Клеткалық инженерия мәселелері

Пән: Биология
Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 16 бет
Таңдаулыға:

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ АУЫЛ ШАРУАШЫЛЫҒЫ МИНИСТРЛІГІ

ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ АГРАРЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

Кафедра : Өсімдік қорғау және карантин

РЕФЕРАТ

Тақырыбы : Клеткалық инженерия мәселелері

Орындаған: Ниязбеков А, Қарасай М,

Қыдырбай Ә. ЗР-307к - тобы

Қабылдаған:

Алматы, 2015ж

Жоспар:

І. Кіріспе

ІІ. Негізгі бөлім

2. 1. Клеткалық инженерия

2. 2. Клеткалық инженерия мәселелері

2. 3. Протопластарды бөліп алу

ІІІ. Қорытынды

IV. Пайдаланылған әдебиеттер

Кіріспе

Клеткаларды өсіру деген ұғымға өсімдіктен бөлініп алынған клеткаларды, ұлпаларды, мүшелерді қоректік ортада заласыздандырылған жағдайда өсіру енеді. Өсімдік клеткаларын іn vitro жағдайында нәтижелі өсіру жұмыстарын ХХ ғасырдың 30-шы жылдары Ф. Уайт пен Р. Готре бастап еді. Өсімдіктің тірі клеткасы лайықты коректік ортада өзіне тән тотипатенттік қасиетін көрсетеді, яғни бүтін регенерант өсімдігін түзеді. Іn vitro жағдайында пайда болған өркені мен тамыры жетілген өсімдікті регенерант деп атайды.

Өсімдіктер биотехнологиясы ғылым ретінде ботаниканың негізінде пайда болып алғашында биотехнологиялық процесстерді баяндау жолымен түсіндірілді. Физикалық-химиялық зерттеулердің әдістерінің пайда болуына байланысты бұл ғылым дамып, өсімдіктерде өтетін процестерді тәжірибе негізінде зерттейді. Өсімдіктер биотехнологиясының табыстары ең алдымен физика мен химия саласындағы жаңалықтарға байланысты болды. Бұл ғылымдардың жетістіктері биотехнологиялық процестерді молекулалық деңгейде зерттеп, білуге жәрдемдесетін әдістерді жасап шығаруға мүмкіндік берді. өйткені физиологиялық функциялар негізінде биохимиялық реакциялар жатады. Организмді құратын заттардың қасиеттері олардың физикалық құрылымына байланысты. Элементтік және молекул- алық құрам организм құрылысына, құрылым функциясы атқаруына байланысты. Химия мен физиканың, биохимия мен биофизиканың енуі ғылымның жаңа салалары биотехнологияның пайда болуына мүмкіндік туғызды.

ІІ Негізгі бөлім

2. 1 Клеткалық инженерия

Клеткалық инженерия - биотехнолгияның маңызды бағыттарының бірі. Ол жаңа объектінің қолданылуына - эукариот ағзалардың, клетка немесе ұлпалардың оқшауланған культурасы, сонымен қатар өсімдік клеткаларының ерекше қасиеті - тотипатенттілікке негізделген. Бұл объектті қолдану ауқымды теориялық және практикалық есептерді шешуге үлкен мүмкіндіктер ашты. Фундаментальді ғылым саласында ұлпаларда болатын клеткааралық өзара әсер, клеткалық дифференциация, морфогенез, клетканың тотипатенттілігін іске асыру сияқты күрделі мәселелерді зерттеу мүмкін болды.

Өсімдіктердің клеткалық инженерясы қазіргі кезде көптеген мәліметтер жинап, біртіндеп генетикада оқытылатын академиялық пәндерден биотехнолгияның маңызды саласына айналды. Біріншіден, бұл клеткалық деңгейде манипуляциялауға болатын өсімдіктер ауқымының кеңеюіне байланысты. Бұдан басқа, жоғары сатыдағы өсімдіктердің клеткалық инженериясына қызығушылық танытқан өсімдіктердің генетикалық трансформациясының тиімді әдістерінің пайда болуымен арта түсті.

Өсірілетін клеткалардың ерекше қасиеті in vitro-да бүтін өсімдікді регенерациялау, оларды клональді микрокөбейту үшін, өсіру және сұрыптау материалдарын патогенді емес, таза өндіріс үшін қолдануға мүмкіндік береді. Құнды екіншілік метаболиттерді синтездеуге қабілетті өсірілетін өсімдік жасушаларын дәрілік, тағамдық, бояу заттарын өндірістік әдіспен алу мақсатында жасушалық технологияны құру үлін пайдаланылады.

Жалпы, клеткалық инженерия-экономикалық маңызды өнімдерді алуға, өсімдіктердің, жануарлар тектерінің, микроағзалар штаммдарының жаңа сорттарын жасау үшін биологиялық процестерді және жүйелерді қолдануға негізделген, ғылым мен өндірістің жаңа саласы. Биотехнология адам тыныс тіршілігінің әртүрлі саласы үшін маңызды өнімдер алуды басқаруды қамтамасыз етеді. Бұл технологиялар микроағзалар, өсімдіктер және жануарлар жасушалары мен ұлпаларын, сондай-ақ жасушадан тыс заттарды және жасушалар компоненттерінің әртүрлі биологиялық агенттер мен жүйелерінің каталитикалық потенциалын қолдануға негізделеді. Қазіргі уақытта биотехнологияны меңгеру және жасау іс-жүзінде барлық елдердің тыныс тіршілігінде сүруінде маңызды орында тұрады. Қазіргі кезде биотехнологиялық жолмен (клеткалық инженерия жолымен) көп мөлшерде, бірақ аз шығынмен, азықтық ақуыз, бактерия, саңырауқұлақтар мен су балдырларының жасушалық массасы алынады, сондай-ақ инсулин, өсу гармоны, интерферон, қан сары суының факторы, моноклональды интиденелер, иммобилизденген ферменттер және басқалар дайындалады.

Клеткалық инженерия биотехнологияны барлық салаларын қамтамасыз етеді. Мысалы, Органикалық қышқылдар алу. Сүт қышқылын алу. Спирттік ашу. Ацетоно - бутилді ашу. Микробиологиялық синтез өнімдерін алу: аминқышқылдары, ферменттер, витаминдер, полисахаридтер, липидтер. Витаминдер жəне ферменттер өндіру. Липидтер мен полисахаридтер алу. Дəрілік жəне профилактикалық препараттардың биотехнолгиялық өндірісі. Антибиотиктер өндірісі. Вакциналар алу. Металл биотехнологиясы. Қоршаған орта биотехнологиясы. Тағам өнімдері мен сусындарының микробиологиялық өндірісі. Шаруашылыққа бағалы белгілерімен жаңа малдар алу. Тез өсетін трансгендік жануарларды алу. Жануарлар биотехнологиясында қолданылатын əдістер жəне қолданалатын деңгейдегі құрылымдар. Биоэтикалық сұрақтар. Биотехнология саласындағы зерттеулеуге бақылау жəне биотехнологиялық патенттелген өнертабыс.

Биотехнология адам тыныс тіршілігінің әртүрлі саласы үшін маңызды өнімдер алуды басқаруды қамтамасыз етеді. Бұл технологиялар микроағзалар, өсімдіктер және жануарлар жасушалары мен ұлпаларын, сондай-ақ жасушадан тыс заттарды және жасушалар компоненттерінің әртүрлі биологиялық агенттер мен жүйелерінің каталитикалық потенциалын қолдануға негізделеді. Қазіргі уақытта биотехнологияны меңгеру және жасау іс-жүзінде барлық елдердің тыныс тіршілігінде сүруінде маңызды орында тұрады. Биотехнология жетістіктерінің артықшылығы дамыған елдердің экономикалық саясатында негізгі міндеттердің бірі болып табылады. Қазіргі уақытта биотехнология саласында алдыңғы орындарды АҚШ, Жапония иемденеді, олардың ауылшаруашылығы, фармацевтика, тағам және химия өнеркәсіптерінде биотехнологияның көп жылдық іс-тәжірибелері жинақталған. Ферментті препараттар, аминқышқылдар, ақуыздар, дәрі-дәрмектер өнідірісінде алдыңғы орындарды Батыс Европа елдері (ФРГ, Франция, Ұлыбритания), сондай-ақ Ресей иемденеді. Бұл елдердегі жағдай жаңа техника мен технологиялардың күшті потенциалымен, биотехнологияның әртүрлі салаларындағы қарқынды дамыған фундаменталды және қолданбалы зерттеулермен сипатталады. Жақын арада биотехнологиялық материалдарды және принциптерді қолдану, өнеркәсіптің көптеген салаларын және адамдар қоғамын түбегейлі өзгертеді.

Қазір өсімдіктер биотехнологиясының ауыл шаруашылығында маңызды бағыттары көп-ақ. Біріншіден, өсімдіктердің кез келген органдарынан жасушасын алып, қоректік орта жағдайында өсіріп, тұтас өсімдік алуға болады. Екіншіден, осы әдіспен бір жылда 1 млн өсімдік алуға болар еді. Үшіншіден, жасушалық биотехнологияға негізделген жасанды қоректік ортада синтезделетін экономикалық маңызды қосымша заттарды (алкалоидтер, гликозидтер, хош иісті майлар, дәмді заттар, табиғи бояулар, т. б. ) алуға болады. Төртіншіден, өсімдіктерді клондық көбейтуге және сауықтыруға болады. Клеткалық инженерияның әдістері: Эмбриондардың қосылуы, Клондау, Гидрид алу, Клетка арқылы тұтас өсімдік алу.

2. 2 Клеткалық инженерия мәселелері

Клеткалық инженерияның зерттеу саласы ретінде оқшауланған мүшелер, ұлпалар, және клеткаларды өсіру әдістері-физиология, биохимия, генетика, өсімдіктердің цитогенетикасында кең қолданылып жұр, сондай-ақ жаңа алғашқы материалдарды құру, оны сақтау және ұстау үшін де практикалық маңызы зор. Клеткалық инженерия облысында зерттеулерді дамыту бойынша тәжірибелі мамандарды дайындаусыз мүмкін емес екені көрініп тұр. Сонымен бірге өсімдіктердің клеткалық инжененириясында қолданылатын негізгі әдістерді сипаттайтын практикалық оқу құралдары өте аз және де бұл саланың дамуына белгілі бір шек қойып отырған факторлардың жоқ еместігі. Оларға: көп еңбекті қажет ететіндігі және де материялды-техникалық базаның қол жетімсіздігі, көптеген мемлекеттерде білімдік дәреже жетіспеушілігі, жылдың барлық мерзімінде өсіруге мүмкіндік бергенмен - олардан каллус алуға көп уақыт кететіндігі болып табылады.

Жасушалық инженерияның артықшылығы мынада: жыл он екі ай маусымға тәуелсіздік және уақыт пен егіс көлемінің үнемделуі, жасушалық популяцияның әрбір жасушасын жеке организм деп теңесе, бір тәжірибенің өзінде-ақ миллиондаған дарақпен айналысуға болады. Ал дала жағдайында ең көп дегенде ғалым мыңдаған ғана өсімдіктермен жұмыс істей алады.

Өсімдіктердің жасушаларын, ұлпаларын және мүшелерін қолдан өсіру сәтті шығу үшін жасанды ортаның құрамының жақсы болуымен қатар әртүрлі қолайлы жағдайлар жасалуы қажет. Осы айтылған сөзге жасушаны қолдан өсіру сәтті болуы үшін үнемі температура шамамен 25±2°С болуы қажет деп жалпылай қабылданған шешім дәлел болады. Алайда мұндай дәстүрлі тәсіл ақпараттың аздығынан қолданылған болатын. Өйткені темекінің каллусының өсуіне 32°С, кәдімгі гармалаға 30°С, ипомеяға 30-32°С қажет.

Температура өсімдікте жүретін метаболизм процестерінің бәріне әсер етеді. Температураны эксперименттің мақсатына байланысты әрбір объектіге жекелей лайықтыланып қойылуы керек. Бірақ мұндай тәжірибелерді жүргізу үлкен еңбек пен ұзақ уақытты талап етеді, сондықтан ғалымдар жасушаларды шамамен 25°С температурада өсіре береді.

Жасушаларды қолдан өсіруге әсер етуші сыртқы факторлардың бірі - жарық. Қазіргі уақытқа дейін фотоавтотрофтылық тек 16 өсімдіктің түріне ғана тән екені сипатталып жазылған. Қалғандары фотоавтотрофтылық өсуге қабілетсіз, оларды қараңғыда немесе әлсіз түскен жарықта өсіреді. Хлорофилдерінен айырылған ұлпаларға жарықтың әсер етуі фитохромды жүйемен қамтамасыз етілген. Екіншілік қосылыстарды алу үшін қолдан өсірілетін жасушаны қолданатын эксперименттерде жарық пен фотопериодтың белсенділігі мен сапасының әсері нақты тағайындалған. Жасуша технологиясында жасушаларды жарықпен қамтамасыз ету басты міндеттердің бірі.

Жасушаларды сәтті өсіру үшін қажет маңызды факторлардың бірі - аэрация ( Аэрация- сұйықтықтарды ауамен қанықтыру процесі мен әдісі; мысалы, органикалық заттардың тотығуы барботирлеу арқылы өткізіледі. Анаэробтық ферментті тотығу-тотықсыздану процесі; оның нәтижесінде бөлінген энергия микроорганизмдердің тіршілігіне жұмсалады ) . Аэрациясыз ешбір жасуша тіршілік ете алмайды. Газдардың (оттегі, азот, көмірқышқыл газы) жасушаларға әсері мүлдем зерттелмеген.

Жасушаларды өсіруде және жасанды ортасын жасағанда физикалық фактор осмос қысымыныңда әсерін ескеру қажет.

2. 3 Протопластарды бөліп алу

Клеткалық инженерия - клеткаларды өсіру, оларды будандастыру және қайта құрастыру арқылы клетканың мүлдем жаңа типін жасау әдістерін негізінде қалыптасқан биотехнологияның саласы. Клеткаларды жасанды жолдармен будандастырғанда, сомалық(жыныстық емес) клеткаларды бір-біріне қосқанда будан геном түзіледі. Будандастырудың бұл тәсілінің мәні мынада: аталық және аналық клеткалар ретінде жыныстық клеткалар (гаметалар) емес өсімдіктің дене (сомалық) клеткалары қосылады. Олардың алдын - ала протопластарын бөліп алады, белгілі жағдайда олар бір-бірімен қиылысады. Пайда болған сомалық будан клеткалардан кейін регенерация арқылы будан өсімдіктер өсіп шығады.

Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердің қоспасын пайдаланады. Бұл қоспаның құрамында ферменттердің үш түрі болады: олар пектиназа, целлюлоза, гемицеллюлаза. Олар клетка қабығының негізгі компо-ненттерін ыдыратады. Бұл ферменттерді кейбір бактериялар мен саңырауқұлақтар өздерін өсірген сұйық ортаға бөліп шығарады, сонымен қатар оларды ұлудың ас қорыту сөлінен бөліп алады. Қазіргі уақытта пептиназалық және целлюлазалық әсері бар бірталай стандарттық бірнеше ферменттер бар. Олардың фирмалық аттары әртүрлі, атап айтқанда мыналар:

Целлюллюлаза;

Гемицеллюлаза;

Пектиназа;

Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу арқылы залалсыздандырады. Клетка түрінде құрылымы мен құрамы жағынан айырмашылық болғандықтан, қолданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара қатынасы бірдей болмайды. Әрбір ұлпа үшін ферменттердің құрамы, концентрациясы мен ара- қатынасы және өңдеу уақыты бөлек іріктеліп алынады. Бөлініп алынған протпластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уақыт болуы керек, одан кейін ұқыпты түрде жуылуы қажет.

Протопластарды бөлу кезеңінде осмостық стабилизатор маңызды қызмет атқарады. Протопластар бүтін болуы үшін ферменттік ерітінділер изотониялық немесе гипертониялық күйде болуы керек. Кейде материалды алдын-ала плазмолиздік ерітіндісінде біраз ұстайды. Осмостық зат ретінде көбінесе қанттар (глюкоза, сахароза, сорбит, маннит) пайдаланылады. Осмостық қысымның дәл концентрациясы өсімдіктің нақты түрінен және оның физиологиялық күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады. Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге қолданылатын қоректік ортада ерітіліп дайындалады. Ферменттік ерітіндінің РН көрсеткішіндегі бір деңгейде (5, 4-6, 2 ) ұстау үшін буфер қосады.

Протопластарды бөлу кезеңінде аэрацияның маңызы зор. Слндықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітіндінің түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады. Протопластарды ала көлеңкеде немесе қараңғыда бөліп алады. Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне, РН және температураға байланыста, 1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады. Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өңдеу уақытын жеке іріктеп алу қажет. Температура әр деңгейде болады, мысалы бидайда 14°С болса, томатқа ең қолайлысы 27°С.

Протопластар бөлініп алынған соң, олар ұлпаның қалдықтары мен ферменттерден тазалануы керек. Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады. Инкубациялық қоспаның тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді, одан кейін протоплас суспензиясын центрифугалайды. Центрифугалау тәртібі осмостық затқа байланысты. Егер ферменттік ерітіндісі 0, 4-0, 5 м сахарозада дайындалса, 100-200гр 2-3 минут бойы центрифугалайды. Протопластар үстіне қалқып шығады, оларды Пастер пипеткасымен сорып алып, 2 рет тұздың ерітіндісімен шаяды. Тығыздығы төмен басқа осмостық заттарды (маннит, сорбит) қолданған кезде, протопластар центрифугалау кезінде тұнба болып шөгеді. Оларды 2 рет жуады. Одан кейін протопластарды тұздың ерітіндісінде немесе 0, 4м маннит, сорбит, глюкоза ерітіндісіне немесе өсіретін қоректік ортаға салып, суспензиясын алады.

Тіршілікке қабілетті протопластарды алу . Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты. Олар атап айтқанда: ұлпаның шығу тегі (жапырақ, тұқым жапырақ, тамыр, тозаң түйірі, каллус ұлпасы, суспензиядағы клеткалар), өсімдіктің түрі мен сорты, өсімдіктің физиологиялық күйі, ферменттердің құрамы, олардфың сапасы, ортаның РН және осмостық заттың түрі.

Протопластардың тіршілікке икемділігін, яғни олардың метоболиттік активтілігін анықтайтын арнайы әдіс бар. Ол протопластардың флуоресцеиндиаце- татпен (ФДА) боялуы. ФДА бұл флуоресценциясы жоқ қосылыс, протопластар мембранасы арқылы жеңіл өтеді, тірі протопластардың ішінде эстеразалардың әсерімен ыдырайды. Соның нәтижесінде флуоресцеин босайды, оны прото-пластардың бүтін мембраналары ұмтап қалады. Сондықтан метоболиттік активтыілігі бар (тіршілікке қабілетті) протопластар ультра күлгін сәулесінде көзге көрінеді, себебі жинақталған флуоресцеин ультрокүлгін сәулесімен қоздырылып, жасыл сәулені тарата бастайды.

Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың саны мен (процент мөлшерінде) белгіленеді. Протопластардың саны Фукс-Резонталь камерасында есептеледі. Протоплдастардың тығыздығы (суспензияның 1 мл-дегі саны) суспензияның маңызды сипаттамасы. Егер ұлпаның немесе өсірген клеткалардың ылғалды массасының 1гр-нан 1х10 ³ тен 1х10 ⁴ ке дейін тіршілікке икемді протопластар шықса, онда протопластар жақсы бөлініп алынды деп есептеледі.

Жоғарыда айтылып кеткендей, протопластардың бөлініп алынатын мөлшері және олардың өміршеңдігі сімдіктің түріне, жасына және физиологиялық күйі-не, яғни генетикалық және эпигенетикалық ерекшеліктеріне байланысты.

Протопластарды көп мөлшерде тұрақты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жағдайда өсіру керек және олардың ең қолайды өсу кезеңін нақтылы бір мүшесін анықтап таңдап алуы қажет.

In vitro өскен клеткалар мен ұлпалардан протопластарды бөліп алудың мынадай артықшылықтары бар: стирильдік, In vitro жағдайларында өсіруге бейімділік. Бірақ клетка қабықшасының химиялық құрамының күрделі болып өзгеруі және оның қалыңдауы ферменттік гидролизді қиындатады. Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген клеткалардың ішінде меристемалық клеткаларының сан жағынан үйлесіне сай болады, ал ол үшін суспенциядағы клеткаларды жиі-жиі жаңа коректік ортаға көшіріп отыруы керек.

Суспензияда өсірген клеткалардан протопластарды алу үшін ең қолайлы мерзім, ол клеткалардың өсу кезеңінің лагарифмдік фазасының соңында. Осы мезгілде клетка қабықшалары ферменттердің әсерімен оңай ыдырап, өміршең протопластарды береді. Протопластардың тіршілікке екемділігі оларды бөліп алу жағдайлары мен тәсілдеріне байланысты. Клетканың плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және қабығының бұзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді. Бұл жағдайда цитоплазмангың вокуольденуі артады, көптеген липид тамыршалары пайда болады, полисомалардың саны азаяды, ядромен хлоропластар қоюланады.

Фермент препаратының сапасы протлпластардың бөліп алынған санына, мөлшеріне ғана емес, олардың кейбір қасиеттерінеде әсер етеді. Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препаратына қоспа ретінде протезалар, липазалар, нуклеазалар және басқа ферменттер, фенолдық қосылыстар, тұздар кіреді. Олар плазмалемманың қасиеттерін өзгертуі мүмкін. Осы токсикалық заттардан құтылуы үшін және протопластардың шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады. Бірақ айта кететін мәселе өте жақсы тазартылған ферменттер протопластарды көп мөлшерде алуға тиімсіз келеді. Кейде ферменттік ерітіндісі қорғаушы заттар (протекторлар) қосылады, мысалы: калий сульфатының 0, 5% ерітінділері. Олар протеиндермен әрекеттесіп, ферменттердің зиянды әсерін төмендетеді.

Инкубациялық ортада иондардың, әсіресе кальций мен магнийдің болуы плазмалемманың тұрақтылығын арттырып оқшауланған протопластардың сапасын жақсартады. Оқшауланған протопластар механикалық және осмостық стреске өте сезімтал болады. Олар тек ішіне сіңіп кіре алмайтын осмостық заттың гипертониялық ерітіндісінде өздерінің осмостық тұрақтылығын сақтай алады.

Ферменттік ертіндісінен жуылып тазартылып алынған тіршілікке икемді протопластар шок күйінен шығып, біртіндеп өзінің ішкі жүйесіндегі бұзылған құрылымдарын жөніне келтіріп (репарация), қабығын қайта құруға (регенерация) дайындалады. Толық жарамды изотониялық қоректік ортада (протопласт пен ортаның осмостық қысымы тепе-тең) асептикалық жағдайда протопластар ұзақ мезгіл тіршілікке икемді болып, бөлінуге қабылетін сақтайды.

Протопластарды In vitro өсіру. Протопластарды In vitro түрлі тәсілдермен өсіруге болады. Өсіру тәсілі тәжірибенің мақсатына байланысты. Алдымен протопластардың қоректік ортада шайқап жуып ферменттерден тазартады. Содан соң олардың 1 мл ортадағы санын есептеп алады. Жасайтын тәжірибеге сәйкес олардың тығыздығын керек көрсеткішке жеткізеді. Ол үшін протопластарды әртүрлі көлемі бар ортаға салады.

Ал, керісінше, протопластардың тығыздығын азайту үшін оларды қоректік орта мол құйылған ыдысқа көшіреді. Сөйтіп, протопластардың 1 мл ортадағы санын оқтын-оқтын есептеу арқылы олардың тығыздығын жасайтын тәжірибеге сайма-сай келтіреді.

Протопластарды сұйық ортада өсіргенде клеткаларды өсірген сияқты олардың тығыздығы жоғары болуы керек. Көбінесе бұл көрсеткіш 1-мл 10 ^4--- 10 ⁵ клетка болады. Егер қоректік орта сұйықталып, протопластар саны бұдан аз болса, онда олар жөнді өсе алмайды. Өте сұйық суспензияда протопластардың ішіндегі тіршілікке қажетті кейбір метоболиттер плазмолемма арқылы ортаға шығып кететін көрінеді. Сондықтан протопластардың тіршілік қабылеті едәуір кемиді. Осының дәлелі ретінде мынадай мысал келтіруге болады. Әдетте ісік ұлпалардан алынған клеткаларды суспензияда өсіргенде қоректік ортаға ауксин мен цитокинин гормондарын қоспайды. Өйткені бұл гормондар осындай ісік клеткаларының өздерінде түзіледі. Сұйық ортада өсіргенде клетка қабығы ол гормондардың клетканың ішінен сыртына шығуын бөгейді де, ондай эндогендік метоболиттерді клетканың өзіде пайдалана алады. Ал ісік клеткалардан бөліп алынған протопластарды суспензияда өсіру үшін қоректік ортаға міндетті түрде экзогендік ауксин мен цитокининді қосу керек. Себебі, жоғарыда айтылғанындай, олардың өз эндогендік гормондары клетканың қабығы болмағандықтан плазмолеммадан шығып кетеді.

Протопластардың өсуіне жақсы жағдай жасау үшін «Қоректік қабат» әдісін пайдаланады немесе байытылған ортаны қолданады, болмаса олар өсіп жатқан ортаның көлемін минимумға дейін азайтады. «Астыңғы қоректік қабат» ретінде рентген немесе гамма сәулелері әсер ететін протопластар мен клеткалар пайдаланылады. Сол әсерден ондай клеткалар бөліну қабылетінен айырылады, бірақ басқа клеткалардың өсуіне жағдай туғызады. Осы әдістің тағы бір түрі, ол нашар өсетін протопластарды жақсы өсетін протопластармен бірге өсіру. Байытылған орталар өсімдіктердің шамалы түрлері үшін ғана оң әсерін тигізеді.

Протопластарды өсірудің кең таралған әдісі, оларды жоғары ылғалдылықта көлемі 20-40 мкм тамшыларда өсіру. Петри табақшасының қақпағында немесе түбіндегі кішкене тамшыларға протопластар автоматтық пипеткамен салы-нады. Протопластарды өсіру үшін бұл әдістің тиімділігі-материалдар мен уақытты үнемдеп, қоректік ортаның мыңдағын вариантарын тексеруге мүмкіншілік береді. Бірақ бұл әдістің де кемшілігі бар, ол протопластардың тамшының ортасына жыиылуы.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.