Клеткалық инженерия. Протопластарды бөліп алу және инвитро жағдайында өсіру

Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 13 бет
Таңдаулыға:

Клеткалық инженерия.Протопластарды бөліп алу және инвитро жағдайында өсіру.
Клеткалық инженерия - клеткаларды өсіру,оларды будандастыру және қайта құрастыру арқылы клетканың мүлдем жаңа типін жасау әдістерін негізінде қалыптасқан биотехнологияның саласы.Клеткаларды жасанды жолдармен будандастырғ,анда,сомалық(жыныстық емес) клеткаларды бір-біріне қосқанда будан геном түзіледі.Будандастырудың бұл тәсілінің мәні мынада:аталық және аналық клеткалар ретінде жыныстық клеткалар (гаметалар) емес өсімдіктің дене (сомалық)клеткалары қосылады.Олардың алдын - ала протопластарын бөліп алады,белгілі жағдайда олар бір-бірімен қиылысады.Пайда болған сомалық будан клеткалардан кейін регенерация арқылы будан өсімдіктер өсіп шығады.
Протопластарды қосу арқылы будандастыруды әртүрлі атайды:сомалық будандастыру,парасексуальды будандастыру,жыныстық емес будандастыру.Сон-да да, көбінесе бірінші термин қолданылады,ал пайда болған будан сомалық будан деп аталады.Клетканы қайта құрастыру (реконструкция)-клетканың құрамына кіретін ядроны,цитоплазманы,митохондриялард ы,хлоропластарды,хромосоларды бір клеткадан басқа клеткаға көшіру негізінде мүлдем жаңа клетканы жасау.Осындай әрекеттер нәтижесінде ядролық және цитоплазмалық гендер тіркестігі әдеттегідей емес,тіпті өзгеше клеткалар пайда болуы мүмкін.Одан да артық ғалымдарды қызықтыратыны,ол жеке хромосомаларды тасымалдау арқылы анеуплойдтық линияларды алу мүмкіншілігі.Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердің қоспасын пайдаланады.Бұл қоспаның құрамында ферменттердің үш түрі болады:олар пектиназа,целлюлоза,гемицеллюлаза.О лар клетка қабығының негізгі компо-ненттерін ыдыратады.Бұл ферменттерді кейбір бактериялар мен саңырауқұлақтар өздерін өсірген сұйық ортаға бөліп шығарады,сонымен қатар оларды ұлудың ас қорыту сөлінен бөліп алады. Қазіргі уақытта пептиназалық және целлюлазалық әсері бар бірталай стандарттық бірнеше ферменттер бар.Олардың фирмалық аттары әртүрлі,атап айтқанда мыналар:
Целлюллюлаза:
Гемицеллюлаза:
Пектиназа:

Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу арқылы залалсыздандыра-ды.Клетка түрінде құрылымы мен құрамы жағынан айырмашылық болғандық-тан,қолданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара қатынасы бірдей болмайды.Әр-бір ұлпа үшін ферменттердің құрамы,концентрациясы мен ара қатынасы және өңдеу уақыты бөлек іріктеліп алынады.Бөлініп алынған протпластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уақыт болуы керек,одан кейін ұқыпты түрде жуылуы қажет.
Протопластарды бөлу кезеңінде осмостық стабилизатор маңызды қызмет атқарады.Протопластар бүтін болуы үшін ферменттік ерітінділер изотониялық немесе гипертониялық күйде болуы керек.Кейде материалды алдын - ала плазмолиздік ерітіндісінде біраз ұстайды.Осмостық зат ретінде көбінесе қанттар (глюкоза,сахароза,сорбит,маннит) пайдаланылады.Осмостық қысымның дәл концентрациясы өсімдіктің нақты түрінен және оның физиологиялық күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады.Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге қолданылатын қоректік ортада ерітіліп дайындалады.Ферменттік ерітіндінің РН көрсеткішіндегі бір деңгейде (5,4-6,2 ) ұстау үшін буфер қосады.
