Жасанды ұрықтандыру тәжірибесінің техникалық жабдықталуымен танысу. In vivo және in vitro-да эмбриондарды өсіру әдістері

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 5 бет
Таңдаулыға:

Зертханалық жұмыс № 12

Сабақ тақырыбы: Жасанды ұрықтандыру тәжірибесінің техникалық жабдықталуымен танысу. In vivo және in vitro-да эмбриондарды өсіру әдістері

Сабақ мақсаты. Іn vitro жағдайында гаметаларды культивирлеу әдістерімен танысу.

Зертханалық жұмыстардың техникалық қамтамасыздандыруы және қолданылатын құрал-жабдықтар. Кестелер, тақырыпқа сәйкес фабрикада және қолдан жасалған плакаттар. Микроскоптар, микроманипуляторлар, термостат-инкубатор.

Сабақтың жоспары және қысқа мазмұны. Тақырып бойынша сұрау (қысқаша) .

Іn vitro және in vivo ооциттерді культивирлегенде жетістіктер және кемшіліктер.
Ооциттерді in vitro культивирлеу әдістерімен танысу (ооциттерді бөлек культивирлеу, тубальді ооциттерді культивирлеу, ооциттерді фолликулаларда культивирлеу) .

Культивирлеу - өмірлік функция сақтау үшін, пісу және даму үшін гаметаларды және ұрықтарды табиғи және жасанды орталарға отырту әдісі.

Малшаруашылық тәжірибеде гаметаларды культивирлеу екі әдіспен қолданады: in vivo (жануардың ағзасының ішінде) және in vitro (пробиркаларда қоректік орталармен қолданып) . Ооциттерді культивирлеу биологиялық белгілер келесі:

Ана бездерде ооциттердің саны көп болу.
Фолликулаларда ооциттердің пісуі.
Репродукция гормондары.

Ооциттерді культивирлеу технологиясына керек:

Микроскоптық техника.
Қоректік орта.
Термостат - инкубатор.

In vivo культивирлеу. Жануарлардың жоғарыөнімді ұрғашыларына бір жыныс циклда көп овуляция алу үшін (суперовуляциялық фолликулогенез) гормоналдық препараттарды салады. Сперматазоидтердің культивирлеүін өткізбейді. Селекциялық жұмыс өткізу үшін еркек малдардың сперматазоидтердің саны жеткілікті.

In vitro культивирлеу. Дамып жету және пісу үшін фолликулаларды немесе ооциттерді қоректік орталарға салады. Культивирлеу әдісі келесі жұмыстардан құрастырылады:

Ана бездің фолликулаларынан ооциттерді алу немесе ана бездерден фолликулалардың өздерін алу. Ана бездерді етке жіберетін малдардан алғанда, материалды 1, 5-2 сағат 3-10 градус температурада антибиотиктер қосылған Хэнкс тұзды ерітіндісінде ұстайды. Тек қана осыдан кейін ооциттерді алуға болады.
Ооциттерді іріктеу. Культивирлеу үшін 2-3 мм диаметры бар фолликулалармен қолданады.
In vitro культивирлеу. Үш әдіспен қолданады: бөлініп алынған ооциттерді культивирлеу, тубальдық ооциттерді культивирлеу, фолликулалардың ішінде ооциттерді культивирлеу.

Ооциттерді алуда келесі жұмыстарды өткізеді: ана бездерді қоректік ерітіндісі бар Петри табақшасына салады, керекті фолликулаларды бөліп алады, фолликулаларды лункасы бар шыныға салады, микроскоптың астында фолликулаларды кесіп ооциттерді алады. Алынған ооциттерді инкубациялық шкафта Петри табақшасында 37, 5 градуста өсіреді. Культивирлеу уақыты 8-26 сағат. Осылай алынған жұмыртқа жасұшаларды ұрықтандыруға 16 сағаттың ішінде жібереді. Осы уақыттан артып кетсе ядроларда хромосомалардың дағдарысы басталып, жұмыртқа жасұшасы өледі.

Культивирлеудің екінші әдісін экстракорпоралдық ұрықтандыруда қолданады. Ооциттер метафаза ІІ кезеңде фолликуладан алынып 2 мл «дақылға» 40 данадан 24-26 сағатқа салынады. Осыдан кейін ооциттер экстракорпоралдық ұрықтануға жіберіледі.

Үшінші әдіс - ең көп қолданылатын әдіс. Фолликулалардың ішінде ооциттерді культивирлеу үш әдіс бар:

статистикалық әдіс;
ройлерлы құрал әдісі. Әр бір фолликула бөлек культивирленеді.
ағын жүйе әдісі. Орта жаңарып, жаңа инградиенттер қосылып тұрады.

Бәр әдістердің бірдей бір жағдайы - ортадан міндетті түрде газ қоспасы жіберіледі: 37 градуста азот - 90 пайыз, оттек және көмірқышқыл газ - 5 пайыздан.

Әр түрлі даму кезеңдеріндегі ұрықтарды алу үшін ұрықтануға піскен ооциттерді қолдану.

Бақылау сұрақтары:

1. Малшаруашылықта гаметаларды культивирлеу қандай әдістерімен қолданады?

Малшаруашылық тәжірибелерінде гаметаларды культивирлеуде екі әдіс қолданады:

1 . In vivo (жануардың ағзасының ішінде)

2. In vitro (пробиркаларда қоректік орталарды қолданып)

In vivo культивирлеу . Жануарлардың жоғары-өнімді ұрғашыларына бір жыныс циклда көп овуляция алу үшін (суперовуляциялық фолликулогенез) гормоналдық препараттарды салады. Сперматазоидтердің культивирлеүін өткізбейді.

In vivo культивирлеу. Ұрықты агармен бірге реципиенттің жұмыртқа жолына кіргізеді. Реконструкциядан өткен ұрықтарды культивирлеу үшін реципиент ретінде қойлармен қолданады. Ұрықтарды бластоциста кезеңінедейін культивирлейді. Кейіннен лапаротомия әдісімен бластоцистаны жұмыртқа жолынан алып, агарды алып тастап, ұрықты бағалайды

In vivo культивирлеу. Реципиенттің жұмыртқа жолдарына ұрықтар отырғызылып 4-6 күн инкубацияға жатады. Содан соң ұрықтарды алып биологиялық толықтылықтан өтеізеді.

In vitro культивирлеу . Дамып жету және пісу үшін фолликулаларды немесе ооциттерді қоректік орталарға салып, өсіреді. In vitro культивирлеу (37 градуста 1 сағат) өтеді.

2. Іn vitro жағдайында гаметаларды культивирлеудің жетістіктерін атап беріңіз

Экстракорпоралды ұрықтандыру -гаметаларды жануардың агзасынан бөлек ұрықтандыру Экстракорпоралды ұрықтандыру жұмыстарын өткізу үшін қажетті нәрселер: сынама, қоректік орта, термостат-инкубатор, дайын гаметалар. Медицинада бұл әдістерді ЭКО(жасанды ұрықтандыру) көмегімен бала көтере алмайтын жағдайларда қолданылады.

Мал шаруашылығында-жануарлардыда бұл әдіс жануарларды көбейту жұмыстарының қарқынын арттырады. Экстракорпоралды ұрықтандырудың жетістіктері:

1. Ұрықтандыру физиологиясының зерттеулерін өткізу.

2. Гаметалардың ұрықтандыруға жарамдылығын анықтау

3. Сперматазоидтердің мүмкіншіліктерін толығынан қолдану.

4. Қажетті жынысы бар жануарларды алу.

5. Трансгендік жануарларды алу

6. Клондалған жануарларды алу.

7. Химралық жвнуар алу

8. Эмбриондардың өлу проблемаларын зерттеу.

9. Трансплантация әдістерімен бағалы генотиптері бар ұрықтарды алу

10. Мал шаруашылығы өнімдерін. арттырып, сапасын жақсарту үшін жасушалы және молекулярлы деігейде зерттеулер жүргізілуде

Гаметаларды культивирлеуде ең жетістікке жеткені:трансгенді, химералық ж/е клондық жануарлар алу.

Трансген -бір биологиялық жүйеден екінші биологиялық жүйеге гендерді тасымалдау.

Мақсатына байланысты трансгендік жануарларды екі дәрежеге бөледі:

1 . Жаңа өнім алуға арналған трансгендік жануарлар, мысалы, медицинаға және малдәрігерлікке қажетті бағалы ақуыздарды синтездеу

2. Бағалы селекциялық белгілері бар және жоғары төзімді трансгендік жануарлар

Бірінші трансгендік жануар - тышқан - 1976жылы алынған. 1986жылы трансгендік қой , 1987 жылы ірі қара мал , 1989жылы шошқа алынған Трансгендік құстар және балықтар алынған.

3. Іn vitro жағдайында гаметаларды культивирлеудің кемшіліктерін айтып беріңіз.

In vitro ұрықтандыру кезін жүргізілетін кезеңдер:1. гаметаларды орталарда бөлек қолдан өсіріп үрықтандыруға дайындау; 2. гаметаларды микротамшының ішінде араластырып бірге инкубациядан өткізу; 3. аналық жүмыртқа жасушасының ұрықтандырылғанын тест әдісімен анықтау болып табылады.

4. Іn vivo жағдайында гаметаларды культивирлеудің жетістіктерін айтып беріңіз.

Табиғатты жасушаларды культивирлеу арқылы адамға қажетті заттар, жануарлар мен өсімдіктердің жаңа түрлерін, синтетикалық талшықтарды, моноклональды антиденелерді, лимфокиндермен ферменттерді ісікке қарсы препараттар жаңа өнімдер сияқты заттар алынды.

5. Іn vivo жағдайында гаметаларды культивирлеудің кемшіліктерін айтып беріңіз.

In vivo культивирлеуде-Жануарлардың жоғары өнімді ұрғашыларына бір жыныс циклда көп овуляция алу үшін (суперовуляциялық фолликулогенез) гормоналдық препараттарды салады. Сперматазоидтердің культивирлеүін өткізбейді. Селекциялық жұмыс өткізу үшін еркек малдардың сперматазоидтердің саны жеткілікті болады, гаметаларды культиверле күрделі кемшіліктердің бірі-ақуыздар алу болып табылады. Көптеген қарапайым-ақуыздар салыстырмалы түрде бактериялық дақылдарда рДНК пайдалану арқылы алынуы мүмкін болса да, мұндай гликопротеиндер сияқты неғұрлым күрделі ақуыздар, қазіргі уақытта тек жануарлар жасушаларынан алынуы мүмкін. Маңызды ақуыздардың бірі-эритропоэтин гормоны.

Эритропоэтин

Сүт қоректілер организмінде күнделікті 200 миллиардтан астам қан клеткалары түзіледі. Бұл процес сүйек кемігі клеткаларының өсу факторлар жүйесі көмегімен түрлі механизмдермен реттелінеді. Сүйек кемігінің миелоидты клеткаларының өсу факторлары организмде түрлі клеткалар типтерімен түзіледі:фибробластармен, эндотелиалық клеткалармен, макрофагтармен, Т-лимфоциттермен. Қазіргі уақытта микроорганизмдердің рекомбинантты штамдар қолдануымен адамның өсу факторларының төрт нәруызы өндіріледі:

- грамостим, филграстим және ленограстим - бұл лейкоцитарлы бұршіктің өсу факторлары;

- эритропоэтин (ЭПО) немесе эпотин - бұл эритроидты бұршіктің өсу факторлары.

Рекомбинантты ДНҚ технологиялармен дайындалған коммерциялық препараттардың арасында өнеркәсіп өндірісі мен тұтынуы бойынша инсулин мен эритропоэтин алғашқы болып озып келеді. Эритропоэтин-гликопротеин, бүйрек тінінде түзіледі және сүйек кемігінде эритроциттердің бастауыш клеткаларын көбейтуі мен дифференциациясын белсендіреді Эритропоэтиннің рекомбинантты өндіруші штамдар ретінде адамның эритропоэтиннің қадағалайтын генің тасымалдайтын трансформацияланған плазмидті векторлары бар E. coli, B. subtilis және басқа микроорганизмдер қолданылады. Рекомбинантты эритропоэтиннің шетелдік препараттары белгілі: Рекормон, Эритростим, Эпокрин, Эпрекс және т. б.

6. Ооциттерді культивирлегенде көрсеткіштер қандай болады?

Овоциттердің, өсуі-ұрғашылық гаметаның пайда болуы өте күрделі процесс, яғни хромосома аппраттарының мейоздың өзгеруі, цитоплазмаға, ұрықтанылу және бөлшектену үшін, өте қажетті қоректік заттардың жиналуы, жасуша мембранасы қасиеттерінің өзгерістері, ооциттің қоршаған ортамен байланыс сипаты (фолликулярлық кумулюс жасушалары және кумулюс өзгерісі) . Оогенездің басты ерекшелігі, бақылау механизімінің белгілі бір мезгілдеріне мейоздың тоқтауына және ендігі жүруіне (реницизатция) әсер ықпалдарына. Ооциттің цитофференцировкасын болжай отырып, есепке мына екі бір-біріне тығыз қарым-қатынастағы процестер - мейоз мүмкіншілігі және мейоздық жетілуді ұмытпау керек. Мейоздық жетілу төмендегідей сипат алады:

1. Ядроның, не эмбрионың везикулярлық мембранасының сорылуы

2. диплоидты хромосоманың конденцатциясы

3. Гомологиялық хромосоманың сегрегациясы;

4. Алғашқы полярлық дененің бөлінуі;

5. Мейоз процесінің метафаза П кідіруі. Метафаза П стадиясында 20-24 сағаттан соң, мейоз жетілуінің алдына тоқталады және оның жасалуы жүмыртқа спермиймен активтенгеннен кейін ғана болады, жалғасады. Ооцитта мейоздың жүру овуляцияның аз-ақ алдында басталады. Мысалы: тышқанда мейоздың қайта басталуы овуляцияға 13 сағат қалғанда, мегежінде - 36 сағат, адамды-42 сағат қалғанда басталады. Сонымен, ооцитті өсіру кезіндеі оның жетілу уақыты малдардың түрлетіне байланысты. Мысалға арнаулы ортада ооциттерді іп уйго өсіру уақыты, негізгі лабараториялық жануарлар және ауылшаруашылық малдары үшін төмендегіше қоян 9-12 сағат, кемірушілер 6-8 сағат, қой және сиыр 18-26 сағат, ал шошқалар үшін 30-36 сағатқа созылады