аппресория түзді. Топырақтағы паразиттік қатынастардың интенсивтілігі екі мәдениеттің қарама-қарсы сынағымен салыстырғанда төмен болды, мүмкін бұл Trichoderma өсуін қолдайтын топырақтағы қоректік заттардың төмен концентрациясына байланысты.
Сурет 7 - Микопаразитикалық өзара әрекеттесу. Гиф сканерлеу электронды
Микрофотография. Trichoderma, Rhizoctonia solani қоршаған. Хемотропизм( А), тану және бекіту (Б)
Trichoderma саңырауқұлақтардың зең қоздырғышы ретінде
1985 жылы Солтүстік Ирландия, Шотландия және Англияда шампиньондар өсіру бойынша фермаларда жасыл зең індеті кеңінен таралған, содан кейін Германияға жетті және кейіннен Еуропада. Канада фермаларының 50% - ы, жасыл зеңмен байланысты проблемалар 2000 жылға дейін сақталды. Компост жұғу кезеңінде базидиомицет өнімінің шығыны 15-тен 40% - ға дейін өсті. Кейбір аудандарда зейнетақы шығыны 100% - ға дейін өсті және фермерлер бизнестен айрылды. Қазіргі уақытта шығындар 5% құрайды. Түрлі балық өсіру шаруашылықтарында залалданған субстрат пайызы өзгерді
0-ден 85% - ға дейін. Тек Ирландияда ғана Trichoderma Th2 патогенді биотипінің жоғалуы 1986 жылы 1 млн.фунт құрады.
Trichoderma агрессивті биотиптері-өсірілетін саңырауқұлақтардың антагонистері-қоршаған ортадан жапырақтың шірік қоздырғыштары ретінде бөлініп алынған болатын. Trichoderma патогенді түрлері тежелді Agaricus өсіру үшін пайдаланылатын компост автохтонды бактериялардың тіршілік әрекеті патогендердің жаңа жағдайларға тез бейімделуіне ықпал етті.
Патогендік триходерманың түрлері ингибирленген
Agaricus өсіру үшін қолданылатын компосттың автохтонды бактерияларының өмірлік белсенділігі, бұл қоздырғыштардың жаңа жағдайларға тез бейімделуіне ықпал етті.
Триходерманың патогенді түрлерін анықтау
Инфекцияның алғашқы белгілері пайда болған кезде Рифай кілтін қолдану арқылы морфологиялық әдістердің көмегімен Trichoderma 7 түрі анықталды. Бөлінген түрлер 11 таксонға бөлінген, оның ішінде T.harzianum бар 4 биотип бар. Олардың үшеуі (Th1, Th2 Th3) Англия мен Ирландияда табылды. Бұрын Еуропадан шыққан Trichoderma harzianum және Америкадан Th4 биотиптері молекулалық әдістерді қолдана отырып Trichoderma aggressivum f ретінде анықталды. Еuropaeum және T. aggressivum f. agressivum, сәйкесінше. T. agressivum f-тің биологиялық формалары. agressivium және T. aggressivum f. Europaeum бір-бірінен және триходерманың басқа түрлерінен морфологиялық, мәдени және молекулалық сипаттамаларында ерекшеленді. Биотиптер Th1 және Th3 T. harzianum және T. atroviride болып анықталды. T. aggressivum f. aggressivum және T.aggressivum f. europaeum биологиялық нысандары морфологиялық, мәдени және молекулалық белгілері бойынша бір-бірінен және басқа Trichoderma түрлерінен ерекшеленді. Th1 және Th3 биотиптері T. harzianum және T. atroviride ретінде анықталды.
Th2 вируленттілігін анықтау үшін зертханалық және далалық зерттеулер.
In vitro тәжірибесі Th2 және басқа компосттан оқшауланған түрлердің вируленттілігін салыстыру үшін жүргізілді. Отарлау 5 балдық жүйенің көмегімен бағаланды. 1- деңгей өсудің шектеулі болғанын және инокулятта байқалғанын білдірді; 5 -деңгей компосттың толық өнуін білдірді. Нәтижелер Th2 ең вирустық таксон болып табылатынын көрсетті (Th4-пен салыстырғанда). Th2-ді отарлау деңгейі Th3 үшін 1,25 балл деңгейімен және Th1 және басқакомпост микроорганизмдерімен 1 балл деңгейімен салыстырғанда 3,56 балл құрады. Th2 колонизациясының деңгейі 27 ° C-қа дейін жоғарылап, 18 ° C немесе 22 ° C төмендеді. 30 ° C температурада, тіпті Th1 қауіпті бола бастады. Th2 тек автоклавта немесе микротолқынды компостта дамиды деп көрсетілген. Алайда, Себи (Seaby) Th2 дақылын, Agaricus жоқ компостта, тіпті егіс түйіршіктері болмаған кезде де дами алатынын анықтады [13].
2.2 Trichoderma тектес саңырауқұлақтардың адамға әсері
Триходерма түрлері иммунологиялық тұрғыдан патогенді деп танылады. Trichoderma тұқымының сапрофитті түрлері арасында кейбір изоляторлар адамдардардың тыныс алу жолдарында жоғары аллергиялық аурулар тудырады, мысалы, t.viride. Триходерманың кейбір өкілдері,әсіресе T. viride, T. koningii,
T. longibrachiatum перитониттің қоздырғыштары болып табылады. Олар гематологиялық қатерлі ісігі бар немесе трансплантация кезінде перитониттермен және иммундық сезімтал пациенттердің инфекцияларымен ассоциацияланған ұзақ амбулаториялық перитониялық диализге қатысатын органдар. T. longibrachiatum - бұл жұқпалы ауру үдерісінің негізгі қатысушысы болып табылады. Лейкемиямен ауыратын науқаста T. viride туындаған, ол өлімге әкелетін өкпе инфекциясы екендігі дәлелденген. Бұл штамм жіті миелоидты лейкемия химиотерапиясын бастан өткерген 54 жастағы пациенттің ағзасынан бөлінген. Дене үшін ингибиторлық минималды концентрация келесідей болды: амфотерицин (0,25 Ag мл) және вориконазол (2 Ag мл). Триходерма тұқымына кіретін саңырауқұлақтар үлкен қауіп тудырады. Қазіргі заманғы қалалар бұл топырақ пен атмосфераның физика-химиялық қасиеттерімен, жануарлар, өсімдіктер, микроорганизмдер қауымдастықтарымен, техногендік материалдардан көптеген құрылымдардың болуы және аймақтық биогеоценоздардан қоршаған ортаның жоғары ластануымен ерекшеленетін арнайы экожүйелер. Қалаларда, әдетте, жылы климаттық жағдайлар жасалады, атмосфералық ауа көміртек ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz