Целлюлозалитикалық бактериялар
КІРІСПЕ
НЕГІЗГІ БӨЛІМ 7
9
1 Әдебиетке шолу 9
1.1 Целлюлозалитикалық микроорганизмдердің жалпы сипаттамасы 9
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6 Микроорганизмдердің целлюлозалитикалық ферменттері
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу және олардың ферменттік белсенділігн анықтау әдістері Микробтық целлюлазалардың пайдаланылуы
Целлюлозалы шикізатты қатты фазалы ферментация әдісімен жемдік қоспаларды алу
Целлюлозалы шикізат микроорганизмдерінің биоконверсиясы 10
16
19
22
27
2 ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ӘДІСТЕРІ 28
2.1 Зерттеу нысаналары мен материалдары 28
2.2 Зерттеу әдістері 28
2.2.1 Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу 28
2.2.2 Целлюлазалық белсенділігі бар штаммдар скринингі 28
2.2.3
2.2.4 Микробтық целлюлозалардың белсенділігін, пайдалану аясы мен ауданын анықтау
Эксперимент нәтижесін статистикалық өңдеу 29
30
3 Зерттеу нәтижелері және оларды талқылау 31
3.1
3.2
3.3
3.4 Қатты фазалы ферментацияда моно. және аралас дақылдардың целлюлоза конверсиясына белсенділігін анықтау
Табиғи көздерден целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу
Целлюлозалитикалық белсенділігі жоғары штаммдарды іріктеп алу
Микробтық целлюлазалардың белсенділік аясын қант қысқарту әдісі арқылы анықтау 31
41
44
49
ҚОРЫТЫНДЫ 54
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ
Қосымша
55
НЕГІЗГІ БӨЛІМ 7
9
1 Әдебиетке шолу 9
1.1 Целлюлозалитикалық микроорганизмдердің жалпы сипаттамасы 9
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6 Микроорганизмдердің целлюлозалитикалық ферменттері
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу және олардың ферменттік белсенділігн анықтау әдістері Микробтық целлюлазалардың пайдаланылуы
Целлюлозалы шикізатты қатты фазалы ферментация әдісімен жемдік қоспаларды алу
Целлюлозалы шикізат микроорганизмдерінің биоконверсиясы 10
16
19
22
27
2 ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ӘДІСТЕРІ 28
2.1 Зерттеу нысаналары мен материалдары 28
2.2 Зерттеу әдістері 28
2.2.1 Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу 28
2.2.2 Целлюлазалық белсенділігі бар штаммдар скринингі 28
2.2.3
2.2.4 Микробтық целлюлозалардың белсенділігін, пайдалану аясы мен ауданын анықтау
Эксперимент нәтижесін статистикалық өңдеу 29
30
3 Зерттеу нәтижелері және оларды талқылау 31
3.1
3.2
3.3
3.4 Қатты фазалы ферментацияда моно. және аралас дақылдардың целлюлоза конверсиясына белсенділігін анықтау
Табиғи көздерден целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу
Целлюлозалитикалық белсенділігі жоғары штаммдарды іріктеп алу
Микробтық целлюлазалардың белсенділік аясын қант қысқарту әдісі арқылы анықтау 31
41
44
49
ҚОРЫТЫНДЫ 54
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ
Қосымша
55
Тақырыптың өзектілігі. Соңғы онжылдықтың ғылыми және аналитикалық зерттеулері тиімді және нәтижелі энергия алудың көзі ретінде қайта қалпына келетін әдістер ретінде биожүйені пайдалануға негізделген технология деген қорытындыға келген. Бұл тәсілдердің ішінде жақсы зерттелгені, спирт өндірісі мен биометаногаз процессіндегі биомассаның энерготасымалдаушыларға айналуының биологиялық технологиясы. Бұл процесстер бірнеше кезеңнен тұрады, біріншісінде, органикалық полимерлердің микробиологиялық бұзылуы іске асады. Органикалық массаның декструкциясында белсенді рөлді целлюлозалитикалық бактериялар атқарады, өйткені өндіріс үдерісіне араласатын өсімді биомассалар целлюлозаның жоғары құрамымен сипатталады. Целлюлозалардың микробтық конверсиясы биотехнологиялық зерттеулердің маңызды бағыттарының бірі болып қала беруде [1; 2].
1. Рабинович М.Л., Мельник М.С., Болобова А.В. Целлюлазы микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология.- 2002, Т.38.- №4.- С.355-373.
2. Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Владимирова Е.Г. Использование целлюлозолитических бактерий в кормопроизводстве // Прикладная биохимия и микробиология.- 1998, Т.34.- №1.- С.91-94.
3. Осадчая А.Н., Сафронова Л.А., Авдеева Л.В., Иляш В.М. Скрининг штаммов бактерий с высокой целлюлазной активностью // Мiкробиологический журнал.- 2009, Т.71.- №5.- С.41-48.
4. Авдеева Л.В., Осадчая А.И., Хархота М.А. Целлюлазная активность бактерий рода Bacillus // Мiкробiологiя и бiотехнологiя.- 2011.- №2.- С.65-72.
5. Анкудимова Н.В., Баразненок В.А., Беккер Е.Г., Окунев О.Н. Целлюлазный комплекс Chaetomium cellulyticum: выделение и свойства основных компонентов// Биохимия.- 1999.- Т.64, № 9. – С. 1267-1273.
6. Борзова Н.В., Варбанецъ Л.Д. Целлюлозодеградуючi мікроорганізмів: біосинтез, властивості та структурно-функціональні особливості // Біотехнологія. – 2009. – Т.2, № 2, - С. 23-41.
7. Клесов А.А. Ферменты целлюлазного комплекса// Проблемы биоконверсии растительного сырья. – М.., Наука, 1986. - С. 93-51.
8. Клесов А.А., Черноглазов В.М., Рабинович М.А., Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы// Биоорганич.химия. – 1982. – Т.8, №5. – С. 643-651.
9. Панкратов Т. А., Дедыш С. Н., Заварзин Г. А. Ведущая роль представителей Actinobacteria в процессах аэробной деструкции целлюлозы в сфагновых болотах // ДАН. - 2006. - Т.410, № 4. - С. 438 - 442.
10. Маслова Н. Ф., Крамаренко Е. А. Эффективность применения и актуальность создания новых ферментных препаратов на основе микробиологических субстанций для нормализации пищеварения//Фармакология. – 2008. - № 4. С. 39 – 5.
11. Manmeet Kaur and Dr. S. Arora Isolation and Screening of Cellulose Degrading Bacteria in Kitchen Waste and Detecting Their Degrading Potential // IOSR Journal of Mechanical and Civil Engineering.- 2012.- Issue 2.- P. 33-35.
12. A. Balamurugan, R. Jayanthi, P. Nepolean, R. Vidhya Pallavi and R. Premkumar. Studies on cellulose degrading bacteria in tea garden soils // African Journal of Plant Science.- 2011.- Vol 5 (1).- P. 22-27.
2. Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Владимирова Е.Г. Использование целлюлозолитических бактерий в кормопроизводстве // Прикладная биохимия и микробиология.- 1998, Т.34.- №1.- С.91-94.
3. Осадчая А.Н., Сафронова Л.А., Авдеева Л.В., Иляш В.М. Скрининг штаммов бактерий с высокой целлюлазной активностью // Мiкробиологический журнал.- 2009, Т.71.- №5.- С.41-48.
4. Авдеева Л.В., Осадчая А.И., Хархота М.А. Целлюлазная активность бактерий рода Bacillus // Мiкробiологiя и бiотехнологiя.- 2011.- №2.- С.65-72.
5. Анкудимова Н.В., Баразненок В.А., Беккер Е.Г., Окунев О.Н. Целлюлазный комплекс Chaetomium cellulyticum: выделение и свойства основных компонентов// Биохимия.- 1999.- Т.64, № 9. – С. 1267-1273.
6. Борзова Н.В., Варбанецъ Л.Д. Целлюлозодеградуючi мікроорганізмів: біосинтез, властивості та структурно-функціональні особливості // Біотехнологія. – 2009. – Т.2, № 2, - С. 23-41.
7. Клесов А.А. Ферменты целлюлазного комплекса// Проблемы биоконверсии растительного сырья. – М.., Наука, 1986. - С. 93-51.
8. Клесов А.А., Черноглазов В.М., Рабинович М.А., Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы// Биоорганич.химия. – 1982. – Т.8, №5. – С. 643-651.
9. Панкратов Т. А., Дедыш С. Н., Заварзин Г. А. Ведущая роль представителей Actinobacteria в процессах аэробной деструкции целлюлозы в сфагновых болотах // ДАН. - 2006. - Т.410, № 4. - С. 438 - 442.
10. Маслова Н. Ф., Крамаренко Е. А. Эффективность применения и актуальность создания новых ферментных препаратов на основе микробиологических субстанций для нормализации пищеварения//Фармакология. – 2008. - № 4. С. 39 – 5.
11. Manmeet Kaur and Dr. S. Arora Isolation and Screening of Cellulose Degrading Bacteria in Kitchen Waste and Detecting Their Degrading Potential // IOSR Journal of Mechanical and Civil Engineering.- 2012.- Issue 2.- P. 33-35.
12. A. Balamurugan, R. Jayanthi, P. Nepolean, R. Vidhya Pallavi and R. Premkumar. Studies on cellulose degrading bacteria in tea garden soils // African Journal of Plant Science.- 2011.- Vol 5 (1).- P. 22-27.
РЕФЕРАТ
Дипломдық жұмыс кiрiспе, тақырып бойынша әдебиетке шoлу, зeрттeу әдiстерiн сипaттaйтын бөлiмнен, қoрытынды мeн пaйдaлaнылғaн 49 әдебиет көздерінен тұрады, оның 21 - шетелдік әдебиеттер. Жұмыс 7 сурет пен 12 кестеден құралған.
Түйін сөздер: Целлюлозалитикалық бактериялар, изоляттар, целлюлозалитикалық белсенділік, дақылдау.
Зерттеу жұмысының мақсаты: Салмақтық әдіс көмегімен моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін анықтау.
Жұмыстың міндеті:
1. Моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін өлшемдік әдіс көмегімен анықтау;
2. Целлюлоза спектрлерін қанттар редуцирлеуші әдіспен анықтау.
Зерттеу әдістері: Моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін анықтау өлшемдік әдіс көмегімен жүргізілді. Целлюлоза спектрлері қанттар редуцирлеуші әдіспен анықталды.
Алынған нәтижелер:
1. 25 штамм (53%) эндоглюканазамен қатар целлобиазаны түзді. Бұл штаммдардың ферментативтік кешендегі эндоглюканаздық белсенділігі 0,24+0,01 пен 0,52+0,02 мгмл аралығында, целлобиазалық белсенділігі - 0,55+0,02 тен 1,61+0,01 мгмл дейін.
2. Целлюлозолитикалық бактерияларды қатты фазалы дақылдаудың зертханалық үлгісі жасалды.
3. Штаммдарды кешенді қолдану кезінде целлюлозаның жойылуы 2 - 3 есеге артты. Белсенді аралас дақылдар: Ж23+НП-9, С-17+ НП1,Ж-7 + С-7, Ж-7 + П-5 қатты субстраттарда клетчатканы 20 - 25% гидролиздейді.
Практикалық маңыздылығы: Целлюлозаны ыдырата алатын микроорганизмдер, микробтық қалдықта биоконверсия, жемдік және азықтық ақуызды препараттар өндірісі сонымен қатар, энергетикалық мақсатта, спирт алу үшін пайдаланылады.
РЕФЕРАТ
Выпускная работа состоит из введения, обзора литературы по теме работы, раздела, из описывающих объектов и методов исследований, заключения и 49 списка использованных источников, из них 21 - зарубежная литература. Работа проиллюстрирована 7 рисунками, 12 таблицами.
Ключевые слова: Целлюлозолитические бактерии, изоляты, целлюлозолитическая активность, культивирование.
Цель: Определить активность целлюлаз в моно- и смешанных культурах весовым методом.
Задачи:
1. Определение активности целлюлаз в моно- и смешанных культурах проводили весовым методом.
2. Определение спектра целлюлаз - методом редуцирующих сахаров.
Объекты:
1. 26 вариантов смешанных культур целлюлозолитических бактерий.
Методы: Для выделения целлюлозолитических бактерий использован метод накопительных культур с двумя вариантами селективной среды Гетчинсона.
В качестве единственного источника углерода использовали: фильтровальную бумагу и натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (Na- КМЦ). Скрининг штаммов по целлюлозолитической активности проводили чашечным, весовым и методом редуцирующих сахаров.
Полученные результаты:
1. 25 штаммов (53%) образовывали как эндоглюканазы, так и целлобиазу. Активность ферментного комплекса эндоклюканаз у этих штаммов составляет от 0,24+0,01 до 0,52+0,02 мгмл, целлобиазы - от 0,55+0,02 до 1,61+0,01 мгмл.
2. Разработана лабораторная модель твердофазного культивирования целлюлозолитических бактерий.
3. При совместном применении штаммов степень деструкции целлюлозы возрастает в 2-3 раза. Наиболее активные смешанные культуры: Ж23+НП-9, С-17+ НП1,Ж-7 + С-7, Ж-7 + П-5 гидролизуют клетчатку твердых субстратов на 20- 25 % .
Практическая значимость: Микроорганизмы, способные разрушать целлюлозу перспективны для микробной биоконверсии отходов, производства пищевых и кормовых белковых препаратов, а также для энергетических целей в получении спирта.
ABSTRACT
Final work consists of an introduction , literature review on the topic of work section of describing the objects and methods of research , conclusions and list of sources used 49 , 21 of them - foreign literature . Job 7 is illustrated with drawings, 12tables.
Keywords: cellulolytic bacteria isolates cellulolytic activity, cultivation.
Purpose: Determine the cellulase activity in mono and mixed cultures gravimetric method.
Objectives:
1. Determination of cellulase activity in single and mixed cultures was performed gravimetrically.
2. Determination of the spectrum of cellulases - method of reducing sugars.
Methods: To select cellulolytic bacteria used the method of enrichment cultures with two different selective media Hutchinson.
As a sole carbon source was used: filter paper, and sodium carboxymethylcellulose (Na- CMC). Screening strains of cellulolytic activity carried the cup, weight and method of reducing sugars.
Results:
1. Of 25 strains ( 53 %) formed as endoglucanase, and cellobiase . Activity of the enzyme complex endoklyukanaz these strains ranges from 0.24 0.01 to 0.52 0.02 mg ml, cellobiase - 0.55 0.02 to 1.61 0.01 mg ml.
2. Developed a laboratory model of the solid-state culture of cellulolytic bacteria.
3 When combined strains of the degree of degradation of cellulose increases by 2-3 times. The most active mixed cultures: ZH23 + NP-9, C-17 + NP1, F-7 + C-7, F-7, P-5 + hydrolyzed cellulose solid substrates 20 to 25%.
Practical significance: Microorganisms capable of break down cellulose promising for microbial bioconversion of waste products , food and feed protein drugs , as well as for energy purposes in obtaining alcohol.
МАЗМҰНЫ
КІРІСПЕ
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
7
9
1
Әдебиетке шолу
9
1.1
Целлюлозалитикалық микроорганизмдердің жалпы сипаттамасы
9
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Микроорганизмдердің целлюлозалитикалық ферменттері
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу және олардың ферменттік белсенділігн анықтау әдістері Микробтық целлюлазалардың пайдаланылуы
Целлюлозалы шикізатты қатты фазалы ферментация әдісімен жемдік қоспаларды алу
Целлюлозалы шикізат микроорганизмдерінің биоконверсиясы
10
16
19
22
27
2
ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ӘДІСТЕРІ
28
2.1
Зерттеу нысаналары мен материалдары
28
2.2
Зерттеу әдістері
28
2.2.1
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу
28
2.2.2
Целлюлазалық белсенділігі бар штаммдар скринингі
28
2.2.3
2.2.4
Микробтық целлюлозалардың белсенділігін, пайдалану аясы мен ауданын анықтау
Эксперимент нәтижесін статистикалық өңдеу
29
30
3
Зерттеу нәтижелері және оларды талқылау
31
3.1
3.2
3.3
3.4
Қатты фазалы ферментацияда моно- және аралас дақылдардың целлюлоза конверсиясына белсенділігін анықтау
Табиғи көздерден целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу
Целлюлозалитикалық белсенділігі жоғары штаммдарды іріктеп алу
Микробтық целлюлазалардың белсенділік аясын қант қысқарту әдісі арқылы анықтау
31
41
44
49
ҚОРЫТЫНДЫ
54
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ
Қосымша
55
БЕЛГІЛІР МЕН ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР
Na-КМЦ - карбоксиметилцеллюлозаның натрий тұзы
кДа - килоДальтон
мг - миллиграм
мкм - микрометр
ЕПА - ет-пептонды агар
КІРІСПЕ
Тақырыптың өзектілігі. Соңғы онжылдықтың ғылыми және аналитикалық зерттеулері тиімді және нәтижелі энергия алудың көзі ретінде қайта қалпына келетін әдістер ретінде биожүйені пайдалануға негізделген технология деген қорытындыға келген. Бұл тәсілдердің ішінде жақсы зерттелгені, спирт өндірісі мен биометаногаз процессіндегі биомассаның энерготасымалдаушыларға айналуының биологиялық технологиясы. Бұл процесстер бірнеше кезеңнен тұрады, біріншісінде, органикалық полимерлердің микробиологиялық бұзылуы іске асады. Органикалық массаның декструкциясында белсенді рөлді целлюлозалитикалық бактериялар атқарады, өйткені өндіріс үдерісіне араласатын өсімді биомассалар целлюлозаның жоғары құрамымен сипатталады. Целлюлозалардың микробтық конверсиясы биотехнологиялық зерттеулердің маңызды бағыттарының бірі болып қала беруде [1; 2].
Одан басқа, құс шаруашылығы мен мал шаруашылығының өндірісін күшейтуде толыққанды қоректендіру маңызды мәселе болып отыр, өйткені ол өндіріс үдерісінің тізбегінің тиімділігін анықтап қана қоймай, соңғы өнімнің сапасы мен пайдалылығын анықтайды. Жемдік азықтың сіңімділігі мен құндылығын арттыра отырып, сонымен қатар, өнімділік индексін ұлғайтуға экзогенді микробтық ферменттерді пайдалану арқылы қол жеткізуге болады [3]. Оларды алудың қазіргі заманғы бағыты ол целлюлозалитикалық бактерияларды пайдалану. Олардың арасынан, жоғары ферментативтік белсенділік көрсететін штаммдар іріктеліп алынуы мүмкін, сол арқылы ас қорытылуын реттеуге болады, өйткені бұл бактериялармен өндірілетін целлюлазалар азықтың қорытылуын жақсартады.
Практикалық маңыздылығы: Целлюлозаны ыдырата алатын микроорганизмдер, микробтық қалдықта биоконверсия, жемдік және азықтық ақуызды препараттар өндірісі сонымен қатар, энергетикалық мақсатта, спирт алу үшін пайдаланылады.
Зерттеу жұмысының мақсаты. Салмақтық әдіс көмегімен моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін анықтау.
Зерттеу жұмысының міндеттері:
1. моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін өлшемдік әдіс көмегімен анықтау;
2. Целлюлоза спектрлерін қанттар редуцирлеуші әдіспен анықтау.
Бұл жұмысқа байланысты мақалалар ғылыми практикалық журналда жарияланған Гигиена, эпидемиология және иммунология; жас ғалымдардың халықаралық Пущинск ғылыми конференциясында; Экологияның маңызды мәселелері атты жинақта; Микроорганизмдер және биосфера халықаралық симпозиум материалдарында.
Зерттеу объектісі ретінде:
1. Целлюлозалық бактериялардың 26 түрлі аралас дақылдары пайдаланылды.
Практикалық базасы. Жұмыс әл- Фараби атындағы ҚазҰУ биология және биотехнология факультетінің биотехнология кафедрасында Биотехнологияда сұранысқа ие целлюлозалитикалық бактериялардың коллекциясын құрастыру атты жоба аясында жүргізілді (№ 8 Келісім).
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
1 Әдебиетке шолу
1.1.Целлюлозалитикалық микроорганизмдердің жалпы сипаттамасы
Целлюлоза ағаштарда, біржылдық өсімдіктерде, шөпте, жемістің тұқым қабығында, балдырлардың құрамында болады. Табиғатта, сонымен қатар, бактериялық және жануар (кейбір шаянтәрізділер және ұлулар) целлюлозасы кездеседі [1,2].
Целлюлоза D - глюкоза (β - 1,4 - байланыс) қалдықтарынан түзілген полимер болып табылады. Бұл қарапайым полимер макромолекулалары сызықты құрылымды болып келеді. Целлюлозаның макромолекула конфигурациясы ішкі және молекула аралық өзара әрекеттерді жүзеге асыруға мүмкіндік береді [2].
Табиғатта целлюлозаны пайдаланатын бактерияларға үлкен рөл бөлінген, өйткені соның арқасында табиғатта синтезделетін қосылыстардың басым көпшілігін, оның ішінде жасұнықты ыдыратуға болады [1].
Целлюлозалитикалық микроорганизмдер аэробты және анаэробты жағдайларда, жасұнықты жаңқалай отырып, көміртек пен энергия көзі болып табылатын, целлобиоза мен глюкозаны түзеді [2; 14].
Миксобактериялардың мезофилді түрлері, споралы және спорасыз бактериялар, актиномициттер мен саңырауқұлақтар аэробты жағдайда целлюлозаны гидролиздейді. Олардың ішінде, алдыңғы орынды, миксобактериялар алады, миксобактериялар - өте майда (0,3 - 0,4 x 0,7 - 10 мкм), кішкене майысқан, көбінесе үшкір соңды таяқшалар, басқа бактериялармен салыстырғанда бояғыштармен аз боялады. Миксобактериялар тек қатты ортада (субстратта) жылжымалы (сырғанақ) қозғалысқа ие болады. Миксобактериялардың қозғалысы бүкіл жасушаның беттік шырышының бөлінуіне байланысты деген болжам жасалады. Миксобактериялардың біркелкі емес қозғалысы, бүкіл клетка бетінен сұйықтық бөлінуіне байланысты деп болжам жасалады. Кейбір миксобактерияларда талшықтар табылған. Көптеген миксобактериялардың көбею циклы күрделі. Жасы келе, таяқшалар жуандай бастап ірі доғалданған, сфералық жасушаларға - микроцисталарға айналады, олар вегетативті клеткаларға қарағанда, қолайсыз жағдайларға тұрақты, бірақ эндоспермді бактерияларға қарағанда, тұрақтылығы төмен. Миксобактериялардың микроцисталарының өкілдері, ондаған жасушалардан тұратын шырышқа батқан, бір топқа щоғырланған (цисталар). Цисталардың шоғырлануы, көзбен көрінетін жалған ұрық денешіктерін түзеді [2; 12; 17].
Миксобактерялар агарды қоректік ортада колония түзеді. Көміртек көзі ретінде, миксобактериялар тек қана жасұнықты емес, басқа да көмірсуларды мысалы, крахмалды пайдалана алады. Бірақ та, Cytophaga және Sporocytophaga түрлері жасұнықты қалайды. Миксобактериялар үшін жақсы азот көзі - нитраттар. Миксобактериялар, жасұнық өнімдерін жаңқалау арқылы СO2 мен Н2О тотықтандыру арқылы энергия алады [3; 4].
Миксобактериялардан басқа топырақта, псевдоманас тобына жақын, жасұнықтарды жаңқалаушы Cellvibrio түрі болады. Ол бір талшықты, майысқан, эндоспоралар түзуші жылжымалы жасушалар. Cellvibrio түрінің колонияларының бірі, түссіз, басқалары - сары-жасыл реңкке боялған. Cellvibrio жасұнықты басқа да, көміртек көзі жоқ кезде пайдаланады және миксобактериялар сияқты қарқынды бұзбайды.
Қышқыл топырақта целлюлозаны ыдыратушы Chaetomium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus, Botrytis түрінің саңырауқұлақтары. Аэробты жағдайда жасұнықтыActinomyces және де басқа түрдің өкілдерінің Achromobacter, Pseudomonas мен Bacillus пайдалану қабілеті бар [5].
Сонымен, жоғарыда көрсетілген мәліметтерге сүйене отырып, целлюлозаны анаэробты және аэробты жағдайда, әр түрлі таксономиялық топқа жататын эубактериялар: Clostridium түрінің жеке өкілдері, актиномициттер қатары, миксобактериялар, Pseudomonas тегінің кейбір бактериялары, коринеформды Cellulomonas бактерия өкілдері, күйіс қайыратын жануарлардың асқазанның тұрақты тұрғындары Ruminicoccus, Bacteroides, Butyrivibrio түріне жататын бактериялар қабілетті. Бұл организмдерді біріктіретін бір ғана нәрсе, ол -- целлюлозаны ыдырататын, ферменттерді синтездеу қабілетінің болуы [1].
1.2 Микроорганизмдердің целлюлозалитикалық ферменттері
Целлюлозалитикалық ферменттерге дәстүрлі номенклатурада тек қана екі анықтама берілген, қазіргі құрылымдық классификацияда ең көп таралған негізгісі, гликолизгидролаза тобына жататын ферменттер, оларды кем дегенде 15 тұқымдасқа бөлінген [6].
Целлюлозаның ферменттік ыдырауы, бірнеше этаптан тұратын целлюлозалы кешен көмегімен іске асады. Алдымен, эндо-β -1,4-глюканаза гликозидтік байланысты, целлюлозды тізбекті ішіндегі байланысты бос соңды жуан фрагменттерге бөледі. Содан соң, экзо-β -1,4 - глюканаза тізбектің соңында дисахаридті целлобиозды бөлінуін катализдейді. Соңында, β - глюкозидазаның көмегімен, глюкозаны гидролиздейді [3; 6].
Цeллюлoзды кeшeннің құрaмынa кіретін ферменттер, анаэробтардың жасуша қабықшасымен байланыста болады немесе аэробтардан қоршаған ортаға бөліне алады. Аэробтарда, экзогенді глюконаза көмегімен целлюлоза целлобиозаға дейін ыдырай алады. Ал анаэробтарда, қоршаған ортаға целлюлозаның немесе басқа да жасушадан тыс целлюлозалар мен аралық өнімдер түзілмейді. Бaктeриялдық жaсушaның беткі қабатында, целлюлолитикалық белсенділігі бар орталықтардың сфералық бөлшектері табылған, олар целлюлостар деген атқа ие, олар көмірсутекті фибриллалар мен полипептидтік суббірліктен (целлюлозалық фермент кешені) құралған [1; 6; 13].
Aэробты және aнaэробтарда целлюлозалитикалық жәнe жалғаспалы белсенділіктің әр типті болуы тұратын ортасының ерешеліктерінің болуына байланысты. Аэробтар судың жұқа қабықшасына кішігірім көлемде ферменттерді секреттейді, ол продуцент жасушасын бүркеп, субстратқа іргелес орналасады. Конвекцияның жоқ болуы (өзіндік целлюлозобайланыстырушы домені болған жағдайда), субстраттағы жасуша- продуценттерінің ферменттердің иммобилизациясына жол ашып, сұйықтықтың жұқа қабықшасына (пленка) субстрат пен колония түзуші организммен тұрақты компартмент, эффективті диффузды гидролиз өнімін микроб жасушасына тасымалдайды. Анаэробтарда, үлкен көлемде сұйықтық бөлетін, аналогты фермент секрециясы сөзсіз продуценттен айырылуға, конвективті қажетті, нүктелі сұйықтықтың ажырауына алып келер еді. Сондықтан да, олардың целлюлолитикалық системалары, жасуша қабықшасымен байланысқан, целлюлосомалар мен полицеллюлосомаларға бүркелген [6; 15].
Аэробты микроорганизмдер, жасуша қабырғасын бұзатын, жоғары формалар сияқты, арнаулы биокатализатор құрастырушы жолымен келе жатқан, қазіргі заманғы биотехнологияға үлгі ретінде қызмет атқарады деп айтуға болады. Өз кезегінде, анаэробты ферменттер, әр түрлі функцияларды атқаратын, дайын құрылыс конструкцияларының көзі.
Жасұнықтың минералдануына қатысатын барлық микроорганизмдер, хемоорганогетеротрофтар. Олар - целлюлозаның целлобиозамен, глюкозаға дейін ыдырауын катализдейтін целлюлазды ферментке ие [2; 7; 16].
Целлюлазалар (целлюлозалитикалық ферменттер), гидролаза класына жататын ферменттер, целлюлоза молекуласындағы 1,4-гликозидті байланыстың гидролизін катализдеп, әр түрлі деңгейдегі олигосахаридтердің полимирленуіне, мономері - глюкоза түзілуіне дейін қатысады. Целлюлазаларды негізгі екі типке бөлінеді: эндоглюканазалар (1,4-глюкан-4-глюканогидролазалар,э ндо-1,4-глюканазалар) және целлобиогидролазалар (1,4-D-глюкан-4-целлобиогидролазала р, экзоцеллобиогидролазалар), ережеге сай бірге әсер ететін, целлюлоза молекуласына әсер ету мінезіне қарай ерекшеленеді [1; 4; 7].
Бірінші типті целлюлазалар реттелмеген тәсіл арқылы целлюлозды молекулаларды және олардың кейбір ерігіш туындыларының байланысын гидролиздейді (карбоксиметил-, гидроксиэтилцеллюлоза және т.б) де, әр түрлі ұзындықтағы поли және олигомерлі фрагменттер түзеді.Трансгликозилирлену реакциясын катализдейді (субстрат молекуласындағы поли немесе олигосахаридтер соңындағы қалпына келмеген ангидроглюкозды қалдыққа басқа поли және олигомерлерді қосады). Екінші типті целлюлазалар тек целлобиозды түзеді, полисахаридтің қалпына келмеген соңын бөліп, целлюлоза молекуласын гидролиздейді.
Екінші типті целлюлазалардың эндоглюканаздан айырмашылығы карбоксиметил немесе гидроксимэтилцеллюлазалар ерітіндісінің тұтқырлығының төмендеуі (полимер гидролизінің бірдей деңгейінде) [14].
Эндоглюканазалар - целлюлозаның полимерлі тізбегінің соңынан үзіліп, целлоолигосахаридтерді түзе отырып, целлюлозаның полимеризация деңгейінің (ПД) төмендеуімен іске асатын, ішкі қосылыстарды гидролиздейтін ферменттер. Көп жағдайларда, ыдырайтын қосылыстың конфигурациясы сақтала отырып трансгликозилденумен қатар гидролиз іске асады. Эндоглюканазалар, целлюлозаның аморфты аудандарын гидролиздейді, бірақ та эндоглюканазаның криссталдық целлюлозаны гидролиздейтіні белгілі болған, мысалы Т. reеssei саңырауқұлағының эндоглюканазалары [15]. Әсер ету тәртібі әр түрлі дәрежелі эндоглюканазалар белгілі. Азырақ тәртіпті эндоглюканазалар субстраттың полимиризация деңгейін кенеттен төмендетеді, соның нәтижесінде суда еритін өндірістік целлюлозалардың (мысалы, Na- карбоксиметилцеллюлозаның) тұтқырлығының төмендеуіне алып келеді. Мұндай жағдайда, ірі олигосахаридтердің түзілуі моно - немесе дисахаридтер арқылы іске аспайды. Көбірек тәртіпті әсер ететін эндоглюканазалар деполимиризациямен қатар, моно-, ди- және трисахаридтерді жаңқалай отырып, аз көлемде ПД азайтады. [16].
Ережеге сай, эндоглканазалар ПД 4 - тен кем, целлоолигосахаридтерді гидролиздей алмайды. Эндополимеразалардың әсер ету кинетикасы субстрат ретінде көбінесе ПД 2 - 7 дейін целлоолигосахаридтерді пайдалану арқылы зерттелген. Эндоглюканазалардың белсенділігі олигосахаридтің ұзындығының ұзаруымен белсенділігі де артады. [17].
Саңырауқұлақтардың эндоглюканазаларының молекулалық массасы 11-100 кДа арасында, молекулалық массасы 30 дан 55 кДа дейін кең таралған эндоглюканазалар. Бактериялық эндоглюканазалар саңырауқұлақтармен салыстырғанда көбірек, олардың молекулалық массасы 65 кДа жоғары.
Көптеген эндоглюканазалар гидролизденген, сондықтан фермент протеолитикалық ферменттерден қорғалған, термотұрақтылығы жоғарылаған және кейбір жағдайларда, целлюлазалардың ерімейтін субстраттарда, адсорбция процессінде маңызды рөл атқарады. Гликолиздеу ережеге сай, аспаргин, треонин және аминқышқылды қалдықтар арқылы іске асады. [18].
Сипатталған саңырауқұлақты эндоглюканазалардың басым бөлігі - қышқыл ақуыздар (pН 2,7-5,0), олар көп мөлшерде дикарбонды және окси-аминоқышқылынан тұрады. Саңырауқұлақ эндоглюканазаларының pН бейтарап түрлері де белгілі. Бактериялық эндоглюканазалар ережеге сай, қышқыл ферменттерге жатады, pН 3,1 пен 6,1 арасында болады. Сілтілі бактериялық эндоглюканазалардың да түрі белгілі, мысалы, Fibrobacter succinogenes - дан екі целлюлаза, pH 9,2 және 9,4. Көптеген эндоглюканазалардың қолайлы pH-оптимумы 2,5 ден 7,0 арасында болады, бірақ та бір ерешелігі бар мысалы, Bacillus sp. Целлюлазалары үшін рН-оптимумы 10,9 болып табылады.
Эндоглюканазалар үшін қолайлы температура 30 бен 75 °С арасында, көбінесе, қолайлы температура 50 °С жақын.
Целлюлазалардың эндоглюканазалық әсер ету ерекшеліктерінің қазіргі заманғы көзқарастарына сәйкес, (эндодеполимеразаларға) КМЦ - ға байланысты жоғары белсенділік (ең бірінші ол - белсенділігі жоғары тұтқырлықтық) және арпаға байланысты ß-глюканды (сонымен қатар лихенинге қатысты). Эндоглюканазалардың криссталдық целлюлозаларға байланысты белсенділігі (мысалы, мақтаға немесе сүзгіш қағазына қатысты) салыстырмалы түрде төмен. Одан басқа, ережеге сай, эндоглюканазалардың (МКЦ) микрокристаллдық целлюлозаға қатысты целлобигидролазалармен салыстырғанда белсенділігі төмен болып келеді. Ксиланды гидролиздеу қабілеті бар эндоглюканазалар да кездеседі, олар ксиланазалы целлюлазалар деп аталады. Мұндай ферменттерге мысал ретінде, Schizophyllum commune, Irpex lacteus, Cl. ihermocellum (целлюлаза E) және Т. reesei (эндоглюканаза I) эндоглюканазаларын келтіруге болады [21].
Целлобиогидролазалар целлобиозаны қалпына келетін және қалпына келмейтін нативті немесе ішінара гидролиздеген целлюлоза соңдарынан ажыратады, сонымен қатар целлюлозаның ПД азаюы қалпына келетін қанттардың концентрациясының жоғарлауына қарағанда аз жүреді. Эндоглюканазаларға қарағанда, целлобиогидролазалар аморфты және кристаллдық целлюлозаларды гидролиздей алады, сонымен қатар таңдамалы түрде криссталдық целлюлозаны гидролиздейді (мақта, сүзгіш қағаз) [19]. Целлюлозаның гидролизі ыдырап жатқан қосылыстың аномерлі конфигурациясын сақтай отырып іске асады. Бұл тек қана Р-1,4- байланыстарды гидролиздейтін сезімталдылығы жоғары ферменттер.
Әртүрлі көздерден гомогенді күйде бөлініп алынған целлобиогидролазалар, және олардың қасиеттері толыққанды зерттелген. Көптеген целлобиогидролазалардың молекулалық массасы 30-85 кДа арасында. Саңырауқұлақ целлобиогидролазаларының изоэлектрик нүктелері 3,0-6,4 арасында өзгереді. Көптеген, целлобиогидролазалардың құрамына көмірсу кіреді. [20].
Целлобиогидролазалар (экзодеполимеразалар) төмен белсенділікке ие, (көбінесе тұтқыр) КМЦ - ға қатысты, сонымен қатар, ß-глюканға да қатысты, өйткені (КМЦ) карбоксилді орын ауыстырғыштары немесе ß-1,3-байланысы (ß-глюкан) "соңдық" механизмі бойынша полимерлі субстраттардың атқылауына кедергі жасайды. КМЦ - ға қатысты целлобиогидролазалардың белсенділігі эндоглюканазаларға қарағанда жоғары, өйткені целлюлозаның бұл түрі соңдық топтың жоғары құрамымен сипатталады, яғни соңдық типті әсер ететін ферменттер үшін өте жақсы субстрат болып табылады [21]. Сонымен қатар, целлобиогидролазалар метилумбеллиферильді немесе n-нитрофенильді өндірісті целлобиозамен лактоза үшін жоғары белсенділік көрсетеді.
Экзоглюкозидазалар - целлюлозадан гидролизденген, аномерлі ыдырайтын қосылыстың конфигурация айналымы арқылы глюкоза қалдықтарын нативті немесе бөлшектік соңдарынан ажырататын ферменттер. Экзоглюкозидазалар целлюлозоитикалық ферменттердің ішінде жақсы зерттелгені болып отыр. Бұрындары, глюкоза түзілуі целлюлазалы кешенде маңызды рөлді целлобиаза мен экзоглюкозидазалар атқарады деп ойлаған. Бірақ та, соңғы кездері гомогенді эндоглюканазаларды бөліп алып, қасиеттерін зерттеген соң, глюкозаны түзу процессіне өзіндік үлесін қосатыны анықталған, сондықтан шынайы эндоглюкозидазалық белсенділікті эндоглюканаза бар жерде, анықтау қиынға соғады. Гомогенезделген экзогюкозидазаны бөліп алу өте сирек кездеседі. Мысалы, Р. funiculosum мен Sclerotium rolfsii гомогенді ферменттер бөлініп алынды, авторларымен экзоглюкозидазалы деп сипатталған. Ферменттер жоғары сезімталдылыққа ие болған және аморфты целллозаны целлоолигосахаридтерді, целлобиоза мен о-нитрофенил-р-o-глюкопиранозид түзу арқылы глюкозаны гидролиздеген [22].
Целлобиазалар - ол ß-глюкозидазаның бір түрі, жіңішке сезімталдылыққа ие және тек қана целлобиозаны гидролиздейді. Целлобиазалар целлобиозаны агликонның аномерлі конфигурациясын сақтай отырып гидролиздейді, ол жерде гидролиз трансгликозилдену арқылы іске асады. Целлобиазаның молекулалық массасы үлкен көлемде болады, мысалы, целлобиазаныкы гомогенді күйде, 50 кДа арасында және 100-300 кДа молекулалық массамен сипатталады. Көптеген микроорганизм целлобиазалары қышқыл ақуыздармен сипатталады олардың pH 3,1-5,9, бірақ та Т. viride және Т. reesei целлобиазалары рH дейін 8,3 мағынасына ие. Көптеген целлобиазалар гликолизденген, көмірсу құрамы 10 нан 65% дейін [12; 23].
Көптеген ß-глюкозидазалар целлобиозамен қатар, жоғары ПД бар олигосахаридтерді гидролиздеу қабілетіне ие, сонымен бірге олигосахаридтің ұзындығы ұзарған сайын оның каталитикалық белсенділігі төмендейді. Кейбір ß-глюкозидазалар ß-1,4 сияқты және басқа да гликозидтік байланыстардың ыдырауын катализдеуі мүмкін. Осылайша, А. phoenicis целлбиазасын гидролиздей алады, целлобиозадан басқа, ß,ß-трегалозаны (ß-1,1-связь), гентиобиозаны (ß-1,6), ламинарибиозаны (ß-1,3), софорозаны (ß-1,2). Реакция өнімі (глюкоза) целлобиазаны ингибирлейді. Сонымен қатар, целлобиозамен субстратты ингибирлеу іске асады. Ингибирлеу түрі, әртүрлі көздерден алынғанына байланысты ажыратылады.
Целлобиазаның трансгликолиздену реакциясында глюкозалы қалдықтың акцептор молекуласына орын ауыстыруы іске асады. Акцептор ретінде қанттар және басқа да қосылыстар болуы мүмкін (спирттер, фенолдар). Трансгликолиздену акцептордың жоғары концентрациясы болған жағдайда ғана жоғары деңгейде байқалатынын атап өткен жөн [24].
Целлюлоза гидролизінің тиімділігі целлюлазалы кешеннің құрамының тұрақтылығы мен құрамдас деңгейінің белсенділігіне, яғни кешеннің құрамы мен сандық құрамына байланысты. Целлюлазалы кешеннің құрамына қойылатын негізгі талаптар, жоғары эндоглюканазалық және целлобиогидролазалық белсенділікке ие болуы тиіс, онсыз целлюлазаның терең гидролизі іске аспайды, одан басқа, аралық ерігіш өнім үшін целлобиозаның глюкозаға конверсиясы үшін жоғары целлобиазалық белсенділік қажет.
Екі типті целлюлазаларға синергизімінің болуы тән (бір-бірін өзара нығайту), олардың біріккен әсерінде целлюлозалардың жоғары реттілігі түзіледі (мақталы талшық, микрокристаллдық целлюлозалар).
Рииза сызбанұсқасына сәйкес, микроорганизмдерде ферментативті целлюлозаның гидролизі, С1-, Сх - ферменттері мен β-глюкозидазалардан тұратын, целлюлаза әсерімен жүреді [6;7]. С1- мен Сх- ферменттерінен басқа, зерттеушілер С2- ферментін бөліп алған, ол құрамы жағынан, С1-ферменттеріне ұқсас. С1- ферментінің әсерінен, целлюлоза бөртіле бастайды содан соң, С2- ферментінің әсерінен целлодекстриндерге, Сх- ферменттің әсерінен целлобиозаға дейін ыдырайды [8,13].
Микроорганизмдердің целлюлозды кешенінің маңызды қасиеті, целлолозадан тұратын субстраттарды терең қантсыздандыру мен деструкциялау қабілеті, басқаша айтқанда, оның сахаролитикалық белсенділік қасиеті [7; 9; 18].
Сондықтанда ферменті бар, целлюлозаның гидролизін глюкозаға дейін жеткізе алатын, белсенді целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу, алға қойылған мақсат болып табылады.
Целлюлазалар бактерияларда, актиномициттерде, саңырауқұлақтар мен өсімдіктер де табылған. Целлюлазалардың жануарларда бар немесе жоқ екендігі дәлелденбеген, бірақ көптеген насекомдар, құстар, күйіс қайырғыштардың ас қорыту мүшелерінде, целлюлаза түзетін микрофлорасы болады. Күйіс қайыратын жануарлардың жасұнықты қорыту қасиеті, олардың асқазанындағы (күйіс қайыратын хайуандардың жалбыршақ қарны негізгісі) целлюлаза бөлетін, симбиотикалық анаэробты микроорганизмдердің болуымен түсіндіріледі. Өсіп кеткен астықтарда, көптеген бактерияларда, саңырауқұлақтарда (ағаштың қабық астындағы қатты бөлігінде дамитын көбінесе үй саңырауқұлақтарында белсенді); кейбір ағаштың қабық астындағы қатты бөлігімен қоректенетін жануарлардың құрамында болады (корабельді және ағашұштағыш құрттары) [29,30].
Целлюлазалардың тиімді өндірушісі (продуценті) - саңырауқұлақтар. Саңырауқұлақтардың ферменттік жүйесі, екі түрлі целлюлазалардан, бір- бірінен молекулалық массасы, изоэлектрикалық нүктесі мен көмірсу қалдықтарының ковалентті байланысында айырмашылығы бар әр түрлі формаларынан тұрады. Целлюлазалардың басым бөлігі - жеке гендермен кодталатын, шынайы изоферменттер, негізгі целлюлазалалардың типтерінің посттрансляциялық модификациясы кезінде басқа формалары түзіледі [4; 9].
Целлюлаза продуценттерінің ішінде қолданбалы маңызы бар, жақсы зерттелген топырақ саңырауқұлағы Trichoderma viride (reesei) болып табылады. Ол кем дегенде целлобиогидролазалардың молекулалық массасы 65 және 55 мың., рН 3,9-4,2 және 5,9-6,5, сондай -ақ эндоглюканазалардың 2 изоферментін рН-ы 4,7 және 5,4 секреттейді. Барлық ферменттердің бірінші реттік құрылымы анықталған. Басым саңырауқұлақтардағы целлюлазалардың каталитикалық әсері үшін қолайлы рН 4-5 болып табылады[3; 4].
Анаэробты бактериялардың арасындағы целлюлазалардың белгілі продуценті - Clostridium thennocellum [9]. Бұл бактериялардың целлюлазаларының құрылымы саңырауқұлақтардыкінен ерекшеленеді. Бұл микроорганизм құрамына кем дегенде 14 әртүрлі ақуыздар кіреді, ол ірі молекулаүстілік құрылымдар секреттейді, соның ішінде, целлюлаза молекуласы - целлюлосомалар (жалпы молекулалық массасы 2 млн.).
Целлобиоза - целлюлазалардың белгілі ингибиторы, соның ішінде, екінші типті целлюлазалар үшін [1; 7].
Көптеген целлюлазалардың бірінші реттік құрылымына сорбционды домен деп аталатын, фермент молекуласы мен беттік целлюлозаның байланысын анықтайтын - полипептидтік тізбектің фрагменті кіреді. Әр түрлі целлюлазаларда ол С - немесе N - соңындағы молекулаларындағы каталитикалық домендердің ауыспалы аудандарымен байланысты. Соңғысы, сорбционды доменнің протеолитикалық ажырауы болғанда,ерітіндіде өндірісті целлюлозаның гидролизін катализдей алады, бірақ ерімейтін субстраттарға белсенді емес.
Целлюлазалар сусындар мен шараптардың өндірісінде пайдаланылады (оларды ағарту үшін), жемдік - қорек (олардың жақсы қорытылуы үшін), сонымен қатар, жоғары дәрежелі қағаз алу үшін [1; 3; 5; 19].
1.3. Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу және олардың ферменттік белсенділігн анықтау әдістері
Целлюлозаны ыдырататын бактерияларды әр түрлі табиғи субстраттардан бөліп алуға болады, мысалы: шіріген өсімдіктерден, жоғары сапалы сүрленген шөп, ағаш, ішек жолынан немесе жәндіктердің экскременттерінен.
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу үшін, жинақатушы селективті Гетчинсон қоректік ортасын пайдаланады. Гетчинсон қоректік ортасының құрамы (гл): NaNO3 - 2,5; FeCl3 - 0,01; K2HPO4 - 1; MgSO4х7H2O - 0,3; NaCl - 0,1; CaCl2 - 0,1; 20% - ті Na2CO3 ерітіндісін қоса отырып ортаның pH 7,2 ге дейін жеткізеді; дистилдеген су; ЕПА. Көміртектің көзі ретінде тек қана: сүзгіш қағазын немесе карбоксиметилцеллюлозаның натрий тұзын пайдаланады (Na- КЦМ) [3; 8].
Аэробты жағдайда целлюлозаны бұзатын микроорганизмдер санын анықтау әдісі, зерттеліп отырған суспензияны элективті Гетчинсон ортасымен сіңген, көміртектің жалғыз көзі жасұнық болып табылатын силикагелді пластинкаларға ауыстырады. Дақылдау аэробты жағдайда жүргізіледі. Микроорганизмдердің санын Кох әдісімен анықтайды [2].
Анаэробты жағдайда целлюлозаны бұзатын бактериялардың санын анықтау үшін, жасұнық бар элективті ортада жүзеге асырылады. Анаэробты жағдайда жасұнықты бұзатын, бактериялардың сандық көрсеткішін анықтау, жасұнық қосылған селективті ортада жүргізіледі. Мезофилдер үшін 30⁰, ал термофильдер үшін - 60⁰ температуралы оттексіз, ауа көзі шектелген жағдай жасайды. Ақырғы сұйылту арқылы бактерия санын анықтайды [2; 25].
Целлюлозолитиктерді анықтау әдістерінің нақты сатылары келесі жұмыс барыстарынан тұрады. Петри табақшаларына құйылып қойған, агарозалы Гетчинсон ортасына, сүзгіш қағазын салады, ол жалғыз көміртек көзі болып табылады, содан соң алдын ала целлюлозалитикалық бактериялармен жұқтырылған, зерттеліп отырған үлгінің гомогенизделген бөлшегін енгізеді. Микроорганизмдердің дамуын, сүзгіш қағазындағы гидролиз аудандарына қарап аңғаруға болады. Микроскоппен көрінісін көрген соң, өсім пайда болған ауданды, ары қарай тазалап, бактерия табу үшін, қайта егіледі. Жеке бөліп алу үшін, микробтық массаны қоректік агарға сұрыпталып қалғандарын өсіріледі [2; 3].
Зерттеуге алынып отырған субстраттан целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алудың басқа тәсілі Гетчинсонның сұйық ортасында 250 мл колбаға жұқа текше құйып, жүргізіледі. Оған конус болып оралған фильтр қағазы салынады. Жұмыр шыныдағы (колбадағы) сұйық орта субстратты пайдалануымен инокулянт алынады. Дақылдау 14 күн ішінде жүргізіледі, содан соң, суспензия көміртек көзі ретінде, 0,1% Na- КЦМ бар агарозды ортаға отырғызылады. Өсім байқалған жағдайда, екпінді бактериялар бөлініп алынып, сұйылту жасалып жеке колонияларды алу үшін, агарозалы қоректік ортаға отырғызылады. Ары қарай, бактериялардың таза дақылдары көміртектің бірден - бір көзі ретінде целлюлозаны сіңу қабілетін анықтау үшін, 0,1 % - карбоксиметилцеллюлозалы натрий тұзы бар Гетчинсон ортасына жіңішке сызықтармен егіледі [22; 26].
Бөлініп алынған бактериялардың ішінен, целлюлозалық белсенділігі бар, целлюлозаны ажырататын қабілетін анықтау үшін, сол белсенділігі бойынша штаммдардың скринингі жүргізіледі [3; 11; 17].
Бактериялармен жақсы өндірілген целлюлозалитикалық ферменттерді, екі әдіс арқылы анықтауға болады: табақшалы әдіс немесе титрлі әдіс.
Табақшалы әдіс арқылы штаммдардың скринигі жүргізілгенде, Na- КЦМ бар агарозалы қоректік ортаның әр түрлі бактериялардың белсенді дақылдарын тура жолмен бөліп алып жүргізіледі. Өндірілген дақылдардың ішінен, целлюлозалитикалық белсенділігі бар ферменттерді табақшаны Конго қызыл бояуымен бояған соң, жарықтанған аймақтар арқылы анықтауға болады. Гидролиздік аймақ 10 мм дейін жеткен жағдайда ферменттік белсенділіктің төмен екенін байқауға болады, егер 10-20 мм аралығында болса, онда ферменттік белсенділік орташа, ал 20 мм жоғары болған жағдайда ферменттік белсенділік жоғары екендігін көрсетеді[3; 11].
Титр әдісі, сұйық Омелянский ортасында топырақ суспензиясына сұйылту жасау арқылы, целлюлозолитиктер үшін, көміртек көзі ретінде фильтр қағазын қосып егу [ 4; 25].
Целлюлазалардың белсенділігін анықтау, олардың белсенділігін зерттеліп отырған ферменттің синтезі үшін, көміртектің бірден бір көзі ретінде, (%): Na-КМЦ (карбоксиметицеллюлозаның натрий тұзын) - 0,5; целлобиозаны - 0,2; целлюлозаны - 0,5; мақта - 0,5 және сүзгіш қағазын - 0,5 өлшеу арқылы жүргізуге болады. Мақтаны бөлме температурасында бір тәулік 10 н НСl өңдеу арқылы, рН бейтараптандырып, гидроцеллюлозаға айналдырады. Сүзгішті мұқият таяздатып, кофетартқыштан үгіледі [5; 29].
Целлодекстринді целлобиозаға ажырататын (Рииз бойынша), Сх-ферменттік топқа жататын целлюлазалардың белсенділігін анықтау үшін, эндоглюканазды белсенділігін бойынша 0,5 %-тік Na-КМЦ бар реакциялық қоспаның кему (редуциялануына) қасиетінің ұзаруына байланысты анықтау үшін пайдаланылатын әдіс қолданылады [6;30]. Целлюлозаны целлюлозодекстриндерге дейін ыдырататын (Рииз бойынша), С1- және С2- ферменттерінің белсенділігін сүзгіш қағазы мен мақтадан түзілген редуцирленген қант мөлшері бойынша анықтайды. Қант мөлшері колориметриялық әдіс арқылы, 3,5-динитросалицил қышқылды реакция бойынша анықталады [3]. Целлобиазалық белсенділікті реакциялық қоспаның 0,2 %-тік целлобиоза ерітіндісімен 115 М фосфатты буфер (рН 5,5) редуцирленуі бойынша анықтайды.
Глюкозооксидазды-пероксидазалы әдіс - глюкоза концентрациясын анықтауға, ал модификацияланған Шомоди-Нельсон әдісі қайта қалпына келетін қанттарды анықтауға мүмкіншідік береді [31].
Целлюлазалардың джинсалық мата (тополитикалық белсенділік) депигментациялану қабілеттілігін индигомен боялған, мақта- маталы жіп пайдалану арқылы арнайы микротест бойынша анықтайды [32].
Бактериялардың белсенді штаммдарын бөліп алған соң, олардың салмақтық әдіс арқылы, сандық көрсеткіштерін анықтауға болады.
Бұл әдістің мәнісі, культуралды бактериялармен инкубацияланған целлюлозаның сандық шығымын анықтауда. Ол үшін, Гетчинсон ортасынан, сұйық ортаға ыдыраған қалдықтарды ауыстырады, ол жерде целлюлоза көзі ретінде, сүзгіш қағазы пайдаланылады Filtrak № 88. Тәжербиені бастамас бұрын, алдын - ала жолақтармен кесілген, сүзгіш қағазы қалыпты салмаққа дейін, бюкста 105⁰С кептіріледі де 0,001г дәлдікке дейін өлшенеді. Содан соң оларды зарарсыздандырылған шыны түтікшелерге салып, үстінен 15 мл қоректік ортаны құйылады. Осындай жолмен дайындалған шыны түтікшелерге алдын- ала бор және целлюлоза қосылған, қоректік сорпада өсірілген, 10 мл суспензия культурасы енгізледі. Шыны түтікшелерді резеңкелі дегфлагматори салынған, тығынмен жауып, дистилденген су қуйып, 37⁰С қа термостатқа қояды. Шығынды субстратты есептеу, инкубациядан 24-72 соң жүргізіледі. Ол үшін, пинцеттің көмегімен пробиркадан сүзгіш қағазын шығарып алып, оны дистилденген сумен шайып, 105⁰С температурада қалыпты салмаққа дейін кептіреді. Штаммдардың целлюлозалитикалық белсенділігінің көрсеткіші, жинақтаушы дақыл құрамына кіретін целлюлозаның салмағының өзгеруі, ол бастапқы мағынадан, проценттік үлесін салыстыру арқылы анықталады [33].
Бөлініп алынған, целлюлозалитикалық микроорганизмдердің белсенді штаммдары таза культуралары вазелин майының қабатының астында, қоректік ортада 2⁰ ден 4⁰ С температурада сақталады. Қоректік ортаның құрамы: ет пептонды сорпа - 500 мл; СaCO3 - 2,0 г, сүзгіш қағазы 2-3 тілім түтік шыныға, 1000 мл құбыр суы [2; 27].
1.4 Микробтық целлюлазалардың пайдаланылуы
Қазіргі заманғы физико-химиялық энзимологияның даму кезеңінің екі ерекше қасиеті бар. Бірінші жағынан, іргелі білімнің дамуы ферменттер мен ферменттік жүйенің негізгі ерекшеліктері мен қызметтерін зерттеу терең жүргізілуде. Екінші жағынан, әр түрлі технология саласында, биокатализаторларды пайдаланылудың жаңа әдістерін зерттеу жұмыстары жүргізілуде. Биокатализ бен заттар биотрансформация принципі, жаңа биотехнологиялық процесстердің жаңа шикізат пен энергия көздерін, қалдықтарды қайта өңдеуге арналған сонымен қатар дәстүрлі химиялық процесстерді биокаталикалыққа ауыстыру экологиялық тұрғыдан тиімді және зиянсыз [34,38].
Дүние жүзінде кең тараған биополимер, целлюлозаның биодеградациясына қатысатын, целлюлозалитикалық ферменттер, органикалық көміртектің айналымында маңызды орын алады. Целлюлазаны өндіретін, негізгі микроорганизм әртүрлі аэробты және анаэробты бактериялар жұмсақ және ақ шіріктің қоздырғышы болып табылатын саңырауқұлақтар. Сондықтан, алдыңғы ғасырдың ортасынан бастап, көптеген әлем елдерінде целлюлазаны зерттеу жүргізіле бастады.[32,33].
Мұндай зерттеулердің кенеттен көбеюі АҚШ, Батыс Еуропада 1970- жылдары мұнай мен энерготасымалдаушылардың бағасының қымбыттауына байланысты, энергетикалық дағдарысты жеңу үшін жүргізілді.
Өсімдік биомассасының целлюлозасы сарқылмайтын шикізат көзі болып табылады, ферментативтік жол арқылы глюкозаға айнала алады. Өз кезегінде, глюкоза микробиологиялық процесстерге қатысатын, газ тәрізді және сұйық отын алу (этанол, бутанол, этилен және т.б), органикалық және аминқышқылдық, жемдік ақуыз және басқа да көптеген микробиологиялық синтездің пайдалы өнімдерін алу үшін шикізат көзі болып табылады. Жер шарының шикізатпен жаңарып отыратын, жалпы сақтаулы қоры биомассаның 11 млрд. т бағаланады, фиксация нәтижесінде, 10 кал күн энергиясы шамамен 50 млрд. т биомассамен өндіріледі, сонымен қатар, 4-5 млрд. т екінші реттік өнімдердің өндірістік және ауылшаруашылықтық өсімдіктер мен ағаштардың қайта өндірілуіне қатысады [33]. Осыған байланысты, болашақта өсімді биомасса қазіргі кездегі мұнайдың орнына пайдаланылуы мүмкін [29].
Қайта қалпына келмеген энергия мен материялдардың қазіргі кезде дефициті туындап отыр. Соңғы кезде, лигноцеллюлозды шикізаттан алынған биоэтанолға және де басқа да отындарға деген қызығушылық күрт көтеріліп кетті, себебі, мұнайдың бағасы қымбаттамаса төмендер емес және 1997 ж., атмосфераға газ бөлінуіне байланысты көшеттік әсер Киотски келісіміне сәйке (парниковый эффект). Отынның қазынды түріне қарағанда, өсімді шикізаттан қалпына келетін, биоэтанол мен басқа да отын түрлерінің әсерінен, атмосферада көмірқышқыл газы жинақталмайды, яғни ол өсімдіктердің көмегімен фотосинтез процесінде қайта оттекке айналып кетеді (СО2О2 айналымы іске асып, өсімді биомассаның басқа да компоненттері мен целлюлоза параллельді жаңартылады) [36,41].
Осыған байланысты, целлюлозалитикалық ферменттерді тек фундаментальды зерттеуде емес, табиғаттағы целлюлозаның биодеградациясының физико - химиялық заңдылықтарын, саңырауқұлақтық және бактериялды ферменттердің әсер ету механизімін соңғы 30 жылда целлюлазаның гидролизін ферментативті әсерін қолданбалы зерттеу белсенді жүргізілуде, сонымен қатар, целлюлазалардың күштіпродуценттерінің жаңа штаммдарын алуға жаңа әдістер ойластырылуда. Негізгі күш целлюлозаны тиімді ыдыратып, оны қант пен мономеріне (глюкоза) дейін ыдырататын жаңа ферменттерді іздестіруге бағытталған.
1980 жылдың соңына қарай, целлюлазаларды мақталы-мата өнімдерін өңдеу үшін белсенді пайдалана бастады [34]. Бірінші мұндай процесс, джинсалы өнімдерді өңдеу ферментациясы арқылы, матаның бетінен бояу түсі кетірілген, соның арқасында мата өз кейіпіне енеді пісірілген джинсы. Бірнеше жылдың ішінде ферменттер пемзалар мен химиялық агенттердің орнын толық ауыстырды. Кейінірек, целлюлазалар мақталы маталы өнімдер мен трикотаждардың биожылтыратқышы ретінде кеңінен пайдаланыла бастады. Нәтижесінде, өңдеудің арқасында түктері мен кедір-бұдыр материал жұмсара түсіп, ұстағанға да жағымды бола түседі. Содан соң, киімді жуғанда, киім кесектеніп қалмайды, сондықтан да мұндай өнім түріне сұраныста жоғарылайды. Соңғы кезде целлюлазаларды (пектиназалармен бірге) маталарды талшықтарды жұмсарту арқылы жақсы бояу үшін, биоқайнатпада (биоскорингте) пайдалану кең етек алуда. Мата өнімін өңдеу үшін оның маңызы зор, бірақ та сілтінің ыстық ерітіндісінде өнімдерді қайнату, құрылғылардың таттануы мен қоршаған ортаға зиянды заттардың бөлінуіне алып келеді [36,37].
Соңғы он жылда целлюлазалар жуғыш құралдар мен детергенттерге, жуу процессінде талшықты целлюлозадан тұратын маталы өнімге әсер ете отырып, гидролиз нәтижесінде кірдің тез кетуіне тиімді әсерін көрсететіндіктен, пайдаланылуда [32, 34].
Целлюлозалитикалық ферменттердің пайдаланылуының басқа да аудандарына жануарлар мен құстардың жемдік қоспасына крахмал емес полисахаридтерді жою үшін кеңінен пайдаланылады [34]. Беріліп отырған жағдайда, карбогидразалардың кең спектрінен тұратын, яғни тек қана целлюлазадан емес, ксиланазалар, Р-глюканазалар, пектиназалардан тұратын мультиферменттік препараттар пайдаланылады. Мысалы, мұндай жемдік қоспаларды пайдалану арқылы құс шаруашылығының өнімділігін ғана жақсартып қоймай, қиын сіңімді арпа мен қарабидай сияқты астық тұқымдастардың жемдік диетасын пайдалануда қолдануға болады.
Целлюлолитикалық ферменттердің жаңа технологияда спецификалық пайдаланылуы, саңырауқұлақтық целлюлазаларға тән ферменттердің тек қышқыл ортада (рН 4-5) емес, сілтілі және бейтарап ортада да жоғары белсенділікке ие болғанын талап етеді. Сондықтан, соңғы ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Дипломдық жұмыс кiрiспе, тақырып бойынша әдебиетке шoлу, зeрттeу әдiстерiн сипaттaйтын бөлiмнен, қoрытынды мeн пaйдaлaнылғaн 49 әдебиет көздерінен тұрады, оның 21 - шетелдік әдебиеттер. Жұмыс 7 сурет пен 12 кестеден құралған.
Түйін сөздер: Целлюлозалитикалық бактериялар, изоляттар, целлюлозалитикалық белсенділік, дақылдау.
Зерттеу жұмысының мақсаты: Салмақтық әдіс көмегімен моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін анықтау.
Жұмыстың міндеті:
1. Моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін өлшемдік әдіс көмегімен анықтау;
2. Целлюлоза спектрлерін қанттар редуцирлеуші әдіспен анықтау.
Зерттеу әдістері: Моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін анықтау өлшемдік әдіс көмегімен жүргізілді. Целлюлоза спектрлері қанттар редуцирлеуші әдіспен анықталды.
Алынған нәтижелер:
1. 25 штамм (53%) эндоглюканазамен қатар целлобиазаны түзді. Бұл штаммдардың ферментативтік кешендегі эндоглюканаздық белсенділігі 0,24+0,01 пен 0,52+0,02 мгмл аралығында, целлобиазалық белсенділігі - 0,55+0,02 тен 1,61+0,01 мгмл дейін.
2. Целлюлозолитикалық бактерияларды қатты фазалы дақылдаудың зертханалық үлгісі жасалды.
3. Штаммдарды кешенді қолдану кезінде целлюлозаның жойылуы 2 - 3 есеге артты. Белсенді аралас дақылдар: Ж23+НП-9, С-17+ НП1,Ж-7 + С-7, Ж-7 + П-5 қатты субстраттарда клетчатканы 20 - 25% гидролиздейді.
Практикалық маңыздылығы: Целлюлозаны ыдырата алатын микроорганизмдер, микробтық қалдықта биоконверсия, жемдік және азықтық ақуызды препараттар өндірісі сонымен қатар, энергетикалық мақсатта, спирт алу үшін пайдаланылады.
РЕФЕРАТ
Выпускная работа состоит из введения, обзора литературы по теме работы, раздела, из описывающих объектов и методов исследований, заключения и 49 списка использованных источников, из них 21 - зарубежная литература. Работа проиллюстрирована 7 рисунками, 12 таблицами.
Ключевые слова: Целлюлозолитические бактерии, изоляты, целлюлозолитическая активность, культивирование.
Цель: Определить активность целлюлаз в моно- и смешанных культурах весовым методом.
Задачи:
1. Определение активности целлюлаз в моно- и смешанных культурах проводили весовым методом.
2. Определение спектра целлюлаз - методом редуцирующих сахаров.
Объекты:
1. 26 вариантов смешанных культур целлюлозолитических бактерий.
Методы: Для выделения целлюлозолитических бактерий использован метод накопительных культур с двумя вариантами селективной среды Гетчинсона.
В качестве единственного источника углерода использовали: фильтровальную бумагу и натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (Na- КМЦ). Скрининг штаммов по целлюлозолитической активности проводили чашечным, весовым и методом редуцирующих сахаров.
Полученные результаты:
1. 25 штаммов (53%) образовывали как эндоглюканазы, так и целлобиазу. Активность ферментного комплекса эндоклюканаз у этих штаммов составляет от 0,24+0,01 до 0,52+0,02 мгмл, целлобиазы - от 0,55+0,02 до 1,61+0,01 мгмл.
2. Разработана лабораторная модель твердофазного культивирования целлюлозолитических бактерий.
3. При совместном применении штаммов степень деструкции целлюлозы возрастает в 2-3 раза. Наиболее активные смешанные культуры: Ж23+НП-9, С-17+ НП1,Ж-7 + С-7, Ж-7 + П-5 гидролизуют клетчатку твердых субстратов на 20- 25 % .
Практическая значимость: Микроорганизмы, способные разрушать целлюлозу перспективны для микробной биоконверсии отходов, производства пищевых и кормовых белковых препаратов, а также для энергетических целей в получении спирта.
ABSTRACT
Final work consists of an introduction , literature review on the topic of work section of describing the objects and methods of research , conclusions and list of sources used 49 , 21 of them - foreign literature . Job 7 is illustrated with drawings, 12tables.
Keywords: cellulolytic bacteria isolates cellulolytic activity, cultivation.
Purpose: Determine the cellulase activity in mono and mixed cultures gravimetric method.
Objectives:
1. Determination of cellulase activity in single and mixed cultures was performed gravimetrically.
2. Determination of the spectrum of cellulases - method of reducing sugars.
Methods: To select cellulolytic bacteria used the method of enrichment cultures with two different selective media Hutchinson.
As a sole carbon source was used: filter paper, and sodium carboxymethylcellulose (Na- CMC). Screening strains of cellulolytic activity carried the cup, weight and method of reducing sugars.
Results:
1. Of 25 strains ( 53 %) formed as endoglucanase, and cellobiase . Activity of the enzyme complex endoklyukanaz these strains ranges from 0.24 0.01 to 0.52 0.02 mg ml, cellobiase - 0.55 0.02 to 1.61 0.01 mg ml.
2. Developed a laboratory model of the solid-state culture of cellulolytic bacteria.
3 When combined strains of the degree of degradation of cellulose increases by 2-3 times. The most active mixed cultures: ZH23 + NP-9, C-17 + NP1, F-7 + C-7, F-7, P-5 + hydrolyzed cellulose solid substrates 20 to 25%.
Practical significance: Microorganisms capable of break down cellulose promising for microbial bioconversion of waste products , food and feed protein drugs , as well as for energy purposes in obtaining alcohol.
МАЗМҰНЫ
КІРІСПЕ
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
7
9
1
Әдебиетке шолу
9
1.1
Целлюлозалитикалық микроорганизмдердің жалпы сипаттамасы
9
1.2
1.3
1.4
1.5
1.6
Микроорганизмдердің целлюлозалитикалық ферменттері
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу және олардың ферменттік белсенділігн анықтау әдістері Микробтық целлюлазалардың пайдаланылуы
Целлюлозалы шикізатты қатты фазалы ферментация әдісімен жемдік қоспаларды алу
Целлюлозалы шикізат микроорганизмдерінің биоконверсиясы
10
16
19
22
27
2
ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ӘДІСТЕРІ
28
2.1
Зерттеу нысаналары мен материалдары
28
2.2
Зерттеу әдістері
28
2.2.1
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу
28
2.2.2
Целлюлазалық белсенділігі бар штаммдар скринингі
28
2.2.3
2.2.4
Микробтық целлюлозалардың белсенділігін, пайдалану аясы мен ауданын анықтау
Эксперимент нәтижесін статистикалық өңдеу
29
30
3
Зерттеу нәтижелері және оларды талқылау
31
3.1
3.2
3.3
3.4
Қатты фазалы ферментацияда моно- және аралас дақылдардың целлюлоза конверсиясына белсенділігін анықтау
Табиғи көздерден целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу
Целлюлозалитикалық белсенділігі жоғары штаммдарды іріктеп алу
Микробтық целлюлазалардың белсенділік аясын қант қысқарту әдісі арқылы анықтау
31
41
44
49
ҚОРЫТЫНДЫ
54
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ
Қосымша
55
БЕЛГІЛІР МЕН ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР
Na-КМЦ - карбоксиметилцеллюлозаның натрий тұзы
кДа - килоДальтон
мг - миллиграм
мкм - микрометр
ЕПА - ет-пептонды агар
КІРІСПЕ
Тақырыптың өзектілігі. Соңғы онжылдықтың ғылыми және аналитикалық зерттеулері тиімді және нәтижелі энергия алудың көзі ретінде қайта қалпына келетін әдістер ретінде биожүйені пайдалануға негізделген технология деген қорытындыға келген. Бұл тәсілдердің ішінде жақсы зерттелгені, спирт өндірісі мен биометаногаз процессіндегі биомассаның энерготасымалдаушыларға айналуының биологиялық технологиясы. Бұл процесстер бірнеше кезеңнен тұрады, біріншісінде, органикалық полимерлердің микробиологиялық бұзылуы іске асады. Органикалық массаның декструкциясында белсенді рөлді целлюлозалитикалық бактериялар атқарады, өйткені өндіріс үдерісіне араласатын өсімді биомассалар целлюлозаның жоғары құрамымен сипатталады. Целлюлозалардың микробтық конверсиясы биотехнологиялық зерттеулердің маңызды бағыттарының бірі болып қала беруде [1; 2].
Одан басқа, құс шаруашылығы мен мал шаруашылығының өндірісін күшейтуде толыққанды қоректендіру маңызды мәселе болып отыр, өйткені ол өндіріс үдерісінің тізбегінің тиімділігін анықтап қана қоймай, соңғы өнімнің сапасы мен пайдалылығын анықтайды. Жемдік азықтың сіңімділігі мен құндылығын арттыра отырып, сонымен қатар, өнімділік индексін ұлғайтуға экзогенді микробтық ферменттерді пайдалану арқылы қол жеткізуге болады [3]. Оларды алудың қазіргі заманғы бағыты ол целлюлозалитикалық бактерияларды пайдалану. Олардың арасынан, жоғары ферментативтік белсенділік көрсететін штаммдар іріктеліп алынуы мүмкін, сол арқылы ас қорытылуын реттеуге болады, өйткені бұл бактериялармен өндірілетін целлюлазалар азықтың қорытылуын жақсартады.
Практикалық маңыздылығы: Целлюлозаны ыдырата алатын микроорганизмдер, микробтық қалдықта биоконверсия, жемдік және азықтық ақуызды препараттар өндірісі сонымен қатар, энергетикалық мақсатта, спирт алу үшін пайдаланылады.
Зерттеу жұмысының мақсаты. Салмақтық әдіс көмегімен моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін анықтау.
Зерттеу жұмысының міндеттері:
1. моно- және аралас дақылдардың целлюлоза белсенділігін өлшемдік әдіс көмегімен анықтау;
2. Целлюлоза спектрлерін қанттар редуцирлеуші әдіспен анықтау.
