Жануарлар биотехнологиясында қолданылатын векторлар. Трансгенді тышқандарды анықтау әдістері

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 4 бет
Таңдаулыға:

Қарабаев Тұрар

Тақырыбы: Жануарлар биотехнологиясында қолданылатын векторлар. Трансгенді тышқандарды анықтау әдістері.

1. Трансгенді жануарлардың алудың неізгі кезеңдері атаңыз.

Трансгенді жануарларды алудың екі негізгі схемасы бар. Олардың біріншісі - трансгенді тышқандарды алу үшін жасалынған ұрықтандырылған зигота жұмыртқасына өзге ДНҚ микроинъекциясы арқылы. Тышқанды ғана емес кейінірек адамның дәрілік ақуыздарын өндіретін ірі жануарларды: қояндарды, ешкілерді, қойларды, сиырларды алу үшін қолданыла бастады. Мұндай жұмыстың бірінші кезеңі-белгілі бір қасиеттері бар генетикалық құрылымды құру. Сонымен, егер зерттеуші трансгенді жануар келсе, онда өзге ген сүт безі эпителийінің жасушаларында көрінеді және оның өнімі сүтке шығарылады, онда трансгеннің рекомбинантты ДНҚ және сүт құрамына кіретін ақуыз β-казеин генінің промоторы бар құрылым жасалады. Идеал жағдайда бұл дизайн тек сүт бездерінің жасушаларында және лактация кезінде трансгенді жануардың денесіне жанама әсер етпестен жұмыс істеуі керек.

Қазіргі уақытта сүтқоректілердің эмбриондарымен жұмыс істеу әдістері жақсы дамыған және эмбриондардың үлкен пайызы микроинжекциядан кейін қалыпты дамып, дамып келе жатқанда, бұл генетикалық құрылыс, бұл трансгенді жануардың қажетті қасиеттерге ие болатындығын немесе болмайтынын анықтайтын фактор. Бактериялық вектордың құрамындағы гендік құрылым Е. coli бактерияларының культурасында клондалады, шығарылады және сақина ДНҚ-ға қарағанда эмбрион геномына жақсы енетін сызықты пішінге аударылады.

Жұмыстың келесі кезеңінде генетикалық құрылым бір клеткалы эмбрион-зиготаға енгізіледі. Зиготада әке мен анадан алынған генетикалық материал ядролық мембранамен қоршалған екі везикулада - ерлер мен әйелдердің пронуклеустарында болады. Микроманипулятор ұстағышында бекітілген микропипетканың көмегімен генетикалық конструкция көшірмелерінің қажетті саны. Содан кейін эмбриондар алушы әйелге трансплантацияланады, олардың көпшілігі қалыпты имплантацияланады және туылғанға дейін дамиды. Алайда, енгізілген зиготалардан туылған барлық жануарлар өзге генді алып жүрмейді. Дегенмен, трансгендер, әдетте, енгізілген ген бойынша мозаикаға айналады, яғни олар оны дененің барлық тіндерінде тасымалдамайды. Сонымен, трансгенді жануарларды алу үшін туылған ұрпақты молекулалық-генетикалық талдаудың маңызы зор. Ең жақсысы, жыныстық жасушаларында шетелдік ген бар трансгенді еркек алынған кезде, бұл жағдайда трансген оның балаларына беріледі. Еркектерді көптеген ұрғашылармен, соның ішінде жасанды ұрықтандыру арқылы тұқым қуалау арқылы өтіп, тез арада көптеген ұрпақтар (F1 ұрпағы) алуға болады. F1 жануарлары трансгенді дененің барлық жасушаларында тасымалдайды, бірақ екі гомологиялық хромосоманың біреуінде ғана болады, яғни олар енгізілген ген бойынша гетерозиготалы болады. Трансгендік сызықтың негізі үшін F2 ұрпағын алу керек, F1 жануарларын бір-бірімен кесіп өту керек. Жұмыстың соңғы кезеңі қалады-трансгеннің белсенділігі үшін F ұрпағынан гомозиготаларды талдау. Ақыр соңында, барлық осы талаптарға жауап беретін жануарлар ұзақ және күрделі жолдың нәтижесінде алынған кезде, трансгенді Жануарлар желісін құру жұмыстары аяқталды деп болжауға болады. Енді оларды бір - бірімен кесіп өту арқылы көбейтуге болады-олардың барлық ұрпақтары өзге генді мұра етеді.

Трансгенді жануарларды алудың екінші схемасы (жаңа) ірі трансгенді жануарларды құру кезінде ең көп таралған болып көрінеді-бұл эмбрионалды бағаналы жасушаларды (ESC) қолдану схемасы. Зиготадағы микроинжекция әдісінен айырмашылығы, ESC мәдениетімен жұмыс жасау кезеңінде сіз трансгенді жасуша геномына ендіруді де, ендірілген көшірмелердің санын да талдай аласыз, кейде енгізілген трансгеннің өрнегін тексере аласыз, бұл ESC сызығын ең жақсы қасиеттермен таңдауға мүмкіндік береді. Бұл жасушалардың бір бөлігін сұйық азотта мұздатуға болады және кейіннен трансгенді жануарларды құру үшін көптеген жылдар бойы сақтауға болады.

Зиготаға гендік құрылымдарды инъекциялау әдісімен трансгендік жануарларды алу кезеңдері:

1 - инъекциялау үшін зиготалар алу (in vitro культурасында гормоналды инъекциялармен индукцияланған суперовуляция немесе ооциттерді ұрықтандыру қолданылады) ;

2 - гендік құрылымды енгізу (пронуклеусқа микроинъекция) ;

3 - реципиент-аналықтарға эмбриондарды ауыстырып салу (реципиенттер жүн түсі және басқа тұқымдық белгілері бойынша ерекшеленетін басқа тұқымды жануарларды таңдайды) ;

4 -инъекцияланған эмбриондардан туған жануарлар: олардың тек бір бөлігі ғана. Сонымен қатар, бұл жануарлар, әдетте, гетерозиготалар (трансген гомологиялық хромосомалардың бірінде ғана кездеседі) және Мозаика (трансген жануардың барлық жасушалары мен тіндерінде болмайды) ;

5 - Жануарлар геномының құрамында енгізілген геннің болуын растау үшін молекулалық-генетикалық талдау жүргізу;

6 - трансгенді гаметаларды шығаратын жануарларды таңдау (трансгенді жануарларды пальто түсі мен басқа тұқымдық сипаттамалары бойынша ерекшеленетін басқа тұқымды жануарлармен кесіп өту және олардың ұрпақтарын талдау) . Трансгендік гомозиготаларды іріктеу: енгізілген ген бойынша гомозиготалы ұрпақ алу үшін трансгендік жануарларды будандастыру;

7 - трансгендік Жануарлар табынын алу;

8 - сүттен дәрілік ақуызды бөлу және оны тазарту.

2. Трансгенді жануарларды алудағы әдістік өзгешеліктері қандай?

Трансгенді жануарларды алу кезінде зерттеушілер барлық соматикалық жасушаларды (толық трансгенділік) және әсіресе генеративті жасушаларды гендік құрылыммен қамтамасыз етуге тырысады. Мұндай жағдайларда рекомбинантты ДНҚ интеграциясы толық трансгенділікке әкеледі және жеткілікті өрнек болған жағдайда жануарлардың фенотипінің өзгеруіне және осы белгінің ұрпақтарға берілуіне әкеледі. Трансгенді жануарларды алудың негізгі әдісі-рекомбинантты ДНҚ-ны ерте зиготалардың еркек пронуклеусіне микроинъекциялау. Сондықтан гендердің микроинъекциясы жануардың дамуының ең ерте кезеңдерінде жүзеге асырылады: көп жағдайда ұрықтандырылған жұмыртқа немесе екі жасушалы эмбриондар сатысында.

3. Трансгенді жануарлардың өнімінің сапасындағы өзгерістерді атаңыз?

Жаңа Зеландияның "AgroResearch" мемлекеттік компаниясы ірімшік алудың тиімділігін арттыру мақсатында трансгенді сиырларды жасайды. Сүт ақуыздарының шамамен 80% - ы ең құнды ақуыздар-казеиндер. Бұл жағдайда сиыр сүтінің казеиндерінің фракциясы әрқайсысы геннің бір көшірмесімен кодталған αS1-, αS2-, β - және k-казеиндерден тұрады. Казеиндер үлкен мицеллаларға біріктіріледі. Мицеллярлық құрылым және оның тұрақтылығы казеиндердің қатынасына байланысты өзгеруі мүмкін, бұл сүттің физика-химиялық қасиеттеріне әсер етеді. Ірімшік казеин мицеллаларын біріктіру арқылы түзіледі, олар ақуыз желісін құра отырып, су мен майды сақтайды.

Β - және k-казеиндердің көбеюі мицеллалар мөлшерінің азаюына әкеледі және ірімшік өндірісі үшін қажет температураға төзімділікті арттырады. Сүттегі β - және k-казеиндердің санын көбейту мақсатында тиісті гендердің қосымша көшірмелері бар трансгенді сиырлар алынды. Бұл ретте сиырлардың β-казеинінің эндогендік гені оның реттеушілік реттілігімен пайдаланылды. Казеин k гені салыстырмалы түрде төмен деңгейге ие болғандықтан, трансгендік сиырларды алу үшін β-казеин генінің реттеуші аймағы және K-казеин генінің кодтау бөлігі бар химиялық ген қолданылды.

Нәтижесінде трансгенді сиырлар алынды, олардың сүтінде β казеин деңгейі 20%-ға, ал k - казеин деңгейі 2 есе артты. Бұл нәтиже трансгенез әдісімен сүттің құрамын өзгерту мүмкіндігін айқын көрсетеді, бұл миллиардтаған ірімшік өндірісінің тиімділігін арттыруы мүмкін.

Шошқа өсіру проблемаларының бірі-сүтте α-лакталбуминнің болмауына байланысты торай жоғары өлімі. Бұл мәселені шешу үшін трансгенді шошқалар алынды, олардың геномына сиырлардың α-лактальбумин гені енгізілді, бұл сүттегі лактоза концентрациясының жоғарылауына әкелді.

Нәтижесінде модификацияланған сүтпен қоректенетін торайлардың өлімі айтарлықтай төмендеді. Шошқа өсірудің тағы бір проблемасы - қоршаған ортаның құрамында фосфордың жоғары концентрациясы бар нәжіспен ластануы. Бұл мәселені шешу үшін олар трансгенді шошқаларды алды, олардың геномына фитазды кодтайтын бактериалды ген енгізілді. Нәтижесінде трансгенді шошқалардың нәжісіндегі фосфат деңгейі 75% төмендеді.

Ауруларға төзімділік - ауыл шаруашылығында трансгенезді қолданудың тағы бір маңызды аспектісі. Сонымен, АҚШ-тағы ірі қара малдың маститінен (бактериялық инфекциядан туындаған сүт безінің қабынуы) зиян жылына 1. 7 миллиард доллардан асады. Әдетте мастит стафилококктардан болады. Мастит тудыратын стафилококктарға қарсы бактерицидтік әсерге Staphylococcus simulans шығаратын күшті пептидогликангидролаз лизостафин ие. Сүтте лизостафин (0. 014 мг/мл деңгейінде) бар трансгендік сиырлар алынды. Мұндай сиырлардың стафилококк инфекцияларына төзімділігі жоғарылағаны көрсетілген

4. Химералық жануарлар алу жолдарына сипаттама беріңіз

Химераларды алу әдісінің мәні екі немесе одан да көп жануарлардың эмбриональды жасушаларының жасанды бірігуі болып табылады. Жануарлар бір тұқымнан, немесе әр түрлі тұқымнан, тіпті әр түрлі түрден болуы мүмкін. Химералар әртүрлі генотипті жануарларға тән қасиеттерге ие.

Химерлі жануарлар генетика, эмбриология мәселелерін шешу үшін, биомедициналық зерттеулерде қолданылады, сонымен қатар мал шаруашылығы практикасы үшін қызығушылық тудыруы мүмкін.

Химерлі жануарларды алу

1. Агрегациялық әдіс (1961-1962 жылдары ұсынылған) .

8 бластомер сатысына жеткен әртүрлі жануарлардың эмбриондарын қолданыңыз.
Оларды 16 жасушалық эмбрионның агрегациясы мен қалыптасуына ықпал ететін жағдайларға салады.
Құрама (химерлі) эмбриондар бластоцист сатысына дейін in vitro дамиды, содан кейін олар патронат ананың жатырына имплантацияланады, онда олар дамуды жалғастырады.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.