Таңқурай өсімдіктерін тамырландыру мен жылыжай жағдайына көшіру сатысы

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 17 бет
Таңдаулыға:

2. ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ӘДІСТЕРІ

2.1 Зерттеу нысандары
Зерттеу нысандары таңқурайдың "Геркулес", "Брянская Диво", "Полка", "Polana"сорттары мен"Форма 5" үлгісі.

2.2 Зерттеу әдістері
Таңқурайдың сорттары мен гибридтік үлгісі үшін in vitro микроклондық көбейту әдісі, криоконсервация әдісі.

2.2.1 Таңқурайдың экспланттарын in vitro енгізу үрдісі

Таңқурайдың зерттеліп отырған сорттары мен гибридтік үлгісін in vitro жағдайға енгізу мен микроклондық көбейту үшін зертханалық жағдайда олардың бүршіктерін қоректік ортаға енгізілді.
Белсенді түрде өсіп жатқан, меристемалық аймаққа ие өркендер сабынды ерітінді негізінде жуылады да, кейіннен дистилденген сумен шайылды. Осыдан соң түрлі концентрация мен уақыт экспозициясы бойынша ажыратылатын залалсыздандырушы ерітінділермен өңделді.
Таңқурай сорттары мен гибридтік үлгісін асертикалық таза культураға отырғызу үшін сапрофитті микрофлорадан арылу мақсатында олардың өркендерін Domestos залалсыздандырғышымен (1:1) 7 минут және 10 минут, 3% сутегі асқын тотығымен (Н2О2) 10 минут, сонымен бірге 0,1% сулема (HgCl2)ерітіндісімен 3 минут, 5 минут және 7 минут өңделді. Кейіннен таңқурай өркендері дистилденген стерильді сумен 3 рет шайылды да, арнайы пробиркалардағы қоректің ортаға енгізілді.
Таңқурайдың зерттеліп отырған сорттары мен гибридтік үлгісін in vitro енгізу мақсатында рН=5,7тең МС ортасының 3 нұсқасы зерттелінді. Сәйкесінше олардың құрамындағы заттардың мөлшері әр түрлі:
1. БАП - 0,02 мгл, индолил-3-май-қышқылы (ИМҚ) - 0,1 мгл, гиббереллин қышқылы (ГҚ) - 0,2 мгл, АҚ - 1 мгл, сахароза - 30 гл, темір хелаты - 5 мгл;
2. БАП - 0,5 мгл, индолил-3-май-қышқылы (ИМҚ) - 0,2 мгл, гиббереллин қышқылы (ГҚ) - 0,5 мгл,АҚ - 1 мгл, глюкоза - 20 гл, темір хелаты - 5 мгл;
3.БАП - 0,5 мгл, индолил-3-май-қышқылы (ИМҚ) - 0,1 мгл, гиббереллин қышқылы (ГҚ) - 0,2 мгл, тиамин (В1 витамині) - 0,1 мгл, АҚ - 1 мгл, сахароза - 30 гл, темір хелаты - 10 мгл.
Кейіннен 3-4 апта өткен соң 1-1,5 см ұзындығы сәйкес кесіліп алынған таңқурай өркендері МС қоректік ортасы болатын арнайы культуралдық банкілерге отырғызылды да, клонды микрокөбейтілді.
Көбіне өсімдіктерді клонды микрокөбейту барысында залалсыздандырылған өркендерде сапрофитті микрофлорадан басқа патогенді латентті микрофлора болуы мүмкін. Сондықтан мұндай қауіптін алдын-алу үшін оларды клонды көбейтпестен алдын рН=6,9 болатын арнайы Viss қоректік ортасында тексеріп анықтаған дұрыс. Құрамындағы компоненттерінің барлығы түгел, дайын қоректік ортаны алдымен колбаның жартысындай мөлшерде құйып, фольгамен орап, 0,8 атм. Қысымда 15-20 минуттай автоклавтайды. Кейіннен қоректік ортаныалдын ала залалсыздандырылған ламинарлы бокс астында пластикті Петри табақшаларына құйылып қойылады. Таңқурай өсімдіктерінің ұзындығы 5,0 мм тең базальді бөлігі кесілген соң, құрамында MgSO4*7H2O 0,15 гл, сахароза 10,0 гл, казеин гидролизаты 8,0 гл, ашытқы экстракті 4,0 гл, джелрайт 6,0 г, KH2PO4 2,0 гл, болатын Viss ортасына отырғызылады да 25 С температурада 2 аптада төңірегінде культивирленеді. Қоректік ортада латентті микрофлора байқалмағанда орта көзге бірден мөлдірлігімен түседі, ал егер аталған көрініс байқалмаса ортада патогенді микрофлораның бар екендігі сөзсіз және мұндай өсімдіктер бірден асептикалық өсімдіктер қатарынан шығарылады. Ал қоректік ортасы таза өсімдіктермен микроклондық көбейту жұмыстары жалғасады.