Бұл жұмысқа байланысты мақалалар ғылыми практикалық журналда жарияланған Гигиена, эпидемиология және иммунология; жас ғалымдардың халықаралық Пущинск ғылыми конференциясында; Экологияның маңызды мәселелері атты жинақта; Микроорганизмдер және биосфера халықаралық симпозиум материалдарында.
Зерттеу объектісі ретінде:
1. Целлюлозалық бактериялардың 26 түрлі аралас дақылдары пайдаланылды.
Практикалық базасы. Жұмыс әл- Фараби атындағы ҚазҰУ биология және биотехнология факультетінің биотехнология кафедрасында Биотехнологияда сұранысқа ие целлюлозалитикалық бактериялардың коллекциясын құрастыру атты жоба аясында жүргізілді (№ 8 Келісім).
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
1 Әдебиетке шолу
1.1.Целлюлозалитикалық микроорганизмдердің жалпы сипаттамасы
Целлюлоза ағаштарда, біржылдық өсімдіктерде, шөпте, жемістің тұқым қабығында, балдырлардың құрамында болады. Табиғатта, сонымен қатар, бактериялық және жануар (кейбір шаянтәрізділер және ұлулар) целлюлозасы кездеседі [1,2].
Целлюлоза D - глюкоза (β - 1,4 - байланыс) қалдықтарынан түзілген полимер болып табылады. Бұл қарапайым полимер макромолекулалары сызықты құрылымды болып келеді. Целлюлозаның макромолекула конфигурациясы ішкі және молекула аралық өзара әрекеттерді жүзеге асыруға мүмкіндік береді [2].
Табиғатта целлюлозаны пайдаланатын бактерияларға үлкен рөл бөлінген, өйткені соның арқасында табиғатта синтезделетін қосылыстардың басым көпшілігін, оның ішінде жасұнықты ыдыратуға болады [1].
Целлюлозалитикалық микроорганизмдер аэробты және анаэробты жағдайларда, жасұнықты жаңқалай отырып, көміртек пен энергия көзі болып табылатын, целлобиоза мен глюкозаны түзеді [2; 14].
Миксобактериялардың мезофилді түрлері, споралы және спорасыз бактериялар, актиномициттер мен саңырауқұлақтар аэробты жағдайда целлюлозаны гидролиздейді. Олардың ішінде, алдыңғы орынды, миксобактериялар алады, миксобактериялар - өте майда (0,3 - 0,4 x 0,7 - 10 мкм), кішкене майысқан, көбінесе үшкір соңды таяқшалар, басқа бактериялармен салыстырғанда бояғыштармен аз боялады. Миксобактериялар тек қатты ортада (субстратта) жылжымалы (сырғанақ) қозғалысқа ие болады. Миксобактериялардың қозғалысы бүкіл жасушаның беттік шырышының бөлінуіне байланысты деген болжам жасалады. Миксобактериялардың біркелкі емес қозғалысы, бүкіл клетка бетінен сұйықтық бөлінуіне байланысты деп болжам жасалады. Кейбір миксобактерияларда талшықтар табылған. Көптеген миксобактериялардың көбею циклы күрделі. Жасы келе, таяқшалар жуандай бастап ірі доғалданған, сфералық жасушаларға - микроцисталарға айналады, олар вегетативті клеткаларға қарағанда, қолайсыз жағдайларға тұрақты, бірақ эндоспермді бактерияларға қарағанда, тұрақтылығы төмен. Миксобактериялардың микроцисталарының өкілдері, ондаған жасушалардан тұратын шырышқа батқан, бір топқа щоғырланған (цисталар). Цисталардың шоғырлануы, көзбен көрінетін жалған ұрық денешіктерін түзеді [2; 12; 17].
Миксобактерялар агарды қоректік ортада колония түзеді. Көміртек көзі ретінде, миксобактериялар тек қана жасұнықты емес, басқа да көмірсуларды мысалы, крахмалды пайдалана алады. Бірақ та, Cytophaga және Sporocytophaga түрлері жасұнықты қалайды. Миксобактериялар үшін жақсы азот көзі - нитраттар. Миксобактериялар, жасұнық өнімдерін жаңқалау арқылы СO2 мен Н2О тотықтандыру арқылы энергия алады [3; 4].
Миксобактериялардан басқа топырақта, псевдоманас тобына жақын, жасұнықтарды жаңқалаушы Cellvibrio түрі болады. Ол бір талшықты, майысқан, эндоспоралар түзуші жылжымалы жасушалар. Cellvibrio түрінің колонияларының бірі, түссіз, басқалары - сары-жасыл реңкке боялған. Cellvibrio жасұнықты басқа да, көміртек көзі жоқ кезде пайдаланады және миксобактериялар сияқты қарқынды бұзбайды.
Қышқыл топырақта целлюлозаны ыдыратушы Chaetomium, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus, Botrytis түрінің саңырауқұлақтары. Аэробты жағдайда жасұнықтыActinomyces және де басқа түрдің өкілдерінің Achromobacter, Pseudomonas мен Bacillus пайдалану қабілеті бар [5].
Сонымен, жоғарыда көрсетілген мәліметтерге сүйене отырып, целлюлозаны анаэробты және аэробты жағдайда, әр түрлі таксономиялық топқа жататын эубактериялар: Clostridium түрінің жеке өкілдері, актиномициттер қатары, миксобактериялар, Pseudomonas тегінің кейбір бактериялары, коринеформды Cellulomonas бактерия өкілдері, күйіс қайыратын жануарлардың асқазанның тұрақты тұрғындары Ruminicoccus, Bacteroides, Butyrivibrio түріне жататын бактериялар қабілетті. Бұл организмдерді біріктіретін бір ғана нәрсе, ол -- целлюлозаны ыдырататын, ферменттерді синтездеу қабілетінің болуы [1].
1.2 Микроорганизмдердің целлюлозалитикалық ферменттері
Целлюлозалитикалық ферменттерге дәстүрлі номенклатурада тек қана екі анықтама берілген, қазіргі құрылымдық классификацияда ең көп таралған негізгісі, гликолизгидролаза тобына жататын ферменттер, оларды кем дегенде 15 тұқымдасқа бөлінген [6].
Целлюлозаның ферменттік ыдырауы, бірнеше этаптан тұратын целлюлозалы кешен көмегімен іске асады. Алдымен, эндо-β -1,4-глюканаза гликозидтік байланысты, целлюлозды тізбекті ішіндегі байланысты бос соңды жуан фрагменттерге бөледі. Содан соң, экзо-β -1,4 - глюканаза тізбектің соңында дисахаридті целлобиозды бөлінуін катализдейді. Соңында, β - глюкозидазаның көмегімен, глюкозаны гидролиздейді [3; 6].
Цeллюлoзды кeшeннің құрaмынa кіретін ферменттер, анаэробтардың жасуша қабықшасымен байланыста болады немесе аэробтардан қоршаған ортаға бөліне алады. Аэробтарда, экзогенді глюконаза көмегімен целлюлоза целлобиозаға дейін ыдырай алады. Ал анаэробтарда, қоршаған ортаға целлюлозаның немесе басқа да жасушадан тыс целлюлозалар мен аралық өнімдер түзілмейді. Бaктeриялдық жaсушaның беткі қабатында, целлюлолитикалық белсенділігі бар орталықтардың сфералық бөлшектері табылған, олар целлюлостар деген атқа ие, олар көмірсутекті фибриллалар мен полипептидтік суббірліктен (целлюлозалық фермент кешені) құралған [1; 6; 13].
Aэробты және aнaэробтарда целлюлозалитикалық жәнe жалғаспалы белсенділіктің әр типті болуы тұратын ортасының ерешеліктерінің болуына байланысты. Аэробтар судың жұқа қабықшасына кішігірім көлемде ферменттерді секреттейді, ол продуцент жасушасын бүркеп, субстратқа іргелес орналасады. Конвекцияның жоқ болуы (өзіндік целлюлозобайланыстырушы домені болған жағдайда), субстраттағы жасуша- продуценттерінің ферменттердің иммобилизациясына жол ашып, сұйықтықтың жұқа қабықшасына (пленка) субстрат пен колония түзуші организммен тұрақты компартмент, эффективті диффузды гидролиз өнімін микроб жасушасына тасымалдайды. Анаэробтарда, үлкен көлемде сұйықтық бөлетін, аналогты фермент секрециясы сөзсіз продуценттен айырылуға, конвективті қажетті, нүктелі сұйықтықтың ажырауына алып келер еді. Сондықтан да, олардың целлюлолитикалық системалары, жасуша қабықшасымен байланысқан, целлюлосомалар мен полицеллюлосомаларға бүркелген [6; 15].
Аэробты микроорганизмдер, жасуша қабырғасын бұзатын, жоғары формалар сияқты, арнаулы биокатализатор құрастырушы жолымен келе жатқан, қазіргі заманғы биотехнологияға үлгі ретінде қызмет атқарады деп айтуға болады. Өз кезегінде, анаэробты ферменттер, әр түрлі функцияларды атқаратын, дайын құрылыс конструкцияларының көзі.
Жасұнықтың минералдануына қатысатын барлық микроорганизмдер, хемоорганогетеротрофтар. Олар - целлюлозаның целлобиозамен, глюкозаға дейін ыдырауын катализдейтін целлюлазды ферментке ие [2; 7; 16].
Целлюлазалар (целлюлозалитикалық ферменттер), гидролаза класына жататын ферменттер, целлюлоза молекуласындағы 1,4-гликозидті байланыстың гидролизін катализдеп, әр түрлі деңгейдегі олигосахаридтердің полимирленуіне, мономері - глюкоза түзілуіне дейін қатысады. Целлюлазаларды негізгі екі типке бөлінеді: эндоглюканазалар (1,4-глюкан-4-глюканогидролазалар,э ндо-1,4-глюканазалар) және целлобиогидролазалар (1,4-D-глюкан-4-целлобиогидролазала р, экзоцеллобиогидролазалар), ережеге сай бірге әсер ететін, целлюлоза молекуласына әсер ету мінезіне қарай ерекшеленеді [1; 4; 7].
Бірінші типті целлюлазалар реттелмеген тәсіл арқылы целлюлозды молекулаларды және олардың кейбір ерігіш туындыларының байланысын гидролиздейді (карбоксиметил-, гидроксиэтилцеллюлоза және т.б) де, әр түрлі ұзындықтағы поли және олигомерлі фрагменттер түзеді.Трансгликозилирлену реакциясын катализдейді (субстрат молекуласындағы поли немесе олигосахаридтер соңындағы қалпына келмеген ангидроглюкозды қалдыққа басқа поли және олигомерлерді қосады). Екінші типті целлюлазалар тек целлобиозды түзеді, полисахаридтің қалпына келмеген соңын бөліп, целлюлоза молекуласын гидролиздейді.
Екінші типті целлюлазалардың эндоглюканаздан айырмашылығы карбоксиметил немесе гидроксимэтилцеллюлазалар ерітіндісінің тұтқырлығының төмендеуі (полимер гидролизінің бірдей деңгейінде) [14].
Эндоглюканазалар - целлюлозаның полимерлі тізбегінің соңынан үзіліп, целлоолигосахаридтерді түзе отырып, целлюлозаның полимеризация деңгейінің (ПД) төмендеуімен іске асатын, ішкі қосылыстарды гидролиздейтін ферменттер. Көп жағдайларда, ыдырайтын қосылыстың конфигурациясы сақтала отырып трансгликозилденумен қатар гидролиз іске асады. Эндоглюканазалар, целлюлозаның аморфты аудандарын гидролиздейді, бірақ та эндоглюканазаның криссталдық целлюлозаны гидролиздейтіні белгілі болған, мысалы Т. reеssei саңырауқұлағының эндоглюканазалары [15]. Әсер ету тәртібі әр түрлі дәрежелі эндоглюканазалар белгілі. Азырақ тәртіпті эндоглюканазалар субстраттың полимиризация деңгейін кенеттен төмендетеді, соның нәтижесінде суда еритін өндірістік целлюлозалардың (мысалы, Na- карбоксиметилцеллюлозаның) тұтқырлығының төмендеуіне алып келеді. Мұндай жағдайда, ірі олигосахаридтердің түзілуі моно - немесе дисахаридтер арқылы іске аспайды. Көбірек тәртіпті әсер ететін эндоглюканазалар деполимиризациямен қатар, моно-, ди- және трисахаридтерді жаңқалай отырып, аз көлемде ПД азайтады. [16].
Ережеге сай, эндоглканазалар ПД 4 - тен кем, целлоолигосахаридтерді гидролиздей алмайды. Эндополимеразалардың әсер ету кинетикасы субстрат ретінде көбінесе ПД 2 - 7 дейін целлоолигосахаридтерді пайдалану арқылы зерттелген. Эндоглюканазалардың белсенділігі олигосахаридтің ұзындығының ұзаруымен белсенділігі де артады. [17].
Саңырауқұлақтардың эндоглюканазаларының молекулалық массасы 11-100 кДа арасында, молекулалық массасы 30 дан 55 кДа дейін кең таралған эндоглюканазалар. Бактериялық эндоглюканазалар саңырауқұлақтармен салыстырғанда көбірек, олардың молекулалық массасы 65 кДа жоғары.
Көптеген эндоглюканазалар гидролизденген, сондықтан фермент протеолитикалық ферменттерден қорғалған, термотұрақтылығы жоғарылаған және кейбір жағдайларда, целлюлазалардың ерімейтін субстраттарда, адсорбция процессінде маңызды рөл атқарады. Гликолиздеу ережеге сай, аспаргин, треонин және аминқышқылды қалдықтар арқылы іске асады. [18].
Сипатталған саңырауқұлақты эндоглюканазалардың басым бөлігі - қышқыл ақуыздар (pН 2,7-5,0), олар көп мөлшерде дикарбонды және окси-аминоқышқылынан тұрады. Саңырауқұлақ эндоглюканазаларының pН бейтарап түрлері де белгілі. Бактериялық эндоглюканазалар ережеге сай, қышқыл ферменттерге жатады, pН 3,1 пен 6,1 арасында болады. Сілтілі бактериялық эндоглюканазалардың да түрі белгілі, мысалы, Fibrobacter succinogenes - дан екі целлюлаза, pH 9,2 және 9,4. Көптеген эндоглюканазалардың қолайлы pH-оптимумы 2,5 ден 7,0 арасында болады, бірақ та бір ерешелігі бар мысалы, Bacillus sp. Целлюлазалары үшін рН-оптимумы 10,9 болып табылады.
Эндоглюканазалар үшін қолайлы температура 30 бен 75 °С арасында, көбінесе, қолайлы температура 50 °С жақын.
Целлюлазалардың эндоглюканазалық әсер ету ерекшеліктерінің қазіргі заманғы көзқарастарына сәйкес, (эндодеполимеразаларға) КМЦ - ға байланысты жоғары белсенділік (ең бірінші ол - белсенділігі жоғары тұтқырлықтық) және арпаға байланысты ß-глюканды (сонымен қатар лихенинге қатысты). Эндоглюканазалардың криссталдық целлюлозаларға байланысты белсенділігі (мысалы, мақтаға немесе сүзгіш қағазына қатысты) салыстырмалы түрде төмен. Одан басқа, ережеге сай, эндоглюканазалардың (МКЦ) микрокристаллдық целлюлозаға қатысты целлобигидролазалармен салыстырғанда белсенділігі төмен болып келеді. Ксиланды гидролиздеу қабілеті бар эндоглюканазалар да кездеседі, олар ксиланазалы целлюлазалар деп аталады. Мұндай ферменттерге мысал ретінде, Schizophyllum commune, Irpex lacteus, Cl. ihermocellum (целлюлаза E) және Т. reesei (эндоглюканаза I) эндоглюканазаларын келтіруге болады [21].
Целлобиогидролазалар целлобиозаны қалпына келетін және қалпына келмейтін нативті немесе ішінара гидролиздеген целлюлоза соңдарынан ажыратады, сонымен қатар целлюлозаның ПД азаюы қалпына келетін қанттардың концентрациясының жоғарлауына қарағанда аз жүреді. Эндоглюканазаларға қарағанда, целлобиогидролазалар аморфты және кристаллдық целлюлозаларды гидролиздей алады, сонымен қатар таңдамалы түрде криссталдық целлюлозаны гидролиздейді (мақта, сүзгіш қағаз) [19]. Целлюлозаның гидролизі ыдырап жатқан қосылыстың аномерлі конфигурациясын сақтай отырып іске асады. Бұл тек қана Р-1,4- байланыстарды гидролиздейтін сезімталдылығы жоғары ферменттер.
Әртүрлі көздерден гомогенді күйде бөлініп алынған целлобиогидролазалар, және олардың қасиеттері толыққанды зерттелген. Көптеген целлобиогидролазалардың молекулалық массасы 30-85 кДа арасында. Саңырауқұлақ целлобиогидролазаларының изоэлектрик нүктелері 3,0-6,4 арасында өзгереді. Көптеген, целлобиогидролазалардың құрамына көмірсу кіреді. [20].
Целлобиогидролазалар (экзодеполимеразалар) төмен белсенділікке ие, (көбінесе тұтқыр) КМЦ - ға қатысты, сонымен қатар, ß-глюканға да қатысты, өйткені (КМЦ) карбоксилді орын ауыстырғыштары немесе ß-1,3-байланысы (ß-глюкан) "соңдық" механизмі бойынша полимерлі субстраттардың атқылауына кедергі жасайды. КМЦ - ға қатысты целлобиогидролазалардың белсенділігі эндоглюканазаларға қарағанда жоғары, өйткені целлюлозаның бұл түрі соңдық топтың жоғары құрамымен сипатталады, яғни соңдық типті әсер ететін ферменттер үшін өте жақсы субстрат болып табылады [21]. Сонымен қатар, целлобиогидролазалар метилумбеллиферильді немесе n-нитрофенильді өндірісті целлобиозамен лактоза үшін жоғары белсенділік көрсетеді.
Экзоглюкозидазалар - целлюлозадан гидролизденген, аномерлі ыдырайтын қосылыстың конфигурация айналымы арқылы глюкоза қалдықтарын нативті немесе бөлшектік соңдарынан ажырататын ферменттер. Экзоглюкозидазалар целлюлозоитикалық ферменттердің ішінде жақсы зерттелгені болып отыр. Бұрындары, глюкоза түзілуі целлюлазалы кешенде маңызды рөлді целлобиаза мен экзоглюкозидазалар атқарады деп ойлаған. Бірақ та, соңғы кездері гомогенді эндоглюканазаларды бөліп алып, қасиеттерін зерттеген соң, глюкозаны түзу процессіне өзіндік үлесін қосатыны анықталған, сондықтан шынайы эндоглюкозидазалық белсенділікті эндоглюканаза бар жерде, анықтау қиынға соғады. Гомогенезделген экзогюкозидазаны бөліп алу өте сирек кездеседі. Мысалы, Р. funiculosum мен Sclerotium rolfsii гомогенді ферменттер бөлініп алынды, авторларымен экзоглюкозидазалы деп сипатталған. Ферменттер жоғары сезімталдылыққа ие болған және аморфты целллозаны целлоолигосахаридтерді, целлобиоза мен о-нитрофенил-р-o-глюкопиранозид түзу арқылы глюкозаны гидролиздеген [22].
Целлобиазалар - ол ß-глюкозидазаның бір түрі, жіңішке сезімталдылыққа ие және тек қана целлобиозаны гидролиздейді. Целлобиазалар целлобиозаны агликонның аномерлі конфигурациясын сақтай отырып гидролиздейді, ол жерде гидролиз трансгликозилдену арқылы іске асады. Целлобиазаның молекулалық массасы үлкен көлемде болады, мысалы, целлобиазаныкы гомогенді күйде, 50 кДа арасында және 100-300 кДа молекулалық массамен сипатталады. Көптеген микроорганизм целлобиазалары қышқыл ақуыздармен сипатталады олардың pH 3,1-5,9, бірақ та Т. viride және Т. reesei целлобиазалары рH дейін 8,3 мағынасына ие. Көптеген целлобиазалар гликолизденген, көмірсу құрамы 10 нан 65% дейін [12; 23].
Көптеген ß-глюкозидазалар целлобиозамен қатар, жоғары ПД бар олигосахаридтерді гидролиздеу қабілетіне ие, сонымен бірге олигосахаридтің ұзындығы ұзарған сайын оның каталитикалық белсенділігі төмендейді. Кейбір ß-глюкозидазалар ß-1,4 сияқты және басқа да гликозидтік байланыстардың ыдырауын катализдеуі мүмкін. Осылайша, А. phoenicis целлбиазасын гидролиздей алады, целлобиозадан басқа, ß,ß-трегалозаны (ß-1,1-связь), гентиобиозаны (ß-1,6), ламинарибиозаны (ß-1,3), софорозаны (ß-1,2). Реакция өнімі (глюкоза) целлобиазаны ингибирлейді. Сонымен қатар, целлобиозамен субстратты ингибирлеу іске асады. Ингибирлеу түрі, әртүрлі көздерден алынғанына байланысты ажыратылады.
Целлобиазаның трансгликолиздену реакциясында глюкозалы қалдықтың акцептор молекуласына орын ауыстыруы іске асады. Акцептор ретінде қанттар және басқа да қосылыстар болуы мүмкін (спирттер, фенолдар). Трансгликолиздену акцептордың жоғары концентрациясы болған жағдайда ғана жоғары деңгейде байқалатынын атап өткен жөн [24].
Целлюлоза гидролизінің тиімділігі целлюлазалы кешеннің құрамының тұрақтылығы мен құрамдас деңгейінің белсенділігіне, яғни кешеннің құрамы мен сандық құрамына байланысты. Целлюлазалы кешеннің құрамына қойылатын негізгі талаптар, жоғары эндоглюканазалық және целлобиогидролазалық белсенділікке ие болуы тиіс, онсыз целлюлазаның терең гидролизі іске аспайды, одан басқа, аралық ерігіш өнім үшін целлобиозаның глюкозаға конверсиясы үшін жоғары целлобиазалық белсенділік қажет.
Екі типті целлюлазаларға синергизімінің болуы тән (бір-бірін өзара нығайту), олардың біріккен әсерінде целлюлозалардың жоғары реттілігі түзіледі (мақталы талшық, микрокристаллдық целлюлозалар).
Рииза сызбанұсқасына сәйкес, микроорганизмдерде ферментативті целлюлозаның гидролизі, С1-, Сх - ферменттері мен β-глюкозидазалардан тұратын, целлюлаза әсерімен жүреді [6;7]. С1- мен Сх- ферменттерінен басқа, зерттеушілер С2- ферментін бөліп алған, ол құрамы жағынан, С1-ферменттеріне ұқсас. С1- ферментінің әсерінен, целлюлоза бөртіле бастайды содан соң, С2- ферментінің әсерінен целлодекстриндерге, Сх- ферменттің әсерінен целлобиозаға дейін ыдырайды [8,13].
Микроорганизмдердің целлюлозды кешенінің маңызды қасиеті, целлолозадан тұратын субстраттарды терең қантсыздандыру мен деструкциялау қабілеті, басқаша айтқанда, оның сахаролитикалық белсенділік қасиеті [7; 9; 18].
Сондықтанда ферменті бар, целлюлозаның гидролизін глюкозаға дейін жеткізе алатын, белсенді целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу, алға қойылған мақсат болып табылады.
Целлюлазалар бактерияларда, актиномициттерде, саңырауқұлақтар мен өсімдіктер де табылған. Целлюлазалардың жануарларда бар немесе жоқ екендігі дәлелденбеген, бірақ көптеген насекомдар, құстар, күйіс қайырғыштардың ас қорыту мүшелерінде, целлюлаза түзетін микрофлорасы болады. Күйіс қайыратын жануарлардың жасұнықты қорыту қасиеті, олардың асқазанындағы (күйіс қайыратын хайуандардың жалбыршақ қарны негізгісі) целлюлаза бөлетін, симбиотикалық анаэробты микроорганизмдердің болуымен түсіндіріледі. Өсіп кеткен астықтарда, көптеген бактерияларда, саңырауқұлақтарда (ағаштың қабық астындағы қатты бөлігінде дамитын көбінесе үй саңырауқұлақтарында белсенді); кейбір ағаштың қабық астындағы қатты бөлігімен қоректенетін жануарлардың құрамында болады (корабельді және ағашұштағыш құрттары) [29,30].
Целлюлазалардың тиімді өндірушісі (продуценті) - саңырауқұлақтар. Саңырауқұлақтардың ферменттік жүйесі, екі түрлі целлюлазалардан, бір- бірінен молекулалық массасы, изоэлектрикалық нүктесі мен көмірсу қалдықтарының ковалентті байланысында айырмашылығы бар әр түрлі формаларынан тұрады. Целлюлазалардың басым бөлігі - жеке гендермен кодталатын, шынайы изоферменттер, негізгі целлюлазалалардың типтерінің посттрансляциялық модификациясы кезінде басқа формалары түзіледі [4; 9].
Целлюлаза продуценттерінің ішінде қолданбалы маңызы бар, жақсы зерттелген топырақ саңырауқұлағы Trichoderma viride (reesei) болып табылады. Ол кем дегенде целлобиогидролазалардың молекулалық массасы 65 және 55 мың., рН 3,9-4,2 және 5,9-6,5, сондай -ақ эндоглюканазалардың 2 изоферментін рН-ы 4,7 және 5,4 секреттейді. Барлық ферменттердің бірінші реттік құрылымы анықталған. Басым саңырауқұлақтардағы целлюлазалардың каталитикалық әсері үшін қолайлы рН 4-5 болып табылады[3; 4].
Анаэробты бактериялардың арасындағы целлюлазалардың белгілі продуценті - Clostridium thennocellum [9]. Бұл бактериялардың целлюлазаларының құрылымы саңырауқұлақтардыкінен ерекшеленеді. Бұл микроорганизм құрамына кем дегенде 14 әртүрлі ақуыздар кіреді, ол ірі молекулаүстілік құрылымдар секреттейді, соның ішінде, целлюлаза молекуласы - целлюлосомалар (жалпы молекулалық массасы 2 млн.).
Целлобиоза - целлюлазалардың белгілі ингибиторы, соның ішінде, екінші типті целлюлазалар үшін [1; 7].
Көптеген целлюлазалардың бірінші реттік құрылымына сорбционды домен деп аталатын, фермент молекуласы мен беттік целлюлозаның байланысын анықтайтын - полипептидтік тізбектің фрагменті кіреді. Әр түрлі целлюлазаларда ол С - немесе N - соңындағы молекулаларындағы каталитикалық домендердің ауыспалы аудандарымен байланысты. Соңғысы, сорбционды доменнің протеолитикалық ажырауы болғанда,ерітіндіде өндірісті целлюлозаның гидролизін катализдей алады, бірақ ерімейтін субстраттарға белсенді емес.
Целлюлазалар сусындар мен шараптардың өндірісінде пайдаланылады (оларды ағарту үшін), жемдік - қорек (олардың жақсы қорытылуы үшін), сонымен қатар, жоғары дәрежелі қағаз алу үшін [1; 3; 5; 19].
1.3. Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу және олардың ферменттік белсенділігн анықтау әдістері
Целлюлозаны ыдырататын бактерияларды әр түрлі табиғи субстраттардан бөліп алуға болады, мысалы: шіріген өсімдіктерден, жоғары сапалы сүрленген шөп, ағаш, ішек жолынан немесе жәндіктердің экскременттерінен.
Целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алу үшін, жинақатушы селективті Гетчинсон қоректік ортасын пайдаланады. Гетчинсон қоректік ортасының құрамы (гл): NaNO3 - 2,5; FeCl3 - 0,01; K2HPO4 - 1; MgSO4х7H2O - 0,3; NaCl - 0,1; CaCl2 - 0,1; 20% - ті Na2CO3 ерітіндісін қоса отырып ортаның pH 7,2 ге дейін жеткізеді; дистилдеген су; ЕПА. Көміртектің көзі ретінде тек қана: сүзгіш қағазын немесе карбоксиметилцеллюлозаның натрий тұзын пайдаланады (Na- КЦМ) [3; 8].
Аэробты жағдайда целлюлозаны бұзатын микроорганизмдер санын анықтау әдісі, зерттеліп отырған суспензияны элективті Гетчинсон ортасымен сіңген, көміртектің жалғыз көзі жасұнық болып табылатын силикагелді пластинкаларға ауыстырады. Дақылдау аэробты жағдайда жүргізіледі. Микроорганизмдердің санын Кох әдісімен анықтайды [2].
Анаэробты жағдайда целлюлозаны бұзатын бактериялардың санын анықтау үшін, жасұнық бар элективті ортада жүзеге асырылады. Анаэробты жағдайда жасұнықты бұзатын, бактериялардың сандық көрсеткішін анықтау, жасұнық қосылған селективті ортада жүргізіледі. Мезофилдер үшін 30⁰, ал термофильдер үшін - 60⁰ температуралы оттексіз, ауа көзі шектелген жағдай жасайды. Ақырғы сұйылту арқылы бактерия санын анықтайды [2; 25].
Целлюлозолитиктерді анықтау әдістерінің нақты сатылары келесі жұмыс барыстарынан тұрады. Петри табақшаларына құйылып қойған, агарозалы Гетчинсон ортасына, сүзгіш қағазын салады, ол жалғыз көміртек көзі болып табылады, содан соң алдын ала целлюлозалитикалық бактериялармен жұқтырылған, зерттеліп отырған үлгінің гомогенизделген бөлшегін енгізеді. Микроорганизмдердің дамуын, сүзгіш қағазындағы гидролиз аудандарына қарап аңғаруға болады. Микроскоппен көрінісін көрген соң, өсім пайда болған ауданды, ары қарай тазалап, бактерия табу үшін, қайта егіледі. Жеке бөліп алу үшін, микробтық массаны қоректік агарға сұрыпталып қалғандарын өсіріледі [2; 3].
Зерттеуге алынып отырған субстраттан целлюлозалитикалық бактерияларды бөліп алудың басқа тәсілі Гетчинсонның сұйық ортасында 250 мл колбаға жұқа текше құйып, жүргізіледі. Оған конус болып оралған фильтр қағазы салынады. Жұмыр шыныдағы (колбадағы) сұйық орта субстратты пайдалануымен инокулянт алынады. Дақылдау 14 күн ішінде жүргізіледі, содан соң, суспензия көміртек көзі ретінде, 0,1% Na- КЦМ бар агарозды ортаға отырғызылады. Өсім байқалған жағдайда, екпінді бактериялар бөлініп алынып, сұйылту жасалып жеке колонияларды алу үшін, агарозалы қоректік ортаға отырғызылады. Ары қарай, бактериялардың таза дақылдары көміртектің бірден - бір көзі ретінде целлюлозаны сіңу қабілетін анықтау үшін, 0,1 % - карбоксиметилцеллюлозалы натрий тұзы бар Гетчинсон ортасына жіңішке сызықтармен егіледі [22; 26].
Бөлініп алынған бактериялардың ішінен, целлюлозалық белсенділігі бар, целлюлозаны ажырататын қабілетін анықтау үшін, сол белсенділігі бойынша штаммдардың скринингі жүргізіледі [3; 11; 17].
Бактериялармен жақсы өндірілген целлюлозалитикалық ферменттерді, екі әдіс арқылы анықтауға болады: табақшалы әдіс немесе титрлі әдіс.
Табақшалы әдіс арқылы штаммдардың скринигі жүргізілгенде, Na- КЦМ бар агарозалы қоректік ортаның әр түрлі бактериялардың белсенді дақылдарын тура жолмен бөліп алып жүргізіледі. Өндірілген дақылдардың ішінен, целлюлозалитикалық белсенділігі бар ферменттерді табақшаны Конго қызыл бояуымен бояған соң, жарықтанған аймақтар арқылы анықтауға болады. Гидролиздік аймақ 10 мм дейін жеткен жағдайда ферменттік белсенділіктің төмен екенін байқауға болады, егер 10-20 мм аралығында болса, онда ферменттік белсенділік орташа, ал 20 мм жоғары болған жағдайда ферменттік белсенділік жоғары екендігін көрсетеді[3; 11].
Титр әдісі, сұйық Омелянский ортасында топырақ суспензиясына сұйылту жасау арқылы, целлюлозолитиктер үшін, көміртек көзі ретінде фильтр қағазын қосып егу [ 4; 25].
Целлюлазалардың белсенділігін анықтау, олардың белсенділігін зерттеліп отырған ферменттің синтезі үшін, көміртектің бірден бір көзі ретінде, (%): Na-КМЦ (карбоксиметицеллюлозаның натрий тұзын) - 0,5; целлобиозаны - 0,2; целлюлозаны - 0,5; мақта - 0,5 және сүзгіш қағазын - 0,5 өлшеу арқылы жүргізуге болады. Мақтаны бөлме температурасында бір тәулік 10 н НСl өңдеу арқылы, рН бейтараптандырып, гидроцеллюлозаға айналдырады. Сүзгішті мұқият таяздатып, кофетартқыштан үгіледі [5; 29].
Целлодекстринді целлобиозаға ажырататын (Рииз бойынша), Сх-ферменттік топқа жататын целлюлазалардың белсенділігін анықтау үшін, эндоглюканазды белсенділігін бойынша 0,5 %-тік Na-КМЦ бар реакциялық қоспаның кему (редуциялануына) қасиетінің ұзаруына байланысты анықтау үшін пайдаланылатын әдіс қолданылады [6;30]. Целлюлозаны целлюлозодекстриндерге дейін ыдырататын (Рииз бойынша), С1- және С2- ферменттерінің белсенділігін сүзгіш қағазы мен мақтадан түзілген редуцирленген қант мөлшері бойынша анықтайды. Қант мөлшері колориметриялық әдіс арқылы, 3,5-динитросалицил қышқылды реакция бойынша анықталады [3]. Целлобиазалық белсенділікті реакциялық қоспаның 0,2 %-тік целлобиоза ерітіндісімен 115 М фосфатты буфер (рН 5,5) редуцирленуі бойынша анықтайды.
Глюкозооксидазды-пероксидазалы әдіс - глюкоза концентрациясын анықтауға, ал модификацияланған Шомоди-Нельсон әдісі қайта қалпына келетін қанттарды анықтауға мүмкіншідік береді [31].
Целлюлазалардың джинсалық мата (тополитикалық белсенділік) депигментациялану қабілеттілігін индигомен боялған, мақта- маталы жіп пайдалану арқылы арнайы микротест бойынша анықтайды [32].
Бактериялардың белсенді штаммдарын бөліп алған соң, олардың салмақтық әдіс арқылы, сандық көрсеткіштерін анықтауға болады.
Бұл әдістің мәнісі, культуралды бактериялармен инкубацияланған целлюлозаның сандық шығымын анықтауда. Ол үшін, Гетчинсон ортасынан, сұйық ортаға ыдыраған қалдықтарды ауыстырады, ол жерде целлюлоза көзі ретінде, сүзгіш қағазы пайдаланылады Filtrak № 88. Тәжербиені бастамас бұрын, алдын - ала жолақтармен кесілген, сүзгіш қағазы қалыпты салмаққа дейін, бюкста 105⁰С кептіріледі де 0,001г дәлдікке дейін өлшенеді. Содан соң оларды зарарсыздандырылған шыны түтікшелерге салып, үстінен 15 мл қоректік ортаны құйылады. Осындай жолмен дайындалған шыны түтікшелерге алдын- ала бор және целлюлоза қосылған, қоректік сорпада өсірілген, 10 мл суспензия культурасы енгізледі. Шыны түтікшелерді резеңкелі дегфлагматори салынған, тығынмен жауып, дистилденген су қуйып, 37⁰С қа термостатқа қояды. Шығынды субстратты есептеу, инкубациядан 24-72 соң жүргізіледі. Ол үшін, пинцеттің көмегімен пробиркадан сүзгіш қағазын шығарып алып, оны дистилденген сумен шайып, 105⁰С температурада қалыпты салмаққа дейін кептіреді. Штаммдардың целлюлозалитикалық белсенділігінің көрсеткіші, жинақтаушы дақыл құрамына кіретін целлюлозаның салмағының өзгеруі, ол бастапқы мағынадан, проценттік үлесін салыстыру арқылы анықталады [33].
Бөлініп алынған, целлюлозалитикалық микроорганизмдердің белсенді штаммдары таза культуралары вазелин майының қабатының астында, қоректік ортада 2⁰ ден 4⁰ С температурада сақталады. Қоректік ортаның құрамы: ет пептонды сорпа - 500 мл; СaCO3 - 2,0 г, сүзгіш қағазы 2-3 тілім түтік шыныға, 1000 мл құбыр суы [2; 27].
1.4 Микробтық целлюлазалардың пайдаланылуы
Қазіргі заманғы физико-химиялық энзимологияның даму кезеңінің екі ерекше қасиеті бар. Бірінші жағынан, іргелі білімнің дамуы ферменттер мен ферменттік жүйенің негізгі ерекшеліктері мен қызметтерін зерттеу терең жүргізілуде. Екінші жағынан, әр түрлі технология саласында, биокатализаторларды пайдаланылудың жаңа әдістерін зерттеу жұмыстары жүргізілуде. Биокатализ бен заттар биотрансформация принципі, жаңа биотехнологиялық процесстердің жаңа шикізат пен энергия көздерін, қалдықтарды қайта өңдеуге арналған сонымен қатар дәстүрлі химиялық процесстерді биокаталикалыққа ауыстыру экологиялық тұрғыдан тиімді және зиянсыз [34,38].
Дүние жүзінде кең тараған биополимер, целлюлозаның биодеградациясына қатысатын, целлюлозалитикалық ферменттер, органикалық көміртектің айналымында маңызды орын алады. Целлюлазаны өндіретін, негізгі микроорганизм әртүрлі аэробты және анаэробты бактериялар жұмсақ және ақ шіріктің қоздырғышы болып табылатын саңырауқұлақтар. Сондықтан, алдыңғы ғасырдың ортасынан бастап, көптеген әлем елдерінде целлюлазаны зерттеу жүргізіле бастады.[32,33].
Мұндай зерттеулердің кенеттен көбеюі АҚШ, Батыс Еуропада 1970- жылдары мұнай мен энерготасымалдаушылардың бағасының қымбыттауына байланысты, энергетикалық дағдарысты жеңу үшін жүргізілді.
Өсімдік биомассасының целлюлозасы сарқылмайтын шикізат көзі болып табылады, ферментативтік жол арқылы глюкозаға айнала алады. Өз кезегінде, глюкоза микробиологиялық процесстерге қатысатын, газ тәрізді және сұйық отын алу (этанол, бутанол, этилен және т.б), органикалық және аминқышқылдық, жемдік ақуыз және басқа да көптеген микробиологиялық синтездің пайдалы өнімдерін алу үшін шикізат көзі болып табылады. Жер шарының шикізатпен жаңарып отыратын, жалпы сақтаулы қоры биомассаның 11 млрд. т бағаланады, фиксация нәтижесінде, 10 кал күн энергиясы шамамен 50 млрд. т биомассамен өндіріледі, сонымен қатар, 4-5 млрд. т екінші реттік өнімдердің өндірістік және ауылшаруашылықтық өсімдіктер мен ағаштардың қайта өндірілуіне қатысады [33]. Осыған байланысты, болашақта өсімді биомасса қазіргі кездегі мұнайдың орнына пайдаланылуы мүмкін [29].
Қайта қалпына келмеген энергия мен материялдардың қазіргі кезде дефициті туындап отыр. Соңғы кезде, лигноцеллюлозды шикізаттан алынған биоэтанолға және де басқа да отындарға деген қызығушылық күрт көтеріліп кетті, себебі, мұнайдың бағасы қымбаттамаса төмендер емес және 1997 ж., атмосфераға газ бөлінуіне байланысты көшеттік әсер Киотски келісіміне сәйке (парниковый эффект). Отынның қазынды түріне қарағанда, өсімді шикізаттан қалпына келетін, биоэтанол мен басқа да отын түрлерінің әсерінен, атмосферада көмірқышқыл газы жинақталмайды, яғни ол өсімдіктердің көмегімен фотосинтез процесінде қайта оттекке айналып кетеді (СО2О2 айналымы іске асып, өсімді биомассаның басқа да компоненттері мен целлюлоза параллельді жаңартылады) [36,41].
Осыған байланысты, целлюлозалитикалық ферменттерді тек фундаментальды зерттеуде емес, табиғаттағы целлюлозаның биодеградациясының физико - химиялық заңдылықтарын, саңырауқұлақтық және бактериялды ферменттердің әсер ету механизімін соңғы 30 жылда целлюлазаның гидролизін ферментативті әсерін қолданбалы зерттеу белсенді жүргізілуде, сонымен қатар, целлюлазалардың күштіпродуценттерінің жаңа штаммдарын алуға жаңа әдістер ойластырылуда. Негізгі күш целлюлозаны тиімді ыдыратып, оны қант пен мономеріне (глюкоза) дейін ыдырататын жаңа ферменттерді іздестіруге бағытталған.
1980 жылдың соңына қарай, целлюлазаларды мақталы-мата өнімдерін өңдеу үшін белсенді пайдалана бастады [34]. Бірінші мұндай процесс, джинсалы өнімдерді өңдеу ферментациясы арқылы, матаның бетінен бояу түсі кетірілген, соның арқасында мата өз кейіпіне енеді пісірілген джинсы. Бірнеше жылдың ішінде ферменттер пемзалар мен химиялық агенттердің орнын толық ауыстырды. Кейінірек, целлюлазалар мақталы маталы өнімдер мен трикотаждардың биожылтыратқышы ретінде кеңінен пайдаланыла бастады. Нәтижесінде, өңдеудің арқасында түктері мен кедір-бұдыр материал жұмсара түсіп, ұстағанға да жағымды бола түседі. Содан соң, киімді жуғанда, киім кесектеніп қалмайды, сондықтан да мұндай өнім түріне сұраныста жоғарылайды. Соңғы кезде целлюлазаларды (пектиназалармен бірге) маталарды талшықтарды жұмсарту арқылы жақсы бояу үшін, биоқайнатпада (биоскорингте) пайдалану кең етек алуда. Мата өнімін өңдеу үшін оның маңызы зор, бірақ та сілтінің ыстық ерітіндісінде өнімдерді қайнату, құрылғылардың таттануы мен қоршаған ортаға зиянды заттардың бөлінуіне алып келеді [36,37].
Соңғы он жылда целлюлазалар жуғыш құралдар мен детергенттерге, жуу процессінде талшықты целлюлозадан тұратын маталы өнімге әсер ете отырып, гидролиз нәтижесінде кірдің тез кетуіне тиімді әсерін көрсететіндіктен, пайдаланылуда [32, 34].
Целлюлозалитикалық ферменттердің пайдаланылуының басқа да аудандарына жануарлар мен құстардың жемдік қоспасына крахмал емес полисахаридтерді жою үшін кеңінен пайдаланылады [34]. Беріліп отырған жағдайда, карбогидразалардың кең спектрінен тұратын, яғни тек қана целлюлазадан емес, ксиланазалар, Р-глюканазалар, пектиназалардан тұратын мультиферменттік препараттар пайдаланылады. Мысалы, мұндай жемдік қоспаларды пайдалану арқылы құс шаруашылығының өнімділігін ғана жақсартып қоймай, қиын сіңімді арпа мен қарабидай сияқты астық тұқымдастардың жемдік диетасын пайдалануда қолдануға болады.
Целлюлолитикалық ферменттердің жаңа технологияда спецификалық пайдаланылуы, саңырауқұлақтық целлюлазаларға тән ферменттердің тек қышқыл ортада (рН 4-5) емес, сілтілі және бейтарап ортада да жоғары белсенділікке ие болғанын талап етеді. Сондықтан, соңғы ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz