Биологиялық химия курсы
МАЗМҰНЫ
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4
1. Белоктар. Зертханалық жұмыс № 1. Белоктарға және амин қышқылдарына сапалық реакциялар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...5
2. Зертханалық жұмыс № 2. Белоктарды тұндыру реакциялары ... ... ... ... 11
3. Зертханалық жұмыс № 3. Казеинді бөліп алу және оның изоэлектрлік нүктесін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..13
4. Зертханалық жұмыс № 4. Белоктар диализі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..16
5. Зертханалық жұмыс № 5. Қағаздағы хроматография әдісімен
амин қышқылдарын бөлу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 18
6. Зертханалық жұмыс № 6. Серенсен бойынша формольдік
титрлеу арқылы аминдік азот мөлшерін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 20
7. Ферменттер. Зертханалық жұмыс №7. Биологиялық материалдағы
ферменттерді ашу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 22
8. Зертханалық жұмыс № 8. Ферменттердің қасиеттері ... ... ... ... ... ... ... ..25
9. Ферменттер активтілігін сандық анықтау.
Зертханалық жұмыс № 9. Каталаза активтілігін анықтау ... ... ... ... ... ... ...30
10. Зертханалық жұмыс № 10. Субстрат ретінде пирокатехинді
пайдалану арқылы пероксидаза активтілігін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... .33
11. Зертханалық жұмыс № 11. Сүт майының гидролизі реакция.
сындағы липаза активтілігін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...34
12. Витаминдер. Зертханалық жұмыс № 12. Витаминдерге сапалық реакциялар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 36
13. Зертханалық жұмыс № 13. С витаминінің мөлшерін иодометрлік титрлеу арқылы сандық анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...41
14. Белоктардың қорытылуы. Зертханалық жұмыс № 14. Белоктардың пепсин және ұйқы безі ферменттері әсерінен қорытылуы ... ... ... ... ... ... ..42
15. Нуклеин қышқылдары. Зертханалық жұмыс № 15. Ашытқыдан рибонуклеопротеиндерді бөліп алу және гидролиз өнімдерін
сапалық анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..44
16. Көмірсулар. Зертханалық жұмыс № 16. Көмірсуларға сапалық реакциялар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 46
17. Зертханалық жұмыс № 17. Көмірсулардың ас қорыту жолында қорытылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...49
18. Зертханалық жұмыс № 18. Ашу процесі кезінде бейорганикалық фосфаттың пайдаланылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..50
Пайдаланылған әдебиет тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .52
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4
1. Белоктар. Зертханалық жұмыс № 1. Белоктарға және амин қышқылдарына сапалық реакциялар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...5
2. Зертханалық жұмыс № 2. Белоктарды тұндыру реакциялары ... ... ... ... 11
3. Зертханалық жұмыс № 3. Казеинді бөліп алу және оның изоэлектрлік нүктесін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..13
4. Зертханалық жұмыс № 4. Белоктар диализі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..16
5. Зертханалық жұмыс № 5. Қағаздағы хроматография әдісімен
амин қышқылдарын бөлу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 18
6. Зертханалық жұмыс № 6. Серенсен бойынша формольдік
титрлеу арқылы аминдік азот мөлшерін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 20
7. Ферменттер. Зертханалық жұмыс №7. Биологиялық материалдағы
ферменттерді ашу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 22
8. Зертханалық жұмыс № 8. Ферменттердің қасиеттері ... ... ... ... ... ... ... ..25
9. Ферменттер активтілігін сандық анықтау.
Зертханалық жұмыс № 9. Каталаза активтілігін анықтау ... ... ... ... ... ... ...30
10. Зертханалық жұмыс № 10. Субстрат ретінде пирокатехинді
пайдалану арқылы пероксидаза активтілігін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... .33
11. Зертханалық жұмыс № 11. Сүт майының гидролизі реакция.
сындағы липаза активтілігін анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...34
12. Витаминдер. Зертханалық жұмыс № 12. Витаминдерге сапалық реакциялар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 36
13. Зертханалық жұмыс № 13. С витаминінің мөлшерін иодометрлік титрлеу арқылы сандық анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...41
14. Белоктардың қорытылуы. Зертханалық жұмыс № 14. Белоктардың пепсин және ұйқы безі ферменттері әсерінен қорытылуы ... ... ... ... ... ... ..42
15. Нуклеин қышқылдары. Зертханалық жұмыс № 15. Ашытқыдан рибонуклеопротеиндерді бөліп алу және гидролиз өнімдерін
сапалық анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..44
16. Көмірсулар. Зертханалық жұмыс № 16. Көмірсуларға сапалық реакциялар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 46
17. Зертханалық жұмыс № 17. Көмірсулардың ас қорыту жолында қорытылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...49
18. Зертханалық жұмыс № 18. Ашу процесі кезінде бейорганикалық фосфаттың пайдаланылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..50
Пайдаланылған әдебиет тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .52
Биологиялық химия курсы тіршіліктің материалдық негізі мағынасын, тірі организмдерде өтетін химиялық және биологиялық процестерді түсіндіре отырып, биология-химия мамандықтары студенттерін дайындау жүйесінде маңызды рөл атқарады.
Биохимия курсының мақсаты – тірі организмдерді құрайтын қосылыстардың негізгі кластарының химиялық құрамы, құрылысы және тіршілік процестеріне қатысуы жөнінде білім қалыптастыру.
Оқу құралына енгізілетін зертханалық жұмыстар студенттерге биохимиядан теориялық білімді бекітуге, биохимиялық экспериментті, соның ішінде модельді тәжірибелер түріндегі экспериментті жүргізудің практикалық дағдыларын алуға көмектесуі тиіс.
Берілген оқу құралына химик және биолог-студенттерге арналған биохимияның «Белоктар», «Ферменттер», «Витаминдер», «Көмірсулар» тараулары бойынша 18 зертханалық жұмыстың әдістемелік нұсқаулары енгізілген. Әрбір жұмыстың сипаттамасы теориялық бөлімнен және жұмыстың мақсаты, тәжірибелерді жүргізу барысы, олардың химизмі көрсетілген практикалық бөлімнен тұрады. Жұмысқа дайындалу және оның нәтижелерін қорытындылауға көмек ретінде бақылау сұрақтары келтірілген.
Зертханалық жұмыстар оқытудың кәсіби бағдары ескеріліп таңдалып алынған. Олар студенттерді тек биохимиялық эксперимент жүргізу дағдысын алып қана қоймай, сонымен қатар болашақ биология және химия мұғалімі қызметінде пайдалануға қажет болатын биохимиялық тәжірибелерді таңдап алып, мектеп бағдарламасына бейімдеуге бағыт береді. Оқу құралының ерекшелігі – биохимияны оқытуды биосфераның антропогенді ластану проблемаларымен байланыстыратын биохимиялық-экологиялық эксперименттердің енгізілуі.
Оқу құралы биохимия элементтерін тек биология және химия сабақтарында пайдаланып қана қоймай, оқушылардың ғылыми жұмысын ұйымдастыруға пайдалана білу дайындығын алуда болашақ мұғалімдерге көмегін тигізеді.
Биохимия курсының мақсаты – тірі организмдерді құрайтын қосылыстардың негізгі кластарының химиялық құрамы, құрылысы және тіршілік процестеріне қатысуы жөнінде білім қалыптастыру.
Оқу құралына енгізілетін зертханалық жұмыстар студенттерге биохимиядан теориялық білімді бекітуге, биохимиялық экспериментті, соның ішінде модельді тәжірибелер түріндегі экспериментті жүргізудің практикалық дағдыларын алуға көмектесуі тиіс.
Берілген оқу құралына химик және биолог-студенттерге арналған биохимияның «Белоктар», «Ферменттер», «Витаминдер», «Көмірсулар» тараулары бойынша 18 зертханалық жұмыстың әдістемелік нұсқаулары енгізілген. Әрбір жұмыстың сипаттамасы теориялық бөлімнен және жұмыстың мақсаты, тәжірибелерді жүргізу барысы, олардың химизмі көрсетілген практикалық бөлімнен тұрады. Жұмысқа дайындалу және оның нәтижелерін қорытындылауға көмек ретінде бақылау сұрақтары келтірілген.
Зертханалық жұмыстар оқытудың кәсіби бағдары ескеріліп таңдалып алынған. Олар студенттерді тек биохимиялық эксперимент жүргізу дағдысын алып қана қоймай, сонымен қатар болашақ биология және химия мұғалімі қызметінде пайдалануға қажет болатын биохимиялық тәжірибелерді таңдап алып, мектеп бағдарламасына бейімдеуге бағыт береді. Оқу құралының ерекшелігі – биохимияны оқытуды биосфераның антропогенді ластану проблемаларымен байланыстыратын биохимиялық-экологиялық эксперименттердің енгізілуі.
Оқу құралы биохимия элементтерін тек биология және химия сабақтарында пайдаланып қана қоймай, оқушылардың ғылыми жұмысын ұйымдастыруға пайдалана білу дайындығын алуда болашақ мұғалімдерге көмегін тигізеді.
1. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии // Учеб. для хим. и биол. спец. пед. ин-тов и ун- тов. - 3-е изд. перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 1993. - 496 с.
2. Филиппович Ю.Б., Коничев А.С., Севастьянова Г.А., Кутузова Н.М. Биохимические основы жизнедеятельности человека // Учеб. пос. для студентов вузов. - М.: ВЛАДОС, 2005. - 407 с.
3. Бейсембаева Р.Ұ., Төлегенова Б.Т. Биологиялық химия. Статикалық биохимиядан дәрістер курсы. – Алматы: Қазақ университеті, 2007. – 218 б.
4. Сейтембетова А.Ж., Лиходий С.С. Биологиялық химия. – Алматы: Білім, 1994. - 304 бет
5. Сейiтов З.С. Биологиялық химия. - Алматы: Қайнар, 1992.
6. Сағатов К.С. Биологиялық химия практикумы. - Алматы: Ана тiлi, 1992. - 148 бет
7. Қайырханов Қ.Қ. Жануарлар биохимиясы. - Алматы: Ана тiлi, 1993. - 276 бет
8. Практикум по общей биохимии // Учеб. пособие для студентов хим. спец. пед. ин-тов. Филиппович Ю. Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. - М.: Просвещение, 1982. - 311 с.
9. Землянухин А.А. Малый практикум по биохимии // Учеб. пос. для студ. биол. спец-тей вузов. – Воронеж: Изд-во ВГУ. – 1985. – 128 с.
10. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии // Учеб. пос. для мед. вузов. – М.: Высшая школа, 1988. – 239 с.
11. Важева Н.В. Лабораторные работы по биохимии // Метод. реком. для студ-в спец-тей «Химия» и «Биология». - Костанай: КГПИ, 2005. – 36 с.
2. Филиппович Ю.Б., Коничев А.С., Севастьянова Г.А., Кутузова Н.М. Биохимические основы жизнедеятельности человека // Учеб. пос. для студентов вузов. - М.: ВЛАДОС, 2005. - 407 с.
3. Бейсембаева Р.Ұ., Төлегенова Б.Т. Биологиялық химия. Статикалық биохимиядан дәрістер курсы. – Алматы: Қазақ университеті, 2007. – 218 б.
4. Сейтембетова А.Ж., Лиходий С.С. Биологиялық химия. – Алматы: Білім, 1994. - 304 бет
5. Сейiтов З.С. Биологиялық химия. - Алматы: Қайнар, 1992.
6. Сағатов К.С. Биологиялық химия практикумы. - Алматы: Ана тiлi, 1992. - 148 бет
7. Қайырханов Қ.Қ. Жануарлар биохимиясы. - Алматы: Ана тiлi, 1993. - 276 бет
8. Практикум по общей биохимии // Учеб. пособие для студентов хим. спец. пед. ин-тов. Филиппович Ю. Б., Егорова Т.А., Севастьянова Г.А. - М.: Просвещение, 1982. - 311 с.
9. Землянухин А.А. Малый практикум по биохимии // Учеб. пос. для студ. биол. спец-тей вузов. – Воронеж: Изд-во ВГУ. – 1985. – 128 с.
10. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии // Учеб. пос. для мед. вузов. – М.: Высшая школа, 1988. – 239 с.
11. Важева Н.В. Лабораторные работы по биохимии // Метод. реком. для студ-в спец-тей «Химия» и «Биология». - Костанай: КГПИ, 2005. – 36 с.
МАЗМҰНЫ
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4
1. Белоктар. Зертханалық жұмыс № 1. Белоктарға және амин қышқылдарына
сапалық реакциялар
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 5
2. Зертханалық жұмыс № 2. Белоктарды тұндыру реакциялары ... ... ... ... 11
3. Зертханалық жұмыс № 3. Казеинді бөліп алу және оның изоэлектрлік
нүктесін
анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... .13
4. Зертханалық жұмыс № 4. Белоктар
диализі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...16
5. Зертханалық жұмыс № 5. Қағаздағы хроматография әдісімен
амин қышқылдарын
бөлу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... 18
6. Зертханалық жұмыс № 6. Серенсен бойынша формольдік
титрлеу арқылы аминдік азот мөлшерін анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .20
7. Ферменттер. Зертханалық жұмыс №7. Биологиялық материалдағы
ферменттерді ашу
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... 22
8. Зертханалық жұмыс № 8. Ферменттердің қасиеттері
... ... ... ... ... ... ... ..25
9. Ферменттер активтілігін сандық анықтау.
Зертханалық жұмыс № 9. Каталаза активтілігін анықтау
... ... ... ... ... ... ...30
10. Зертханалық жұмыс № 10. Субстрат ретінде пирокатехинді
пайдалану арқылы пероксидаза активтілігін анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... .33
11. Зертханалық жұмыс № 11. Сүт майының гидролизі реакция-
сындағы липаза активтілігін анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 34
12. Витаминдер. Зертханалық жұмыс № 12. Витаминдерге сапалық реакциялар
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ... ... ... 36
13. Зертханалық жұмыс № 13. С витаминінің мөлшерін иодометрлік титрлеу
арқылы сандық анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 41
14. Белоктардың қорытылуы. Зертханалық жұмыс № 14. Белоктардың пепсин және
ұйқы безі ферменттері әсерінен қорытылуы ... ... ... ... ... ... ..42
15. Нуклеин қышқылдары. Зертханалық жұмыс № 15. Ашытқыдан
рибонуклеопротеиндерді бөліп алу және гидролиз өнімдерін
сапалық анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ..44
16. Көмірсулар. Зертханалық жұмыс № 16. Көмірсуларға сапалық реакциялар
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ... ... ... 46
17. Зертханалық жұмыс № 17. Көмірсулардың ас қорыту жолында қорытылуы
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ... ... ...49
18. Зертханалық жұмыс № 18. Ашу процесі кезінде бейорганикалық фосфаттың
пайдаланылуы
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
..50
Пайдаланылған әдебиет
тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
...52
КІРІСПЕ
Биологиялық химия курсы тіршіліктің материалдық негізі мағынасын, тірі
организмдерде өтетін химиялық және биологиялық процестерді түсіндіре
отырып, биология-химия мамандықтары студенттерін дайындау жүйесінде маңызды
рөл атқарады.
Биохимия курсының мақсаты – тірі организмдерді құрайтын қосылыстардың
негізгі кластарының химиялық құрамы, құрылысы және тіршілік процестеріне
қатысуы жөнінде білім қалыптастыру.
Оқу құралына енгізілетін зертханалық жұмыстар студенттерге биохимиядан
теориялық білімді бекітуге, биохимиялық экспериментті, соның ішінде
модельді тәжірибелер түріндегі экспериментті жүргізудің практикалық
дағдыларын алуға көмектесуі тиіс.
Берілген оқу құралына химик және биолог-студенттерге арналған
биохимияның Белоктар, Ферменттер, Витаминдер, Көмірсулар тараулары
бойынша 18 зертханалық жұмыстың әдістемелік нұсқаулары енгізілген. Әрбір
жұмыстың сипаттамасы теориялық бөлімнен және жұмыстың мақсаты,
тәжірибелерді жүргізу барысы, олардың химизмі көрсетілген практикалық
бөлімнен тұрады. Жұмысқа дайындалу және оның нәтижелерін қорытындылауға
көмек ретінде бақылау сұрақтары келтірілген.