2.2.2 Таңқурайдың сорттары мен гибридтік үлгісін in vitro микроклондық көбейту
Қазіргі таңда өсімдіктерді in vitro клонды микрокөбейту әдісі жемісті культуралардың сау егін материалын жылдам уақыт аралығында өндіру жүйесінде кеңінен қолданылу мүмкіншілігіне ие болды. Сәйкесінше аталмыш әдісте әр өсімдіктің түрі мен тұқымдасына сай арнайы қоректік орталар пайдаланылады.
In vitro клонды микрокөбейту әдісі көмегімен өсімдіктердің санын арттырып, көбейтуде көбіне Мурасиге және Скуг қоректік ортасы пайдаланылады. Сондай-ақ in vitro экспланттарды культивирлеуге қажетті оңтайлы ортаның қалыптасуы үшін зерттеу жұмыстары негізінде таңдалынып алынған қоректік ортаның құрамындағы цитокиндер мен ауксиндер мөлшерінің қатынасы өте маңызды. Зерттелген цитокиндердің (зеатин, кинетин және БАП) ішінде өсімдіктің клонды микрокөбею деңгейін 7,2 дейін арттыратын БАП өз тиімділігін көрсететіндігі белгілі. Көбіне қоректік орта құрамындағы в-индолил май қышқылын 0,05-0,10 мгл төңірегінде 0,5 мгл 6-БАП-пен бірге пайдалану таңқурай өсімдігінің микроөркендерінің регенерациялану қабілетіне оң әсерін береді. Е.В. Колбанованың айтуынша аталған сатыда МС қоректік ортасына 3 гл сахароза мен 0,5 мгл 6-БАП-ты қолдану өсімдіктердің микрокөбею деңгейін арттырады.
Сонымен қоса қоректік ортаның зерттеліп отырған өсімдік үшін оңтайлылығының дәлелі аталмыш өсімдіктің сол ортадағы көбею коэффицентінің мәні болып саналады.
Басқаша айтсақ, көбею коэффиценті дегеніміз пайда болған адвентивті өркендеріміздің толық сандық көрсеткішін қоректік ортаға енгізілген микроөркендердің сандық көрсеткішіне қатынасымен анықталынады.
In vitro таңқурай сорттары мен гибридтік үлгісін микроклондық көбейту мақсатында МС қоректік ортасының құрамындағы реттегіштер, макротұздар және темір хелатын оңтайландыру үшін олардың түрлі концентрацияларының қатынасында қоректік орталар жасалынды. Агары бар МС қоректік ортасының 5 нұсқасына зерттеу жұмыстары өткізілді:
1. ИМҚ - 0,1 мгл, АҚ - 1 мгл, БАП - 0,1 мгл, ГҚ - 0,02 мгл, В1 витамині - 0,5 мгл, глюкоза - 30 гл;
2. ИМҚ - 0,1 мгл, БАП - 0,5 мгл, В1 витамині - 0,1 мгл, сахароза - 30 гл;
3. ИМҚ - 0,1 мгл, АҚ - 2 мгл, БАП - 0,5 мгл, ГҚ - 0,1 мгл, В1 витамині - 10 мгл, сахароза - 30 гл;
4. ИМҚ - 0,2 мгл, АҚ - 1 мгл, БАП - 0,1 мгл, ГҚ - 0,01 мгл, В1 витамині - 0,5 мг, глюкоза - 30 гл,;
5. ИМҚ - 0,1 мгл, АҚ - 1 мгл, БАП - 0,3 мгл, В1 витамині - 0,01 мгл, сахароза - 30 гл;

2.2.3 Өсімдіктерден апикальды меристемалар оқшаулау
Апикалды меристемаларды бөлу үшін 4 апта культивирленген өсімдіктер алынады. Олардың 3-4 жапырақ пен апикалды меристемадан құрылған 0,9-1,0 мм өркендерінің апекстерінен аталған апикалды меристема бөлініп алынды. Апикалды меристеманы қандай да бір зақымдалусыз бөлу күрделі жұмыс болғандықтан, оларды бірнеше жапырағымен бірге бөлінді.
Аталған процесс ламинарлы бокс астында бинокулярлы микроскоп көмегімен жүргізіледі. Апикалды меристемалар құрғап кетпеу мақсатында алдын-ала залалсыздандырылған және дистилденген су көмегімен ылғалды күйдегі қағаздың бетінде бөлінді. Кейіннен Мурасиге және Скуг ортасына отырғызылды.

2.2.4 Таңқурай өсімдіктерін тамырландыру мен жылыжай жағдайына көшіру сатысы
Тамырлану процесі. Тамырландыру - клонды микрокөбейту әдісіндегі күрделі саты болып саналады. Бұл сатыда қоректік ортаның құрамын біршама өзгерту қажет, яғни ортадағы цитокиндер мөлшері жоғарылап, ауксиндер мөлшері керісінше азаяды. Алайда ортадағы ауксиндер мөлшерінің оңтайлы болуы маңызды. Себебі ауксиндердің өсімдікке ұзақ уақыт әсер етуі мен мөлшерінің жоғары болуы олардың тез қартаю көрсеткіштеріне байланысты. Мысалы өркендердің тамырлануға бейімдеушілік деңгейі, қолданылатын ауксиннің түрі, сонымен бірге фитогормондардың өзара қатынасы.
Таңқурай өсімдіктеріндегі тамырландыру процесін жүзеге асыру үшін құрамындағы қосылыстары өзара мөлшері бойынша әр түрлі болатын МС қоректік ортасының 3 түрлі нұсқасына зерттеу жұмыстары өткізілді:
1. АҚ - 0,5 мгл, В1 витамині - 0,05 мгл, сахароза - 15 гл, ИМҚ - 0,5 мгл, ГҚ - 0,3 мгл;
2. (12) МС : АҚ - 0,2 мгл, сахароза - 15 гл, ИМҚ - 0,20 мгл, ГҚ - 0,1 мгл,;
3. АҚ - 0,4 мгл, В1 витамині - 0,01 мгл, сахароза - 15 гл, глицин - 2 мгл ГҚ - 0,1 мгл.
Тамырлануға арналған МС ортасына отырғызылған өсімдіктер 22С-24°С температурада жарық бөлмеде өсіріледі.
Таңқурай сорттары мен гибридтік үлгісін топыраққа ауыстыру.In vitroжағдайында микрокөбейтілген таңқурай өсімдіктері тамырлануға арналған МС ортасында жақсы тамырланғандары таңдалынып алынып, содан соң 2-3 аптадан кейін in vіtro жағдайдан in vivo жағдайға ауысады. Өсімдіктерді топырақты контейнерге көшірмей тұрып калий перманганатының (K4MnO4) әлсіз ерітіндісіне (1мгл) батырады да, оларды залалсыздандырады.
Зерттеу жұмыстары үшін топырақты субстраттың 3 түрлі нұсқасы зерттелінді:
40% қара топырақ, 50% торф, 10% перлит;
80% қара топырақ, 20% торф;
50% қара топырақ пен 50% құм.

3. ЗЕРТТЕУ НӘТИЖEЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ

3.1 Таңқурайдың сорттары мен үлгісін in vitro жағдайына енгізу мен патогенді инфекцияға тексеру

Таңқурай өсімдігінің апикалды өркендерін залалсыздандыру жұмысы негізінде аталған таңқурай өсімдіктеріндегі сапрофитті инфекциялы микрофлораның дамуын тежеуде оңтайлы залалсыздандырғыш агент ретінде 5 минут бойы 0,1% HgCl2 ерітіндісімен өңдеу таңдалынып алынды. Сулема ерітіндісімен өсімдікті 3 минут өңдеу кезінде олардағы сапрофитті микрофлораның жоғалу дәрежесі төмен болса, ал оларды 7 минут өңдеу барысында өсімдіктердің регенерациялану деңгейі төмендеп, жапырақтардың бояулары өзінің қанық жасыл түсін жоғалта бастады.
Оңтайлы болып таңдалған сулема ерітіндісімен 5 минут өңдеу кезінде болса зерттелініп отырған таңқурай өсімдіктерінің жалпы регенерациялану көрсеткіші 95% немесе Брянская Диво сортында 95%, Полка сортында 96%, Геркулес сортында 93% , Полана сортында 94 %және F 5 үлгісінде 97% құрады (сурет 2). Ал басқа залалсыздандырғыштар өсімдіктің регенерациялық қабілетінің көрсеткішіне кері әсер етті. Мысалы, 3% сутегі асқын тотығымен (Н2О2) 10 минут өңдеудің нәтижесінде өсімдіктердің регенерациялану көрсеткіші 36,4% аспады.

Сурет 2 - Таңқурайдың зерттелген өсімдіктері өркендерінің кейінгі регенерациялануы

Өсімдіктерді in vitro енгізу кезінде қоректік ортаны құраушы заттар мен олардың мөлшері үлкен рөлге ие екендігі белгілі. Қоректік ортаның химиялық құрамы мен физикалық қасиеті клонды микрокөбейтудің әр сатысындағыдай өз рөлін дұрыс атқаруы тиіс. Қоректік орта құрамындағы антиоксиданттар гидролитикалық ферменттердің әсерін мен отырғызылған экспланттардың тіршілігінің тоқталуының алдын алады.
Белсенді көмірдің қоректік ортада болуы өркендердің өсуіне ықпал етеді. Ол экспланттан бөлінетін токсикалық заттарды адсорбциялайды. Сонымен бірге белсенді көмір ортадан биологиялық белсенді қосылыстарды адсорбциялау арқылы олардың мөлшерін азайтады. Сондықтан аталмыш қосылыс бар ортада фитогормондардың үлкен концентрациясы қажет. Біздер зерттеу жұмысының барысында таңқурай өсімдіктерін in vitro жағдайына енгізуде оңтайлы орта болып құрамында темір хелаты - 10 мгл, БАП - 0,5 мгл, ИМҚ - 0,1 мгл, ГҚ - 0,2 мгл, глицин - 2 мгл, В1 витамині - 0,1 мгл және сахароза - 30 гл бар МС қоректік ортасында екендігі белгілі болды. Ортадағы темір хелатының өсімдіктерге негізгі әсері олардағы регенерациялану деңгейін көтеруде болды. Жалпы зерттелініп отырған өсімдіктер үшін регенерациялану көрсеткіші 95% (кесте 2,3). Сонымен қоса регенерацияға ортадағы ИМҚ да әсер етті, ол өсімдіктердердің өміршеңдігін ұзартуға жауапты екендігі белгілі.

Кесте 2 - Таңқурайдың Полка, Полана мен Геркулес сорттарын in vitro енгізу негізінде қоректік ортаның әсер етуі

Полка
Полана
Геркулес
Қоректік орта нұсқалары мен фитогормондар
концентрациясы, мгл
Өркендер
Регенерация

Отырғы-зылды
Инфекция
Некроз
Дана
%
БАП - 0,02 мгл, ИМҚ - 0,1 мгл, ГҚ - 0,2 мгл, Fe хелаты - 5 мгл;
15
20
27
6
10
12
3
4
3
6
6
12
40
30
44
БАП - 0,5 мгл, ИМҚ - 0,2 мгл, ГҚ - 0,5 мгл, Fe хелаты - 5 мгл;

14
18
16
7
5
8
2
4
4
5
9
4
36
50
25
БАП - 0,5 мгл, ИМҚ - 0,1 мгл, ГҚ - 0,2 мгл, Fe хелаты - 10 мгл
20
23
24
1
1
2
-
-
-
19
22
22
95
96
92

Кесте 3 - Таңқурайдың Брянская Диво сорты мен Форма 5 үлгісін in vitro енгізу негізінде қоректік ортаның әсер етуі

Брянская Диво
Форма 5
Қоректік орта нұсқалары мен фитогормондар
концентрациясы, мгл
Өркендер
Регенерация

Отырғы-зылды
Инфекция
Некроз
Дана
%
БАП - 0,02 мгл, ИМҚ - 0,1 мгл, ГҚ - 0,2 мгл, Fe хелаты - 5 мгл;
15
16
7
5
3
5
5
6
33.3
37.5
БАП - 0,5 мгл, ИМҚ - 0,2 мгл, ГҚ - 0,5 мгл, Fe хелаты - 5 мгл;

14
14
5
4
4
3
5
7
35.7
50
БАП - 0,5 мгл, ИМҚ - 0,1 мгл, ГҚ - 0,2 мгл Fe хелаты - 10 мгл
17
19
1
1
-
-
16
18
94.1
94.7

Дегенмен, зерттеу жұмысының нәтижесінде ортада 0,5 мгл БАП пен 0,2 мгл ГҚ болуы таңқурай микроөркендерінің регенерациясы үшін тиімді болып танылды. Әдетте ортада цитокиндер болмаса микроөркендердің даму көрсеткіші төмен болады. Қоректік орта құрамындағы антиоксиданттардың болуы өсімдіктердегі морфогенез процесінің бүзылуының алдын алады. Себебі ортадағы фенолды қосылыстар тотыққанда аталмыш процесс орын алады, ал антиоксиданттар олардың ортадағы мөлшерін төмендетуге тырысады. Сәйкесінше қоректік ортада көзге бірден көрінетін қараю процесі жүрмейді.
Соның нәтижесінде таңқурайдың Брянская Диво, Полка, Полана сорттарында бактериялық микрофлораға ұшырау белгілері көрінсе, ал Геркулес сорты мен F 5 үлгісінде патогенді микрофлора байқалмады (кесте 4).

Кесте 4 ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.