Протопластарды бөлу кезеңінде аэрацияның маңызы зор.Слндықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітіндінің түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады.Протопластарды ала көлеңкеде немесе қараңғыда бөліп алады.Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне,РН және температураға байланыста,1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады.Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өңдеу уақытын жеке іріктеп алу қажет.Температура әр деңгейде болады,мысалы бидайда 14 градус С болса,томатқа ең қолайлысы 27 градус С.
Протопластар бөлініп алынған соң,олар ұлпаның қалдықтары мен ферменттерден тазалануы керек.Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады.Инкубациялық қоспаның тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді,одан кейін протоплас суспензиясын центрифугалайды.Центрифугалау тәртібі осмостық затқа байланысты.Егер ферменттік ерітіндісі 0,4-0,5 м сахарозада дайындалса,100-200гр 2-3 минут бойы центрифугалайды.Протопластар үстіне қалқып шығады,оларды Пастер пипеткасымен сорып алып,2 рет тұздың ерітіндісімен шаяды.Тығыздығы төмен басқа осмостық заттарды (маннит,сорбит)қолданған кезде ,протопластар центрифугалау кезінде тұнба болып шөгеді.Оларды 2 рет жуады.Одан кейін протопластарды тұздың ерітіндісінде немесе 0.4м маннит,сорбит,глюкоза ерітіндісіне нгемесе өсіретін қоректік ортаға салып,суспензиясын алады.Тіршілікке қабілетті протопластарды алуПротопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты.Олар атап айтқанда:ұлпаның шығу тегі (жапырақ,тұқым жапырақ,тамыр,тозаң түйірі,каллус ұлпасы,суспензиядағы клеткалар),өсімдіктің түрі мен сорты,өсімдіктің физиологиялық күйі,ферменттердің құрамы,олардфың сапасы,ортаның Рн және осмостық заттың түрі.
Протопластардың тіршілікке икемділігін ,яғни олардың метоболиттік активті-лігін анықтайтын арнайы әдіс бар .Ол протопластардың флуоресцеиндиацетатпен (ФДА) боялуы.ФДА бұл флуоресценциясы жоқ қосылыс,протопластар мембранасы арқылы жеңіл өтеді,тірі протопластардың ішінде эстеразалардың әсерімен ыдырайды.Соның нәтижесінде флуоресцеин босайды,оны прото-пластардың бүтін мембраналары ұмтап қалады.Сондықтан метоболиттік активтыілігі бар (тіршілікке қабілетті) протопластар ультра күлгін сәулесінде көзге көрінеді,себебі жинақталған флуоресцеин ультро күлгін сәулесімен қоз-дырылып,жасыл сәулені тарата бастайды.
Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың саны мен (процент мөлшерінде) белгіленеді.Протопластардың саны Фукс-Резонталь камерасында есептеледі.Протоплдастардың тығыздығы (суспензияның 1 мл-дегі саны) суспензияның маңызды сипаттамасы.Егер ұлпаның немесе өсірген клеткалардың ылғалды массасының 1 гр-нан 1 х 103 тен 1 х104 ке дейін тіршілікке икемді протопластар шықса,онда протопластар жақсы бөлініп алынды деп есептеледі.
Жоғарыда айтылып кеткендей,протопластардың бөлініп алынатын мөлшері және олардың өміршеңдігі сімдіктің түріне,жасына және физиологиялық күйі-не,яғни генетикалық және эпигенетикалық ерекшеліктеріне байланысты.Протопластарды көп мөлшерде тұрақты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жағдайда өсіру керек және олардың ең қолайды өсу кезеңін нақтылы бір мүшесін анықтап таңдап алуы қажет.
іn vitro өскен клеткалар мен ұлпалардан протопластарды бөліп алудың мынадай артықшылықтары бар:стирильдік, In vitro жағдайларында өсіруге бейімділік.Бірақ клетка қабықшасының химиялық құрамының күрделі болып өзгеруі және оның қалыңдауы ферменттік гидролизді қиындатады.Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген клеткалардың ішінде меристемалық клеткаларының сан жағынан үйлесіне сай болады,ал ол үшін суспенциядағы клеткаларды жиі-жиі жаңа коректік ортаға көшіріп отыруы керек.Суспензияда өсірген клеткалардан протопластарды алу үшін ең қолайлы мерзім,ол клеткалардың өсу кезеңінің лагарифмдік фазасының соңында.Осы мезгілде клетка қабықшалары ферменттердің әсерімен оңай ыдырап,өміршең протопластарды береді.Протопластардың тіршілікке екемділігі оларды бөліп алу жағдайлары мен тәсілдеріне байланысты.Клетканың плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және қабығының бұзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді.Бұл жағдайда цитоплазмангың вокуольденуі артады,көптеген липид тамыршалары пайда болады,полисомалардың саны азаяды,ядромен хлоропластар қоюланады.
Фермент препаратының сапасы протлпластардың бөліп алынған санына,мөлшеріне ғана емес,олардың кейбір қасиеттерінеде әсер етеді.Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препаратына қоспа ретінде протезалар,липазалар,нуклеазалар және басқа ферменттер,фенолдық қосылыстар,тұздар кіреді.Олар плазмалемманың қасиеттерін өзгертуі мүмкін.Осы токсикалық заттардан құтылуы үшін және протопластардың шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады.Бірақ айта кететін мәселе өте жақсы тазартылған ферменттер протопластарды көп мөлшерде алуға тиімсіз келеді.Кейде ферменттік ерітіндісі қорғаушы заттар (протекторлар) қосы-лады,мысалы:калий сульфатының 0,5 процент ерітінділері.Олар протеин-дермен әрекеттесіп,ферменттердің зиянды әсерін төмендетеді.
Инкубациялық ортада иондардың,әсіресе кальций мен магнийдің болуы плазмалемманың тұрақтылығын арттырып оқшауланған протопластардың сапасын жақсартады.Оқшауланған протопластар механикалық және осмостық стреске өте сезімтал болады.Олар тек ішіне сіңіп кіре алмайтын осмостық заттың гипертониялық ерітіндісінде өздерінің осмостық тұрақтылығын сақтай алады.
Ферменттік ертіндісінен жуылып тазартылып алынған тіршілікке икемді протопластар шок күйінен шығып,біртіндеп өзінің ішкі жүйесіндегі бұзылған құрылымдарын жөніне келтіріп (репарация),қабығын қайта құруға (регенерация) дайындалады.Толық жарамды изотониялық қоректік ортада (протопласт пен ортаның осмостық қысымы тепе-тең) асептикалық жағдайда протопластар ұзақ мезгіл тіршілікке икемді болып,бөлінуге қабылетін сақтайды.

Протопластарды In vitro өсіру
Протопластарды In vitro түрлі тәсілдермен өсіруге болады.Өсіру тәсілі тәжірибенің мақсатына байланысты.Алдымен протопластардың қоректік ортада шайқап жуып ферменттерден тазартады.Содан соң олардың 1 мл ортадағы санын есептеп алады.Жасайтын тәжірибеге сәйкес олардың тығыздығын керек көрсеткішке жеткізеді.Ол үшін протопластарды әртүрлі көлемі бар ортаға салады.
Ал,керісінше,протопластардың тығыздығын азайту үшін оларды қоректік орта мол құйылған ыдысқа көшіреді.Сөйтіп,протопластардың 1 мл ортадағы санын оқтын-оқтын есептеу арқылы олардың тығыздығын жасайтын тәжірибеге сайма-сай келтіреді.
Протопластарды сұйық ортада өсіргенде клеткаларды өсірген сияқты олардың тығыздығы жоғары болуы керек.Көбінесе бұл көрсеткіш 1-мл 104---105клетка болады.Егер қоректік орта сұйықталып,протопластар саны бұдан аз болса,лнда олар жөнді өсе алмайды.Өте сұйық суспензияда протопластардың ішіндегі тіршілікке қажетті кейбір метоболиттер плазмолемма арқылы ортаға шығып кететін көрінеді.Сондықтан протопластардың тіршілік қабылеті едәуір кемиді.Осының дәлелі ретінде мынадай мысал келтіруге болады.Әдетте ісік ұлпалардан алынған клеткаларды суспензияда өсіргенде қоректік ортаға ауксин мен цитокинин гормондарын қоспайды.Өйткені бұл гормондар осындай ісік клеткаларының өздерінде түзіледі.Сұйық ортада өсіргенде клетка қабығы ол гормондардың клеьканың ішінен сыртына шығуын бөгейді де ,ондай эндогендік метоболиттерді клетканың өзіде пайдалана алады.Ал ісік клеткалардан бөліп алынған протопластарды суспензияда өсіру үшін қоректік ортаға міндетті түрде экзогендік ауксин мен цитокининді қосу керек.Себебі,жоғарыда айтылғанын-дай,олардың өз эндогендік гормондары клетканың қабығы болмағандықтан плазмолеммадан шығып кетеді.
Протопластардың өсуіне жақсы жағдай жасау үшін Қоректік қабат әдісін пайдаланады немесе байытылған ортаны қолданады,болмаса олар өсіп жатқан ортаның көлемін минимумға дейін азайтады. Астыңғы қоректік қабат ретінде рентген немесе гамма сәулелері әсер ететін протопластар мен клеткалар пайдаланылады.Сол әсерден ондай клеткалар бөліну қабылетінен айыры-лады,бірақ басқа клеткалардың өсуіне жағдай туғызады.

Осы әдістің тағы бір түрі,ол нашар өсетін протопластарды жақсы өсетін протопластармен бірге өсіру.Байытылған орталар өсімдіктердің шамалы түрлері үшін ғана оң әсерін тигізеді.Протопластарды өсірудің кең таралған әдісі,оларды жоғары ылғалдылықта көлемі 20-40 мкм тамшыларда өсіру.Петри табақшасының қақпағында немесе түбіндегі кішкене тамшыларға протопластар автоматтық пипеткамен салы-нады.Протопластарды өсіру үшін бұл әдістің тиімділігі-материалдар мен уақытты үнемдеп,қоректік ортаның мыңдағын вариантарын тексеруге мүмкіншілік береді.Бірақ бұл әдістің де кемшілігі бар,ол протопластардың тамшының ортасына жыиылуы.
1978жылы украйн ғалымы Ю.Ю.Глеба жеке протопластарды қоректік ортаның көлемі 1мкл дейін микротамшыларда өсіру әдісін жете зерттеп дайындады және өзінің зерттеу жұмысында осы әдісті нәтижелі қолданды.Осындай көлемдегі микротамшыда бір клетка болса,онда клетка көлемінің ара-қатнасы әдеттегі өсіргендей тығыздығы 1милилитрде 104 клеткасы бар суспензиямен бірдей болады.Протопластарды алдын-ала 1-3 күн тығыздығы жоғары (104-105 клетка )суспензияда өсірілсе,кейін сондай суспензиядан алынған жеке протопластарды микротамшыда өсірудің тиімділігі арта түседі.
Протопластарды суспензия ретінде сұйық орта ғана емес ,біраз қоюланған ортада да өсіруге болады.Ол үшін ыдысқа құйылған қоюланған ортаның бетіне жұқа қабат етіп қана протопластарды салады.Бұл әдіс бойынша,сұйық ортамен көлемі тең қоюланған ортада протопластардың концентрациясын екі есе көбейтіп ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.