Зертханалық жұмыстар оқытудың кәсіби бағдары ескеріліп таңдалып
алынған. Олар студенттерді тек биохимиялық эксперимент жүргізу дағдысын
алып қана қоймай, сонымен қатар болашақ биология және химия мұғалімі
қызметінде пайдалануға қажет болатын биохимиялық тәжірибелерді таңдап алып,
мектеп бағдарламасына бейімдеуге бағыт береді. Оқу құралының ерекшелігі –
биохимияны оқытуды биосфераның антропогенді ластану проблемаларымен
байланыстыратын биохимиялық-экологиялық эксперименттердің енгізілуі.
Оқу құралы биохимия элементтерін тек биология және химия сабақтарында
пайдаланып қана қоймай, оқушылардың ғылыми жұмысын ұйымдастыруға пайдалана
білу дайындығын алуда болашақ мұғалімдерге көмегін тигізеді.
БЕЛОКТАР
Зертханалық жұмыс №1
Белоктарға және амин қышқылдарына сапалық реакциялар
Теориялық бөлім
Белоктар – бір-бірімен пептидтік байланыстар арқылы байланысқан амин
қышқылдары қалдықтарынан тұратын азотты жоғары молекулалы қосылыстар
(биополимерлер). Белоктарды басқаша протеиндер деп атайды. Белоктардың
мономерлері – протеиногенді амин қышқылдары. Амин қышқылдарының жалпы
формуласы келесідей:
Н2N – CН – СООН
ﺍ
R
Протеиногенді амин қышқылдарының саны – 20. Амин қышқылдары бір-бірінен
бүйір радикалының R структурасы және соған байланысты физика-химиялық
қасиеттері бойынша ерекшеленеді, мысалы:
Н2N – CН2 – СООН глицин (гли) Н2N – CН – СООН серин (сер)
ﺍ
СН2ОН
Н2N – CН – СООН аланин (ала) Н2N – CН – СООН цистеин (цис)
ﺍ
ﺍ
СН3
СН2SH
Радикалдардың химиялық табиғаты алуан түрлі. Радикалдарда әртүрлі
функционалдық топтар болғандықтан амин қышқылдары да, белоктар да басқа
заттармен химиялық реакцияларға белсенді түрде түседі. Нақты белок
молекуласындағы амин қышқылдары қалдықтарының орналасу тәртібі оның 1-ші
ретті құрылымын анықтайды. Белоктың 1-ші ретті құрылымы оның құрылымының
келесі деңгейлерін және соған байланысты болатын биологиялық функциясын
анықтайды.
Биологиялық маңызы бойынша амин қышқылдары алмастыруға болатын,
жартылай алмастырылатын және алмастыруға болмайтын деп бөлінеді.
Алмастыруға болмайтын амин қышқылдары адам организмінде синтезделмейді,
сондықтан олар тағаммен бірге өтуі тиіс. Жартылай алмастырылатын амин
қышқылдары организмде жеткіліксіз мөлшерде түзіледі, сондықтан олардың
жетіспейтін мөлшері белокты тағаммен толықтырылуы тиіс.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- белоктардың сапалық реакцияларымен танысу;
- олардың ішінен мектепте Белоктар тақырыбын оқу кезінде пайдалануға
болатындарын бөліп көрсету.
Белоктарды ашу және олардың аминқышқылдық құрамын анықтау үшін сапалық
(түсті) реакциялар қолданылады. Барлық белоктар үшін тән (биурет, нингидрин
реакциялары) және белоктың құрамындағы жеке амин қышқылдары үшін тән
(ксантопротеин реакциясы, Миллон реакциясы, Фоль реакциясы және т.б.) түсті
реакциялар болады. Реакцияларда түсті өнімдердің түзілуі белок құрамына
кіретін амин қышқылдарының белгілі бір топтарына және пептидтік
байланыстардың болуына байланысты болады.
Жұмыс нәтижелерін кесте түрінде көрсету және түсініктеме қорытындылар
жасау.
1. Биурет реакциясы 2-ден кем емес пептидтік байланыстары бар
қосылыстар үшін тән. Мұндай қосылыстар ішіндегі қарапайымы – биурет Н2N –
СО – NН – СО – NН2 реакцияға атау берді. Бос амин қышқылдары әдетте биурет
реакциясына түспейді.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 5 тамшысына 5 тамшы 10 %-дық NаОН
және 1 тамшы 1 %-дық СuSО4 ерітіндісін қосады. Араластырады. Ерітінді
түсінің өзгеруін бақылау. Реакцияны әртүрлі белок ерітінділерімен жасау,
олардың реакция нәтижесіндегі түсін салыстыру. Белок ерітіндісі пептидтік
байланыстардың санына қарай көк-күлгіннен қызыл-күлгінге дейінгі түстерді
береді.
Реакция химизмі. Күлгін түстің пайда болуы мыс иондарының белоктың
пептидтік топтарымен комплексті қосылыс түзуіне байланысты. Координациялық
байланыстар түзу үшін пептидтік байланыстар енолдық формаға өтуі тиіс деп
есептеледі:
О H ОН
ﺍﺍ ﺍ ﺍ
– С – N– ↔ – С = N –
енолды форма
Түсті комплекс құрылысы шамамен келесідей:
2. Нингидрин реакциясы бос амин топтарының болуына байланысты,
сондықтан белоктармен де, амин қышқылдарымен де орындалады.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 1 мл-не 1-2 тамшы 1 %-дық
нингидриннің ацетондағы ерітіндісін қосады. Ішіндегісін араластырғаннан
кейін пробирканы 70 0С температуралы су моншасына бірнеше минут қояды. Көк-
күлгін түс пайда болады.
Реакция химизмі. Нингидрин қатысында қыздырғанда амин қышқылдары мен
пептидтердің α-амин тобы тотыға дезаминделеді, ал нингидрин молекуласы
тотықсызданады. Тотықсызданған нингидрин аммиакпен және тотыққан
нингидриннің басқа молекуласымен әрекеттесіп, боялған қосылыс түзеді (көк-
күлгін түсті Руэман комплексі). Реакцияның қорытынды теңдеуі:
амин қышқылы тотыққан тотықсызданған
альдегид
нингидрин
нингидрин
көк-күлгін
түсті бояу
3. Ксантопротеин реакциясы. Бұл реакцияға аромат амин қышқылдары және
құрамына сондай амин қышқылы қалдықтары (тирозин, фенилаланин, триптофан)
кіретін белоктар түседі. Реакцияның аты гректің ксантос - сары деген
сөзінен шыққан, себебі азот қышқылы әсерімен реакцияны жүргізгенде сары
түсті нитроқосылыстар түзіледі: Концентрлі азот қышқылы тигенде тері мен
тырнақтың сары түске боялуы олардағы белоктардың аромат амин қышқылдары
азот қышқылымен әрекеттесуінен болады.
Тәжірибе барысы. Сақтықпен жұмыс істеу! Белок ерітіндісінің 1 мл-не 1-2
тамшы конц. НNО3 қосып, әлсіз қыздырады. Алдымен түзілетін ақ тұнба сары
түске боялады. Салқындағаннан кейін пробирка ішіндегісіне тамшылатып, қызыл-
сары түс пайда болғанша 30 %-дық NаОН ерітіндісі қосылады.
Реакция химизмі. Алдымен азот қышқылы әсерінен белок денатурациясы
жүреді. Қыздырғанда сары түсті нитроқосылыстардың түзілуімен тирозин мен
триптофанның (фенилаланин қиын нитрленеді) аромат радикалдары бойынша
нитрленуі жүреді. Сілтілік ортада хромофор топтары бар қосылыстар
түзілгендіктен қызыл-сары түс пайда болады. Тирозин мысалында жүретін
реакциялардың схемасын жазуға болады:
тирозин динитротирозин
хиноидты формасы
(сары түсті)
динитротирозиннің натрий тұзы
(қызыл-сары
түсті)
4. Фоль реакциясы құрамында күкіртті амин қышқылы бар белоктар үшін
тән.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 5 тамшысына 5 тамшы 30 %-дық NаОН
және 1 тамшы 5 %-дық (СН3СОО)Рb ерітіндісін қосады. Сақтықпен қыздыру.
Сұйықтық қараяды, қорғасын сульфидінің қара тұнбасы түзіледі.
Реакция химизмі.
СH2SH CH2OH
( (
CHNH2 + 2 NaOH (( CHNH2 + Na2S + H2O
( (
COOH COOH
цистеин серин
Натрий сульфидін анықтау үшін қорғасын ацетатын пайдаланады, ол натрий
гидроксидімен әрекеттесіп, плюмбитке айналады:
Pb(CH3COO)2 + 2NaOH ( Pb(ONa)2 + 2CH3COOH
Қорғасын мен күкірт иондарының әрекеттесуі нәтижесінде қара немесе
қоңыр түсті қорғасын сульфиді түзіледі:
Na2S + Pb(ONa)2 + 2H2O ( PbS( + 4NaOH
5. Паули реакциясы гистидин және тирозин қалдықтары бар белоктарға тән.
Тәжірибе барысы. Пробиркада 3 тамшы 1 %-дық сульфанил қышқылының тұз
қышқылындағы (5 %-дық) ерітіндісіне 3 тамшы 0,5 %-дық NaNO2 ерітіндісін
қосады, тез араластырады және 5 тамшы белок ерітіндісін қосады,
араластырады және 5 тамшы 10 %-дық Na2СО3 ерітіндісін қосады. Сұйықтық
қызылсары-қызыл немесе шие-қызыл түске боялады.
Реакция химизмі. Сульфанил қышқылының қышқыл ерітіндісі натрий
нитритімен әрекеттескенде диазобензолсульфон қышқылы түзіледі, ал соңғысы
гистидинмен (тирозинмен) боялған азоқосылыс береді:
сульфанил қышқылы
диазобензолсульфон қышқылы
гистидин
2,5-бис-n-сульфобензолазогистидин
6. Миллон реакциясы тирозин және құрамында тирозин қалдықтары бар
белоктарға тән.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 5 тамшысына 1 тамшы Миллон
реактивін (сынап нитраты мен нитритінің конц. азот қышқылындағы ерітіндісі)
қосады және сақтықпен қайнағанша қыздырады. Қызғылт немесе қызыл түсті
тұнба түзіледі (тирозиннің сынапты нитротуындысы).
Реакция химизмі.
Кесте
Реакция аты Қолданылған Байқалатын Ашылатын топтар
реактивтер ерітінді немесе
тұнба түсі
Қорытынды. Жұмыс мақсатына сәйкес қорытынды жасау. Мектеп практикасында
қолдануға болады деген реакциялардың таңдап алыну себебін көрсету.
Бақылау сұрақтары
1 Қай органикалық қосылыстар амин қышқылдары деп аталады? Амин қышқылдарына
қандай химиялық қасиеттер тән?
2. Аспарагин қышқылы мысалында амин қышқылдарының амфотерлілігін
көрсетіңіз.
3. Белоктың аминқышқылдық құрамы және бірінші ретті құрылымы
түсініктерінің айырмашылығы неде?
4. Белоктың 2-ші ретті құрылымы деген не?
5. Белоктың 3-ші ретті құрылымы деген не? Оны қамтамасыз ететін
әрекеттесулердің типтері қандай?
6. Белоктардың сапалық реакцияларын қалай жіктеуге болады?
7. Реакциялардың қайсысы сақтықпен орындауды талап етеді, не себепті?
8. Нингидрин реакциясы көмегімен қандай атомдық топтар ашылады?
9. Белоктағы цистеинді, гистидинді қалай ашуға болады?
10. Миллон реакциясының көмегімен белоктағы қай амин қышқылы ашылады?
11. Ксантопротеин реакциясымен белоктардағы қай амин қышқылдары қалдықтары
ашылады? Реакция неге солай аталады? Қайсысы – тирозин немесе фенилаланин –
оңай нитрленеді? Не себепті?
12. Биурет реакциясы терминінің шығу тегі қандай? Оның химизмі қандай?
13. Мектепте пайдалануға қай реакцияларды және қандай критерийлері бойынша
таңдап алдыңыз?
Зертханалық жұмыс № 2
Белоктарды тұндыру реакциялары
Теориялық бөлім
Белоктарды тұндыру реакцияларын екі топқа бөлуге болады. Қайтымды
тұндыру кезінде ерітіндіден бөлініп шығатын белок өзінің табиғи қасиеттерін
сақтайды және қайтадан ерітіндіге өткізіле алады. Белоктарды аммоний,
сілтілік және сілтілік-жер металдары тұздары әсерімен тұнбаға түсіру
қайтымды тұндыру мысалы бола алады. Бұл тұздар белоктың сулы қабықшасын
жояды және зарядсыздандырады. Белоктардың сулы қабықшасы шамасы мен тұздар
концентрациясы арасында тікелей байланыс бар: гидраттық қабықша аз болған
сайын тұздар да аз қажет болады. Мысалы, ірі, ауыр молекулалары бар және су
қабықшасы аз болатын глобулиндер ерітіндіні тұздармен толық
қанықтырмағанда тұнбаға түседі. Ал неғұрлым кіші молекулалар ретіндегі және
үлкен су қабықшасымен қоршалған альбуминдер тұнбаға ерітіндіні тұзбен толық
қанықтырғанда түседі. Тұздармен тұнбаға түсіру белок фракцияларын бөлу үшін
қолданылады.
Қайтымсыз тұндыру белок құрылымының молекула ішіндік терең
өзгерістерімен байланысты, бұл кезде оның табиғи қасиеттері (ерігіштігі,
биологиялық активтілігі және т.б.) жойылады. Мұндай белок денатурацияланған
белок, ал процесс денатурация деп аталады. Белоктардың денатурациясы күшті
қышқылдық ортасы бар (рН 1-2) асқазанда жүреді және бұл протеолиздік
ферменттер әсерінен олардың ыдырауына себеп болады.
Денатурация кезінде белоктың 3-ші, 4-ші ретті құрылымдары бұзылады,
биологиялық қасиеттері жойылады. Белоктардың қайтымсыз тұндырылуы оларды
қыздырғанда, минералдық қышқылдармен, кейбір органикалық қышқылдармен
(трихлорсірке, сульфосалицил және т.б. қышқылдар), ауыр металдардың
тұздарымен және басқа заттармен әсер еткенде жүреді (химиялық факторлар).
Мысалы, трихлорсірке қышқылымен тұндыру кейбір зерттеулерде белокты бөліп
алып тастау үшін қолданылады. Белоктардың денатурациясы ауыр металдармен
улануды емдеу негізіне қаланған. Бұл кезде уланған адамға сүт немесе шикі
жұмыртқа ішкізеді, себебі металдар сүт немесе жұмыртқа белоктарын
денатурациялай отырып, олардың бетіне адсорбцияланады және асқазан мен
ішектің кілегейлі қабықшасына әсер етпейді, сонымен қатар қанға
сіңірілмейді.
Денатурацияны болдыратын физикалық факторларға температура, механикалық
әсерлер, ультрадыбыспен өңдеу, ионизациялық сәулелендіру жатады.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- белоктарды қайтымды және қайтымсыз тұндыру реакцияларын жүргізуді
меңгеру;
- белоктар денатурациясы құбылысымен танысу;
- белок қасиеттерін мектепте демонстрациялау үшін тәжірибелер таңдап
алу.
Тәжірибе 1. Жұмыртқа белогы альбуминдері мен глобулиндерін тұзбен
тұндыру арқылы бөлу.
Жұмыртқа белогы ерітіндісінің 2 мл-не сонша көлемде (NН4)2SО4 қаныққан
ерітіндісін қосады. Түскен глобулиндер тұнбасын сүзеді және оның белокты
табиғатын сәйкес реакция көмегімен дәлелдейді. Фильтратқа қаныққанша
(NН4)2SО4 ұнтағын қосады. Альбуминдер тұнбасы беткі қабатқа көтеріледі,
себебі ерітіндінің тығыздығы үлкенірек. Альбуминдердің белокты табиғатын
дәлелдеу. Ерітіндіні аммоний сульфатымен қанықтырудың қандай дәрежесінде
глобулиндер, қандай дәрежесінде альбуминдер тұнбаға түсетіні туралы
қорытынды жасау.
Тәжірибе 2. Белоктарды концентрлі минералды қышқылдармен тұндыру.
Үш құрғақ пробирка алу, біреуіне 5 тамшы конц. НNО3, екіншісіне 5
тамшы конц. НСl, үшіншісіне 5 тамшы конц. Н2SО4 тамызу. Пробиркаларды
еңкейте отырып, әрқайсысына абайлап ішкі қабырғасы бойынша 5 тамшы белок
ерітіндісін қосады. Белок ерітіндісінің қышқылмен жанасу шекарасында сақина
түрінде белок тұнбасы түзіледі. Пробирканы сақтықпен шайқағанда тұнбалар
(конц. НNО3 бар пробиркадағы тұнбадан басқалары) ериді.
Тәжірибе 3. Белоктарды органикалық қышқылдармен тұндыру.
Екі пробиркаға 5-7 тамшыдан белок ерітіндісін құяды және 1-2 тамшыдан
бірінші пробиркаға сульфосалицил қышқылын, екінші пробиркаға трихлорсірке
қышқылын қосады. Тұнбалардың түзілуін байқау. Сульфосалицил қышқылы тек
белоктарды ғана емес, олардың ыдырау өнімдерін де тұнбаға түсіреді.
Трихлорсірке қышқылы тек белоктарды тұнбаға түсіреді де, ал олардың ыдырау
өнімдерін тұнбаға түсірмейді.
Тәжірибе 4. Белоктарды ауыр металдар тұздарымен тұндыру.
Үш пробиркаға 5 тамшыдан белок ерітіндісін құяды. Бірінші пробиркаға 1
тамшы 5 %-дық CuSO4, екіншісіне – 1 тамшы 5 %-дық (СН3СОО)2Pb, үшіншісіне
1 тамшы 5 %-дық ZnSO4 ерітіндісін қосады. Ауыр металдар катиондары әсерінен
белоктың коагуляциялануы жүреді. Тұнбалардың түзілуін байқау. Ауыр металл
тұздарымен улану кезінде белоктың зарарсыздандырғыш ретінде қолданылуы оның
ауыр металл иондарымен берік қосылыстар түзу қасиетіне негізделген.
Жұмыс мақсатына сәйкес жалпы қорытындылар жасау.
Бақылау сұрақтары
1. Денатурация деген не? Ол қандай факторлар және реактивтер әсерінен
жүреді.?
2. Денатурация кезінде белок молекуласының құрылымы қалай өзгереді?
3. Денатурациясын болдырмай белокты ерітіндіден қалай тұндыруға болады?
4. Тұзбен тұндыру термині нені білдіреді?
5. Жұмыртқа белогы ерітіндісіндегі глобулиндерді альбуминдерден қалай бөліп
алуға болады?
6. Альбуминдер мен глобулиндердің белокты табиғатын қандай реакциямен
дәлелдеуге болады?
7. Биологиялық материалдан алынған сірінді анализі кезінде белоктарды бөліп
алып тастау қажет болғанда қай реактивті пайдалануға болады?
8. Тәжірибелердің қайсысын мектепте Белоктар тақырыбын оқыту кезінде
көрсетуге болады?
Зертханалық жұмыс № 3
Казеинді бөліп алу және оның изоэлектрлік нүктесін анықтау
Теориялық бөлім
Белоктардың маңызды қасиеті – олардың қышқылдық та, негіздік те қасиет
көрсету, яғни амфотерлі электролиттер ролін атқару қабілеті. Бұл амин
қышқылдары құрамына кіретін әртүрлі диссоциацияланушы топтар есебінен
қамтамасыз етіледі. Мысалы, белокқа қышқылдық қасиетті аспарагин, глутамин
қышқылдарының карбоксил топтары, ал негіздік қасиетті аргинин, лизин және
гистидин радикалдары береді. Белок құрамында дикарбон қышқылдары неғұрлым
көп болса, оның қышқылдық қасиеттері күштірек байқалады және керісінше.
Аталған топтардың белок молекуласының жалпы зарядын қалыптастыратын
электрлік заряды да болады. Құрамында аспарагин және глутамин қышқылдары
көп болатын белоктардың заряды теріс болады, ал негіздік амин қышқылдарының
көп болуы белок молекуласына оң заряд береді. Осының салдарынан белоктар
электр өрісінде жалпы зарядының шамасына байланысты катодқа немесе анодқа
қарай жылжиды. Мысалы, сілтілік ортада (рН 7-14) белок протонды беріп,
теріс зарядталады, ал қышқылдық ортада (рН 1-7) қышқылдық топтардың
диссоциациясы тежеледі де, белок катионға айналады:
NH3+ Қышқылдық орта NH3+ Сілтілік
орта NH2
R R R
COOH COO -
COO -
Катион Амфион
Анион
рН-тың қышқыл облысы Изоэлектрлік нүкте рН-тың сілтілік облысы
Қосынды заряд оң Қосынды заряд нольге тең Қосынды заряд теріс
Катодқа қарай жылжу Қозғалыс жоқ Анодқа қарай жылжу
Сонымен, белоктың катион немесе анион ретінде болуын анықтайтын фактор
– сутек иондарының концентрациясымен анықталып, рН шамасы арқылы
өрнектелетін орта реакциясы. Бірақ рН шамасының белгілі бір мәндерінде оң
және теріс зарядтардың саны теңесіп, молекула электрнейтралды болады, яғни
ол электр өрісінде жылжымайтын болады. Ортаның рН шамасының осындай мәні
белоктардың изоэлектрлік нүктесі деп аталады. Бұл кезде белок тұрақтылығы
төмен күйде болады және рН-тың қышқыл немесе сілтілік жаққа қарай аздаған
өзгерісі кезінде оңай тұнбаға түседі. Көптеген табиғи белоктар үшін
изоэлектрлік нүкте әлсіз қышқыл ортада (рН 4,8-5,4). Бұл олардың құрамында
дикарбон қышқылдарының басым болатындығын көрсетеді.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- казеинді бөліп алу әдістемесін меңгеру, сапалық реакциялар көмегімен
оның белокты табиғатын және фосфаттардың болуын дәлелдеу;
- казеиннің изоэлектрлік нүктесін анықтау әдістемесін меңгеру.
Тәжірибе 1. Казеинді бөліп алу.
Казеинді сүттен бөліп алу оны изоэлектрлік нүктесінде (рН 4,7) тұндыру
арқылы жүзеге асырылады.
Тәжірибе барысы.
1. Центрифугалық пробиркаға 10 тамшы сүт, 10 тамшы су, 1 тамшы 10 %-дық
сірке қышқылы ерітіндісін құяды. Казеиннің тұнбасы түзіледі.
2. Сынаманы 5 минут 3000 айналыммин. жылдамдықпен центрифугалау.
3. Тұнба үстіндегі сұйықтықты құйып алады, ал тұнбаға 30 тамшы су қосады
және гомогенді массаға дейін мұқият шайқап, араластырады.
4. Казеин ерітіндісін оның құрам бөліктеріне сапалық реакцияларды жүргізу
үшін екі пробиркаға бөледі.
а) Биурет реакциясы:
Казеин ерітіндісіне 10 тамшы күйдіргіш натр ерітіндісін және 1 тамшы
мыс (II) сульфаты ерітіндісін қосады. Пробирка ішіндегісі сілкіп-шайқағанда
көк-күлгін түске боялады.
б) Молибдендік сынама:
Казеин ерітіндісіне 2-3 мл молибден реактивін қосады. Қоспаны
араластырады және 1 минутқа қайнаған су моншасына қояды. Сұйықтық лимон-
сары түске боялады, бұл фосфаттардың бар екендігін көрсетеді.
Тәжірибе 2. Казеиннің изоэлектрлік нүктесін анықтау.
Белоктардың ерітіндісі изоэлектрлік нүктеде неғұрлым тұрақсыз,
сондықтан белоктар оңай тұнбаға түседі. Сол себепті белоктың изоэлектрлік
нүктесін анықтау белок ерітіндісі неғұрлым көп лайланатын рН мәнін
анықтауға келіп тіреледі.
Зерттеу материалы: натрий ацетатының 0,2 М ерітіндісіндегі 0,4 %-дық
казеин ерітіндісі.
Реактивтер: сірке қышқылының 0,2 М ерітіндісі, дистильденген су.
Құрал-жабдықтар: пробиркалары бар штатив, өлшеуіш пипеткалар,
бюреткалар.
Тәжірибе барысы.
Белгілі бір рН мәні бар буферлі ерітінділер дайындау үшін 6 құрғақ
пробиркаға реактивтерді кестеде көрсетілгендей мөлшерде құяды:
Кесте
Сына-мСынама құрамы, мл Қоспаның рН Лайлану
а № мәні дәрежесі
СН3СООН Н2О СН3СООNа
0,2 мольл ерітіндісіндегі
казеин ер-сі
1 1,6 0,4 0,2 3,8
2 0,8 1,2 0,2 4,1
3 0,4 1,6 0,2 4,4
4 0,2 1,8 0,2 4,7
5 0,1 1,9 0,2 5,0
6 0,06 1,94 0,2 5,3
Ерітінділерді мұқият араластырады. Бес-он минуттан кейін ерітінділердің
лайлануы байқалады. Казеиннің изоэлектрлік нүктесіне сәйкес келетін рН мәні
бар пробиркада тұнба неғұрлым көп түседі.
Жұмыс нәтижелерін жазу. Нәтижелерді кесте түрінде көрсету. Алынған
нәтижелерден қорытынды жасау, дәптерге жазу. Лайланудың болмауын -
таңбасымен, лайлану жағдайын +, лайлану едәуір болған жағдайды бірнеше
+ таңбасымен белгілеу.
Бақылау сұрақтары
1. Белоктардың амфотерлілігі немен түсіндіріледі?
2. Қандай амин қышқылдарының басым болуы белокқа теріс заряд береді?
3. Белоктың изоэлектрлік нүктесі деген не?
Зертханалық жұмыс № 4
Белоктар диализі
Теориялық бөлім
Белоктарды табиғи көздерден бөліп шығарғанда соңғы қоспада белоктармен
бірге қосымша кіші молекулалы заттар – органикалық еріткіштер, тұздар және
қышқылдар қалады. Белоктарды олардан тазарту үшін диализ әдісі қолданылады.
Диализ деп жоғары және кіші молекулалы заттарды жартылай өткізгіш
мембраналар (коллодий, целлофан, пергамент) көмегімен бөлу процесін айтады.
Диаметрі үлкен болғандықтан белок молекулалары мұндай мембраналар арқылы
өте алмайды, ал кіші молекулалы заттардың бөлшектері оңай өтеді.
Лабораторияда диализденетін белок ерітіндісі целлофаннан жасалған кішкене
қапшыққа құйылады және соңғысы суы бар ыдысқа салынады. Ыдыс арқылы
үздіксіз өткізілетін су ағыны оған мембрана кеуектері арқылы барлық кіші
молекулалы заттардың өтуін қамтамасыз етеді.
Су
Диализге дейін Диализден кейін
(ақ үлкен дөңгелектер – белок молекулалары, қара дөңгелектер – кіші
молекулалар немесе тұз иондары)
Диализ құбылысы жасанды бүйрек аппараты жұмысы негізіне қаланған, ол
медицинада бүйрек қызметі бұзылуын емдеуде кең қолданылады.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:жартылай өткізгіш мембрана көмегімен белокты кіші молекулалы
қоспалардан тазарту әдістемесін меңгеру.
Зерттеу материалы: 3 %-дық жұмыртқа альбумині.
Реактивтер: (NН4)2SО4 қаныққан ерітіндісі, ВаСl2 5 %-дық, СuSO4 1 %-дық,
NаОН 10 %-дық.
Құрал-жабдықтар: 100 мл-лік стакан, 150Х150 мм өлшемді целлофаннан жасалған
квадрат, шыны таяқшалар, резеңке сақиналар, пробиркалары бар штатив,
өлшеуіш пипеткалар.
Жұмыс барысы.
1. Пробиркаға 2 мл жұмыртқа альбумині ерітіндісін құяды және оған 1 тамшы
аммоний сульфатының қаныққан ерітіндісін қосады. Алдын-ала дистильденген
сумен ылғалдандырылған целлофан квадратынан қапшықша (диализатор) жасайды
және оған пробирка ішіндегісін құяды. Қапшықша ұштарын екі шыны таяқша
арасына қыстырады, таяқшалар бір-бірімен резеңке сақиналар арқылы
біріктіріледі. Қапшықшаны таяқшаларын стакан ернеуіне қоя отырып,
дистильденген суы бар стаканға салады. Қапшықшадағы сұйықтық деңгейі
стакандағы су деңгейінен төмен болуы керек.
2. Диализдің басталуынан 1 сағат өткеннен кейін екі пробиркаға стакандағы
сұйықтықтан 1 мл-ден алып, келесі реакцияларды жүргізеді:
а) SO42--иондарының болуын анықтау: бірінші пробиркаға 3-4 тамшы 5 %-дық
ВаСl2 ерітіндісін қосады және лайлану түріндегі ВаSO4 ақ тұнбасының
түзілуін бақылайды;
б) белоктың болуын анықтау: биурет реакциясын жасайды.
3. Диализатордағы сұйықтықты (диализатты) пробиркаға құйып алады, одан 10
тамшы алып, онымен де биурет реакциясын жасайды.
Дәптерге жұмыс нәтижелерін жазу, диализатор суретін салу, қорытынды
жасау.
Бақылау сұрақтары
1. Табиғи көздерден бөлініп алынған белокты препараттарда кіші молекулалы
қоспалардың болуы белоктардың қандай қасиетімен түсіндіріледі?
2. Диализ деген не?
3. Белоктың кіші молекулалы қоспалардан толық тазаруы қалай бақыланады?
Зертханалық жұмыс № 5
Амин қышқылдарын қағаздағы хроматография әдісімен бөлу
Теориялық бөлім
Белок гидролизатында болатын амин қышқылдарының қоспасын бөлу және жеке
амин қышқылдарын сапалық анықтау үшін қағаздағы таралу хроматографиясы
әдісі кең қолданылады. Бұл әдіс 1903 жылы М.С. Цвет ұсынған
хроматографиялық анализ модификацияларының бірі болып табылады.
Амин қышқылдарын бөлу олардың екі араласпайтын сұйықтықта әр түрлі
еруіне негізделген.
Сұйықтықтың бірі – су, ал екіншісі – сумен қанықтырылған органикалық
еріткіш. Су фазасы қағазға сіңірілгендіктен қозғалғыш болмайды (арнайы
дайындалатын хроматографиялық сүзгі қағазы ылғал камераға орналастырғанда
20-22%-ға дейін суды сіңіреді). Қозғалғыш фаза ретінде сумен қанықтырылған
әр түрлі органикалық еріткіштер алынады (мысалы, изопропил, изобутил немесе
бутил спирттері, фенол және т.б.). Амин қышқылдары қоспасының немесе белок
гидролизатының тамшысын сүзгі қағазының жолағына тамызып, оның ұшын
органикалық еріткішке батырады. Еріткіш қағаз жолағы бойымен көтеріліп,
қағаздағы амин қышқылдарын ерітеді және өз ағынымен қоса әкетеді.
Амин қышқылдарының қағаз бойымен қозғалыс жылдамдығы олардың қозғалғыш
және қозғалмайтын фазаларда ерігіштік дәрежесіне байланысты болады.
Амин қышқылының су фазасындағы ерігіштігі жоғары, ал сулы емес фазадағы
ерігіштігі төмен болса, онда амин қышқылы органикалық еріткіштің таралуымен
салыстырғанда баяу қозғалады.
Сүзгі қағазындағы жеке амин қышқылдарының орнын нингидринмен түсті
реакциясы көмегімен анықтайды.
Хроматограммадағы амин қышқылдарын бөле анықтау осы хроматограммаға
жеке амин қышқылдары ерітінділерін (свидетельдер) тамызу арқылы
жүргізіледі. Сонымен қатар амин қышқылдарын Rf шамасы бойынша да анықтауға
болады:
Мұндағы а – амин қышқылының тамызылған жерінен бастап жүрген қашықтығы, b –
еріткіштің амин қышқылы тамызылған жерден бастап таралу аймағына дейінгі
жүрген қашықтығы. Rf коэффициенті әрбір амин қышқылы үшін тән және
тәжірибенің берілген жағдайларында (еріткіш, температура, қағаз сорты)
тұрақты шама.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- амин қышқылдары таралу хроматографиясы әдістерінің вариантын меңгеру;
- бақылау қоспасындағы амин қышқылдарын анықтау.
Реактивтер: тирозин (0,4 %-дық ерітінді); глутамин қышқылы (0,6 %-дық
ерітінді); лейцин (0,5 %-дық ерітінді); нингидрин (0,2 %-дық ацетондағы
ерітінді); амин қышқылдарының қоспасы (тирозин, глутамат, лейцин);
еріткіштер жүйесі: бутил спирті, сірке қышқылы және су (15:15:10
қатынасында).
Құрал-жабдықтар: хроматографиялық қағаз, Петри табақшасы, пульверизатор,
кептіру шкафы (105 0С), қайшы, шыны капиллярлар, ине.
Жұмыс барысы:
1. Хроматографиялық сүзгі қағазынан өлшемі 11х11 см етіп квадрат қиып
алады. Оның бұрыштырының бірінде жіптен ілгек жасайды. Қағаз бетінде
қарандашпен диагональдар жүргізіп, олардың қиылысу нүктесінен радиусы 10 мм
шеңбер сызады, квадраттың бөліктерін нөмірлейді (сурет).
Содан кейін қағазды Петри табақшасына суреттегідей етіп орналастырады.
Диагональдермен шектелген әрбір доғаның ортасына жіңішке капилляр көмегімен
куә ерітінділерді және амин қышқылдарының зерттелетін қоспасын тамызады
(сурет).
2. Квадраттың ортасын инемен тесіп, оған кішкене үшбұрышты сүзгі қағазынан
жасалған білтені (фитилек) орналастырады. Білтенің төменгі ұшы табақшасының
түбіне тиіп тұруы керек. Табақшаға 10-15 мл еріткіштер қоспасы құйылған.
Хроматограмманы диаметрі дәл сондай екінші Петри табақшасымен тығыз жабады.
Білте арқылы еріткіш жоғары көтеріліп, қағаз бойымен оның центрінен шет
жақтарына қарай таралады. Еріткіштің таралу аймағы Петри табақшасы жауып
тұрған жерге жеткенде хроматограмманы алып, еріткіштің таралу аймағының
шетін белгілейді, қағаздың ілгегі арқылы штативке іледі және 5 минут бойы
оны құрғатқыш шкафта (1050С) кептіреді (еріткіш иісі кеткенше). Кептірілген
хроматограммаға пульверизатормен нингидрин ерітіндісін шашыратып, оны тағы
да кептіргіш шкафқа салады. Бірнеше минуттан кейін хроматограммада амин
қышқылдарының орнын көрсететін дақтар пайда болады.
3. Қоспадағы әрбір амин қышқылы үшін Rf мәндерін есептейді. Олардың Rf
мәндерін куәлардың Rf мәндерімен салыстыру арқылы зерттелген қоспадағы
амин қышқылдарын анықтайды. Хроматограмманы дәптерге жапсырып қояды.
Бақылау сұрақтары
1. Амин қышқылдарын қағаздағы хроматография әдісімен бөлу қай құбылысқа
негізделген?
2. Қағаздағы хроматографияны жүргізу үшін қандай еріткіштер қолданылады?
3. Амин қышқылдарының хроматографиялық қағаз бойынша қозғалу жылдамдығы
неге тәуелді болады?
4. Қағаздағы амин қышқылдарының орнын қалай анықтайды?
Зертханалық жұмыс № 6
Аминдік азот мөлшерін формольдік титрлеу арқылы анықтау
Теориялық бөлім
Белоктардың қышқылдар немесе ферменттер қатысындағы гидролизі кезінде
бос амин және карбоксил топтары бар амин қышқылдары түзіледі. Судағы
ерітінділерде амин қышқылдары молекула ішіндік тұздар түзеді, сондықтан
амин топтарын формальдегидпен бекітпесе, олар негіздік қасиетін жоғалтады.
Серенсен бойынша амин топтарының мөлшерін анықтау үшін оларды
формальдегидпен байланыстырып, қалған бос карбоксил топтарын сілтімен
титрлейді:
R H
R
׀ ׀
׀
Н – С – NH2 + CO → H – C – N = CH2
+ H2O
׀ ׀ ׀
COOH H
COOH
... – СООН + NаОН → ... – СООNа + H2O
Карбоксил топтарының мөлшері титрлеуге кеткен сілтінің мөлшері бойынша
анықталады. Жуықтап алғанда амин қышқылдарындағы карбоксил топтарының саны
амин топтарының санына тең болғандықтан амин топтарының да мөлшері
анықталады.
Бұл әдісті әртүрлі белоктар гидролизі процесін бақылау, атап айтқанда,
протеолиздік ферменттердің немесе ферменттік препараттардың әсерін зерттеу
үшін пайдалануға болады. Белок гидролизінің аяқталуы гидролизаттағы амин
және карбоксил топтарының мөлшері одан әрі өспейтін және биурет реакциясы
байқалмайтын моментпен сәйкес келеді.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты: формольдік титрлеу әдісін меңгеру және берілген биологиялық
материал үлгісіндегі аминдік азот мөлшерін анықтау.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: таразы, воронкалар, 20 және 10 мл-лік
пипеткалар, фарфор келі (ступка), 100 мл-лік конустық колбалар, сүзгі
қағаз, шыны таяқшалар, қайшы, бюреткалар, 50 мл-лік өлшеуіш колбалар,
ұсақталған шыны; 0,2 н. NаОН ерітіндісі; 0,2 н. НСl ерітіндісі; формольдік
қоспа (50 мл 30-40 %-дық формалин ерітіндісі + 1 мл 0,1 %-дық
фенолфталеиннің спирттегі ерітіндісі, қоспаны 0,2 н. NаОН ерітіндісімен
әлсіз қызғылт түске дейін жеткізеді).
Зерттеу материалы: Бұршақ тұқымдас өсімдіктердің өскіндері (проростки)
немесе осы өсімдіктердің тұқымдары.
Жұмыс барысы:
Ступкада 5 г тұқымды немесе оның өскіндерін 5-10 мл дистилденген сумен
және ұсатылған шынымен қосып, үгітеді. Осы қоспаны сыйымдылығы 50 мл
өлшеуіш колбаға ауыстырып, сумен шаю арқылы колбаның белгіленген сызығына
дейін жеткізеді, араластырады және сүзеді. Фильтратта аминдік азотты
анықтайды. Тәжірибе үшін 20 мл фильтрат алып, оған 10 мл формольдік қоспа
қосады және бюреткадан 0,2 н. сілті ерітіндісін ашық қызғылт түс пайда
болғанша қосады. Сілтінің артық мөлшерін 0,2 н. НСl ерітіндісімен әлсіз
қызғылт түске дейін кері титрлейді.
Осымен бір мезгілде бақылау титрлеуін жүргізеді. Ол үшін қайнатылып,
салқындатылған 20 мл суға 10 мл формольдік қоспа және бюреткадан 0,2 н.
сілті ерітіндісінің артық мөлшерін қосады. Содан кейін тұз қышқылымен
ерітіндіні әлсіз қызғылт түске дейін жеткізеді.
Есептеу келесі түрде жүргізіледі:
Бақылау Тәжірибе
Қосылады
3,0 мл 0,2 н. NаОН 7,0 мл 0,2 н. NаОН
2,8 мл 0,2 н. НСl 0,3 мл 0,2 н. НСl
Айырма 0,2 мл 0,2 н. NаОН 6,7 мл 0,2 н. NаОН
Яғни тәжірибеге 6,7 мл сілті ерітіндісі, бақылауға 0,2 мл кетті, 6,5 мл
0,2 н. NаОН жұмсалды. Реакция теңдеуінен 1 мл нормальдық сілті ерітіндісіне
14 мг аминдік азот сәйкес келетіні белгілі; онда 1 мл 0,2 н. NаОН
ерітіндісіне 2,8 мг азот сәйкес келеді. Осыдан өсімдік ерітіндісінің
(вытяжка) алынған көлеміндегі аминдік азоттың мөлшері 6,5*2,8=18,2 мг екені
шығады. Құрғақ затқа шаққанда:
Мұндағы 50 мл - өсімдік ерітіндісінің жалпы көлемі; 20 мл – титрлеу үшін
алынған ерітінді көлемі; 5 г - өсімдік массасы.
Белок гидролизаттарын анализдегенде жұмыс нәтижесін келесі кесте
түрінде көрсету:
Жұмыс барысы Белок Белок Белок Аминдік азот
гидролизіне гидролизі гидролизі мөлшері, мг
дейінгі NаОН басталуынан 45басталуынан 90
көлемі, мл минут өткенненминут өткеннен
кейінгі NаОН кейінгі NаОН
көлемі, мл көлемі, мл
Ферменттік препарат табиғатына және гидролизді жүргізу жағдайына байланысты
белок гидролизі жүруінің жылдамдығы және оның толықтығы туралы қорытынды
жасау.
ФЕРМЕНТТЕР
Зертханалық жұмыс № 7
Биологиялық материалдағы ферменттерді ашу
Теориялық бөлім
Ферменттер – тірі организмдердегі реакцияларды жылдамдататын белок
табиғатты биологиялық катализаторлар. Олар микроорганизм клеткаларында
болады, жануар және өсімдік тканьдері құрамына кіреді. Спектрлік анализ
немесе басқа бір әдіс көмегімен анықталатын кейбір ферменттерден
басқаларының болуын катализдейтін спецификалық реакциясының жүруі бойынша
анықтауға болады. Биологиялық материалдағы ферментті ашу үшін ол
жылдамдататын реакцияның қандай да бір сыртқы белгілері болуы керек.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты: әртүрлі көздерден алынған ферменттер әсерін анықтау
реакцияларын жүргізу әдістемесін меңгеру. Мектеп практикасында пайдалануға
болатын тәжірибелерді таңдап алу.
Тәжірибе 1. Қытайбұршақ (соя) ұнындағы уреазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: термостат, екі 2 мл-лік бір сызықты
пипетка, қытайбұршақ ұны, мочевина (1 %-дық), фенолфталеин (1 %-дық
спирттік ерітінді). Тәжірибе үшін қытайбұршақтан алынған ұнтақтан уреаза
ерітіндісі алдын-ала дайындалады [Ә-8; 123 бет].
Тәжірибе барысы: Мочевина ерітіндісінің (1 %-дық) 2 мл-не 2 тамшы
фенолфталеин және 2 мл уреаза ерітіндісі (1:10) қосылады. Қоспаны мұқият
араластырады және 30 минутқа 38 0С температуралы термостатқа қояды. Осыған
параллель тәжірибені уреазаның қайнатылған ерітіндісімен қояды. Бірінші
пробирканың ішіндегісі түзілген аммиак есебінен ерітіндінің рН мәні
сілтілік облысқа ығысатындықтан малина-қызыл түске түске боялады.
Тәжірибе 2. Шикі сүттегі альдегидоксидазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: су моншасы, лабораториялық термометр,
бір сызықты 1 мл-лік және 5 мл-лік пипеткалар; сиыр сүті, вазелин майы,
формальдегид (0,4 %-дық), метилен көгі (0,01 %-дық).
Тәжірибе барысы: Үш пробиркаға 5 мл-ден саумал сиыр сүтін құяды. Бір
сынаманы 2-3 минут қайнатып, салқындатады. Қайнатылған сынамаға және
қайнатылмаған сынамалардың біріне 1 мл-ден 0,4 %-дық формальдегид
ерітіндісін, ал басқа қайнатылмаған сынамаға 1 мл су су қосады. Содан кейін
үш пробиркаға да 1 мл-ден 0,01 %-дық метилен көгі ерітіндісін құяды.
Пробирка ішіндегілерін мұқият араластырып, әрқайсысына сұйықтық ауадағы
оттегімен жанаспау үшін 3-4 тамшыдан вазелин майын құяды. Барлық
сынамаларды 40 0С-қа дейін қыздырылған су моншасына қояды. Белгілі бір
уақыттан кейін субстрат (формальдегид) бар қайнатылмаған сынамадағы
сұйықтық метилен көгінің тотықсызданған формасы түзілуі есебінен
түссізденеді:
Егер метилен көгінің түссіз ерітіндісін ауада сілкісе, онда ерітінді
қайтадан көк түске боялады: МК·Н2 + О2 → МК + Н2О2
Бірінші қайнатылған сынамада активті фермент және қайнатылмаған
сынамалардың бірінде субстрат болмағандықтан оларда метилен көгі
түссізденбейді.
Тәжірибе 3. Картоптағы тирозиназаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: су моншасы, ұсақтағыш (терка), сыртқы
диаметрі 100 мм Бюхнер воронкасы, бір сызықты 1 мл-лік пипетка, дәке
(марля), шикі картоп, тирозин (қаныққан ер.).
Жұмыс барысы. Картопты ұсақтап, бірнеше қабат дәке арқылы өткізеді және
алынған экстрактты тез Бюхнер воронкасы арқылы сүзеді. Пробиркаға 1 мл
экстракт, 2-3 тамшы тирозин ерітіндісін құяды, араластырады және пробирканы
40 0С-қа дейін қыздырылған су моншасына қояды. Сұйықтық ауамен жақсы
жанасуы үшін пробирканы арасында сілкіп-шайқап қойып отырады. Қоспаның түсі
ақшыл қызыл, содан кейін қоңыр және 1-2 сағаттан кейін қара болады, себебі
тирозиназа (монофенолоксидаза) әсерінен тирозин қызыл түске боялған аралық
қосылыстар арқылы қара азотты пигмент – меланинге айналады. Реакция химизмі
[8; 133 бет].
Тәжірибе 4. Картоптағы пероксидазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: Ұсақтағыш (терка), шикі картоп,
пирогаллол (1 %-дық), сутек пероксиді (2 %-дық).
Тәжірибе барысы. Картопты ұсақтайды. Оның аздаған мөлшерін сықпай
пробиркаға ауыстырады, 1-2 мл 1 %-дық пирогаллол ерітіндісін және 1-2 тамшы
2 %-дық сутек пероксиді ерітіндісін қосады. Тұрғанда пурпурогаллиннің қоңыр-
сары тұнбасы түзіледі:
Пирогаллолдың және аралық өнімдердің бірнеше рет дегидрленуі (тотығуы)
пероксидаза қатысуымен жүзеге асырылады. Пероксидаза әр жағдайда үзіліп
алынған сутек атомдарын сутек пероксидіне береді.
Тәжірибе 5. Тұқымдардағы липазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: фарфор келі, 50 мл-лік өлшеуіш цилиндр,
25 мл-лік бюретка, 100 мл-лік конустық колба, 2 және 5 мл-лік пипеткалар;
тұқымдар, вазелин майы, фосфаттық буфер (0,2 М; рН 4,8), этил спирті (96 %-
дық), диэтил эфирі, фенолфталеин (1 %-дық спирттік ерітінді), 0,1 н. калий
гидроксиді.
Тәжірибе барысы. Тазартылған 0,2 г тұқымды фарфор келіде мұқият
үгітеді, содан кейін оны 3 мл вазелин майымен және 2 мл 0,2 М фосфаттық
буфермен (рН 4,8) араластырады. Қоспаны 30 минут инкубациялайды, 30 мл 96 %-
дық этил спиртін және 15 мл эфир қосады. Мұқият араластырады, содан кейін
қоспаны 100 мл-лік конустық колбаға ауыстырады, 2-3 тамшы фенолфталеин
ерітіндісін қосады және бөлініп шыққан май қышқылдарын 0,1 н. КОН
ерітіндісімен титрлейді (лабораториядағы барлық жанарғылар сөндірілген болу
керек!). Бақылау сынамасы ретінде инкубацияланбаған қоспаны пайдаланады.
Тәжірибелік және бақылау сынамаларында титрлеуге кеткен сілті мөлшеріндегі
айырма липаза активтілігінің көрсеткіші болып табылады.
Бақылау сұрақтары
1. Ферменттер деп қандай заттар аталады?
2. Табиғаты белок емес катализаторлардан ферменттердің әсер ету
ерекшеліктері қандай?
3. Биологиялық материалдағы ферменттерді қалай анықтауға болады?
4. Тәжірибелердің қайсыларын мектеп курсында пайдалануға болады?
Зертханалық жұмыс № 8
Ферменттердің қасиеттері
Теориялық бөлім
Ферменттерде белоктардың барлық қасиеттері болады. Бірақ клеткада басқа
функция атқаратын белоктармен салыстырғанда ферменттердің тек өзіне тән
спецификалық қасиеттері бар. Ферменттердің активтілігіне температура,
ортаның рН мәні, кіші молекулалы қосылыстар мен иондардың, әсіресе ауыспалы
металл иондарының болуы әсер етеді. Соңғылары ферменттерге активтендіруші
де, ингибирлеуші де әсер етеді.
Ферменттің активтілігі максимал болатын температура ферменттің
температуралық оптимумы деп аталады. Жануар текті ферменттер үшін
температуралық оптимум 40-50 0С аралығында болады.
Ферменттердің көпшілігі бейтарапқа жақын рН мәндерінде жоғары
активтілік көрсетеді. Тек кейбір жеке ферменттер ғана күшті қышқылдық
немесе күшті сілтілік ортада жұмыс істейді. Мысалы, белоктарды асқазанда
гидролиздейтін пепсин ферментінің активтілігі рН 1,5-2,5 мәндерінде
максимал болады. Әлсіз сілтілік ортада ішекте шоғырланған ферменттер жұмыс
істейді. Әрбір ферменттің рН-оптимумы болады. Ортаның рН мәніне байланысты
фермент-белоктың активті центріндегі ионогенді топтардың иондану
дәрежесінің өзгеруі активті центр конформациясының, соның салдары ретінде
фермент активтілігінің өзгеруіне әкеледі. Амилаза активтілігінің критерийі
ретінде бастапқы субстрат (крахмал) мөлшерінің белгілі бір уақыт ішінде
азаюы қолданылады.
Әсер етуінің спецификалығы – ферменттің басты қасиеттерінің бірі.
Спецификалылық – бұл субстратқа (немесе субстраттарға) қатысты ферменттің
таңдау қасиеті. Мұның негізгі себебі – фермент пен субстрат структурасының
белгілі бір дәрежеде үйлесімді (комплементарлы) болуы. Абсолютті және
салыстырмалы спецификалылық деп бөледі. Абсолютті спецификалылық фермент
тек бір ғана субстраттың айналымын жылдамдатқан кезде байқалады. Мұның
классикалық мысалы мочевина гидролизін катализдейтін уреаза болып табылады.
Салыстырмалы (топтық) арнайылылық фермент химиялық структурасы жақын бір
типтегі реакциялар тобын жылдамдатқан кезде байқалады. Мысалы, липаза
триацилглицериндер гидролизін жылдамдатады, ал олар май қышқылдық құрамы
және қасиеттері бойынша ерекшеленеді. Бірақ олардың барлығында липаза әсер
ететін күрделі эфирлік байланыстар болады.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты: α-амилаза ферменті активтілігінің температураға, ортаның
рН мәніне, активаторлар мен ингибиторлар қатысуына тәуелділігін зерттеу;
мектепте демонстрациялық эксперимент ретінде және факультативтік сабақтарда
пайдалануға болатын тәжірибелерді бөліп көрсету.
Зерттеу материалы: сілекей ерітіндісі, ашытқы сахаразасы.
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: 100 мл-лік стакандар, 50 мл-лік өлшеуіш
цилиндр, воронка, пробиркалар, пипеткалар, заттық шынылар, су моншасы,
термостат, мұз; 1 %-дық крахмал клейстері, Люголь ерітіндісі (КI
ерітіндісіндегі I2), Фелинг реактиві, 1 %-дық НСl, 1 %-дық NаОН, 1 %-дық
NаСl, 1 %-дық СuSО4, ашытқы, сахараза ерітіндісі.
Тәжірибе 1. Сілекей α-амилазасы әсерінен жүретін крахмал гидролизі
Ауыз қуысындағы ферменттердің көзі – сілекей бездерінің шырыны, сонымен
қатар бактериялардың ферментативті қызметі өнімдері, лейкоциттердің ыдырау
өнімдері. Сілекейдің неғұрлым маңызды ферменті – крахмал гидролизін
жылдамдататын α-амилаза. Тәжірибелерде иодпен көк түс бермейтін кіші
молекулалы декстриндер мен мальтозаға дейін жүретін крахмал гидролизі
уақытымен сипатталатын α-амилаза активтілігі бақыланады.
Тәжірибе барысы.
а) Сұйылтылған сілекей дайындау
Тамақтың қалдықтарын кетіру үшін ауызды 2-3 рет сумен шаю керек. Содан
кейін ауызға 40 мл суды ұрттап, 3-5 минут ауызды шайып тұрады, алынған
сұйықтықты стаканға төгеді. Осы сұйықтықты мақта арқылы сүзіп, фильтратты
жұмысқа пайдаланады.
б) Екі пробиркаға 5 мл-ден 1 %-дық крахмал ерітіндісін құяды. Бірінші
пробиркаға 5 мл сілекей ерітіндісін, екіншісіне 5 мл дистильденген су
құяды, таяқшамен араластырады.
Пробиркаларды 40 0С температуралы су моншасына қояды. Бір минут
өткеннен кейін әрбір қоспадан пипетка көмегімен 1 тамшыдан алып, алдын-ала
1 тамшы иод ерітіндісі тамызылған заттық шыныға жеке түсіреді (пипетканы
заттық шыныдағы тамшыға тигізбеу!). Қоспалардан сынама алуды 2,4,6,8 минут
өткен уақыттарда қайталайды. Сілекей бар пробиркадан алынған сынамалардың
түсі көктен күлгінге, содан кейін қызыл-қоңырға, қызылға және ең соңында
сарыға (I2 өзінің түсі) өзгереді – крахмалдың ыдырауы бұл пробиркада жүріп
жатыр. Екінші пробиркадан алынған сынамалар көк түс бере береді – сілекей
амилазасы әсер етпегенде крахмал ыдырамайды. Екі пробиркаға да 1 мл-ден
Фелинг сұйықтығын қосып, су банясында қайнағанша қыздырады. Қызыл түсті
тұнба Cu2O тек крахмал ыдыраған пробиркада ғана түзіледі. Крахмалдың
ыдырауы нәтижесінде кіші молекулалы декстриндер және мальтоза түзіледі.
Тәжірибе 2. Сілекей амилазасы активтілігіне температураның әсері
Төрт нөмірленген пробиркаға 2 мл-ден 1%-дық крахмал ерітіндісін құяды.
Бірінші пробирканы қайнаған су банясына салады, екінші пробирканы 40 0С-ты
баняға, үшінші пробирканы бөлме температурасында қалдырады. Төртінші
пробирканы мұзды суға (0 0С) салады. Бес минуттан кейін әрбір пробиркаға 1
мл-ден сұйылтылған сілекей қосады, араластырады және сол жағдайда
қалдырады. 2,4,6,8,10 минут өткен уақыттарда заттық шыныда иод
ерітіндісімен сынама жасайды. Нәтижесін кестеге жазады. 15 минуттан кейін
әрбір пробиркаға 2 мл-ден Фелинг ерітіндісін қосады және қайнағанға дейін
қыздырады.
№ t0 С Иодпен реакция (минут) Фелинг
... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 4
1. Белоктар. Зертханалық жұмыс № 1. Белоктарға және амин қышқылдарына
сапалық реакциялар
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 5
2. Зертханалық жұмыс № 2. Белоктарды тұндыру реакциялары ... ... ... ... 11
3. Зертханалық жұмыс № 3. Казеинді бөліп алу және оның изоэлектрлік
нүктесін
анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... .13
4. Зертханалық жұмыс № 4. Белоктар
диализі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...16
5. Зертханалық жұмыс № 5. Қағаздағы хроматография әдісімен
амин қышқылдарын
бөлу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... 18
6. Зертханалық жұмыс № 6. Серенсен бойынша формольдік
титрлеу арқылы аминдік азот мөлшерін анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .20
7. Ферменттер. Зертханалық жұмыс №7. Биологиялық материалдағы
ферменттерді ашу
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... 22
8. Зертханалық жұмыс № 8. Ферменттердің қасиеттері
... ... ... ... ... ... ... ..25
9. Ферменттер активтілігін сандық анықтау.
Зертханалық жұмыс № 9. Каталаза активтілігін анықтау
... ... ... ... ... ... ...30
10. Зертханалық жұмыс № 10. Субстрат ретінде пирокатехинді
пайдалану арқылы пероксидаза активтілігін анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... .33
11. Зертханалық жұмыс № 11. Сүт майының гидролизі реакция-
сындағы липаза активтілігін анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 34
12. Витаминдер. Зертханалық жұмыс № 12. Витаминдерге сапалық реакциялар
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ... ... ... 36
13. Зертханалық жұмыс № 13. С витаминінің мөлшерін иодометрлік титрлеу
арқылы сандық анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 41
14. Белоктардың қорытылуы. Зертханалық жұмыс № 14. Белоктардың пепсин және
ұйқы безі ферменттері әсерінен қорытылуы ... ... ... ... ... ... ..42
15. Нуклеин қышқылдары. Зертханалық жұмыс № 15. Ашытқыдан
рибонуклеопротеиндерді бөліп алу және гидролиз өнімдерін
сапалық анықтау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ..44
16. Көмірсулар. Зертханалық жұмыс № 16. Көмірсуларға сапалық реакциялар
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ... ... ... 46
17. Зертханалық жұмыс № 17. Көмірсулардың ас қорыту жолында қорытылуы
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
... ... ... ... ... ... ...49
18. Зертханалық жұмыс № 18. Ашу процесі кезінде бейорганикалық фосфаттың
пайдаланылуы
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
..50
Пайдаланылған әдебиет
тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
...52
КІРІСПЕ
Биологиялық химия курсы тіршіліктің материалдық негізі мағынасын, тірі
организмдерде өтетін химиялық және биологиялық процестерді түсіндіре
отырып, биология-химия мамандықтары студенттерін дайындау жүйесінде маңызды
рөл атқарады.
Биохимия курсының мақсаты – тірі организмдерді құрайтын қосылыстардың
негізгі кластарының химиялық құрамы, құрылысы және тіршілік процестеріне
қатысуы жөнінде білім қалыптастыру.
Оқу құралына енгізілетін зертханалық жұмыстар студенттерге биохимиядан
теориялық білімді бекітуге, биохимиялық экспериментті, соның ішінде
модельді тәжірибелер түріндегі экспериментті жүргізудің практикалық
дағдыларын алуға көмектесуі тиіс.
Берілген оқу құралына химик және биолог-студенттерге арналған
биохимияның Белоктар, Ферменттер, Витаминдер, Көмірсулар тараулары
бойынша 18 зертханалық жұмыстың әдістемелік нұсқаулары енгізілген. Әрбір
жұмыстың сипаттамасы теориялық бөлімнен және жұмыстың мақсаты,
тәжірибелерді жүргізу барысы, олардың химизмі көрсетілген практикалық
бөлімнен тұрады. Жұмысқа дайындалу және оның нәтижелерін қорытындылауға
көмек ретінде бақылау сұрақтары келтірілген.
Зертханалық жұмыстар оқытудың кәсіби бағдары ескеріліп таңдалып
алынған. Олар студенттерді тек биохимиялық эксперимент жүргізу дағдысын
алып қана қоймай, сонымен қатар болашақ биология және химия мұғалімі
қызметінде пайдалануға қажет болатын биохимиялық тәжірибелерді таңдап алып,
мектеп бағдарламасына бейімдеуге бағыт береді. Оқу құралының ерекшелігі –
биохимияны оқытуды биосфераның антропогенді ластану проблемаларымен
байланыстыратын биохимиялық-экологиялық эксперименттердің енгізілуі.
Оқу құралы биохимия элементтерін тек биология және химия сабақтарында
пайдаланып қана қоймай, оқушылардың ғылыми жұмысын ұйымдастыруға пайдалана
білу дайындығын алуда болашақ мұғалімдерге көмегін тигізеді.
БЕЛОКТАР
Зертханалық жұмыс №1
Белоктарға және амин қышқылдарына сапалық реакциялар
Теориялық бөлім
Белоктар – бір-бірімен пептидтік байланыстар арқылы байланысқан амин
қышқылдары қалдықтарынан тұратын азотты жоғары молекулалы қосылыстар
(биополимерлер). Белоктарды басқаша протеиндер деп атайды. Белоктардың
мономерлері – протеиногенді амин қышқылдары. Амин қышқылдарының жалпы
формуласы келесідей:
Н2N – CН – СООН
ﺍ
R
Протеиногенді амин қышқылдарының саны – 20. Амин қышқылдары бір-бірінен
бүйір радикалының R структурасы және соған байланысты физика-химиялық
қасиеттері бойынша ерекшеленеді, мысалы:
Н2N – CН2 – СООН глицин (гли) Н2N – CН – СООН серин (сер)
ﺍ
СН2ОН
Н2N – CН – СООН аланин (ала) Н2N – CН – СООН цистеин (цис)
ﺍ
ﺍ
СН3
СН2SH
Радикалдардың химиялық табиғаты алуан түрлі. Радикалдарда әртүрлі
функционалдық топтар болғандықтан амин қышқылдары да, белоктар да басқа
заттармен химиялық реакцияларға белсенді түрде түседі. Нақты белок
молекуласындағы амин қышқылдары қалдықтарының орналасу тәртібі оның 1-ші
ретті құрылымын анықтайды. Белоктың 1-ші ретті құрылымы оның құрылымының
келесі деңгейлерін және соған байланысты болатын биологиялық функциясын
анықтайды.
Биологиялық маңызы бойынша амин қышқылдары алмастыруға болатын,
жартылай алмастырылатын және алмастыруға болмайтын деп бөлінеді.
Алмастыруға болмайтын амин қышқылдары адам организмінде синтезделмейді,
сондықтан олар тағаммен бірге өтуі тиіс. Жартылай алмастырылатын амин
қышқылдары организмде жеткіліксіз мөлшерде түзіледі, сондықтан олардың
жетіспейтін мөлшері белокты тағаммен толықтырылуы тиіс.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- белоктардың сапалық реакцияларымен танысу;
- олардың ішінен мектепте Белоктар тақырыбын оқу кезінде пайдалануға
болатындарын бөліп көрсету.
Белоктарды ашу және олардың аминқышқылдық құрамын анықтау үшін сапалық
(түсті) реакциялар қолданылады. Барлық белоктар үшін тән (биурет, нингидрин
реакциялары) және белоктың құрамындағы жеке амин қышқылдары үшін тән
(ксантопротеин реакциясы, Миллон реакциясы, Фоль реакциясы және т.б.) түсті
реакциялар болады. Реакцияларда түсті өнімдердің түзілуі белок құрамына
кіретін амин қышқылдарының белгілі бір топтарына және пептидтік
байланыстардың болуына байланысты болады.
Жұмыс нәтижелерін кесте түрінде көрсету және түсініктеме қорытындылар
жасау.
1. Биурет реакциясы 2-ден кем емес пептидтік байланыстары бар
қосылыстар үшін тән. Мұндай қосылыстар ішіндегі қарапайымы – биурет Н2N –
СО – NН – СО – NН2 реакцияға атау берді. Бос амин қышқылдары әдетте биурет
реакциясына түспейді.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 5 тамшысына 5 тамшы 10 %-дық NаОН
және 1 тамшы 1 %-дық СuSО4 ерітіндісін қосады. Араластырады. Ерітінді
түсінің өзгеруін бақылау. Реакцияны әртүрлі белок ерітінділерімен жасау,
олардың реакция нәтижесіндегі түсін салыстыру. Белок ерітіндісі пептидтік
байланыстардың санына қарай көк-күлгіннен қызыл-күлгінге дейінгі түстерді
береді.
Реакция химизмі. Күлгін түстің пайда болуы мыс иондарының белоктың
пептидтік топтарымен комплексті қосылыс түзуіне байланысты. Координациялық
байланыстар түзу үшін пептидтік байланыстар енолдық формаға өтуі тиіс деп
есептеледі:
О H ОН
ﺍﺍ ﺍ ﺍ
– С – N– ↔ – С = N –
енолды форма
Түсті комплекс құрылысы шамамен келесідей:
2. Нингидрин реакциясы бос амин топтарының болуына байланысты,
сондықтан белоктармен де, амин қышқылдарымен де орындалады.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 1 мл-не 1-2 тамшы 1 %-дық
нингидриннің ацетондағы ерітіндісін қосады. Ішіндегісін араластырғаннан
кейін пробирканы 70 0С температуралы су моншасына бірнеше минут қояды. Көк-
күлгін түс пайда болады.
Реакция химизмі. Нингидрин қатысында қыздырғанда амин қышқылдары мен
пептидтердің α-амин тобы тотыға дезаминделеді, ал нингидрин молекуласы
тотықсызданады. Тотықсызданған нингидрин аммиакпен және тотыққан
нингидриннің басқа молекуласымен әрекеттесіп, боялған қосылыс түзеді (көк-
күлгін түсті Руэман комплексі). Реакцияның қорытынды теңдеуі:
амин қышқылы тотыққан тотықсызданған
альдегид
нингидрин
нингидрин
көк-күлгін
түсті бояу
3. Ксантопротеин реакциясы. Бұл реакцияға аромат амин қышқылдары және
құрамына сондай амин қышқылы қалдықтары (тирозин, фенилаланин, триптофан)
кіретін белоктар түседі. Реакцияның аты гректің ксантос - сары деген
сөзінен шыққан, себебі азот қышқылы әсерімен реакцияны жүргізгенде сары
түсті нитроқосылыстар түзіледі: Концентрлі азот қышқылы тигенде тері мен
тырнақтың сары түске боялуы олардағы белоктардың аромат амин қышқылдары
азот қышқылымен әрекеттесуінен болады.
Тәжірибе барысы. Сақтықпен жұмыс істеу! Белок ерітіндісінің 1 мл-не 1-2
тамшы конц. НNО3 қосып, әлсіз қыздырады. Алдымен түзілетін ақ тұнба сары
түске боялады. Салқындағаннан кейін пробирка ішіндегісіне тамшылатып, қызыл-
сары түс пайда болғанша 30 %-дық NаОН ерітіндісі қосылады.
Реакция химизмі. Алдымен азот қышқылы әсерінен белок денатурациясы
жүреді. Қыздырғанда сары түсті нитроқосылыстардың түзілуімен тирозин мен
триптофанның (фенилаланин қиын нитрленеді) аромат радикалдары бойынша
нитрленуі жүреді. Сілтілік ортада хромофор топтары бар қосылыстар
түзілгендіктен қызыл-сары түс пайда болады. Тирозин мысалында жүретін
реакциялардың схемасын жазуға болады:
тирозин динитротирозин
хиноидты формасы
(сары түсті)
динитротирозиннің натрий тұзы
(қызыл-сары
түсті)
4. Фоль реакциясы құрамында күкіртті амин қышқылы бар белоктар үшін
тән.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 5 тамшысына 5 тамшы 30 %-дық NаОН
және 1 тамшы 5 %-дық (СН3СОО)Рb ерітіндісін қосады. Сақтықпен қыздыру.
Сұйықтық қараяды, қорғасын сульфидінің қара тұнбасы түзіледі.
Реакция химизмі.
СH2SH CH2OH
( (
CHNH2 + 2 NaOH (( CHNH2 + Na2S + H2O
( (
COOH COOH
цистеин серин
Натрий сульфидін анықтау үшін қорғасын ацетатын пайдаланады, ол натрий
гидроксидімен әрекеттесіп, плюмбитке айналады:
Pb(CH3COO)2 + 2NaOH ( Pb(ONa)2 + 2CH3COOH
Қорғасын мен күкірт иондарының әрекеттесуі нәтижесінде қара немесе
қоңыр түсті қорғасын сульфиді түзіледі:
Na2S + Pb(ONa)2 + 2H2O ( PbS( + 4NaOH
5. Паули реакциясы гистидин және тирозин қалдықтары бар белоктарға тән.
Тәжірибе барысы. Пробиркада 3 тамшы 1 %-дық сульфанил қышқылының тұз
қышқылындағы (5 %-дық) ерітіндісіне 3 тамшы 0,5 %-дық NaNO2 ерітіндісін
қосады, тез араластырады және 5 тамшы белок ерітіндісін қосады,
араластырады және 5 тамшы 10 %-дық Na2СО3 ерітіндісін қосады. Сұйықтық
қызылсары-қызыл немесе шие-қызыл түске боялады.
Реакция химизмі. Сульфанил қышқылының қышқыл ерітіндісі натрий
нитритімен әрекеттескенде диазобензолсульфон қышқылы түзіледі, ал соңғысы
гистидинмен (тирозинмен) боялған азоқосылыс береді:
сульфанил қышқылы
диазобензолсульфон қышқылы
гистидин
2,5-бис-n-сульфобензолазогистидин
6. Миллон реакциясы тирозин және құрамында тирозин қалдықтары бар
белоктарға тән.
Тәжірибе барысы. Белок ерітіндісінің 5 тамшысына 1 тамшы Миллон
реактивін (сынап нитраты мен нитритінің конц. азот қышқылындағы ерітіндісі)
қосады және сақтықпен қайнағанша қыздырады. Қызғылт немесе қызыл түсті
тұнба түзіледі (тирозиннің сынапты нитротуындысы).
Реакция химизмі.
Кесте
Реакция аты Қолданылған Байқалатын Ашылатын топтар
реактивтер ерітінді немесе
тұнба түсі
Қорытынды. Жұмыс мақсатына сәйкес қорытынды жасау. Мектеп практикасында
қолдануға болады деген реакциялардың таңдап алыну себебін көрсету.
Бақылау сұрақтары
1 Қай органикалық қосылыстар амин қышқылдары деп аталады? Амин қышқылдарына
қандай химиялық қасиеттер тән?
2. Аспарагин қышқылы мысалында амин қышқылдарының амфотерлілігін
көрсетіңіз.
3. Белоктың аминқышқылдық құрамы және бірінші ретті құрылымы
түсініктерінің айырмашылығы неде?
4. Белоктың 2-ші ретті құрылымы деген не?
5. Белоктың 3-ші ретті құрылымы деген не? Оны қамтамасыз ететін
әрекеттесулердің типтері қандай?
6. Белоктардың сапалық реакцияларын қалай жіктеуге болады?
7. Реакциялардың қайсысы сақтықпен орындауды талап етеді, не себепті?
8. Нингидрин реакциясы көмегімен қандай атомдық топтар ашылады?
9. Белоктағы цистеинді, гистидинді қалай ашуға болады?
10. Миллон реакциясының көмегімен белоктағы қай амин қышқылы ашылады?
11. Ксантопротеин реакциясымен белоктардағы қай амин қышқылдары қалдықтары
ашылады? Реакция неге солай аталады? Қайсысы – тирозин немесе фенилаланин –
оңай нитрленеді? Не себепті?
12. Биурет реакциясы терминінің шығу тегі қандай? Оның химизмі қандай?
13. Мектепте пайдалануға қай реакцияларды және қандай критерийлері бойынша
таңдап алдыңыз?
Зертханалық жұмыс № 2
Белоктарды тұндыру реакциялары
Теориялық бөлім
Белоктарды тұндыру реакцияларын екі топқа бөлуге болады. Қайтымды
тұндыру кезінде ерітіндіден бөлініп шығатын белок өзінің табиғи қасиеттерін
сақтайды және қайтадан ерітіндіге өткізіле алады. Белоктарды аммоний,
сілтілік және сілтілік-жер металдары тұздары әсерімен тұнбаға түсіру
қайтымды тұндыру мысалы бола алады. Бұл тұздар белоктың сулы қабықшасын
жояды және зарядсыздандырады. Белоктардың сулы қабықшасы шамасы мен тұздар
концентрациясы арасында тікелей байланыс бар: гидраттық қабықша аз болған
сайын тұздар да аз қажет болады. Мысалы, ірі, ауыр молекулалары бар және су
қабықшасы аз болатын глобулиндер ерітіндіні тұздармен толық
қанықтырмағанда тұнбаға түседі. Ал неғұрлым кіші молекулалар ретіндегі және
үлкен су қабықшасымен қоршалған альбуминдер тұнбаға ерітіндіні тұзбен толық
қанықтырғанда түседі. Тұздармен тұнбаға түсіру белок фракцияларын бөлу үшін
қолданылады.
Қайтымсыз тұндыру белок құрылымының молекула ішіндік терең
өзгерістерімен байланысты, бұл кезде оның табиғи қасиеттері (ерігіштігі,
биологиялық активтілігі және т.б.) жойылады. Мұндай белок денатурацияланған
белок, ал процесс денатурация деп аталады. Белоктардың денатурациясы күшті
қышқылдық ортасы бар (рН 1-2) асқазанда жүреді және бұл протеолиздік
ферменттер әсерінен олардың ыдырауына себеп болады.
Денатурация кезінде белоктың 3-ші, 4-ші ретті құрылымдары бұзылады,
биологиялық қасиеттері жойылады. Белоктардың қайтымсыз тұндырылуы оларды
қыздырғанда, минералдық қышқылдармен, кейбір органикалық қышқылдармен
(трихлорсірке, сульфосалицил және т.б. қышқылдар), ауыр металдардың
тұздарымен және басқа заттармен әсер еткенде жүреді (химиялық факторлар).
Мысалы, трихлорсірке қышқылымен тұндыру кейбір зерттеулерде белокты бөліп
алып тастау үшін қолданылады. Белоктардың денатурациясы ауыр металдармен
улануды емдеу негізіне қаланған. Бұл кезде уланған адамға сүт немесе шикі
жұмыртқа ішкізеді, себебі металдар сүт немесе жұмыртқа белоктарын
денатурациялай отырып, олардың бетіне адсорбцияланады және асқазан мен
ішектің кілегейлі қабықшасына әсер етпейді, сонымен қатар қанға
сіңірілмейді.
Денатурацияны болдыратын физикалық факторларға температура, механикалық
әсерлер, ультрадыбыспен өңдеу, ионизациялық сәулелендіру жатады.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- белоктарды қайтымды және қайтымсыз тұндыру реакцияларын жүргізуді
меңгеру;
- белоктар денатурациясы құбылысымен танысу;
- белок қасиеттерін мектепте демонстрациялау үшін тәжірибелер таңдап
алу.
Тәжірибе 1. Жұмыртқа белогы альбуминдері мен глобулиндерін тұзбен
тұндыру арқылы бөлу.
Жұмыртқа белогы ерітіндісінің 2 мл-не сонша көлемде (NН4)2SО4 қаныққан
ерітіндісін қосады. Түскен глобулиндер тұнбасын сүзеді және оның белокты
табиғатын сәйкес реакция көмегімен дәлелдейді. Фильтратқа қаныққанша
(NН4)2SО4 ұнтағын қосады. Альбуминдер тұнбасы беткі қабатқа көтеріледі,
себебі ерітіндінің тығыздығы үлкенірек. Альбуминдердің белокты табиғатын
дәлелдеу. Ерітіндіні аммоний сульфатымен қанықтырудың қандай дәрежесінде
глобулиндер, қандай дәрежесінде альбуминдер тұнбаға түсетіні туралы
қорытынды жасау.
Тәжірибе 2. Белоктарды концентрлі минералды қышқылдармен тұндыру.
Үш құрғақ пробирка алу, біреуіне 5 тамшы конц. НNО3, екіншісіне 5
тамшы конц. НСl, үшіншісіне 5 тамшы конц. Н2SО4 тамызу. Пробиркаларды
еңкейте отырып, әрқайсысына абайлап ішкі қабырғасы бойынша 5 тамшы белок
ерітіндісін қосады. Белок ерітіндісінің қышқылмен жанасу шекарасында сақина
түрінде белок тұнбасы түзіледі. Пробирканы сақтықпен шайқағанда тұнбалар
(конц. НNО3 бар пробиркадағы тұнбадан басқалары) ериді.
Тәжірибе 3. Белоктарды органикалық қышқылдармен тұндыру.
Екі пробиркаға 5-7 тамшыдан белок ерітіндісін құяды және 1-2 тамшыдан
бірінші пробиркаға сульфосалицил қышқылын, екінші пробиркаға трихлорсірке
қышқылын қосады. Тұнбалардың түзілуін байқау. Сульфосалицил қышқылы тек
белоктарды ғана емес, олардың ыдырау өнімдерін де тұнбаға түсіреді.
Трихлорсірке қышқылы тек белоктарды тұнбаға түсіреді де, ал олардың ыдырау
өнімдерін тұнбаға түсірмейді.
Тәжірибе 4. Белоктарды ауыр металдар тұздарымен тұндыру.
Үш пробиркаға 5 тамшыдан белок ерітіндісін құяды. Бірінші пробиркаға 1
тамшы 5 %-дық CuSO4, екіншісіне – 1 тамшы 5 %-дық (СН3СОО)2Pb, үшіншісіне
1 тамшы 5 %-дық ZnSO4 ерітіндісін қосады. Ауыр металдар катиондары әсерінен
белоктың коагуляциялануы жүреді. Тұнбалардың түзілуін байқау. Ауыр металл
тұздарымен улану кезінде белоктың зарарсыздандырғыш ретінде қолданылуы оның
ауыр металл иондарымен берік қосылыстар түзу қасиетіне негізделген.
Жұмыс мақсатына сәйкес жалпы қорытындылар жасау.
Бақылау сұрақтары
1. Денатурация деген не? Ол қандай факторлар және реактивтер әсерінен
жүреді.?
2. Денатурация кезінде белок молекуласының құрылымы қалай өзгереді?
3. Денатурациясын болдырмай белокты ерітіндіден қалай тұндыруға болады?
4. Тұзбен тұндыру термині нені білдіреді?
5. Жұмыртқа белогы ерітіндісіндегі глобулиндерді альбуминдерден қалай бөліп
алуға болады?
6. Альбуминдер мен глобулиндердің белокты табиғатын қандай реакциямен
дәлелдеуге болады?
7. Биологиялық материалдан алынған сірінді анализі кезінде белоктарды бөліп
алып тастау қажет болғанда қай реактивті пайдалануға болады?
8. Тәжірибелердің қайсысын мектепте Белоктар тақырыбын оқыту кезінде
көрсетуге болады?
Зертханалық жұмыс № 3
Казеинді бөліп алу және оның изоэлектрлік нүктесін анықтау
Теориялық бөлім
Белоктардың маңызды қасиеті – олардың қышқылдық та, негіздік те қасиет
көрсету, яғни амфотерлі электролиттер ролін атқару қабілеті. Бұл амин
қышқылдары құрамына кіретін әртүрлі диссоциацияланушы топтар есебінен
қамтамасыз етіледі. Мысалы, белокқа қышқылдық қасиетті аспарагин, глутамин
қышқылдарының карбоксил топтары, ал негіздік қасиетті аргинин, лизин және
гистидин радикалдары береді. Белок құрамында дикарбон қышқылдары неғұрлым
көп болса, оның қышқылдық қасиеттері күштірек байқалады және керісінше.
Аталған топтардың белок молекуласының жалпы зарядын қалыптастыратын
электрлік заряды да болады. Құрамында аспарагин және глутамин қышқылдары
көп болатын белоктардың заряды теріс болады, ал негіздік амин қышқылдарының
көп болуы белок молекуласына оң заряд береді. Осының салдарынан белоктар
электр өрісінде жалпы зарядының шамасына байланысты катодқа немесе анодқа
қарай жылжиды. Мысалы, сілтілік ортада (рН 7-14) белок протонды беріп,
теріс зарядталады, ал қышқылдық ортада (рН 1-7) қышқылдық топтардың
диссоциациясы тежеледі де, белок катионға айналады:
NH3+ Қышқылдық орта NH3+ Сілтілік
орта NH2
R R R
COOH COO -
COO -
Катион Амфион
Анион
рН-тың қышқыл облысы Изоэлектрлік нүкте рН-тың сілтілік облысы
Қосынды заряд оң Қосынды заряд нольге тең Қосынды заряд теріс
Катодқа қарай жылжу Қозғалыс жоқ Анодқа қарай жылжу
Сонымен, белоктың катион немесе анион ретінде болуын анықтайтын фактор
– сутек иондарының концентрациясымен анықталып, рН шамасы арқылы
өрнектелетін орта реакциясы. Бірақ рН шамасының белгілі бір мәндерінде оң
және теріс зарядтардың саны теңесіп, молекула электрнейтралды болады, яғни
ол электр өрісінде жылжымайтын болады. Ортаның рН шамасының осындай мәні
белоктардың изоэлектрлік нүктесі деп аталады. Бұл кезде белок тұрақтылығы
төмен күйде болады және рН-тың қышқыл немесе сілтілік жаққа қарай аздаған
өзгерісі кезінде оңай тұнбаға түседі. Көптеген табиғи белоктар үшін
изоэлектрлік нүкте әлсіз қышқыл ортада (рН 4,8-5,4). Бұл олардың құрамында
дикарбон қышқылдарының басым болатындығын көрсетеді.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- казеинді бөліп алу әдістемесін меңгеру, сапалық реакциялар көмегімен
оның белокты табиғатын және фосфаттардың болуын дәлелдеу;
- казеиннің изоэлектрлік нүктесін анықтау әдістемесін меңгеру.
Тәжірибе 1. Казеинді бөліп алу.
Казеинді сүттен бөліп алу оны изоэлектрлік нүктесінде (рН 4,7) тұндыру
арқылы жүзеге асырылады.
Тәжірибе барысы.
1. Центрифугалық пробиркаға 10 тамшы сүт, 10 тамшы су, 1 тамшы 10 %-дық
сірке қышқылы ерітіндісін құяды. Казеиннің тұнбасы түзіледі.
2. Сынаманы 5 минут 3000 айналыммин. жылдамдықпен центрифугалау.
3. Тұнба үстіндегі сұйықтықты құйып алады, ал тұнбаға 30 тамшы су қосады
және гомогенді массаға дейін мұқият шайқап, араластырады.
4. Казеин ерітіндісін оның құрам бөліктеріне сапалық реакцияларды жүргізу
үшін екі пробиркаға бөледі.
а) Биурет реакциясы:
Казеин ерітіндісіне 10 тамшы күйдіргіш натр ерітіндісін және 1 тамшы
мыс (II) сульфаты ерітіндісін қосады. Пробирка ішіндегісі сілкіп-шайқағанда
көк-күлгін түске боялады.
б) Молибдендік сынама:
Казеин ерітіндісіне 2-3 мл молибден реактивін қосады. Қоспаны
араластырады және 1 минутқа қайнаған су моншасына қояды. Сұйықтық лимон-
сары түске боялады, бұл фосфаттардың бар екендігін көрсетеді.
Тәжірибе 2. Казеиннің изоэлектрлік нүктесін анықтау.
Белоктардың ерітіндісі изоэлектрлік нүктеде неғұрлым тұрақсыз,
сондықтан белоктар оңай тұнбаға түседі. Сол себепті белоктың изоэлектрлік
нүктесін анықтау белок ерітіндісі неғұрлым көп лайланатын рН мәнін
анықтауға келіп тіреледі.
Зерттеу материалы: натрий ацетатының 0,2 М ерітіндісіндегі 0,4 %-дық
казеин ерітіндісі.
Реактивтер: сірке қышқылының 0,2 М ерітіндісі, дистильденген су.
Құрал-жабдықтар: пробиркалары бар штатив, өлшеуіш пипеткалар,
бюреткалар.
Тәжірибе барысы.
Белгілі бір рН мәні бар буферлі ерітінділер дайындау үшін 6 құрғақ
пробиркаға реактивтерді кестеде көрсетілгендей мөлшерде құяды:
Кесте
Сына-мСынама құрамы, мл Қоспаның рН Лайлану
а № мәні дәрежесі
СН3СООН Н2О СН3СООNа
0,2 мольл ерітіндісіндегі
казеин ер-сі
1 1,6 0,4 0,2 3,8
2 0,8 1,2 0,2 4,1
3 0,4 1,6 0,2 4,4
4 0,2 1,8 0,2 4,7
5 0,1 1,9 0,2 5,0
6 0,06 1,94 0,2 5,3
Ерітінділерді мұқият араластырады. Бес-он минуттан кейін ерітінділердің
лайлануы байқалады. Казеиннің изоэлектрлік нүктесіне сәйкес келетін рН мәні
бар пробиркада тұнба неғұрлым көп түседі.
Жұмыс нәтижелерін жазу. Нәтижелерді кесте түрінде көрсету. Алынған
нәтижелерден қорытынды жасау, дәптерге жазу. Лайланудың болмауын -
таңбасымен, лайлану жағдайын +, лайлану едәуір болған жағдайды бірнеше
+ таңбасымен белгілеу.
Бақылау сұрақтары
1. Белоктардың амфотерлілігі немен түсіндіріледі?
2. Қандай амин қышқылдарының басым болуы белокқа теріс заряд береді?
3. Белоктың изоэлектрлік нүктесі деген не?
Зертханалық жұмыс № 4
Белоктар диализі
Теориялық бөлім
Белоктарды табиғи көздерден бөліп шығарғанда соңғы қоспада белоктармен
бірге қосымша кіші молекулалы заттар – органикалық еріткіштер, тұздар және
қышқылдар қалады. Белоктарды олардан тазарту үшін диализ әдісі қолданылады.
Диализ деп жоғары және кіші молекулалы заттарды жартылай өткізгіш
мембраналар (коллодий, целлофан, пергамент) көмегімен бөлу процесін айтады.
Диаметрі үлкен болғандықтан белок молекулалары мұндай мембраналар арқылы
өте алмайды, ал кіші молекулалы заттардың бөлшектері оңай өтеді.
Лабораторияда диализденетін белок ерітіндісі целлофаннан жасалған кішкене
қапшыққа құйылады және соңғысы суы бар ыдысқа салынады. Ыдыс арқылы
үздіксіз өткізілетін су ағыны оған мембрана кеуектері арқылы барлық кіші
молекулалы заттардың өтуін қамтамасыз етеді.
Су
Диализге дейін Диализден кейін
(ақ үлкен дөңгелектер – белок молекулалары, қара дөңгелектер – кіші
молекулалар немесе тұз иондары)
Диализ құбылысы жасанды бүйрек аппараты жұмысы негізіне қаланған, ол
медицинада бүйрек қызметі бұзылуын емдеуде кең қолданылады.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:жартылай өткізгіш мембрана көмегімен белокты кіші молекулалы
қоспалардан тазарту әдістемесін меңгеру.
Зерттеу материалы: 3 %-дық жұмыртқа альбумині.
Реактивтер: (NН4)2SО4 қаныққан ерітіндісі, ВаСl2 5 %-дық, СuSO4 1 %-дық,
NаОН 10 %-дық.
Құрал-жабдықтар: 100 мл-лік стакан, 150Х150 мм өлшемді целлофаннан жасалған
квадрат, шыны таяқшалар, резеңке сақиналар, пробиркалары бар штатив,
өлшеуіш пипеткалар.
Жұмыс барысы.
1. Пробиркаға 2 мл жұмыртқа альбумині ерітіндісін құяды және оған 1 тамшы
аммоний сульфатының қаныққан ерітіндісін қосады. Алдын-ала дистильденген
сумен ылғалдандырылған целлофан квадратынан қапшықша (диализатор) жасайды
және оған пробирка ішіндегісін құяды. Қапшықша ұштарын екі шыны таяқша
арасына қыстырады, таяқшалар бір-бірімен резеңке сақиналар арқылы
біріктіріледі. Қапшықшаны таяқшаларын стакан ернеуіне қоя отырып,
дистильденген суы бар стаканға салады. Қапшықшадағы сұйықтық деңгейі
стакандағы су деңгейінен төмен болуы керек.
2. Диализдің басталуынан 1 сағат өткеннен кейін екі пробиркаға стакандағы
сұйықтықтан 1 мл-ден алып, келесі реакцияларды жүргізеді:
а) SO42--иондарының болуын анықтау: бірінші пробиркаға 3-4 тамшы 5 %-дық
ВаСl2 ерітіндісін қосады және лайлану түріндегі ВаSO4 ақ тұнбасының
түзілуін бақылайды;
б) белоктың болуын анықтау: биурет реакциясын жасайды.
3. Диализатордағы сұйықтықты (диализатты) пробиркаға құйып алады, одан 10
тамшы алып, онымен де биурет реакциясын жасайды.
Дәптерге жұмыс нәтижелерін жазу, диализатор суретін салу, қорытынды
жасау.
Бақылау сұрақтары
1. Табиғи көздерден бөлініп алынған белокты препараттарда кіші молекулалы
қоспалардың болуы белоктардың қандай қасиетімен түсіндіріледі?
2. Диализ деген не?
3. Белоктың кіші молекулалы қоспалардан толық тазаруы қалай бақыланады?
Зертханалық жұмыс № 5
Амин қышқылдарын қағаздағы хроматография әдісімен бөлу
Теориялық бөлім
Белок гидролизатында болатын амин қышқылдарының қоспасын бөлу және жеке
амин қышқылдарын сапалық анықтау үшін қағаздағы таралу хроматографиясы
әдісі кең қолданылады. Бұл әдіс 1903 жылы М.С. Цвет ұсынған
хроматографиялық анализ модификацияларының бірі болып табылады.
Амин қышқылдарын бөлу олардың екі араласпайтын сұйықтықта әр түрлі
еруіне негізделген.
Сұйықтықтың бірі – су, ал екіншісі – сумен қанықтырылған органикалық
еріткіш. Су фазасы қағазға сіңірілгендіктен қозғалғыш болмайды (арнайы
дайындалатын хроматографиялық сүзгі қағазы ылғал камераға орналастырғанда
20-22%-ға дейін суды сіңіреді). Қозғалғыш фаза ретінде сумен қанықтырылған
әр түрлі органикалық еріткіштер алынады (мысалы, изопропил, изобутил немесе
бутил спирттері, фенол және т.б.). Амин қышқылдары қоспасының немесе белок
гидролизатының тамшысын сүзгі қағазының жолағына тамызып, оның ұшын
органикалық еріткішке батырады. Еріткіш қағаз жолағы бойымен көтеріліп,
қағаздағы амин қышқылдарын ерітеді және өз ағынымен қоса әкетеді.
Амин қышқылдарының қағаз бойымен қозғалыс жылдамдығы олардың қозғалғыш
және қозғалмайтын фазаларда ерігіштік дәрежесіне байланысты болады.
Амин қышқылының су фазасындағы ерігіштігі жоғары, ал сулы емес фазадағы
ерігіштігі төмен болса, онда амин қышқылы органикалық еріткіштің таралуымен
салыстырғанда баяу қозғалады.
Сүзгі қағазындағы жеке амин қышқылдарының орнын нингидринмен түсті
реакциясы көмегімен анықтайды.
Хроматограммадағы амин қышқылдарын бөле анықтау осы хроматограммаға
жеке амин қышқылдары ерітінділерін (свидетельдер) тамызу арқылы
жүргізіледі. Сонымен қатар амин қышқылдарын Rf шамасы бойынша да анықтауға
болады:
Мұндағы а – амин қышқылының тамызылған жерінен бастап жүрген қашықтығы, b –
еріткіштің амин қышқылы тамызылған жерден бастап таралу аймағына дейінгі
жүрген қашықтығы. Rf коэффициенті әрбір амин қышқылы үшін тән және
тәжірибенің берілген жағдайларында (еріткіш, температура, қағаз сорты)
тұрақты шама.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты:
- амин қышқылдары таралу хроматографиясы әдістерінің вариантын меңгеру;
- бақылау қоспасындағы амин қышқылдарын анықтау.
Реактивтер: тирозин (0,4 %-дық ерітінді); глутамин қышқылы (0,6 %-дық
ерітінді); лейцин (0,5 %-дық ерітінді); нингидрин (0,2 %-дық ацетондағы
ерітінді); амин қышқылдарының қоспасы (тирозин, глутамат, лейцин);
еріткіштер жүйесі: бутил спирті, сірке қышқылы және су (15:15:10
қатынасында).
Құрал-жабдықтар: хроматографиялық қағаз, Петри табақшасы, пульверизатор,
кептіру шкафы (105 0С), қайшы, шыны капиллярлар, ине.
Жұмыс барысы:
1. Хроматографиялық сүзгі қағазынан өлшемі 11х11 см етіп квадрат қиып
алады. Оның бұрыштырының бірінде жіптен ілгек жасайды. Қағаз бетінде
қарандашпен диагональдар жүргізіп, олардың қиылысу нүктесінен радиусы 10 мм
шеңбер сызады, квадраттың бөліктерін нөмірлейді (сурет).
Содан кейін қағазды Петри табақшасына суреттегідей етіп орналастырады.
Диагональдермен шектелген әрбір доғаның ортасына жіңішке капилляр көмегімен
куә ерітінділерді және амин қышқылдарының зерттелетін қоспасын тамызады
(сурет).
2. Квадраттың ортасын инемен тесіп, оған кішкене үшбұрышты сүзгі қағазынан
жасалған білтені (фитилек) орналастырады. Білтенің төменгі ұшы табақшасының
түбіне тиіп тұруы керек. Табақшаға 10-15 мл еріткіштер қоспасы құйылған.
Хроматограмманы диаметрі дәл сондай екінші Петри табақшасымен тығыз жабады.
Білте арқылы еріткіш жоғары көтеріліп, қағаз бойымен оның центрінен шет
жақтарына қарай таралады. Еріткіштің таралу аймағы Петри табақшасы жауып
тұрған жерге жеткенде хроматограмманы алып, еріткіштің таралу аймағының
шетін белгілейді, қағаздың ілгегі арқылы штативке іледі және 5 минут бойы
оны құрғатқыш шкафта (1050С) кептіреді (еріткіш иісі кеткенше). Кептірілген
хроматограммаға пульверизатормен нингидрин ерітіндісін шашыратып, оны тағы
да кептіргіш шкафқа салады. Бірнеше минуттан кейін хроматограммада амин
қышқылдарының орнын көрсететін дақтар пайда болады.
3. Қоспадағы әрбір амин қышқылы үшін Rf мәндерін есептейді. Олардың Rf
мәндерін куәлардың Rf мәндерімен салыстыру арқылы зерттелген қоспадағы
амин қышқылдарын анықтайды. Хроматограмманы дәптерге жапсырып қояды.
Бақылау сұрақтары
1. Амин қышқылдарын қағаздағы хроматография әдісімен бөлу қай құбылысқа
негізделген?
2. Қағаздағы хроматографияны жүргізу үшін қандай еріткіштер қолданылады?
3. Амин қышқылдарының хроматографиялық қағаз бойынша қозғалу жылдамдығы
неге тәуелді болады?
4. Қағаздағы амин қышқылдарының орнын қалай анықтайды?
Зертханалық жұмыс № 6
Аминдік азот мөлшерін формольдік титрлеу арқылы анықтау
Теориялық бөлім
Белоктардың қышқылдар немесе ферменттер қатысындағы гидролизі кезінде
бос амин және карбоксил топтары бар амин қышқылдары түзіледі. Судағы
ерітінділерде амин қышқылдары молекула ішіндік тұздар түзеді, сондықтан
амин топтарын формальдегидпен бекітпесе, олар негіздік қасиетін жоғалтады.
Серенсен бойынша амин топтарының мөлшерін анықтау үшін оларды
формальдегидпен байланыстырып, қалған бос карбоксил топтарын сілтімен
титрлейді:
R H
R
׀ ׀
׀
Н – С – NH2 + CO → H – C – N = CH2
+ H2O
׀ ׀ ׀
COOH H
COOH
... – СООН + NаОН → ... – СООNа + H2O
Карбоксил топтарының мөлшері титрлеуге кеткен сілтінің мөлшері бойынша
анықталады. Жуықтап алғанда амин қышқылдарындағы карбоксил топтарының саны
амин топтарының санына тең болғандықтан амин топтарының да мөлшері
анықталады.
Бұл әдісті әртүрлі белоктар гидролизі процесін бақылау, атап айтқанда,
протеолиздік ферменттердің немесе ферменттік препараттардың әсерін зерттеу
үшін пайдалануға болады. Белок гидролизінің аяқталуы гидролизаттағы амин
және карбоксил топтарының мөлшері одан әрі өспейтін және биурет реакциясы
байқалмайтын моментпен сәйкес келеді.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты: формольдік титрлеу әдісін меңгеру және берілген биологиялық
материал үлгісіндегі аминдік азот мөлшерін анықтау.
Құрал-жабдықтар және реактивтер: таразы, воронкалар, 20 және 10 мл-лік
пипеткалар, фарфор келі (ступка), 100 мл-лік конустық колбалар, сүзгі
қағаз, шыны таяқшалар, қайшы, бюреткалар, 50 мл-лік өлшеуіш колбалар,
ұсақталған шыны; 0,2 н. NаОН ерітіндісі; 0,2 н. НСl ерітіндісі; формольдік
қоспа (50 мл 30-40 %-дық формалин ерітіндісі + 1 мл 0,1 %-дық
фенолфталеиннің спирттегі ерітіндісі, қоспаны 0,2 н. NаОН ерітіндісімен
әлсіз қызғылт түске дейін жеткізеді).
Зерттеу материалы: Бұршақ тұқымдас өсімдіктердің өскіндері (проростки)
немесе осы өсімдіктердің тұқымдары.
Жұмыс барысы:
Ступкада 5 г тұқымды немесе оның өскіндерін 5-10 мл дистилденген сумен
және ұсатылған шынымен қосып, үгітеді. Осы қоспаны сыйымдылығы 50 мл
өлшеуіш колбаға ауыстырып, сумен шаю арқылы колбаның белгіленген сызығына
дейін жеткізеді, араластырады және сүзеді. Фильтратта аминдік азотты
анықтайды. Тәжірибе үшін 20 мл фильтрат алып, оған 10 мл формольдік қоспа
қосады және бюреткадан 0,2 н. сілті ерітіндісін ашық қызғылт түс пайда
болғанша қосады. Сілтінің артық мөлшерін 0,2 н. НСl ерітіндісімен әлсіз
қызғылт түске дейін кері титрлейді.
Осымен бір мезгілде бақылау титрлеуін жүргізеді. Ол үшін қайнатылып,
салқындатылған 20 мл суға 10 мл формольдік қоспа және бюреткадан 0,2 н.
сілті ерітіндісінің артық мөлшерін қосады. Содан кейін тұз қышқылымен
ерітіндіні әлсіз қызғылт түске дейін жеткізеді.
Есептеу келесі түрде жүргізіледі:
Бақылау Тәжірибе
Қосылады
3,0 мл 0,2 н. NаОН 7,0 мл 0,2 н. NаОН
2,8 мл 0,2 н. НСl 0,3 мл 0,2 н. НСl
Айырма 0,2 мл 0,2 н. NаОН 6,7 мл 0,2 н. NаОН
Яғни тәжірибеге 6,7 мл сілті ерітіндісі, бақылауға 0,2 мл кетті, 6,5 мл
0,2 н. NаОН жұмсалды. Реакция теңдеуінен 1 мл нормальдық сілті ерітіндісіне
14 мг аминдік азот сәйкес келетіні белгілі; онда 1 мл 0,2 н. NаОН
ерітіндісіне 2,8 мг азот сәйкес келеді. Осыдан өсімдік ерітіндісінің
(вытяжка) алынған көлеміндегі аминдік азоттың мөлшері 6,5*2,8=18,2 мг екені
шығады. Құрғақ затқа шаққанда:
Мұндағы 50 мл - өсімдік ерітіндісінің жалпы көлемі; 20 мл – титрлеу үшін
алынған ерітінді көлемі; 5 г - өсімдік массасы.
Белок гидролизаттарын анализдегенде жұмыс нәтижесін келесі кесте
түрінде көрсету:
Жұмыс барысы Белок Белок Белок Аминдік азот
гидролизіне гидролизі гидролизі мөлшері, мг
дейінгі NаОН басталуынан 45басталуынан 90
көлемі, мл минут өткенненминут өткеннен
кейінгі NаОН кейінгі NаОН
көлемі, мл көлемі, мл
Ферменттік препарат табиғатына және гидролизді жүргізу жағдайына байланысты
белок гидролизі жүруінің жылдамдығы және оның толықтығы туралы қорытынды
жасау.
ФЕРМЕНТТЕР
Зертханалық жұмыс № 7
Биологиялық материалдағы ферменттерді ашу
Теориялық бөлім
Ферменттер – тірі организмдердегі реакцияларды жылдамдататын белок
табиғатты биологиялық катализаторлар. Олар микроорганизм клеткаларында
болады, жануар және өсімдік тканьдері құрамына кіреді. Спектрлік анализ
немесе басқа бір әдіс көмегімен анықталатын кейбір ферменттерден
басқаларының болуын катализдейтін спецификалық реакциясының жүруі бойынша
анықтауға болады. Биологиялық материалдағы ферментті ашу үшін ол
жылдамдататын реакцияның қандай да бір сыртқы белгілері болуы керек.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты: әртүрлі көздерден алынған ферменттер әсерін анықтау
реакцияларын жүргізу әдістемесін меңгеру. Мектеп практикасында пайдалануға
болатын тәжірибелерді таңдап алу.
Тәжірибе 1. Қытайбұршақ (соя) ұнындағы уреазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: термостат, екі 2 мл-лік бір сызықты
пипетка, қытайбұршақ ұны, мочевина (1 %-дық), фенолфталеин (1 %-дық
спирттік ерітінді). Тәжірибе үшін қытайбұршақтан алынған ұнтақтан уреаза
ерітіндісі алдын-ала дайындалады [Ә-8; 123 бет].
Тәжірибе барысы: Мочевина ерітіндісінің (1 %-дық) 2 мл-не 2 тамшы
фенолфталеин және 2 мл уреаза ерітіндісі (1:10) қосылады. Қоспаны мұқият
араластырады және 30 минутқа 38 0С температуралы термостатқа қояды. Осыған
параллель тәжірибені уреазаның қайнатылған ерітіндісімен қояды. Бірінші
пробирканың ішіндегісі түзілген аммиак есебінен ерітіндінің рН мәні
сілтілік облысқа ығысатындықтан малина-қызыл түске түске боялады.
Тәжірибе 2. Шикі сүттегі альдегидоксидазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: су моншасы, лабораториялық термометр,
бір сызықты 1 мл-лік және 5 мл-лік пипеткалар; сиыр сүті, вазелин майы,
формальдегид (0,4 %-дық), метилен көгі (0,01 %-дық).
Тәжірибе барысы: Үш пробиркаға 5 мл-ден саумал сиыр сүтін құяды. Бір
сынаманы 2-3 минут қайнатып, салқындатады. Қайнатылған сынамаға және
қайнатылмаған сынамалардың біріне 1 мл-ден 0,4 %-дық формальдегид
ерітіндісін, ал басқа қайнатылмаған сынамаға 1 мл су су қосады. Содан кейін
үш пробиркаға да 1 мл-ден 0,01 %-дық метилен көгі ерітіндісін құяды.
Пробирка ішіндегілерін мұқият араластырып, әрқайсысына сұйықтық ауадағы
оттегімен жанаспау үшін 3-4 тамшыдан вазелин майын құяды. Барлық
сынамаларды 40 0С-қа дейін қыздырылған су моншасына қояды. Белгілі бір
уақыттан кейін субстрат (формальдегид) бар қайнатылмаған сынамадағы
сұйықтық метилен көгінің тотықсызданған формасы түзілуі есебінен
түссізденеді:
Егер метилен көгінің түссіз ерітіндісін ауада сілкісе, онда ерітінді
қайтадан көк түске боялады: МК·Н2 + О2 → МК + Н2О2
Бірінші қайнатылған сынамада активті фермент және қайнатылмаған
сынамалардың бірінде субстрат болмағандықтан оларда метилен көгі
түссізденбейді.
Тәжірибе 3. Картоптағы тирозиназаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: су моншасы, ұсақтағыш (терка), сыртқы
диаметрі 100 мм Бюхнер воронкасы, бір сызықты 1 мл-лік пипетка, дәке
(марля), шикі картоп, тирозин (қаныққан ер.).
Жұмыс барысы. Картопты ұсақтап, бірнеше қабат дәке арқылы өткізеді және
алынған экстрактты тез Бюхнер воронкасы арқылы сүзеді. Пробиркаға 1 мл
экстракт, 2-3 тамшы тирозин ерітіндісін құяды, араластырады және пробирканы
40 0С-қа дейін қыздырылған су моншасына қояды. Сұйықтық ауамен жақсы
жанасуы үшін пробирканы арасында сілкіп-шайқап қойып отырады. Қоспаның түсі
ақшыл қызыл, содан кейін қоңыр және 1-2 сағаттан кейін қара болады, себебі
тирозиназа (монофенолоксидаза) әсерінен тирозин қызыл түске боялған аралық
қосылыстар арқылы қара азотты пигмент – меланинге айналады. Реакция химизмі
[8; 133 бет].
Тәжірибе 4. Картоптағы пероксидазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: Ұсақтағыш (терка), шикі картоп,
пирогаллол (1 %-дық), сутек пероксиді (2 %-дық).
Тәжірибе барысы. Картопты ұсақтайды. Оның аздаған мөлшерін сықпай
пробиркаға ауыстырады, 1-2 мл 1 %-дық пирогаллол ерітіндісін және 1-2 тамшы
2 %-дық сутек пероксиді ерітіндісін қосады. Тұрғанда пурпурогаллиннің қоңыр-
сары тұнбасы түзіледі:
Пирогаллолдың және аралық өнімдердің бірнеше рет дегидрленуі (тотығуы)
пероксидаза қатысуымен жүзеге асырылады. Пероксидаза әр жағдайда үзіліп
алынған сутек атомдарын сутек пероксидіне береді.
Тәжірибе 5. Тұқымдардағы липазаны ашу
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: фарфор келі, 50 мл-лік өлшеуіш цилиндр,
25 мл-лік бюретка, 100 мл-лік конустық колба, 2 және 5 мл-лік пипеткалар;
тұқымдар, вазелин майы, фосфаттық буфер (0,2 М; рН 4,8), этил спирті (96 %-
дық), диэтил эфирі, фенолфталеин (1 %-дық спирттік ерітінді), 0,1 н. калий
гидроксиді.
Тәжірибе барысы. Тазартылған 0,2 г тұқымды фарфор келіде мұқият
үгітеді, содан кейін оны 3 мл вазелин майымен және 2 мл 0,2 М фосфаттық
буфермен (рН 4,8) араластырады. Қоспаны 30 минут инкубациялайды, 30 мл 96 %-
дық этил спиртін және 15 мл эфир қосады. Мұқият араластырады, содан кейін
қоспаны 100 мл-лік конустық колбаға ауыстырады, 2-3 тамшы фенолфталеин
ерітіндісін қосады және бөлініп шыққан май қышқылдарын 0,1 н. КОН
ерітіндісімен титрлейді (лабораториядағы барлық жанарғылар сөндірілген болу
керек!). Бақылау сынамасы ретінде инкубацияланбаған қоспаны пайдаланады.
Тәжірибелік және бақылау сынамаларында титрлеуге кеткен сілті мөлшеріндегі
айырма липаза активтілігінің көрсеткіші болып табылады.
Бақылау сұрақтары
1. Ферменттер деп қандай заттар аталады?
2. Табиғаты белок емес катализаторлардан ферменттердің әсер ету
ерекшеліктері қандай?
3. Биологиялық материалдағы ферменттерді қалай анықтауға болады?
4. Тәжірибелердің қайсыларын мектеп курсында пайдалануға болады?
Зертханалық жұмыс № 8
Ферменттердің қасиеттері
Теориялық бөлім
Ферменттерде белоктардың барлық қасиеттері болады. Бірақ клеткада басқа
функция атқаратын белоктармен салыстырғанда ферменттердің тек өзіне тән
спецификалық қасиеттері бар. Ферменттердің активтілігіне температура,
ортаның рН мәні, кіші молекулалы қосылыстар мен иондардың, әсіресе ауыспалы
металл иондарының болуы әсер етеді. Соңғылары ферменттерге активтендіруші
де, ингибирлеуші де әсер етеді.
Ферменттің активтілігі максимал болатын температура ферменттің
температуралық оптимумы деп аталады. Жануар текті ферменттер үшін
температуралық оптимум 40-50 0С аралығында болады.
Ферменттердің көпшілігі бейтарапқа жақын рН мәндерінде жоғары
активтілік көрсетеді. Тек кейбір жеке ферменттер ғана күшті қышқылдық
немесе күшті сілтілік ортада жұмыс істейді. Мысалы, белоктарды асқазанда
гидролиздейтін пепсин ферментінің активтілігі рН 1,5-2,5 мәндерінде
максимал болады. Әлсіз сілтілік ортада ішекте шоғырланған ферменттер жұмыс
істейді. Әрбір ферменттің рН-оптимумы болады. Ортаның рН мәніне байланысты
фермент-белоктың активті центріндегі ионогенді топтардың иондану
дәрежесінің өзгеруі активті центр конформациясының, соның салдары ретінде
фермент активтілігінің өзгеруіне әкеледі. Амилаза активтілігінің критерийі
ретінде бастапқы субстрат (крахмал) мөлшерінің белгілі бір уақыт ішінде
азаюы қолданылады.
Әсер етуінің спецификалығы – ферменттің басты қасиеттерінің бірі.
Спецификалылық – бұл субстратқа (немесе субстраттарға) қатысты ферменттің
таңдау қасиеті. Мұның негізгі себебі – фермент пен субстрат структурасының
белгілі бір дәрежеде үйлесімді (комплементарлы) болуы. Абсолютті және
салыстырмалы спецификалылық деп бөледі. Абсолютті спецификалылық фермент
тек бір ғана субстраттың айналымын жылдамдатқан кезде байқалады. Мұның
классикалық мысалы мочевина гидролизін катализдейтін уреаза болып табылады.
Салыстырмалы (топтық) арнайылылық фермент химиялық структурасы жақын бір
типтегі реакциялар тобын жылдамдатқан кезде байқалады. Мысалы, липаза
триацилглицериндер гидролизін жылдамдатады, ал олар май қышқылдық құрамы
және қасиеттері бойынша ерекшеленеді. Бірақ олардың барлығында липаза әсер
ететін күрделі эфирлік байланыстар болады.
Практикалық бөлім
Жұмыс мақсаты: α-амилаза ферменті активтілігінің температураға, ортаның
рН мәніне, активаторлар мен ингибиторлар қатысуына тәуелділігін зерттеу;
мектепте демонстрациялық эксперимент ретінде және факультативтік сабақтарда
пайдалануға болатын тәжірибелерді бөліп көрсету.
Зерттеу материалы: сілекей ерітіндісі, ашытқы сахаразасы.
Құрал-жабдықтар мен реактивтер: 100 мл-лік стакандар, 50 мл-лік өлшеуіш
цилиндр, воронка, пробиркалар, пипеткалар, заттық шынылар, су моншасы,
термостат, мұз; 1 %-дық крахмал клейстері, Люголь ерітіндісі (КI
ерітіндісіндегі I2), Фелинг реактиві, 1 %-дық НСl, 1 %-дық NаОН, 1 %-дық
NаСl, 1 %-дық СuSО4, ашытқы, сахараза ерітіндісі.
Тәжірибе 1. Сілекей α-амилазасы әсерінен жүретін крахмал гидролизі
Ауыз қуысындағы ферменттердің көзі – сілекей бездерінің шырыны, сонымен
қатар бактериялардың ферментативті қызметі өнімдері, лейкоциттердің ыдырау
өнімдері. Сілекейдің неғұрлым маңызды ферменті – крахмал гидролизін
жылдамдататын α-амилаза. Тәжірибелерде иодпен көк түс бермейтін кіші
молекулалы декстриндер мен мальтозаға дейін жүретін крахмал гидролизі
уақытымен сипатталатын α-амилаза активтілігі бақыланады.
Тәжірибе барысы.
а) Сұйылтылған сілекей дайындау
Тамақтың қалдықтарын кетіру үшін ауызды 2-3 рет сумен шаю керек. Содан
кейін ауызға 40 мл суды ұрттап, 3-5 минут ауызды шайып тұрады, алынған
сұйықтықты стаканға төгеді. Осы сұйықтықты мақта арқылы сүзіп, фильтратты
жұмысқа пайдаланады.
б) Екі пробиркаға 5 мл-ден 1 %-дық крахмал ерітіндісін құяды. Бірінші
пробиркаға 5 мл сілекей ерітіндісін, екіншісіне 5 мл дистильденген су
құяды, таяқшамен араластырады.
Пробиркаларды 40 0С температуралы су моншасына қояды. Бір минут
өткеннен кейін әрбір қоспадан пипетка көмегімен 1 тамшыдан алып, алдын-ала
1 тамшы иод ерітіндісі тамызылған заттық шыныға жеке түсіреді (пипетканы
заттық шыныдағы тамшыға тигізбеу!). Қоспалардан сынама алуды 2,4,6,8 минут
өткен уақыттарда қайталайды. Сілекей бар пробиркадан алынған сынамалардың
түсі көктен күлгінге, содан кейін қызыл-қоңырға, қызылға және ең соңында
сарыға (I2 өзінің түсі) өзгереді – крахмалдың ыдырауы бұл пробиркада жүріп
жатыр. Екінші пробиркадан алынған сынамалар көк түс бере береді – сілекей
амилазасы әсер етпегенде крахмал ыдырамайды. Екі пробиркаға да 1 мл-ден
Фелинг сұйықтығын қосып, су банясында қайнағанша қыздырады. Қызыл түсті
тұнба Cu2O тек крахмал ыдыраған пробиркада ғана түзіледі. Крахмалдың
ыдырауы нәтижесінде кіші молекулалы декстриндер және мальтоза түзіледі.
Тәжірибе 2. Сілекей амилазасы активтілігіне температураның әсері
Төрт нөмірленген пробиркаға 2 мл-ден 1%-дық крахмал ерітіндісін құяды.
Бірінші пробирканы қайнаған су банясына салады, екінші пробирканы 40 0С-ты
баняға, үшінші пробирканы бөлме температурасында қалдырады. Төртінші
пробирканы мұзды суға (0 0С) салады. Бес минуттан кейін әрбір пробиркаға 1
мл-ден сұйылтылған сілекей қосады, араластырады және сол жағдайда
қалдырады. 2,4,6,8,10 минут өткен уақыттарда заттық шыныда иод
ерітіндісімен сынама жасайды. Нәтижесін кестеге жазады. 15 минуттан кейін
әрбір пробиркаға 2 мл-ден Фелинг ерітіндісін қосады және қайнағанға дейін
қыздырады.
№ t0 С Иодпен реакция (минут) Фелинг
... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz