Рестрикциялық эндонуклеазалар. Олардың классификациясы

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 6 бет
Таңдаулыға:

Оразәлі Бексұлтан БТ 18-03

1. Рестрикциялық эндонуклеазалар. Олардың классификациясы.

2. Рестрикциялық карталар және рестрикциялық кесінділер.

3. Т4 және E. Coli ДНҚ лигаза ферменттері.

4. ДНҚ полимераза.

1. Рестрикциялық эндонуклеазалар. Олардың классификациясы .

Рестрикциялау - модификациялау құбылысы 50-ші жылдары байқалған болатын. Рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді, ал модификация - молекуланың белгілі топтарын химиялық жолмен немесе оларға баска топтарды жалғау арқылы өзгерту. Рестрикция мен модификациялау құпиясын В. Арбер ашты.

Бактерияның "өзінің" нуклеин кышқылын "бөтен" фагтардың (вирустардың) нуклеин қышқылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның клеткада көбеюіне жол бермейді. Рестриктазалармен қатар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияның өзінің ДНҚ тізбегіндегі азоттық негіздерге белгілі мөлшерде әрбір репликациядан кейін метил тобын (СН ₃ ) жалғап, модификациялап отырады. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза "өзінікі" санап оған "тиіспейді". Бұл бактериялардағы өзіндік бір "иммундык жүйе" іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагтың кейбір нуклеин қышқылы кездейсоқ метилденіп кетеді. Осы қателігінен бактерияның өзі фагтың әсерінен қырылып калады. Осы құбылысты О. Смит, Д. Натанс және В. Арбер ашты. Рестриктазалар табиғаттың ген инженериясына арнап жасаған таптырмас құралы. Бактерия әр түрлі болғандықтан олардың рестриктазалары ДНҚ-ны әртүрлі жолмен үзеді.

Қазір 500-ден аса рестриктаза түрі белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзе алады. Яғни зерттеуші рестриктазаны таңдай отырып ДНҚ-дан қалаған ферментті немесе генді бүлдірмей бүтін күйінде кесіп алады.

Генді бөліп алу мен ген өркенін (клондарын) алу үшін әртүрлі объектілер (бактериялардан, сүтқоректілер клеткаларынан, құстардан т. б. алынған) және әртүрлі вирустар жұқтырылган ортада өсірілетін ерекше ферменттер құрал ретінде пайдаланылады. Негізінде олар үш түрлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза және кері транскриптазалар.

Рестриктазалар - ДНҚ молекуласын қысқа немесе ұзын бөлшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір түрі. Рестриктазалардың ерекшеліктері ДНҚ молекуласын кез келген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. Әрбір рестриктазаның таңдайтын нуклеотидтер орналасу тәртібі бар. Бұл әдетте 4-6 жұп нуклеотидтер, әртүрлі рестриктазалар үзетін жеріндегі нуклеотидтердің құрамында айырмашылығы болады. Мысалы Е. соІі рестриктазасы ДНҚ молекуласын ГААТТЦ учаскесінде үзеді, Ват -НІ-ГГАТЦЦ учаскесінде. Қазір әр түрлі рестриктазалардың жүзден артық өзіндік бірізділігі белгілі.

ДНҚ тізбегінде ұзына бойы нуклеотидтер кездейсоқ орналасса, тест белгілі нуклеотидтен тұратын жүйелілік (бірізділік) 1/256-ға, ал алты нуклеотидтен - 1/4096 тең болады. Сондықтан рестриктазалар ДНК-ны бірнеше жүздеген немесе мыңдаған нуклеотидтер жұптарынан тұратын бөлшектерге үзеді.

Рестриктазалардың негізгі үш типі: I, II және, III белгілі. Барлық рестриктазалар қос спиралды ДНҚ-ның белгілі нуклеотидтер қатарын дәл тани алады. Алайда, рестриктазалардың I типі белгілі нуклеотидтер қатарын танығанымен, оны әр қилы нүктелерде үзеді, ал рестриктазалардың II және III типтері ДНҚ-ның нақты бөліктерін дәл үзе алады. Эндонуклеазалардың I және ІІI типтер құрылымы күрделі және екі модификациялық және АТФ-ға тәуелді эндонуклеазалық активтіліктері бар. Рестрликтазалардың II типі екі жеке белоктардан құралған: рестрициялаушы эндонуклеаза жэне модификациялаушы метилаза. Аталған себептерге байланысты ген инженериясында тек қана рестриктазалардың II типі пайдаланылады. Екінші жағынан; рестриктазаның II типі ғана бірдей нуклеотид тізбектерінің фрагменттері барДНҚ препараттарын алуға және әр түрлі геномдардан алынған фрагменттерден химерлі ДНҚ молекуласын құрастыруға мүмкіндік туғызады.

Рестриктазалардың ІI типінің басым көпшілігі 4-6 н. ж. құралған палиндромды ДНҚ тізбектерін тани алады. Мысалы, Васillus subtilis бактериясының ВsuR1 деп белгіленетін рестриктазасы ДНҚ бөлігін төмендегідей үзе алады:

Әр тізбекті 3’- ұшына 5′ бағытына қарай көз жүгіртсе, олар бірдей оқылады (ЦЦ ГГ), міне осындай тізбек палиндром деп аталады. Натижнсінде ДНҚ-ның қос тізбегі симметриялы үзіледі. (сілтемемен (стрелка) көрсетілген), сақиналы ДНҚ түзу құрылымға айналады. ДНҚ молекуласының. Соңында жабысқақ ұштар пайда болады, сондықтан олар ешқандай қосымша өңдеусіз бір-бірімен қайтадан қосылуға қабілетті болады. Қазіргі кезде рестриктазалардың II типінің 500-ден астам түрлері белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерден үзе алады. 1973 ж. X. Смит және Д. Натанс рестрикция-модификация жүйе (МК) ферменттерін белгілеу номенклатурасын ұсынды. Көпшіліктің мақұлдауы бойынша туыстың бірінші әрпі және түрдің алғашқы екі әрпінен құралған үш әріп ферменттің шығу көзін көрсетеді. Эндонуклеазаларды - R, метилазаларды - М символдарымен белгілейді. Егер клетканың бір типінен екі және одан көп рестрикция ферменттері бөлінгенболса онда оларды рим цифрларымен (I, II, ІІІ т. с. с) нөмірлейді. Осы номенклатура сүйеніп, Е. Соlі рестриктазасы ЕсоRІ, ЕсоRІІ және т, т., ал Вас. subtilis рестриктазасы ВsuRI т. с. с. болып белгіленеді.

2. Рестрикциялық карталар және рестрикциялық кесінділер. 3. Т4 және E. Coli ДНҚ лигаза ферменттері.

Генетикалық рекомбинацияның мәні - екі хромосоманың өзара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан көп тұкым қуатын анықтауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына әкеп соғатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті түрде сүтқоректілердің жыныс клеткалары пайда болғанда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендерімен алмасады (кроссинговер - айқасу кұбылысы) . Осы алмасулар ұрпақтарға берілетін тұқым қуатын белгілердің араласуын түсіндіруге мүмкіндік береді.

Гендер алмасуын, сондай-ақ клеткаға "бөтен" генді енгізуді генетикалық рекомбинация арқылы in vitro - (организмнен тыс) жасауға болады.

1972 жылы П. Бергтің лабораториясында (АҚШ, Станфорд университеті) ең бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның құрамына лямбда (X) бактериофагының геномы мен 5" К40 вирус геномы кірді.

Организмнен тыс рекомбинация әдісі, ор түрдің ДНҚ-ларын (табиғи немесе жасанды) бөліп алып, оларды бір-бірімен қосуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ-ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді.

Мұндай эксперименттердің мақсаты ДНҚ-дағы белгілі бір нуклеотидтер жүйелілігін "векторға" енгізіп, кейін клетканың ішінде жұмыс істеткізу. ДНҚ фрагментін вектормен жалғастыру төмендегідей жолдармен жүргізіледі:

1) ректрикциялық эндонуклеазалардың қатысуымен пайда болған ДНҚ-ның жабысқақ ұштары арқылы;

2) ДНҚ-ның әрбір тізбегіне косымша полинуклеотидтер фрагменттерін синтездеу (поли-А, поли-Т) ;

3) Т4-лигаза ферментінің көмегімен тұқым ұштарын жалғау. 1974 жылдан бастап рекомбинантты ДНҚ алу жұмыстары көптеп жүргізілді.

Кері транскриптазаньщ көмегімен иРНҚ молекуласында ДНҚ тізбегі синтезделеді (кДНҚ), содан кейін иРНҚ сілтінің көмегімен алынып тасталады да ДНҚ-полимеразанын, көмегімен ДНҚ-ның екінші тізбегі құрылады. Экзонуклеаза ферментімен ДНҚ-ның екі тізбегі де кысқартылып, ұштық трансфераза арқылы олардың ұштарына поли-Т жүйелілігі тігіледі. Векторлық плазмиданың сақина ДНҚ-сын рестриктазамен кесіп желі (сызық) түріне келтіреді, содан кейін экзонуклеазамен қысқартып, ұштық трансферазамен поли-А жүйесін тігеді. Ең ақырғы кезеңде осы ДНҚ, молекуласының екі типін жалғап будан молекулалы синтезделген геномы бар векторлық плазмида алады. ДНҚ тізбегінің үзілген жерлерін лигазаның көмегімен жалғайды. Бұл баяндалған жағдайда векторлық плазмидаға қандай ген енгізілгені белгілі. Бірақ трансгеноз жұмыстарында көбінесе көптеген ДНҚ фрагменттері пайданылады, ал солардың ішінде бірлі-жарымында ғана "керек" ген болады. Осыған байланысты ген инженериясында кажет гені бар ДНҚ фрагменттерін табу және оны бөліп алу әдісінің маңызы өте зор. Осы керек гені бар ДНҚ бөлшегін алу үшін "бытыра мылтық" деп аталатын тәсіл колданылады. Оның мәні мынада: ДНҚ ферменттер аркылы көптеген ұсақ бөлшектерге бытыратылады, содан оны вектордың ДНҚ молекуласымен будандастырады. Осының алдында векторлық ДНҚ-ны желі түріне келтіру үшін және жабысқақ ұштар пайда болу үшін рестриктазамен өңдейді. Ішек таяқшасына рекомбинантты молекуланы кіргізгеннен соң, сұрыптайтын қоректік ортаның көмегімен қажетті гені бар ДНҚ бөлшектері түскен бактерияларды бөліп алады. Кірген генді оның шығаратын заты (фермент, гормон т. б. ) арқылы тауып алады. Бактериялар көбейгенде онын құрамындағы рекомбинантты ДНҚ еселенеді де ДНҚ өркендері (клондары) пайда болады.

Матрицалық РНҚ негізінде оған комплементарлы қос тізбекті ДНҚ синтездеуді гибридтелу деп атайды. Бұл кері транскрипция процесі арқасында мүмкін болады. Ең алдымен м РНҚ- ның поли А ұшын праймермен гибридтейді. Праймер бұл жерде қысқа тізбегі болып табылады. Ол бос күйіндегі 3 ΄ ұшты қалыптастыру үшін және кері транскриптаза ферменті жұмысты бастау үшін комплементарлы жұптастыра отырып 5′→3′ бағытында ДНК молекуласын синтездейді реакция өнімі ДНК тізбегімен комплементарлы жұптасқан РНК матрица тізбегінен тұратын гибритті молекула . In Vitro жағдайларында бұл процесті жүргізгенде жалғыз практикалық қиыншылық бар. Кері транскриптаза ферменті м РНК - ның 5′ ұшына жетпей кез- келген нүктеде тоқтап қалуы мүмкін . Ал м РНК - ның 5′ ұшына жетсе, фермент синтезделетін ДНК- ның ұшында тұзақ түзеді . Яғни түзілген ДНК- ның 3′ ұшында 10-20 нуклеотид жұбынан тұратын иілім пайда болады . Осы кезеңде м РНК матрицаны сілтімен өңдеу арқылы ыдыратады. Нәтижесінде мРНК -ға комплементарлы 1 тізбекті ДНК түзілуі . Оны к ДНК деп атайды . Олардың 3′ ұшындағы иілім ДНК полимераза бір ферменті үшін праймер болып табылады. ДНК полимераза бір ДНК -ны комплементар тізбек синтездеу арқылы қос тізбекті ДНК-ға айналады.

S1 ферменті арқылы кесіп, кәдімгі екі тізбекті ДНК алады. Оны ары қарай синтетикалық геннің көп мөлшерін алу үшін клондауға болады. Мұндай клонды кДНҚ клоны деп атайды. Клондау техникасы генетикалық материалдардан жеке гендерді тікелей алуға көп қолданылады. Әрбір жеке ген эукариоттарының геномының өте азғантай бөлігі болып табылады.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.