«ферменттермен жұмыс істеу әдістемесі. ферменттерді бөліп алу»

Пән: Химия
Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 11 бет
Таңдаулыға:

Қазақстан Республикасының Ғылым және Білім министрлігі

Семей қаласындағы Шәкәрім атындағы мемлекеттік университеті

Тақырыбы: «Ферменттермен жұмыс істеу әдістемесі. Ферменттерді бөліп алу».

Орындаған: Ашкенова З. Н.

Тексерген: Кабденова А. Т.

Семей қ. 2015 ж

Жоспар

І. Кіріспе

ІІ. Негізгі бөлім

Ферменттерге жалпы сипаттама.
Жасушалық ферменттер ішінен қажетті биореагенттерді анықтау .
Ферменттер модификациясы және оларды алу әдістері.
Ферменттерді бөліп алу және тазарту.

ІІІ. Қорытынды

IV. Пайдаланған әдебиеттер

Кіріспе

Қазіргі кезеңде, басқа да ғылым салаларымен бірге қарқынды дамып келе жатқан өзінің зерттеулерінің қолданбалы нәтижелері және жетістіктері жердегі бүкіл тіршілік иелері үшін аса маңызды биохимия ілімінің бір бөлімі ферменттер болып табылады.

Ферменттердің тірі ағзаларда өтетін химиялық реакциялардың жүру барысын реттеп, белгілі бір тәртіппен өткізуі сол ағзаның тіршілік ету қабілетінің сақтауының, тұрақты болуының, ұрпақ жалғастыруының кепілі.

Қандай да бір реакциялардың жүру барысының өзгерісі міндетті түрде метаболиттік процесстердің өзгеруіне әкелетіні, сол себепті, ағзада зат алмасуының бұзылатыны күмән келтірмейді.

Ферменттерді медицинада пайдалану адам ағзасындағы әртүрлі патологиялық қалыптың (аурудың) пайда болу себептері мен дамуы механизмдерін (этиопатогенезді), (бұл - энзимодиагностика), емдеу жолдарының стратегиясы мен тактикасын құруды және емдеуді (бұл сол мақсатта ферменттерді дәрілік препарат ретінде пайдалану - энзимотерапия), емдеу барысының тиімділігін бақылау тәріздес аса маңызды проблемаларды шешуге жоғары дәлдікпен көмектеседі. Сонымен бірге, аурудың диагностикасы үшін маңызды, қазіргі қоғамда дені сау ұрпақ жалғастыру үшін алдын-ала болжауға мүмкіндік беретін саланың бірі - энзимопатология - тұқымқуалаушы және жүре пайда болатын аурулардың себептері мен даму механизмдерін айқындап, адамның қоғамдық және индивидуалдық аспектілеріндегі проблемаларды шешіп бере алады.

Ферменттерді зерттеудің нәтижелері тірі биологиялық объектілердің құрылысын, қасиеттері мен зат алмасуы процестерін басқа салалар мен бірге медицинаның да молекулалар деңгейінде зерделей алуына мүмкіндік береді.

Энзимологияны оқып-үйрену және білу студенттің болашақ кәсіпқой дәрігер болып қалыптасуы үшін өте қажетті.

Ферменттерге жалпы сипаттама.

Фермент деп катализатор қызметін атқаратын ақуыздардың ерекше түрі

айтылатыны белгілі. Катализатор дегеніміз - ағзада жүретін химиялық реакциялардың бағытын өзгертетін немесе жүру қарқындылығын арттыратын арнайы молекулалар.

Сонымен, ферменттер қатарына бөтен ақуыздарды ыдыратып, немесе реакцияны басқа бағытқа аудара алатын катализаторлар кіреді. Бұл дегеніміз адам үшін өте қажетті заттар түзілетін қажетті реакциялардың бастамасы. Табиғатта ферменттің мыңдаған түрі бар.

Микроорганиздер ағзаға өте қажетті құрамында көміртекті заттары бар көптеген қосылыстарды синтездей алады. Жануарлар мен өсімдіктермен салыстырғанда, микроорганизмдер арқылы ферменттер алу өте тиімді келеді. Микробтық жасушалары өсіп-даму, тыныс алу жəне өнім түзілуге жауапты түрлі биохимиялық реакцияларға катализаторлық қызмет атқаратын 2 мыңнан астам ферменттерді синтездейді. Осы ферменттер ішіндегі көптеген бөлігін бөліп алуға болады жəне олар жасушадан тыс та өз белсенділіктерін таныта біледі. Ферментті дəрмектерін алу мақсатында микроскопиялық саңырауқұлақтармен қатар, бактериялар мен ашытқылар да пайдаланылады. Культуралдық сұйықтығындағы ферменттер белсенділігі тез басылып қалатындықтан, өндірісте құрғақ техникалық фермент дəрмектерін дайындау кеңінен қолданылады.

Ферменттер, басқа глобулярлық ақуыздар сияқты рибосомада синтезделіп, клетка ішінде қызмет етіп (эндофермент) немесе ішкі оттаға секрецияланады (экзофермент) . Клетканың ферментативтік жиынтығы типтік, түріне сәйкес, генетикалық детерминацияланаған. Сонымен қатар оларды коститутивтік (тіршілікке маңызды негізді, көбінесе эндогендік), клетка үнемі тұрақты концентрацияда болады және , бұлардың концентрациясы мен активтілігі субстратпен байланысты. Клетка өз тілшілігін соңғылырсыз сақтай алады.

Дүние жүзі бойынша қажетті деп танылатын 20 фермент түрі (ғалымдардың айтуынша табиғатта 2500-дей фермент бар) 65 мың тонна көлемінде өндіріледі. Мысалы, өндірістік деңгейде көп өндірілетін ферменттер қатарына амилаза, глюкоамилаза, протеаза, инвертаза, пектиназа, каталаза, стрептокиназа, целлюлаза жəне басқаларын жатқызуға болады.

Өндірісте көбінесе гидролазалар (синтетикалық жуғыш заттар өндірісіндегі детергенттер) және глюкозидазалар (кондитерлік өнімдер, жеміс және көкөніс шырындарын шығаруөндірісінде) қолданылады. Сондай-ақ ферменттер тағамдық, целлюлоза-қағаз, медициналық және басқа салаларда кең қолданады.

Жасушалық ферменттер ішінен қажетті биореагенттерді анықтау.

Жасушаның таңқаларлық көп химиялық қосылыстарын сорттап, ішінен қажетті ферментті таңдап алу - өте күрделі жұмыс. Мұны шешу үшін келесі мүкіндіктердің орындалуы қажет болады:

қызықтыратын қызметі бар жасушаны таңдап, кездейсоқ ферментті

бөліп алғаннан кейін, олардағы амин қышқылдарының орналасу тəртібін анықтау керек. Кейін, осы ферменттер арасындағы ұқсастықтарды анықтау үшін, анықталған фермент құрылысын, бізге белгілі қызмет атқаратын фермент құрылысымен салыстырады. Мұндай қажетті қызмет атқаратын ферменттің табылмауы да мүмкін.

- жасуша құрамынан қажетті затты синтездейтін мРНҚ бөліп алынып, олардың матрицасында трансляция үдерісі кезінде пайда болатын ферменттерді сынап көру қажет. Жасушаның белсенділігіне байланысты көрінетін ферменттерге басты назар аударылады. Кейін, жоғарыда келтірілген тəсілмен ферменттер арасындағы ұқсастықтарды анықтау үшін, қажетті фермент құрылысын белгілі қызмет атқаратын фермент құрылысымен салыстырады.

белсенді емес жасушалар популяциясы іріктеліп алынып, оларға

кездейсоқ жолмен ферменттер қосылады, нəтижесінде қажетті белсенділіктері көрініс бергендері таңдап алынады. Сөйтіп, жасушаға қосылған фермент нəтижесінде қажетті белсенділік пайда болғандықтан, дəл осы фермент біздерге қажеттісі екен деген пікір жасалынады.

Бұл бағыттағы ізденіс жұмыстарының қарқынды түрде жүргізіле бастауы, ақуыздардың құрылысы мен ондағы амин қышқылдарының орналасу реті жөніндегі мол деректердің жинақталуына байланысты арта түскен болатын. Нəтижесінде атқаратын қызметтері ұқсас келетін ақуыздардың құрылымдық ерекшеліктері салыстырыла басталды. Жүздеген мың табиғи ферменттердің шектеулі ғана архитиптерге, немесе супержанұялық типке (суперсемейство) жататындары анықталды. Бір жанұялық типке жататын ақуыздар, ұқсас құрылым мен қызметтерге ие болады жəне олар алыс туыстарда да кездеседі. Жаңа табылған ферментті, атқаратын қызметі бұрыннан белгілі ферменттің құрылымымен салыстыра келе, оның түзілген классификациядағы орнын анықтауға болады. Алайда, ферменттің қандай ұялық типке жататынын анықтау, тіпті оның амин қышқылдық орналасу ретін басқа ұқсас құрылымды ферменттермен салыстыру нəтижесі де, əрдайым бұл проблеманы шешуге қол жеткізе бермейді. Бұған дəлел ретінде, ферменттің атқаратын қызметі оның үш сатылы құрылымымен анықталатынын жəне тек бірнеше амин қышқылдары ғана алмастырылған жағдайдың өзінде, бұл ақуыздың мүлде басқа қызмет атқара бастайтынын еске түсірсек жеткілікті. Бірақ та, соңғы жылдардағы заманауи компютерлік технологияның мүмкіндіктерін пайдалану, биологиялық скрининг нəтижелерінің тиімділігін арттыруға қол жеткіздірді. Соның нəтижесінде көптеген пайдалы жақтары мол болуы мүмкін деп есептелетін биоэнзимдерді анықтау мүмкін болып отыр.

20-суретте жасушалық ферменттерді анықтауға қажетті үдерістердің түрі жинақталып берілген.

Табиғи ферменттер өте тиімді жұмыс істегенімен, жасушаның атқаратын қызметі біздердің сұранысымызды əрдайым толықтай қанағаттандыра бермейді. Біздер, қажетті өнімді көп мөлшерде алуды, яғни оны өндірістік деңгейде өндіруді қалаймыз. Жасушалар болса, зат алмасуы үдерісі барысында түзілетін өнімдерін (метаболизм) реттеп, əрдайым өздеріне қажетті мөлшерде ғана шығаруға бейімделген. Жасушалардың көптеген ферменттері қыздыруға шыдамсыз жəне өмір сүру мерзімі де қысқа болып келеді. Сонымен бірге, олар өздері катализдейтін реакция өнімінің көлемі жеткілікті деңгейге жеткен уақытта, «ажыратылып қалу» (отключение) қасиетіне ие. Кейбір жағдайларда, біздерге қажетті қасиеттері бар ферменттер табиғатта мүлдем болмағандықтан, оларды басқа ферменттерді өзгерістерге ұшырату жолымен алуымызға тура келеді.

Ферменттердің қалай қызмет атқаратындықтарының толықтай зерттелуі, оларды өздеріміздің мақсатымызда пайдалануымызға мүмкіндік беретін - рекомбинантты ДНҚ технологиясын меңгеруімізге жол ашты. Соның нəтижесінде, адамдар табиғат берген сыйды қайта құрастыру мүмкіндігіне қол жеткізді. Мысалы, экстремалды жағдайда (температура, құрғақшылық, РН-ортасы) тіршілік ететін организмдерден ферментін алып, бұл ферменттердің ерекшеліктерін өз мүддемізге сай пайдалану əдістері табылды. Біздер үшін, əсіресе, табылған ферменттің əрекетінің қажетті нəрсеге бағытталуы, яғни оның əсері аумағының шектеулі болуы қызықтырады.

Ферменттер модификациясы жəне оларды алу əдістері

Рекомбинантты технология үдерісінің меңгерілуі, табиғи ферменттерді өндірістік мақсатта пайдалану мүмкіндігін арттырды. Жақын аралықтағы жасуша үдерістерінің ашылуы мен осы саладағы көптеген патенттік ізденістердің тіркелуі, биореагенттерді өндірістік мақсатта қолданудың ауылы алыс еместігіне меңзейді.

Белгілі бір молекуланың химиялық құрамын өзгерту үшін бағытты мутагенез əдісі қолданылады. Бұның мəні, арнайы жүргізілген индукция нəтижесінде генетикалық кодтың бөлігінде жүретін өзгерістерге негізделеді. Мұндай технологияны қолдану кезінде, зерттеуші мутацияның жасушаның қызметіне əсерін бақылағаннан кейін, осы өзгерістің шығу көзін анықтау мақсатында, бұл жұмысты кері бағытта жүргізеді. Егерде зерттеушіні қызықтыратын қызмет көрініс бермесе, онда ол коды бұзылған ақуыз дəл осы қызметке жауап береді деген пікірге келеді. Ал егерде, белсенділігі жоқ жасуша мутагенді əсерден кейін өз белсенділігін жақсартса, онда осы мутацияның біздерді қызықтыратын ақуыздың пайда болуына əкеледі деген қортынды жасауға болады.

Келесі 21-суретте өндірістік мақсатта пайдалануға қажетті жаңа ферменттерді алудың əдістері жинақталып берілген.

21-сурет. Жаңа биореагенттер мен биофабрикаларын жасау

Активті жасушалар деп қажетті (қызықтыратын) қызмет атқаратын жасушалар айтылады.

Бағытты мутагенез əдісі өндірістік мақсатта пайдаланылатын көптеген ферменттерді синтездеу жұмыстарында қолданылған. Бірақ та, өте күрделі болып келетін ақуыз құрылымындағы азғана өзгерістердің өзі, олардың үштік

құрылымындағы күтілмеген өзгерістеріне, белсенділігінің, тұрақтылығының бұзылуына, нəтижесінде ақуыздың мүлде қызмет атқара алмауына алып келуі мүмкін. Алайда, өндіріс үшін бұл технологияларды қолданудан бас тарту мүмкін емес, өйткені ғалымдар ақуыз түзілімінің амин қышқылдық құрамын азғана өзгерту, кейбір жағдайларда қажетті реакцияларды өте нəзік жəне дəл жүргізу мүмкіндігіне алып келетіндерін анықтаған Бұл ерекшелік ғалымдарды осы бағыттағы іздену жұмыстарын əрі қарай қызығушылықпен жүргізулеріне ынталандырады.

Қолдан жасалатын мутациядан басқа, ғалымдар ақуыздардың көп түрлілігін арттыратын жəне бір əдісті тапқан. Ол зертхана жағдайында қолдан шақырылатын, тиісті гендерді рекомбинациялау əдісі. Бұл əдістің негізінде, əуелі, əр түрдің гендерін рекомбинациялау арқылы генетикалық тұрғыдан күтілмеген көп түрлілікті арттыруға болатыны анықталған.

Бағытты мутагенез, не болмаса гендер рекомбинациясы нəтижесінде, қандай да бір жасушадағы ферменттердің көп түрлілігі қамтамасыз етілгені анықталғаннан кейін, мұндай жасушалар популяциясы зертханалық жағдайда көбейтіледі. Осындай жасушаларды əртүрлі қолайсыз жағдайларды қолдан тудыру арқылы тексерген кезде, бұлардың ішінен тек қана құрамында мұндай жағдайларда қажет болатын ферменттері барлары ғана тірі қалады. Осы əдісті қолдана отырып, ғалымдар металдармен ластанған, РН реакцясы өзгертулеріне, температураға шыдамды жəне т. б. факторларға төзімді жəне қажетті өнімді мол өндіре алатын жасушаларды іріктеп алады. Сондықтан, алынған жасушалардың қолайсыз жағдайларға тұрақтылығы мен жоғары өнімділіктерінің қамтамасыз етілуі, оларды шығару жұмыстарына кеткен шығынның толықтай қайтарылып, экономикалық тиімділік көрсеткіштерінің артуына өз əсерін тигізеді.

Ферменттерді бөліп алу және тазарту.

Ферменттер адамның, жануарлардың, өсімдіктердің ұлпаларында және микроорганизмдерде синтезделіп жасалады. Ферментті бөліп алу үшін, ол көп кездесетін материалды (шикізатты) таңдап алу керек. Егер фермент алынатын материал жануар ұлпасы болса, онда ол ұлпаны басқа бөліктерден беліп ажыратады және қанын жуып тазартады. Тандап алынған материалдағы ферменттер бұзылып кетпеу үшін, оны төменгі температурада (2-8°С) ұнтақтайды. Осылайша ұнтақталған біртектес массаны центрифугаға салып өңдейді. Осы кезде фермент оның сұйық белігіне (центрифугатқа) етеді де, шегіндіні тастайды.

Ферменттер белоктік заттар болғандықтан, оларды алу үшін белокті бөліп шығаратын әдісті қолданады. Белокты шөктіріп тұнбаға түсірудің бірінші кезегінде центрифугатқа аммоний сульфатын немесе органикалық еріткіштерді (этил спиртін немесе ацетонды) қосады. Бұл кезде ферменттермен қоса бүкіл белоктар дерлік тұнбаға түсіріледі. Бұдан кейін ферменттерді ептілікпен бөліп алу үшін ионалмасу хроматография әдісін қолданады. Әсіресе әртүрлі шайырлар, олардың ішінде ерімейтін ДЭАЭ-целлюлоза кең түрде қолданылады.

Полиакриламидті, крахмалды немесе агарлы гелде жүргізілетін электрофорез әдісімен де ферменттерді бөліп алуға болады. Осыдан кейін бөліп алынған фермент препаратының біртекті тазалығын тексереді. Ферменттің тазалық дәрежесі оның меншікті активтілігімен бағаланады, бұл кезде ферменттің активтілігін 1 мг белокқа шағып есептейді. Әдетте ферментті тазарту жұмысын, осы істің келесі кезеңінде олардың меншікті активтілігі одан әрі артпайтындай деңгейге дейін немесе электрофорездеу, гель-сүзу, ионалмасу хроматография не ультрацентрифугалау кезінде тек бір ғана белок компоненті бөлінгенге дейін жүргізе береді. Ферментті препараттарды өнеркәсіптік жолмен өндірудің түрлі жолдары бар.

Жасуша цитоплазмасында еріген ферменттер одан сумен немесе тұздардың сұйытылған ерітінділерімен оңай экстракцияланады. Содан кейін бұл ферменттерді аммоний сульфатымен фракционирлеу арқылы тазалайды және бір-бірінен бөліп алады.

Жасушаның құрылымдық элементтерімен байланысқан ферменттерді дезинтеграциадан, яғни жасуша қабықшасын бұзудан кейін ғана бөліп алуға болады. Жасушаларды уатып, қатырып және қайтадан ерітіп, ультрадыбыстың әсеріне ұшырату арқылы механикалық жолмен және арнайы ферменттік препараттарды пайдаланып ферментативтік жолмен бұзуға болады.

Жасушаларды бұзу үшін алдымен биомассаның құрамында қандайда бір буфер, этилендиаминтетра сірке қышқылы және альбумин болатын сахарозаның децимолярлы ерітіндісіне (рн-7, 3) жуады. Содан сон шыны микрошарларды қосады да, 13000 айн/мин жиілікте дезинтеграторда гомогенизациялайды. Жасуша қабықшаларын және шыны микрошарларды центрифугалау арқылы бөліп алады.

Егер фермент суда ерімейтін липопротеидті кешендердің құрамында болса, онда ферментті ерітінді көлемінің 3-6% мөлшеріндегі бутил ерітіндісінің көмегімен ерітіндіден липиттерді бөліп алады. Фермент сулы қабатта қалады, ал липиттер бутил спиртінің қабатына ауысады.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.