Тау-сағыз өсімдігінің биологиялық ерекшеліктері
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР 6
КІРІСПЕ 7
НЕГІЗГІ БӨЛІМ 9
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ 9
1.1 Тау.сағыз (Scorzonera tau.saghyz, Lipsch. et Bosse) өсімдігінің биологиялық ерекшеліктері
9
1.2 Каучук түзуші тау.сағыздың биосинтетикалық қасиеттері, изопреноид синтезі 13
1.3 Тау.сағызды вегетативті және микроклонды көбейту 18
1.4 Микроклонды көбейту әдістері 19
1.5 Микроклонды көбейту технологиясының кезеңдері 21
1.6 Суспензиялық культураны алу 22
1.7 In vitro жағдайында өсірілетін өсімдік клеткаларынан каучукты бөліп алу әдістері
26
2 ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ӘДІСТЕРІ 29
2.1 Зерттеу объектісі 30
2.2 Зерттеу әдістері 30
3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ 36
3.1 Өсімдік материалын залалсыздандыру режимінің оптимизациясы 36
3.1.1 Экспланттарды залалсыздандыру және асептикалық культураны алу
36
3.2 Жабайы өсетін тау.сағыз өсімдігінің формаларын in vitro дақылдау. Тау.сағыздың жапырақ және тамыр экспланттары үшін оптималды қоректік орта құрамын анықтау
40
3.3 Тау.сағыздың залалсызданған тұқым материалынан in vitro асептикалық өскіндер алу
41
3.4 Тау.сағыз клетка культурасындағы каллусогенез процесі 45
ҚОРЫТЫНДЫ 53
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 55
КІРІСПЕ 7
НЕГІЗГІ БӨЛІМ 9
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ 9
1.1 Тау.сағыз (Scorzonera tau.saghyz, Lipsch. et Bosse) өсімдігінің биологиялық ерекшеліктері
9
1.2 Каучук түзуші тау.сағыздың биосинтетикалық қасиеттері, изопреноид синтезі 13
1.3 Тау.сағызды вегетативті және микроклонды көбейту 18
1.4 Микроклонды көбейту әдістері 19
1.5 Микроклонды көбейту технологиясының кезеңдері 21
1.6 Суспензиялық культураны алу 22
1.7 In vitro жағдайында өсірілетін өсімдік клеткаларынан каучукты бөліп алу әдістері
26
2 ЗЕРТТЕУ МАТЕРИАЛДАРЫ МЕН ӘДІСТЕРІ 29
2.1 Зерттеу объектісі 30
2.2 Зерттеу әдістері 30
3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ 36
3.1 Өсімдік материалын залалсыздандыру режимінің оптимизациясы 36
3.1.1 Экспланттарды залалсыздандыру және асептикалық культураны алу
36
3.2 Жабайы өсетін тау.сағыз өсімдігінің формаларын in vitro дақылдау. Тау.сағыздың жапырақ және тамыр экспланттары үшін оптималды қоректік орта құрамын анықтау
40
3.3 Тау.сағыздың залалсызданған тұқым материалынан in vitro асептикалық өскіндер алу
41
3.4 Тау.сағыз клетка культурасындағы каллусогенез процесі 45
ҚОРЫТЫНДЫ 53
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 55
Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) күрделігүлділер тұқымдасы (Asteraceae) – Тянь-Шань ареалындағы жойылып бара жатқан эндемик өсімдік. Өте маңызды техникалық өсімдік, қоңыржай аймақтағы табиғи каучукқа ең бай шикізат көзі [1, 3].
Қазіргі таңда 80% әлемдік синтетикалық каучук бутадиен және изопреннен жасалады. 20% химиялық синтез арқылы стирол, хлоропрен, этилен және басқа да полимерден жасалады. Табиғи каучук 20% құрайды. Латекс (цис-1,4-полиизопрен) – каучук негізі. 2000 өсімдікте синтезделеді. Ол өндірістік масштабта Индонезия, Малайзия, Вьетнам елдерінде плантациялардан алынады. Табиғи каучук медицина, автомобиль шинасын жасауда, соның ішінде үлкен жүк тасушы және спорттық машиналарға қолданылады, себебі табиғи каучук синтетикалыққа қарағанда берік болып табылады. Табиғи каучукқа сұраныс артуы жаңа альтернативті көздер іздеуге себеп болды.
Қаратау каучукқа ең бай өсімдік – тау-сағыздың (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) Қазақстандағы табиғи өсетін аймағы [1].
Тау-сағыз өсімдігінің саны соғыс жылдары күрт төмендеді, себебі 1,4 млн өсімдік қазылып алынған болатын. Қазіргі таңда тау-сағыздың қоры қайта қалпына келу үстінде.
Қазіргі таңда 80% әлемдік синтетикалық каучук бутадиен және изопреннен жасалады. 20% химиялық синтез арқылы стирол, хлоропрен, этилен және басқа да полимерден жасалады. Табиғи каучук 20% құрайды. Латекс (цис-1,4-полиизопрен) – каучук негізі. 2000 өсімдікте синтезделеді. Ол өндірістік масштабта Индонезия, Малайзия, Вьетнам елдерінде плантациялардан алынады. Табиғи каучук медицина, автомобиль шинасын жасауда, соның ішінде үлкен жүк тасушы және спорттық машиналарға қолданылады, себебі табиғи каучук синтетикалыққа қарағанда берік болып табылады. Табиғи каучукқа сұраныс артуы жаңа альтернативті көздер іздеуге себеп болды.
Қаратау каучукқа ең бай өсімдік – тау-сағыздың (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) Қазақстандағы табиғи өсетін аймағы [1].
Тау-сағыз өсімдігінің саны соғыс жылдары күрт төмендеді, себебі 1,4 млн өсімдік қазылып алынған болатын. Қазіргі таңда тау-сағыздың қоры қайта қалпына келу үстінде.
1 Павлов Н.В. Растительные ресурсы Южного Казахстана. - М., 1994. - С. 199.
2 Липщиц С.Ю., Боссе Г.Г. Скорцонера тау-сагыз // Трест Каучуконос ВСНХ СССР. - 1930.- №4. – С. 18-22.
3 Липщиц С.Ю., Боссе Г.Г. Новый каучуконос Казахстана - Scorzonera tau-saghyz Lipschits et Bosse // М. Тр. Всес. инст. кауч. и гуттап. – 1931.- Вып.1.- С. 56.
4 Куликов П.В., Филиппов Е.Г. О методах размножения орхидных умеренной зоны в культуре in vitro // Бюл. Главного ботан. сада. - М., 2000.- С. 125-131.
5 Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. - М., 1999. - С. 154-235.
6 Бондаренко П.В., Тараканов С.Г. Тау-сагыз. –М., 1942.- С.5.
7 Қазақстанның Қызыл кітабы. - Алматы, 1977. 1 том. – С. 375.
8 Paterson- Jones, Roshchina V.V., Roshchina V.D. Cornish “Biochemistry”. –New York, 2001. -P. 56.
9 Келлер Б.А. Каучук и каучуконосы.- M.,1996. 1 том.- С. 234.
10 Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. - М., 1983.- С. 97.
11 Бутенко Р. Г. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Монография. - Москва, ФБК-Пресс, 1999.- С.159.
12 Мурсалиева В.К., Мухамбетжанов С.К., Нам С.В., Рахимбаев И.Р. Микроклональное размножение роз. Методическое руководство по организации и проведению работ.- Алматы, 2011. - 64 с.
13 Войновский А.Б., Вейнберг С. Развитие метода для восстановления резиновых от тау-сагыз и его практическое применение.- Киев, 1986. III-IV том.- С. 40-42.
14 Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – Киев, Наукова думка, 1980. – С.487.
15 Эскью, Р.К., Эдвардс Г.С. Процесс восстановления резины от мясистых растений. – США, 1997 . – С.35
16 Jung- Hwan Lee, Yoon Eui-Soo, Jung Su-Jin, Bae Ki-Hwa6 Seo Jin-Wook6 Choi Yuonh-Eui Plant Regeneration and Effect of Auxin and Cytokinin on Adventitiouns Shoot Formation from Seeding Explant of Taraxacum platycarpum // Korean Jurnal Plant Biotechnology. - 2002.- Vol. 29.- № 2.-P. 111-115.
17 Jeong Kim, Stephen B. Ryu1, Yeon Sig Kwak and Hunseung Kang. A novel cDNA from Parthenium argentatum Gray enhances the rubber biosynthetic activity in vitro // Journal of Experimental Botany. 2004.-Vol. 55.- № 396.-P. 377-385.
18 Soo Kyung Oh, Hunseung Kang, Dong Ho Shin, Jaemo Yang, Keng-See Chow, Hoong Yeet Yeang, Birgit Wagner, Heimo Breiteneder, and Kyung-Hwan Han. Isolation, Characterization, and Functional Analysis of a Novel cDNA Clone Encoding a Small Rubber Particle Protein from Hevea brasiliensis // The journal of biological chemistry. 2009.-Vol. 274.- № 24.- P. 17132–17138.
19 Omo-Ikerodah E. E. , Omokhafe K. O., Akpobome F. A. and Mokwunye M. U. Review. An overview of the potentials of natural rubber (Hevea brasiliensis) engineering for the production of valuable proteins // African Journal of Biotechnology. 2009. - Vol. 8 (25).- P. 7303-7307.
20 Jan B. van Beilen and Yves Poirier. Production of renewable polymers from crop plants // The Plant Journal.- 2008.- Vol. 54.- Р. 684–701.
21 Бутенко Р.Г. Культура изолированных органов и физиология морфогенеза растений. – М., 1998. – С. 270.
22 Sanadze, Jones Rassmussen “Biotechnology”. – USA, 2006.- С. 23.
23 Макогон В.Н. Проблемы натурального каучука в СССР. - Москва, 1978. - С. 127-170.
24 Ковальчук И.Ю., Волгина М.А., Насибулина А.Х., Использование клонального микроразмножения в селекции плодовых и ягодных культур / Ускорение размножения посадочного материала плодово-ягодных культур с использованием биотехнологических методов. – Москва, 2005.- С. 6-14.
25 Ковальчук И.Ю., Мухитдинова З.Р., Турдиев Т.Т., Успанова Г.К., Чуканова Н.И. Микроклональное размножение малины, как метод сохранения биоразнообразия растений в Казахстане // Материалы II Всерос. научно-практ. конф. «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира». – Волгоград, 2008. – С. 186-190.
26 Долгих С.Г., Карычев, Остаркова Л.В. Клональное микроразмножение и оздоровление сортов и подвоев яблони. Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве.- Москва. 2000. - С. 3-7.
27 Волкова Н.К. Сад и ягодник.- Алматы, 1998. - С.215.
28 Pliego-Altaro F. Development of an in vitro rooting bioassay using juvenile phase stem cuttings of Persea Americana Mill // J. Hort. Sci. – 2008. – Vol. 63. - № 2. – P. 295-301.
29 Ковальчук И.Ю., Боровикова О.В. Клональное микроразмножение вишни и сливы // Ускорение размножения посадочного материала плодово-ягодных культур с использованием биотехнологических методов. – Москва, 2005. -С. 14-21.
30 Ромаданова Н.В., Мухидинова З.Р. Корнеобразование и кариологический анализ растений яблони in vitro после хранения в жидком азоте // Пробл. обеспеч. биол. Безопасности Казахстана: международная конф., посвященная 80-летию академика И.О. Байтулина. - Алматы, 2008. – С. 215-218.
31 О. Я. Нейланд Органическая химия. — М.: Высшая школа, 1990. — 751 с.
32 Stratification (botany). Backyardagora. Accessed September 1, 2012.
33 Dan, Meyer. "Growing Wisconsin Trees From Seed". University of Wisconsin College of Agricultural and Life Sciences. Retrieved 2008-07-01.
34 "Germination of Tree Seed". University of Iowa Extension. Retrieved 2008-07-01.
35 "Growing Milkweed". University of Minnesota Monarch Lab.
36 Paal, T. "Dependency of Lingonberry Seed Germinating Ability on Seed Age and Storage Method". International Society for Horticultural Science.
37 Zeynizadeh, Behzad; Samal Yeghaneh (2008). «Solvent-Free Conversion of Epoxides to Thiiranes by Thiourea/NH4Cl System». Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements 183 (9): 2280-2286.
38 Гринченко А.Л. Применение ретардантов в растениеводстве. // Итоги науки и техники. Серия Растениеводство-1983.
39 Жукова П.С. Гербициды и стимуляторы роста в овощеводстве. Минск, 1976.
40 Калинин Ф.Л., Мережинский Ю.Г. Регуляторы роста растений (Биохимия действие и применение). Киев, 1965
41 Применение регуляторов роста в плодоводстве. / Под ред. и с предисл. М.Т. Тарасенко. – М.: Издательство иностранной литературы, 1985 г.
42 Ракитин. Ю.В. Ростовые вещества и их применение в растениеводстве. – М., 1948 г.
43 "Вредные вещества в промышленности: Справочник для химиков, инженеров и врачей". - 7-е изд., Т.2. - Л.: Химия, 1976. - С. 127-130
44 "Вредные химические вещества: Углеводороды, галогенпроизводные углеводородов. Справочник". - Л.: Химия, 1990. - С. 127-129
45 Mackay D., Shiu W.Y., Ma K.-C., Lee S.C. "Handbook of Physical-Chemical Properties and Enviromental Fate for Organic Chemacals". - 2ed, Vol.3. - CRC Press, 2006. - С. 2761-2763
46 Mackay D., Shiu W.Y., Ma K.-C., Lee S.C. "Handbook of Physical-Chemical Properties and Enviromental Fate for Organic Chemacals". - 2ed, Vol.4. - CRC Press, 2006. - С. 3517-3521
47 Yalkowsky S.H., Yan H. "Handbook of aqueous solubility data". - CRC Press, 2003. - С. 450-451
48 Другов Ю.С., Родин А.А. "Мониторинг органических загрязнений природной среды". - СПб.: Наука, 2004. - С. 549
49 Мельников Н.Н. "Пестициды: химия, технология и применение". - М.: Химия, 1987. - С. 229-233
50 Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Пылова Т.Н. "Химические средства защиты растений (пестициды)". - М.: Химия, 1980. - С. 44
51 J.J. Kieber (2002): Tribute to Folke Skoog: Recent advances in our understanding of cytokinin biology. Journal of Plant Growth Regulation 21, 1-2. [1]
52 Chen, C. et al. 1985. Localization of Cytokinin Biosynthetic Sites in Pea Plants and Carrot Roots. Plant Physiology 78:510-513.
53 Mok, DWS and Mok, MC. 2001. Cytokinin metabolism and action. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 52: 89-118
54 Sakakibara, H. 2006. Cytokinins: Activity, Biosynthesis, and Translocation. Annual Review of Plant Biology 57: 431—449
55 Kieber JJ (2002 Cytokinins. In CR Somerville, EM Meyerowitz, eds, [www.aspb.org/publications/arabidopsis/ The Arabidopsis Book]. American Society of Plant Biologists, Rockville, MD, doi: 10.1199/tab.0009
56 Eva L. Decker, Wolfgang Frank, Eric Sarnighausen, Ralf Reski (2006): Moss systems biology en route: Phytohormones in Physcomitrella development. Plant Biology 8, 397—406 [2]
57 Ildoo Hwang, Hitoshi Sakakibara (2006) Cytokinin biosynthesis and perception Physiologia Plantarum 126 (4), 528—538
58 Kaori Miyawaki, Miho Matsumoto-Kitano, Tatsuo Kakimoto (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate The Plant Journal 37 (1), 128—138
2 Липщиц С.Ю., Боссе Г.Г. Скорцонера тау-сагыз // Трест Каучуконос ВСНХ СССР. - 1930.- №4. – С. 18-22.
3 Липщиц С.Ю., Боссе Г.Г. Новый каучуконос Казахстана - Scorzonera tau-saghyz Lipschits et Bosse // М. Тр. Всес. инст. кауч. и гуттап. – 1931.- Вып.1.- С. 56.
4 Куликов П.В., Филиппов Е.Г. О методах размножения орхидных умеренной зоны в культуре in vitro // Бюл. Главного ботан. сада. - М., 2000.- С. 125-131.
5 Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. - М., 1999. - С. 154-235.
6 Бондаренко П.В., Тараканов С.Г. Тау-сагыз. –М., 1942.- С.5.
7 Қазақстанның Қызыл кітабы. - Алматы, 1977. 1 том. – С. 375.
8 Paterson- Jones, Roshchina V.V., Roshchina V.D. Cornish “Biochemistry”. –New York, 2001. -P. 56.
9 Келлер Б.А. Каучук и каучуконосы.- M.,1996. 1 том.- С. 234.
10 Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. - М., 1983.- С. 97.
11 Бутенко Р. Г. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. Монография. - Москва, ФБК-Пресс, 1999.- С.159.
12 Мурсалиева В.К., Мухамбетжанов С.К., Нам С.В., Рахимбаев И.Р. Микроклональное размножение роз. Методическое руководство по организации и проведению работ.- Алматы, 2011. - 64 с.
13 Войновский А.Б., Вейнберг С. Развитие метода для восстановления резиновых от тау-сагыз и его практическое применение.- Киев, 1986. III-IV том.- С. 40-42.
14 Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – Киев, Наукова думка, 1980. – С.487.
15 Эскью, Р.К., Эдвардс Г.С. Процесс восстановления резины от мясистых растений. – США, 1997 . – С.35
16 Jung- Hwan Lee, Yoon Eui-Soo, Jung Su-Jin, Bae Ki-Hwa6 Seo Jin-Wook6 Choi Yuonh-Eui Plant Regeneration and Effect of Auxin and Cytokinin on Adventitiouns Shoot Formation from Seeding Explant of Taraxacum platycarpum // Korean Jurnal Plant Biotechnology. - 2002.- Vol. 29.- № 2.-P. 111-115.
17 Jeong Kim, Stephen B. Ryu1, Yeon Sig Kwak and Hunseung Kang. A novel cDNA from Parthenium argentatum Gray enhances the rubber biosynthetic activity in vitro // Journal of Experimental Botany. 2004.-Vol. 55.- № 396.-P. 377-385.
18 Soo Kyung Oh, Hunseung Kang, Dong Ho Shin, Jaemo Yang, Keng-See Chow, Hoong Yeet Yeang, Birgit Wagner, Heimo Breiteneder, and Kyung-Hwan Han. Isolation, Characterization, and Functional Analysis of a Novel cDNA Clone Encoding a Small Rubber Particle Protein from Hevea brasiliensis // The journal of biological chemistry. 2009.-Vol. 274.- № 24.- P. 17132–17138.
19 Omo-Ikerodah E. E. , Omokhafe K. O., Akpobome F. A. and Mokwunye M. U. Review. An overview of the potentials of natural rubber (Hevea brasiliensis) engineering for the production of valuable proteins // African Journal of Biotechnology. 2009. - Vol. 8 (25).- P. 7303-7307.
20 Jan B. van Beilen and Yves Poirier. Production of renewable polymers from crop plants // The Plant Journal.- 2008.- Vol. 54.- Р. 684–701.
21 Бутенко Р.Г. Культура изолированных органов и физиология морфогенеза растений. – М., 1998. – С. 270.
22 Sanadze, Jones Rassmussen “Biotechnology”. – USA, 2006.- С. 23.
23 Макогон В.Н. Проблемы натурального каучука в СССР. - Москва, 1978. - С. 127-170.
24 Ковальчук И.Ю., Волгина М.А., Насибулина А.Х., Использование клонального микроразмножения в селекции плодовых и ягодных культур / Ускорение размножения посадочного материала плодово-ягодных культур с использованием биотехнологических методов. – Москва, 2005.- С. 6-14.
25 Ковальчук И.Ю., Мухитдинова З.Р., Турдиев Т.Т., Успанова Г.К., Чуканова Н.И. Микроклональное размножение малины, как метод сохранения биоразнообразия растений в Казахстане // Материалы II Всерос. научно-практ. конф. «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира». – Волгоград, 2008. – С. 186-190.
26 Долгих С.Г., Карычев, Остаркова Л.В. Клональное микроразмножение и оздоровление сортов и подвоев яблони. Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве.- Москва. 2000. - С. 3-7.
27 Волкова Н.К. Сад и ягодник.- Алматы, 1998. - С.215.
28 Pliego-Altaro F. Development of an in vitro rooting bioassay using juvenile phase stem cuttings of Persea Americana Mill // J. Hort. Sci. – 2008. – Vol. 63. - № 2. – P. 295-301.
29 Ковальчук И.Ю., Боровикова О.В. Клональное микроразмножение вишни и сливы // Ускорение размножения посадочного материала плодово-ягодных культур с использованием биотехнологических методов. – Москва, 2005. -С. 14-21.
30 Ромаданова Н.В., Мухидинова З.Р. Корнеобразование и кариологический анализ растений яблони in vitro после хранения в жидком азоте // Пробл. обеспеч. биол. Безопасности Казахстана: международная конф., посвященная 80-летию академика И.О. Байтулина. - Алматы, 2008. – С. 215-218.
31 О. Я. Нейланд Органическая химия. — М.: Высшая школа, 1990. — 751 с.
32 Stratification (botany). Backyardagora. Accessed September 1, 2012.
33 Dan, Meyer. "Growing Wisconsin Trees From Seed". University of Wisconsin College of Agricultural and Life Sciences. Retrieved 2008-07-01.
34 "Germination of Tree Seed". University of Iowa Extension. Retrieved 2008-07-01.
35 "Growing Milkweed". University of Minnesota Monarch Lab.
36 Paal, T. "Dependency of Lingonberry Seed Germinating Ability on Seed Age and Storage Method". International Society for Horticultural Science.
37 Zeynizadeh, Behzad; Samal Yeghaneh (2008). «Solvent-Free Conversion of Epoxides to Thiiranes by Thiourea/NH4Cl System». Phosphorus, Sulfur, and Silicon and the Related Elements 183 (9): 2280-2286.
38 Гринченко А.Л. Применение ретардантов в растениеводстве. // Итоги науки и техники. Серия Растениеводство-1983.
39 Жукова П.С. Гербициды и стимуляторы роста в овощеводстве. Минск, 1976.
40 Калинин Ф.Л., Мережинский Ю.Г. Регуляторы роста растений (Биохимия действие и применение). Киев, 1965
41 Применение регуляторов роста в плодоводстве. / Под ред. и с предисл. М.Т. Тарасенко. – М.: Издательство иностранной литературы, 1985 г.
42 Ракитин. Ю.В. Ростовые вещества и их применение в растениеводстве. – М., 1948 г.
43 "Вредные вещества в промышленности: Справочник для химиков, инженеров и врачей". - 7-е изд., Т.2. - Л.: Химия, 1976. - С. 127-130
44 "Вредные химические вещества: Углеводороды, галогенпроизводные углеводородов. Справочник". - Л.: Химия, 1990. - С. 127-129
45 Mackay D., Shiu W.Y., Ma K.-C., Lee S.C. "Handbook of Physical-Chemical Properties and Enviromental Fate for Organic Chemacals". - 2ed, Vol.3. - CRC Press, 2006. - С. 2761-2763
46 Mackay D., Shiu W.Y., Ma K.-C., Lee S.C. "Handbook of Physical-Chemical Properties and Enviromental Fate for Organic Chemacals". - 2ed, Vol.4. - CRC Press, 2006. - С. 3517-3521
47 Yalkowsky S.H., Yan H. "Handbook of aqueous solubility data". - CRC Press, 2003. - С. 450-451
48 Другов Ю.С., Родин А.А. "Мониторинг органических загрязнений природной среды". - СПб.: Наука, 2004. - С. 549
49 Мельников Н.Н. "Пестициды: химия, технология и применение". - М.: Химия, 1987. - С. 229-233
50 Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Пылова Т.Н. "Химические средства защиты растений (пестициды)". - М.: Химия, 1980. - С. 44
51 J.J. Kieber (2002): Tribute to Folke Skoog: Recent advances in our understanding of cytokinin biology. Journal of Plant Growth Regulation 21, 1-2. [1]
52 Chen, C. et al. 1985. Localization of Cytokinin Biosynthetic Sites in Pea Plants and Carrot Roots. Plant Physiology 78:510-513.
53 Mok, DWS and Mok, MC. 2001. Cytokinin metabolism and action. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 52: 89-118
54 Sakakibara, H. 2006. Cytokinins: Activity, Biosynthesis, and Translocation. Annual Review of Plant Biology 57: 431—449
55 Kieber JJ (2002 Cytokinins. In CR Somerville, EM Meyerowitz, eds, [www.aspb.org/publications/arabidopsis/ The Arabidopsis Book]. American Society of Plant Biologists, Rockville, MD, doi: 10.1199/tab.0009
56 Eva L. Decker, Wolfgang Frank, Eric Sarnighausen, Ralf Reski (2006): Moss systems biology en route: Phytohormones in Physcomitrella development. Plant Biology 8, 397—406 [2]
57 Ildoo Hwang, Hitoshi Sakakibara (2006) Cytokinin biosynthesis and perception Physiologia Plantarum 126 (4), 528—538
58 Kaori Miyawaki, Miho Matsumoto-Kitano, Tatsuo Kakimoto (2004) Expression of cytokinin biosynthetic isopentenyltransferase genes in Arabidopsis: tissue specificity and regulation by auxin, cytokinin, and nitrate The Plant Journal 37 (1), 128—138
МАЗМҰНЫ
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР
6
КІРІСПЕ
7
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
9
1
ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
9
1.1
Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) өсімдігінің биологиялық ерекшеліктері
9
1.2
Каучук түзуші тау-сағыздың биосинтетикалық қасиеттері, изопреноид синтезі
13
1.3
Тау-сағызды вегетативті және микроклонды көбейту
18
1.4
микроклонды көбейту әдістері
19
1.5
Микроклонды көбейту технологиясының кезеңдері
21
1.6
Суспензиялық культураны алу
22
1.7
In vitro жағдайында өсірілетін өсімдік клеткаларынан каучукты бөліп алу әдістері
26
2
зерттеу МАТЕРИАЛДАРЫ мен әдістері
29
2.1
Зерттеу объектісі
30
2.2
Зерттеу әдістері
30
3
ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ
36
3.1
Өсімдік материалын залалсыздандыру режимінің оптимизациясы
36
3.1.1
Экспланттарды залалсыздандыру және асептикалық культураны алу
36
3.2
Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдігінің формаларын in vitro дақылдау. Тау-сағыздың жапырақ және тамыр экспланттары үшін оптималды қоректік орта құрамын анықтау
40
3.3
Тау-сағыздың залалсызданған тұқым материалынан in vitro асептикалық өскіндер алу
41
3.4
Тау-сағыз клетка культурасындағы каллусогенез процесі
45
ҚОРЫТЫНДЫ
53
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ
55
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР
6-БАП - 6 -Бензиламинопурин
2,4-Д - 2,4- Дихлорфеноксисірке қышқылы
ИСҚ - Индолилсірке қышқылы
НСҚ - Нафтилсірке қышқылы
КІРІСПЕ
Тақырыптың өзектілігі: Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) күрделігүлділер тұқымдасы (Asteraceae) - Тянь-Шань ареалындағы жойылып бара жатқан эндемик өсімдік. Өте маңызды техникалық өсімдік, қоңыржай аймақтағы табиғи каучукқа ең бай шикізат көзі [1, 3].
Қазіргі таңда 80% әлемдік синтетикалық каучук бутадиен және изопреннен жасалады. 20% химиялық синтез арқылы стирол, хлоропрен, этилен және басқа да полимерден жасалады. Табиғи каучук 20% құрайды. Латекс (цис-1,4-полиизопрен) - каучук негізі. 2000 өсімдікте синтезделеді. Ол өндірістік масштабта Индонезия, Малайзия, Вьетнам елдерінде плантациялардан алынады. Табиғи каучук медицина, автомобиль шинасын жасауда, соның ішінде үлкен жүк тасушы және спорттық машиналарға қолданылады, себебі табиғи каучук синтетикалыққа қарағанда берік болып табылады. Табиғи каучукқа сұраныс артуы жаңа альтернативті көздер іздеуге себеп болды.
Қаратау каучукқа ең бай өсімдік - тау-сағыздың (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) Қазақстандағы табиғи өсетін аймағы [1].
Тау-сағыз өсімдігінің саны соғыс жылдары күрт төмендеді, себебі 1,4 млн өсімдік қазылып алынған болатын. Қазіргі таңда тау-сағыздың қоры қайта қалпына келу үстінде.
Тау-сағыз өсімдігінің ең құнды екенін ескере отырып, қандай да бір жоюшы фактор немесе өсуін тоқтататын шаралар мемлекетпен қудаланылады [2, 3].
Ғылыми жаңалығы: Тау-сағыз өсімдігінің жапырақ және тамыр эксплантарының дақылдануы үшін залалсыздандыру әдісін жетілдіру маңызды болып табылады. Зерттелген залалсыздандыратын агенттердің арасында ең тиімді 0,1% сулема және 70 % этанол екендігі анықталды. Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдіктерін in vitro культураға енгізу және каллусогенезді оңтайландыру үшін 2,4-Д, кинетин, БАП, ИСҚ фитогормондарының әртүрлі концентрациялары бар Мурасиге-Скуг (МС) және Гамборга-Эвелега В5 (В5) қоректік орталары қолданылды. 0,1% тиомочевинамен алдын ала өндеу және стратификациядан кейін төмен өну қабілеті бар тұқымдарынан тау-сағыздың асептикалық өскіндерін алу мүмкіндігі анықталды.
Практикалық маңыздылығы: Бұл жұмыстың өзектілігі бірден тау-сағыздың (Scorzonera tau-saghyz) өсіп жатқан ареалындағы санының қайта қалпына келтіру проблемасын шешуде. Егілетін материалдардың аздығы, Қазақстанда оларды өсіретін саябақтардың жоқ болуына байланысты маңызды культураны өсіру мен технологияларды дамыту негізгі өзекті мәселе болып табылады. Осыған орай жылдам көбейтудің альтернативті технологиясын жасау, соның ішінде микроклонды көбейту технологиясын дамыту коммерциялизацияландыруда маңызды болып табылады.
Зерттеу жұмысының мақсаты: Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдігін микроклонды көбейту үшін культивирлеудің оптималды жағдайларын анықтау.
Жұмыстың міндеттері:
1. Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдігінің формаларын in vitro культурасына енгізу;
2. Тау-сағыз экспланттарын залалсыздандыру жағдайларын оптимизациялау;
3. Тау-сағыз клетка культурасы үшін қоректік орта құрамын оптимизациялау;
4. Микроклонды көбейту үшін тау-сағыздың асептикалық өскіндерін алу және оларды қалемшелеу.
Зерттеу объектісі:
Қаратау таулары аймағында өсетін Scorzonera tau-saghyz Lipsch. et Bosse жабайы өсетін эндемик өсімдіктердің түрлері; эксплант ретінде - 2-жылдық өсімдіктердің жапырақ сегменттері және тамыр сегменттері қолданылды.
Зерттеу әдістері:
* Залалсыздандыру әдісі: залалсыздандырушы агенттер ретінде 50% Na гипохлориді, калий перманганаты, асқын тотығы, 70% этанол, 0,1% сулема пайдаланылды;
* Микроклондық көбейту әдісі: жапырақ, тамыр экспланттарынан пайда болған регенеранттарын және асептикалық өсімдіктерінен алынған микроқалемшелерін 16 сағаттық фотопериодта, 25+-2º С температурада, 60% ылғалды жағдайларында өсіру;
* Статистикалық талдау әдісі.
"Жоғары дәрежеде табиғи каучук бар тау-сағыз өсімдігінің сорттарын алу мақсатында микроклонды көбейту әдісін жетілдіру" ғылыми жобасы бойынша жұмыс жүргізілді.
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1 Тау-сағыз өсімдігінің биологиялық ерекшеліктері
Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz) - күрделігүлділер тұқымдасына жататын көпжылдық өсімдік. Көпжылдық кейде 2 жылдық шөптекті және бұта тәрізді болып келеді, 170 түрі бар. Шөлейтті өңірлерде, соның ішінде көбіне Орта Европа және Шығыс Азияда өседі. Жуандаған жер асты мүшелері жеуге жарамды түрлері кездеседі, мысалы S.turberosa, S.hispanica. Европа мен Америкаға көкөніс ретінде өсіріледі. Ең маңыздысы тау-сағыз өсімдігінің тамырында каучук болатыны анықталған. Біржылдық тау-сағыздың тамырында 5-6% каучук, 2 жылдықта 9-10 % , 3 жылдық 12-15 %. Көпжылдық өсімдік тамырының диаметрі 10см - ге жетеді, ал ұзындығы 4 м, биіктігі 25-40 см [2].
Ғылыми классификациясы:
Бөлім: Жабық тұқымды гүлділер
Класс: Қосжарнақтылар
Тұқымдас: Астрагүлділер
Туыс: Астрагүлділер
Түр: Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) [3].
Сыртқы түрі жартылай бұта түріндегі қысқа, жуан тамыр сабақтан тұрады (каудекс). Каудекс соңы бір немесе бірнеше астық тұқымдас өсімдігіне ұқсас біркелкі жапырақшалармен аяқталады. 1-4 гүл тостағаншасынан тұрады. Гүл шоғыры көптеген сары күлтешелерден (30-40) тұрады. Пісіп жетілген бақбақ өсімдігіне тән шар тәрізді болып, желмен жеңіл таралады. Тұқым - цилиндрлі, қабырғалы, үстіңгі бөлігінде ұшуға қабілетті айдары бар, ақ өскіншелермен.
Табиғи жағдайда өсімдік тұқыммен ғана емес, вегетативті жолмен сабақ пен тамырдың өскіндерімен көбееді. Вегетация уақыты ұзақ емеc −3-3,5 ай. Табиғи жағдайда 3 жылы ғана гүлдейді. Гүлдеу мамыр- маусым аралығында, ал шілде - тамыз аралығында аз мөлшерде жеміс түзеді. Вегетация кезінде өсімдік биомассаны аз түзеді. Культуральды жағдайда тау-сағыз салыстырмалы тез өседі, 2 жылы гүлдей береді. Тұқымның қалыпты өсуі топырақтың 20-25°С температурасында жүзеге асады. Егер 9°С - дан төмен болса, олар өспейді және 25°С-дан жоғары температурада өсу қабілеті төмендейді. Тұқымдар өнуі үшін жылумен қатар, топырақтың беткі қабаты жақсы ылғалданған болу керек. Сондықтан суарып отыру қажет. Егер аталған жағдайлар жасалған болса, тау-сағыздың өскіндері 5-6 күннен соң шығады.
Өскіндер 2 жапырақшадан тұратын ұзынша формада болады. 7-10 күнде өскінде нағыз жапырақтар пайда болады. Олардың өсуі келесі жаздың маусымы мен шілдесіне дейін жалғасады. Жаздың ыстық температурасында жапырақ өсуі тоқтатылып, ескілері шіріп кетеді, ал өсімдік жаздық тыныштыққа көшеді. Келесі жапырақ өсуі қыркүйектен басталады [3].
1 жылда тау-сағыз тамыры 1 м дейін өседі. 1 жылдық тамырдың салмағы орташа 2,5-5 г болады. Ал каучук құрғақ салмағының 3-7 % алады [6].
Тау-сағыздың вегетация уақыты 2 жылы көктемде басталады. 2 жылы тамырдың өсуі қарқынды жүреді және массасы 8-20 г жетеді. Кей жағдайда 40-80 г, ал каучук түзуі 7-12 % өседі.3 жылы өсімдік гүлдей бастайды. Тұқымның 1 га жерден жиналғаны 15-60 кг құрайды. 1 га 30-35 ц тамыр, соның ішінде 15-20% каучук құрғақ массасын құрайды, яғни 150-250 кг каучук [3] (Сурет 1).
Cурет 1. Scorzonera tau-saghyz
Каучук тамырының өзегінде және жер асты бұтақшаларында салыстырмалы көп мөлшерде болады. Табиғи каучукты алу үшін тау-сағыздың құрғақ тамырларын пайдаланады. Тамыр 40 % өнімнен тұрады. Өсімдікті 1929 жылы С.С.Зарецкий Қаратау өңірінен тапқан. Бұл өсімдік бұрыннан жергілікті тұрғындарға таныс еді. Егер тау-сағыздың тамырын бөлсе, каучуктың созылмалы жіпшелерін көруге болады. Каучук сонымен қатар тамырдан ғана емес, каудекстен және жапырақтан да анықталған [6].
Жапырақта басқа органдарға қарағанда каучук аз мөлшерде болады. Сабақта каучук түзетін глобуллалар орналасады. Әр түрлі жастағы өсімдіктердің глобула формасы мен өлшемі әр түрлі. Өсімдік жасы өскен сайын мүшелері үлкейіп, формасы ұзарады. Соған байланысты өсімдікте өзектегі каучук мөлшері өзгереді. Егер 1 жылдықта 1-8% каучук болса, 2-3 жылдықта 8-30 % каучук мөлшері болады [3].
Қазіргі кезде тау-сағыз "Қызыл кітапқа" енген. Бұл антропогендік фактор әсерінен болған, яғни соғыс жылдары 14 млн. өсімдік алынып пайдаланған. Кейін оның табиғи қоры толуы үшін ұзақ уакыт керек. Себебі өсімдіктен тұқымның түзілуі 3-4 - ші жылы ғана жүреді және жас кезінде өскіндердің өлімі көп кездеседі. Тау- сағыз сол аймақта өсетін басқа өсімдіктерге қарағанда бәсекеге төмен болып табылады [1].
Өсетін аймағын интенсивті түрде басқа өсімдіктер қамтуы тау-сағыздың жойылуына себеп болып табылады. Сырдарияның Қаратау тауларынан алғаш тау- сағыз табылған, содан бері геологиялық процестер жүргізіліп, топырақта түрлі өзгерістер болған. Бұл да өз әсерін тигізді, яғни шөл және шөлейтті аймақта өсетін өсімдіктің өсуін шектейді.
Топырақ өзгеруіне байланысты көптеген өсімдіктер тау-сағыздың өсетін аймағын кішірейтуде. Төмен бәсекелестігіне байланысты тау-сағыз өсімдігі саны азаюда [7].
Көптеген болжамдарға қарамастан табиғи каучук өндіру даму үстінде. 1963 жылы 2,17 млн. тонна, 1973- 3,45, ал 1981 жылы - 4 млн. тонна каучук өндірілді. Қазіргі таңда табиғи каучук өндіру ақталады. Төмен бағамен сатылса да, тиімді болып табылады. Табиғи каучуктың әлемдік нарықта бағасы синтетикалық полиизопренді каучуктың бағасына қарағанда төмен. Қазіргі таңда бағалы заттар өндіруде биотехнологиялық және гендік инженериялық әдістер қолдану арқылы табиғи каучукты тау-сағыз өсімдігінен өндіруге әбден болады [2].
Вегетативті көбею бұл өсімдіктің белгілі бір мүшелерінен, яғни тамыр немесе сабақтың бөлігінің дифференциациясы арқылы жыныссыз жолмен көбею процесі. Жабық тұқымды өсімдіктердің ішінде вегетативті жолмен көбінесе құлпынай, тау-сағыз, раушан, батат т.б өсімдіктер көбееді. Тау-сағыз өсімдігінің негізгі көбею жолы - вегетативті тамыр арқылы [21]
Клеткалық және гендік инженерия әдістері көмегімен, мысалы, тау-сағыздың каучук синтездейтін гені бақбақ өсімдігіне енгізуге болады. Бақбақ та өз алдына каучук синтездеуге қабілетті деп саналады. Бұл қол жетімді, бірақ бұл әдісті қолдану үшін тау-сағыздың барлық генетикалық әртүрлілігін және генетикалық картаны анықтау керек [5].
Қаратау аймағының табиғи жағдайларында тау-сағыздың 6 түрі табылған болатын. Олар ауылшаруашылықта пайдасы зор. Ең маңыздылары Қайнар-бастау аймағында өсетін тау-сағыз түрлері. Олардың бір-бірінен айырмашылығы жапырақ және гүлінің формасында.
Қайнар- бастау тау-сағызының жапырағы ұсақ және гүлі бүршіктелген тәріздес, сүтті жолы ақ түсті болып табылады. Басқа түрлерден айырмашылығы тез өну қабелеттілігінде. Екінші жылда өсімдіктің 5 % және 10% гүдей бастайды. Үшінші жылда гүлдеу 50%, ал тұқым өнімі 60 кг жетеді. Тамыры жақсы жетілген болып келеді.
Желаған-ата тау-сағыз түрі жуан жапырақтарымен ерекшеленеді. Гүлдері ұсақ. Дақылдау барысында бұл сорт жай өну қабілетіне ие екені анықталды. Төртінші жылы гүлдеу 20% ғана құрайды, ал тұқым өнімі 10-15 кг құрайды.
Леонтьевка тау-сағыз жуан лацентті жапырақ типіне ие. Гүлі жуан, сүтті жолы сары-жасыл түсті. Кеш пісіп жетіледі, үшінші жылы гүлдеу 10-15% құрайды [6].
Тау-сағыз өсімдігінің өсуі үшін органикалық массаға бай және құнарлы топырақ болу қажет. Негізгі топырақ дайындау оптимальді жағдайларды қарастыру сатысынан тұрады. Топарқты әртүрлі зиянкестерден тазарту керек.
Тау-сағыз көпжылдық өсімдік болғандықтан топыраққа мына заттардың қажет мөлшерде себілуі өте маңызды болып табылады: аммоний сульфаттары, суперфосфат, калий тұздары т.б.
Тамыр жүйесі жақсы жетілуі маңызды болғандықтан минералды тыңайтқыштар маңызды рөл атқарады. Тыңайтқыштарды күзде сепкен өте тиімді болып табылады. Азотты тыңайтқыштарды көктемде сепкен тиімді.
Тау-сағыз өсімдігі өну үшін жеткілікті дәрежеде бақылануда болу керек. Ол үшін өсудің бірінші жылында ылғал көп мөлшерде болу маңызды. Сондықтан суаруды 8-10 рет жүргізу керек. Көктем және жаз айларында көп мөлшерде суару жүргізіледі, ал қыс айларында минимум дәрежеде жүзеге асырылу қажет [9].
Тау-сағыздың тұқым түзуі үшінші жылы жүзеге асады. Тұқым пісіп жетілуі 5 сатыдан тұрады. Тұқымның түзілуі 3-4 - ші жылы ғана жүреді және жас кезінде өскіндердің өлімі көп кездеседі. Тау- сағыз сол аймақта өсетін басқа өсімдіктерге қарағанда бәсекеге төмен болып табылады Тұқымдарды жинаған кезде ең соңғы сатыдағы екеніне көңіл аудару керек. Яғни толықтай өнген тұқым болуы өте маңызды. Тау-сағыз тұқымдары қолмен жиналады. Кейін олар толықтай кебу керек, ол үшін белгілі уақыт оларды кептіреді. Тұқымдар өнуі үшін жылумен қатар, топырақтың беткі қабаты жақсы ылғалданған болу керек. Сондықтан суарып отыру қажет. Егер аталған жағдайлар жасалған болса, тау-сағыздың өскіндері 5-6 күннен соң шығады.
Тау-сағыз тамырларын жинау 3-4 жылдары жүзеге асады. Жаздық тыныштық қалыпқа көшкен кезге дейін. Тамырларын жинамас бұрын өсімдікті көп мөлшерде суару керек. Кейін тамырларды кетіру қажет. Оны ауада жүргізеді [5]
Тау-сағыз өсімдігінің таралу аймақтары: Қазақстан: Сырдария, Қаратау, Машат, Даубаба, Тәжікстан: Фан таулары, Өзбекстан: Ферғана солтүстігі, Қырғызстан: Талас Алатауы, Шатқал тауы, Түркістан қыраты, Исфир бассейні. Орта Азияның эндемик өсімдігі, Батыс Тянь-Шань, Қаратау, Тамир Алтайдың төмен немесе таулы, қыратты жерлерінде өседі [3].
Тау-сағыз өсімдігінің саны соғыс жылдары күрт азайды, сол кезде 14 млн. өсімдік қазып алынды. Қазіргі кезде жайлап қайта қалпына келуде.
Табиғи таралуының негізгі шектеуші факторы: төмен бәсекеге қабілеттілік, тұқымның ұзақ уақыт пайда болуы, геологиялық жұмыстар, малға азық болуы, каучук түзуші ретінде көп қолданылуы [9].
1.2 Каучук түзуші тау-сағыздың биосинтетикалық қасиеттері, изопреноид синтезі
Каучуктың полиизопреноидының түзілуі клетка паренхимасында жүзеге асады. Алдымен каучуктың бөлігі цитоплазмада, кейін вакуольде түзіледі. Каучуктың бастамасы қант, ацетат, пируват, мевалонат болып табылады. Каучук - эмперикалық формуласы С5Н8, изопреннің полимердену өнімі мен молекулалық массасының алуан түрлі спектрінен тұрады. 105-4x105 дейін, бұл 1500-60000 полимерге эквивалентті [9]. Изопреноид көмірсуларының атомдары пируваттың декарбоксильденуі нәтижесінде ацетаттан түзіледі. (Сурет 2).
Сурет 2. Каучук биосинтезі
Көміртегінің екі атомы бар ацетат молекуласы ацетаттың үш молекуласының конденсациясы мен бір атом көміртегінің бөлінуінен С5 молекуланы изопренге айналдырады
Изопреноидтар - көміртегі атомдарының тобынан тұратын табиғи қосылыс. Изопрендер терпен және олардың туындылары стероидтар , полиизопреноидтарға бөлінеді.Тірі организмдерде изопреноидтар сірке қышқылынан түзіледі. Изопреноидтарға каротиноид, мысалы витмин А, феромондар, каучук, ювенильді гормондар, гуттаперча жатады [22].
Келесі кезең үш молекула ацетаттың қосылып бұтақталған тізбек түзуі ацетил коферменті қатысымен жүреді. Келесі кезең мевалонатқа айналудан тұрады. Кейін мевалонаттың фосфорилденуі жүреді. Сол кезде пирофосфатмевалонат түзіледі [8].
Пирофосфатмевалонат ең негізгі изопреноид метаболизмінің реакциясына қатысады. Ол изопентилпирофосфат пайда болуы. Терпендердің, сесквитерпендердің және жоғарғы изопреноидтардың изопентилпирофосфаттан түзілуі цис-1,4- полиизопентилтрансфераза көмегімен изопентилпирофосфат қалдығының ұзарған изопреноид тізбегіне қосылуы нәтижесінде пайда болады. Бұндай полимеризация әдісі изопреноид синтезінің негізі болып табылады
Бұл әдіс арқылы каучук түзілуі фруктозадан 1-0-метил- L-инозитол арқылы алуға болады. Каучук синтезінің жылдамдығы көптеген жағдайларға байланысты. Мысалы, Гевея ағаш Hevea brasiliensis латексінде ол 5 мг. Судың жеткіліксіз болуы каучук түзілуін арттырады. Каучук синтезін сонымен қоса, этилен де стимулдейді [8].
Сүттіген шырынының кей бөліктерінде каучук емес, тритерпеноидтарды эфирлер болады. Латексте терпеноидтар және терпеноидты спирттер де болады. Бұл дезинфицирлеуге қабілеттілігін арттырады. Терпеноидтармен қатар латекстен басқа да қосылыстар анықталған. Вакуольде мекон және хелидон қышқылы, фенол болады (Сурет 3).
Сурет 3. Латекстегі хелидон (1) және мекон (2) қышқылы
Ең кең таралған амин қышқылы 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА). Латексте ДОФА 1,7% құрайды. Қорғаныш қызметін сүттіген шырынында лизоцим белоктары атқарады. Олар бактериалды полисахаридтік байланысты гидролиздейді [8] (Сурет 4).
Сурет 4. Изопреннің түзілу жолы
Латекс - (англ. latex, нем. Latex m, Kautschukmilch f) сулы ерітіндідегі дисперсті полимерлі заттардан тұратын эмульсия. Табиғатты өсімдіктің сүтті жолынан бөлінеді, соның ішінде бразилиялық гевея және бақбақ өсімдіктерінде т.б (Сурет 5, Кесте 1 ).
Кесте 1
Каучук түзуші өсімдіктердегі латекстің құрамы
Құрамындағы заттар
Өсімдік (%)
Гевея
Asclepias
Тау-сағыз
Су
70
70
51 - 64
Минералды заттар
0,26
1,4
--
Қанттар
0,79
4,0
--
Шайыр
1,22
23,6
1,3 - 3,4
Каучук
27,1
3,4
30,0 - 44,6
Азот
0,24
0,46
--
Сурет 5. Өсімдік кесіндісінен бөлінген латекс
Латекс құрамында коллоидты каучукты бөлшектер (глобула), беттік активті заттар эмульгаторлар болады. Латекстегі глобулалар ионогенді беттік-активті заттар арқылы тұрақтанған, көбінесе анион типті ионогендермен. Латекс полидиперсті жүйе. Алғашқы латекс глобуласының диаметрі 10-200 нм құрайды. Өндірістік масштабта әртүрлі мысалы, изопренді, бутадиенді, акрилді, карбоксилатты латекстер қолданылады [35].
Каучукты латекстен бөліп алу үшін форманы тұз ертіндісі бар ертіндіге салып, мысалы, хлорлы кальция бар. Ертінді құрамында оң зарядталған металл бөлшектері - катиондар бар. Латексті ертіндіге салған кезде катиондар диффундирленеді. Латекс құрамындағы теріс зарядталған бөлшектермен соқтығысқан соң оң зарядталған бөлшектер оларды зарядынан айырады. Каучук бөлшектері ертіндіде тұнба түзеді.
Табиғи латексті тек концентрленген күйде ғана қолданады. Табиғи латекстен жасалған заттар салқын температураға тұрақты (- 67°), жоғары физико-химиялық қасиет көрсетеді. Вулканизацияланған пленкалар 200 -- 350 кгсм2 құрайды.
Ең маңызды латекс қолданылатын сала болып адгезивтер түзу болып табылады. Ол шина, транспортерлік жіптер т.б жасауда маңызы зор. Басқа да мақсатта қолданылады: мата жасауда, фрикционды заттар жасауда, қағаз өндірісінде, тері өндеуде, электротехникада, жол құрылысында т.б салаларда кеңінен қолданылады [42].
Каучук - жоғары молекулалы көмірсутегі, эмпирикалық формуласы С5Н8. Құрылымдық жағынан изопрен полимерлену өнімі болып табылады. (Сурет 6).
Cурет 6. Каучуктың формуласы
Каучук бензолда, петролейндік эфирде, күкіртті эфирде ериді, бірақ ацетон және спиртте ерімейді. Каучук молекулалық массасы әртүрлі гомологты полимерлердің қоспасы. Каучук әртүрлі өсімдік тканьдерінде жиналуы мүмкін. Клетка паренхимасында түзіледі. Тау-сағыз, көк-сағыз, гевея сияқты өсімдіктерде көп мөлшерде жинақталады [14].
Өсімдіктегі сүтті жолда активті ферменттер көп мөлшерде болады. Олар протеолиттік және тотығу ферменттері. Ферменттердің көп болуы каучук биосинтезімен тығыз байланысты. Сүтті жолда каучук микроскопиялық бөлшек түрінде болады (глобула).
Латекстегі каучук мөлшері әр өсімдікте әртүрлі формада болып келеді. Каучук глобулаларының сырты жіңішке белокты қабықпен қапталған.
Каучук биосинтезіне тоқталар болсақ, қазіргі кезде зерттеулерге қарағанда каучук өсімдік ұлпалары бойымен жылжуға қабілетсіз. Сондықтан каучук жинақталатын өсімдік мүшелері биосинтез жүретін негізгі орын екені анықталды. Каучук биосинтезі үшін алғы зат көмірсулар және олардың туындылары саналады. Мысалы, тау-сағыз өсімдігінің тамырында жиналатын каучук түзілуінің алғы заты қант екені анықталды [23].
Ацетат, яғни ацетил қалдығы CH3CO- каучук биосинтезі үшін қажет негізгі зат болып табылады. Каучук және гутта биосинтезі каротиноидтар және терпендердің синтезімен тығыз байланысты. Бұл қосылыстардың барлығы өсімдікте А коферменті қатысуымен активті ацетилден түзіледі.
Табиғи каучук эластомерлер тобына жатады. Көптеген жылдар бойы табиғи каучук техникалық маңызы зор материал болып келеді.
Өсімдіктерде каучуктың түзілуі.
Табиғи каучук көп сатылы биохимиялық процестердің соңғы өнімі. Бұл процесс көптеген ферменттер арқылы жүзеге асырылады. Негізгі сатысын хроматографиялық анализ арқылы анықтауға болады. Каучуктың өсімдікте түзілуіне әртүрлі сыртқы орта факторлары да әсер етуі мүмкін. Сірке қышқылының болуы каучук түзілуін арттыратыны анықталынды [9].
1.3 Тау-сағызды вегетативті және микроклонды көбейту
Табиғи жағдайда тұқымға қарағанда көбінесе вегетативті жолмен көбейеді. Культурада тау-сағыздың тұқым арқылы көбеюі қарастырылады. Вегетативті көбею тамыр бөлігі арқылы жүзеге асырылады. Зерттеулерге қарағанда, тау-сағыз тамырынан ұзындығы 0,5 см жаңа өсімдік түзілетіні анықталған. Академик Лысенко бұл қасиетті қолданып тау-сағыздың тез өсуін қамтамассыз ету үшін қолданған [9].
Вегетативті көбею бұл өсімдіктің белгілі бір мүшелерінен, яғни тамыр немесе сабақтың бөлігінің дифференциациясы арқылы жыныссыз жолмен көбею процесі. Жабық тұқымды өсімдіктердің ішінде вегетативті жолмен көбінесе құлпынай, тау-сағыз, раушан, батат т.б өсімдіктер көбееді. Тау-сағыз өсімдігінің негізгі көбею жолы - вегетативті тамыр арқылы.
Клон деген жыныссыз жолмен, яғги вегетативтік көбею жолымен, түзілетін организм. Өсімдіктердің клондық микрокобеюі деген өсімдіктердің in vitro жағдайында жыныссыз жолмен көбеюі. Соның нәтижесінде пайда болған өсімдіктер бастапқы өсімдікпен және өзара бір-бірімен генетикалық тұрғыдан айнымастай бірдей болады. Клондық микрокөбейтудің мынадай артықшылықтары айтарлықтай жоғары: мысалы көбею коэффициенті өте жоғары, микрокөбеюмен қатар өсімдіктер вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтырылады, сұрыптау процесін жылдамдатылады, Жаңа сорттарды тез көбейтеді, вегетативтік жолмен көбейе алмайтын өсімдіктерді көбейтуге болады, үнемділік арнайы бөлмеде стеллаждарда орналасқан пробиркаларда жыл бойы мыңдаған өсімдіктерді қсіру арқылы теплицалар алаңы үнемделеді.
Клондық микрокөбейтудің түрлі әдістерін ғалымдар өтетін морфогенездің өзгешеліктеріне қарай жіктеді. Н.В. Катаева мен Р.Г. Бутенко былай жіктеуді ұсынады. Бірінші типті өсімдіктер бүтін өсімдікте бұрыннан боған меристемаларды (сабақтың апексі, қолтық және бұйыққан бүршіктері) активтендіру жолымен пайда болады. Екінші типті өсімдіктер in vitro жағдайында пайда болған бүршіктер мен эмбриоидтардан алынады.
Микроклонды көбейтудің мынадай артықшылықтыры:
1) Көбею коэффиценті өте жоғары (шөптектес өсімдіктерде бұталарда, ағаштарда, қылқан жапырақтыларда). Мысалы, гербера, бүлдірген, бақытгүл, раушанның бір өсімдігінен in vitro жағдайында бір жылдың ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер алуға болады. Алма ағашының бір бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мыңнан астам өркен шығады. Таңқурайдың бір бұтағы меристемаларын бөліп алып өсіріп жылына 50 мыңға дейін өсімдік алуға болады. Сонымен микроклоналды көбейтудің коэффиценті басқа вегетативтік көбею әдістерімен салыстырғанда мыңдаған есе артық.
2) Микроконалды көбейтумен қатар өсімдіктер вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтырылады.
3) Сұрыптау процесін жылдамдату. Жаңа сорттарды тез көбейтіп, оларды ауылшаруашылық өндірісінде пайдалану мерзімі едәуір қысқарады.
4) Вегетативтік жолмен көбейе алмайтын өсімдіктерді, мысалы, пальманы тек in vitro жағдайында көбейтуге болады. Осы әдіспен өнеркәсіп деңгейінде бірқатар өсімдіктерді көбейтеді.
5) Үнемділік. Арнайы бөлмеде стеллаждарда орналасқан пробиркаларда жыл бойы мыңдаған өсімдіктерді өсіру арқылы жылыжайлар алаңы үнемделеді.
6) Жас өсімдіктерді алу, яғни кәрі дарақтарды жасарту.
7) Өсу процесін жыл бойы үзбеуге болады, әсіресе бұл дамуында тыныштық кезеңі болатын өсімдіктерді көбейтуге тиімді [10].
1.4 Микроклонды көбейту әдістері
Микроклонды көбейтудің түрлі әдістерін ғалымдар ол кезде өтетін морфогенездің өзгешеліктеріне қарай жіктейді. Н.В. Катаева мен Р.Г. Бутенко былай жіктеуді ұсынады:
а) бұрыннан болған меристемалардан өскен өсімдіктер;
б) жаңадан пайда болған меристемалардан өскен өсімдіктер [11].
Бірінші типті өсімдіктер бүтін өсімдікте бұрыннан болған меристемаларды сабақтың апексі, қолтық пен тыныштық күйіндегі бүршіктерді активтендіру жолымен пайда болады. Бұл меристемадан шыққан өсімдіктер генетикалық жағынан аналық өсімдікпен пара пар, өйткені апекстерді in vitro жағдайында өсіргенде олар генетикалық тұрақтылығын сақтайды. Өсімдіктердің меристемалары in vivo жағдайында үздіксіз белсенді пролиферациялық күйде болады. Олардың генетикалық тұрақтылығы
ДНҚ- ның репарация жүйесінің активтілігі жоғары болғандықтан және де өзгерген клеткалардың вегативтік сұрыпталуына байланысты (Сурет 7).
Сурет 7. Алманың төбе бүршігінің көлденең кесіндісі
M - апикальды меристема; Л - жапырақ
Екінші типті өсімдіктер in vitro жағдайында пайда болған бүршіктер мен эмбриондардан алынады. Бұл өсімдіктерде маманданған және каллус клеткаларынан шыққандығына байланысты генетикалық өзгергіштіктер орын алуы мүмкін. Сондықтан, шыққан клондар бастапқы өсімдіктен біршама ауытқып кете береді. Сөйтіп бұл әдіс тек каллустары тұрақты немесе регенеранттарда пайда болған өзгерістер табиғи өзгергіштіктен аспайтын өсімдіктерге пайдалануға болады [].
Бүршіктер мен эмбриоидтар былай пайда болады:
1)Экспланттың маманданған клеткаларынан тікелей көбеймей мүшелерінің ұлпаларының, эпидермистен, субэпидермис ұлпаларынан, жапырақ мезофилінен т.б.
2) Экспланттан шыққан алғашқы каллустан
3) Көшіріп отырғызылған каллустан немсе суспензиядағы клеткалардан [11].
Қолтық бүршіктерін оятып, олардың дамуын қоздырып, олардан шыққан қолтық өркендерді пайдалану өсімдіктерді микрокөбейтудегі ең тараған әдіс. Бүтін өсімдікте қолтық бүршіктердің өсуін сабақ ұшындағы апекс тежейді. Қолтық меристемалардың өсуі сабақтың ұшын кесіп тастағанда немесе цитокинмен өңдеген соң басталады. Қоректік ортадағы цитокининдер жанама бүршіктердің жандануына әсер етеді және толып жатқан қолтық өркендердің дамуына әкеледі. Тез өсетін өркендердің шоғыры пайда болады, одан жеке өркендерді бөліп алып жаңа қоректік ортаға отырғызғанда, олар өсіп қайта шоғырланады. Бірақ барлық өркендерде тамыр пайда бола бермейді. Ал оларды цитокинині жоқ ортаға көшірсе, өзінен-өзі тамырлары өсіп шығады, әсіресе даражарнақты өсімдіктерде [24].
Қосалқы өркендердің экспланттан пайда болуы. Адвентивтік бүршіктердің эксплант ұлпаларынан тікелей пайда болуы өсімдіктердің лайықты жағдайда жетіспейтін мүшелерін қалпына келтіру қабілетіне негізделеді. Адвентивтік бүршіктерді өсімдіктердің қайсы болса да мүшелерінен және ұлпаларынан шығаруға болады, мысалы, бөліп алынған ұрықтан , жапырақтан, сабақтан, тұқым жарнағынан, пиязшықтың қыбыршағынан және түбіртегінен, тамыр бөлігінен, гүлшоғыры бастамасынан, т.б. [25].
Регенерант өсімдіктің каллустан пайда болуы. Микрокөбейтудің тағы бір көп таралған әдісі ол өсімдіктерді каллустан органогенез немесе эмбриоидогенез жолымен шығару. Морфогенездің басталуы қоректік ортадағы фитогормондардың ара қатысымен реттеледі. Органогенез арқылы регенерант өсімдіктерді алудың модельді жүйесі ретінде темекі бола алады. Қоректік ортада фитогормондардың концентрациясын өзгертіп отырып, каллустан немесе тікелей экспланттан өркендерді өсіруге болады. Мысалы, темекінің Nicotina tabacum мен N.occidentalis деген екі түрін бірі мен бірін будандастырғанда, будан ұрықтар түзілген. Бірақ бұлар табиғи жағдайда өне алмаған. Оларды in vitro өндіріп каллус алынды. Одан кейін каллуста сабақ бүршіктері мен тамырлардың пайда болуына жағдай туғызылады. Сөйтіп темекінің бағалы буданы көбейтіледі [26].
1.5 Микроклонды көбейту технологиясының кезеңдері
Клонды микрокөбейту технологиясын 4 сатыға бөлуге болады:
1) Донор - өсімдікті таңдап алу, экспланттарды бөлу және жақсы өсетін стерильді культураны алу.
2) Микрокөбею, яғни меристемалық клондар санының максималды дәрежеге жетуі;
3) Тамыр түзіп, ортаға адаптацияның қалыптасуы (+2°C, +10°C);
4) Жылыжайда өсімдіктерді өсіруі немесе егіс алқапта өсіруге дайындау [24].
Әр сатыда өзіндік қоректік орта қолданылуы керек.Сатыда стерильді, жақсы өсетін культура алу керек. Егер мүмкіндік болмаса қоректік ортаға антибиотик қосады (тетрациклин, бензилпеницилл) 100-200 мгл концентрацияда. Бұл сатыда Мурасиге -Скуг қоректік ортасы қолданылады және ауксин, цитокинин қосады.
Микрокөбею сатысында максимальды мөлшерде мериклондар алу мақсаты қойылады. МС ортасы қолданылады. Бұл сатыда цитокинин мен ауксиннің концентрацияда арақатынасы маңызды рөл атқарады. Цитокининнен БАП 1-10 мгл концентрация , ал ауксиннен ИСҚ және НСҚ концентрациясы 0,5 мгл қолданылады. Егер өсімікті цитокинин мөлшері жоғары қоректік ортада өсірсе өсімдіктің морфологиясының өзгеруіне алып келеді. Витрифицирленген бүршіктер түзілуі мүмкін. Минималды концентрацияда цитокинин бар қоректік ортада өсірілу керек [12].
Үшінші және төртінші сатыда микробүршіктердің тамырлануы және адаптация жүреді. Бұл сатыда қоректік орта Уайт ортасымен алмастырылады. Қант мөлшері 0,5-1% азаяды, цитокинин мүлдем қосылмайды, тек ауксин қосылады. β-индолил -3 май қышқылы, ИСҚ және НСҚ қосылады [25].
Микробүршіктердің тамырлануы екі әдіс арқылы жүргізіледі:
1. Микробүршіктерді ауксиннің стерильді концентрациялы ертіндісінде (20-50мгл) 2-24 сағат ұстайды, кейін гормонсыз агарозды ортаға көшіреді.
2. Микробүршіктердің 3-4 аптада кұрамында ауксин (1-5 мгл) аз концентрациясы бар қоректік ортада өсіру.
Регенерант- өсімдікті субстратқа отырғызу микроклонды көбейтудің ең маңызды сатысы болып табылады. Ол үшін көктем мен жаз ыңғайлы мезгіл болып есептеледі. Көпшілік өсімдіктерге субстрат ретінде топырақ , торф, пермет (1:1:1); торф, топырақ (3:1) қолданылады. Көшірілген өсімдіктерді жылыжайда 20-22°С температурада, 65-90% ылғалдылықта өсіреді [13].
Көптеген пайдалы өсімдіктер толып жатқан вирустар, бактериялар және саңырауқұлақтар қоздыратын ауруларға шалдығады. Соның зардабынан жыл сайын олардың өнімі төмендеп, сапасы нашарлайды. Клондық микрокөбейту кезінде стерильденген экспланттарды асептикалық жағдайда өсірудің арқасында өсімдіктер бактериялық және саңырауқұлақтық патогендерден сауықтырылады, бірақ сыртқы залалсыздандыру эксплантты вирустан тазарта алмайды.
1.6 Суспензиялық культураны алу
Суспензиялық культура дегеніміз - жеке немесе бір топ клеткалардың сұйық ортада өсірілуі. Химиялық заттар әсеріне ұшырату мүмкіндігі жеңіл гомогенді клетка популяциясын құрайды. Суспензиялық культура модельді жүйе ретінде, екінші реттік метаболизм жолдарын зерттеуде, ферменттер индукциясы және гендер экспрессиясы, бөгде қосылыстар деградациясы, цитологиялық зерттеулерде т.б. мақсаттарда қолданылады. Сұйық қоректік ортасы бар колбаға каллусты тканьді салу арқылы суспензиялы клетканы алады. Суспензияны арнайы араластырғыш аппарат көмегімен (100-120 айнмин) араластырады. Жаңа қоректік ортаға көшірер алдында каллустың үлкен агрегаттарынан 1-2 қабат марлі, нейлонды елеуіш көмегімен құтылады [14].
Суспензиялық культура модельді жүйе ретінде екінші реттік метаболиттерді зерттеуде, ферментер индукциясын зерттеуде, гендер экспрессиясына талдау жүргізгенде, бөгде қосылыстар деградациясын қарастырғанда және цитологиялық зерттеулер жүргізгенде кеңінен қолданылады [21].
Өсімдіктің жақсы линияларын алуда негізгі рөлді клеткалардың метаболизмге және жылдам көбеюге қабілеттілігі атқарады. Бұл линиялардың морфологиялық сипаттамасы:
* Дезагрегацияға жоғары қабілеттілігі;
* Клеткалардың морфологиялық біртектілігі;
* Трахеидтәрізді элементтердің болмауы.
Ең бірінші рет жаңа қоректік ортаға көшіргенде каллустың үлкен бөлшектерін және агрегаттарды алып, марлінің 1-2 орамы арқылы фильтрлейді. Суспензиялық культураны инициализациялау үшін 60-100мл сұйық ортаға 2-3 г жаңа каллусты культура клеткалары керек. Бірақ әр клетка культурасының линиясына төмен мөлшерде инокулят керек.
Суспензиялық клетка культурасындағы өсу дәрежесін бірнеше параметрлерге байланысты анықтауға болады:
1) Тұнбаға түскен клетка мөлшері. Суспензиялық культураның аздаған мөлшерін 15 мл пробиркаға алып центрифугалайды. Нәтижені пайыздық көрсеткішпен бағалайды;
2) Клетка саны. Фукс-Розенталь камерасында саналады;
3) Құрғақ массасы. Суспензиялық культураны ылғал фильтр арқылы фильтрлейді, клеткаларды дистелденген сумен жуып, суды вакуум арқылы сорып алады. Кейін құрғақ масса өлшенеді;
4) Белок мөлшеріне қарай талдау. Суспензиялық культураны фильтрде жинап, 70% этанол ертіндісімен екі реет жуып, ацетонмен кептіреді. Кейін Лоури әдісі арқылы белокты анықтайды;
5) Қоректік ортаның өткізгіштігі. Кондуктометр көмегімен анықталады;
6) Клеткалар өміршеңдігі. Цитоплазманың жылжуын микроскоп арқылы арнайы бояғыштар көмегімен (флюоресцеиндиацетат, соли тетразолия, синий Эванса) анықтайды. Алдын ала рн мөлшерін таңдап алады. Алынған нәтижелерге байланысты S-тәрізді формадағы өсу қисығын алады (Сурет 8).
Сурет 8. S- формалы өсу қисығы
Суспензия культурасының ерекшелігінің бірі жоғары тығыздығы, яғни клеткаларды культивирлеуде биомасса өскен сайын орта арта түседі. Ол адгезияға ұшыратады. Адгезия - клеткалардың бір-біріне жабысып, араластырғыш аппараттың жұмысына қиындық туғызады. Кейін көбік түзіледі. Ол биомассаның ары қарай дамуына кедергі келтіру мүмкін. Суспензиялы клетка культурасын екінші реттік метаболиттерді алу үшін қолданылады. Олар: өсімдік клеткаларында өндірілетін алкалоид, терпеноид, гликозид, полифенол, полисахарид, эфир майлары, пигменттер, антиканцерогендер (птотецин, харрингтонин), пептидтер (фитовирустардың ингибиторлары) [12].
Нәтижеден алынған өсу қисығы модельдегіден біршама өзгеше болуы мүмкін. Өсу қисығына популяцияның генетикалық сипаттамалары, инокулят саны, өсірілу жағдайлары (қоректік орта құрамы, рН көрсеткіші, араластыру жылдамдығы).Жылдамдықтың арасындағы дисбаланс әр сатыдағы өсімдіктің клеткаларының онтогенездік қабілетін сипаттайды.
Өсімдік клеткаларын кейінгі культивирленуі үшін микробиологиялық әдістер қолданылады.
Мерзімді өсіру - клеткаларды қоректік ортасы бар жабық ферментерға салады және оған қажетті жағдай енгізіп, нәтижесінде биомасса алады. Уақыт өту барысында клетканың популяция тығыздығы өсіп, қоректік орта концентрация азайып, оның пайдалы өнімдері төмендейді. Тұйық процесс болып табылады. Әр фаза өзінің физиологиялық параметрлерімен анықталады. Стацинарлы фаза өлу фазасына жақын. Нәрі біткеннен кейін мерзімді процесс тоқтайды. Бұл процесс барысында биомасса бөлінеді. Экономикалық жағынан тиімсіз. Культураны көп уақыт экспоненциалды ұстап тұру үшін жартылай мерзімді өсіру процесі қолданылады.
Жартылай мерзімді процесс мерзімді процестен айырмашылығы қоректік ортаға үнемі қосымша қоректік орта компоненттері қосылады да қадағаланып тұрады. Бұл экономикалық тиімді себебі, бұл процесс барысында биомасса жоғары [25].
Үздіксіз өсіру - экспоненциалды фаза тұрақты болып келеді. Культура жақсы өседі. Бұл процесс ескі қоректік орта жаңарып отырады. Ескісі бөлек шығарылады, дайын биомасса басқа ферментерға құйылып отырады. Экспоненциалды фаза үнемі сақталады. Автоматты реттеліп отырады. Үздіксіз өсіру кезінде қажетті жағдай тудыруда синхронды түрде клеткалар бөлінеді. 2-3 циклға дейін айналады. Үздіксіз жұмыс жасайтын аппараттардың батареясының негізгі артықшылығы жоғары өнімділікпен субстратты толық өңдеу, көп сатылы үрдістерде әртүрлі дақылдау режимін сақтауға қолайлы. Бірінші культиваторда режимдер орныққаннан кейін өсу процессі өтеді. Өскен культура биомассасы толыққан соң келесі ферментерға өтеді. Ескі қоректік орта басқа ферментерға төгіліп клетка культураларға жаңа қоректік ортаға келіп түседі. Экономикалық жағынан тиімді болып табылады.
Клеткаларды өсіру үшін эксплантты, қоректік ортаны, ыдыстарды, құрал-саймандарлы алдын ала залалсыздандыру қажет. Өсімдіктен эксплантты бөліп алуды және оны қоректік ортаға отырғызуды ламинар боксінде өткізеді. Әр түрлі тәсілмен залалсыздандырылған және дистилденген суда бірнеше мәрте жуылған объектілерден керекті ұлпалар бөлініп алынып оларды стирильденген қатты немесе сұйық ортаға отырғызады.
Клеткаларды өсіруге арналған қ.о. құрамы өте күрделі. Олардың құрамына макро және микроэлементтер, көмірсулар, витаминдер, амин қышқылдары, фитогормондар кіреді. Клеткаларды нәтижелі өсіру үшін ең алдымен лайықты орта қажет. Клеткаларға әсер ететін сыртқы факторлар: температура, жарық, осмос қысымы, оттегі [27].
Каллус ұлпасы клеткалардың ретсіз бөлінуі арқасында пайда болады. Каллустың туындауы және әрмен қарай өсуі фитогормондармен реттеледі. Каллус ұлпасын 3-4 апта сайын жана ортаға көшіріп отырады, өте ұзақ өсіруге болады. Ал қоректік орта құрамын өзгертіп, марфогенездің нәтижесінде регенерант өсімдікті алуға болады.
Клеткалар суспензиясы - жеке клеткаларды немесе олардың кішігірім топтарын аэрациясы мен араластыруын қамтамасыз етіп сұйық ортада өсіру. Сұйық ортада өскен клеткалар агарлы қатты ортада өсірген клеткалармен салыстырғанда, қоректік заттармен және оттегімен жақсырақ қамтамасыз етіледі. Жеке клеткаларды борпылдақ каллустан сұйық ортада шайқап шығарып алады. Клеткалардың суспензияда ең лайықты тығыздығы бир милилитрде 105-106 клетка шамасында болуы керек.
Клеткаларды сұйық ортада өсірудің екі әдісі бар: мерзімді (қорландырып) өсіру (суспензиядағы клеткаларды өсіру процесі белгілі бір уақыт ішінде жүргізіледі және де бұл кезде бастапқы құйылған қоректік орта жаңартылмай, өз нәрі сарқылғанша пайдаланылады) және ағынды ортада үзіліссіз өсіру (суспензиядағы клеткаларды өсіру процесі үздіксіз жүргізіледі және де ылғи жаңартылып отырылады).
Өсімдік клеткаларын сұйық ортада өсіргенде микроорганизмдерге арналған технологиялар мен аппараттар қолданылады. Клеткалар суспензиясын өсіру биореакторда хемостат және турбидостат принциптері арқылы жүргізіледі. Хемостат принципі бойынша үздіксіз өсіру процесі өсуді тежейтін белгілі бір фактордың әсерімен өтеді, популяция стационар күйіне көшеді, клеткалар физиология тұрғысынан біркелкі болады. Турбидостат принципі бойынша үздіксіз өсіргенде клеткалардың өсу қарқындылығын бір деңгейде ұстау, олардың суспензияда оптикалық тығыздығының реттелуі арқылы жүзеге асырылады. Онда фотоэлектр элементі болады, ол суспензияның, яғни лайлануын бақылайды, соның арқасында клеткалардың өсуі автоматтық жолмен берілетін жаңа қ.о.мен реттеледі. Хемостат және турбидостат ережесімен өсіру тәсілдері клеткалар популяциясын өсу күйінде тұрақтандыру үшін және оны ұзақ сақтау үшін қолданылады. Бұл өсіру әдістері клеткалардың өсуі мен метаболизміне әр түрлі факторлардың әсерін стандартты жағдайда зерттеу үшін өте құнды тәсілдер болып табылады [25].
1.7 In vitro жағдайында өсірілетін өсімдік клеткаларынан каучукты (изопреноид) бөліп алу әдістері
Табиғи каучук алу технологиясы:
1. Сілтілік әдіс. 3 этаптан тұрады:
1) 2% NaOH арқылы сілтілендіру;
2) Суда уату;
3) Будың көмегімен резиналық қалыпқа келтіру.
2. Центрифугалау әдісі. 3 сатылы:
1) Тегістеу;
2) Микробиологиялық ферментация;
3) Центрифугалау.
3. Эскью әдісі: фрезерлік тастарды суға салып кейін центрифугалауға негізделген. 1949 жылы пайда болған [15].
Эскью әдісі арқылы тау-сағыздың тамырынан табиғи каучук алуға болады. Ең алдымен өсімдікті біраз уақыт ауада кептіреді. Кейін кальций құрамында бар сода 0,1% ертіндісі көмегімен сілтілендіреді. Қалған бөлігінен арнайы шар тәрізді ұсақтағыш аппараттан өткізіп "құрт" тәрізді каучук түзілгенше өткізеді. Целлюлоза және т.б. қосылыстардан айыру үшін жуып, флотациялайды. Флотацияны пульпа қоректік ортасында жүргізеді. Кейін каучук алынады [13].
4. Еріткіш әдісі: 3% каучук еріткіште және жарылғыш заттар пайдаланылады. Эмульсиялық каучукты бөліп алу органикалық коагулянт қолдану арқылы жүзеге асады. Коагулянт ретінде фенол конденсация өнімдері (NHn(CH2-CH(R)-OH)m немесе N(CH2-CH(R)-OH)3), полигексаметиленгуанидингидрохлорид (метацид) т.б қолданылады. Каучук бөліп алу сусыз дегазация арқылы да алынады. Полимеризат 20% сополимерден тұрады. Ол горизонталь конденсаторға түседі де жоғары температурада қыздырылады. Сусыз жағдайда каучукты бөліп алу улкен артықшылықтарға ие. Себебі кептіру процесіне қажет көптеген қондырғыларды қажет етпейді, нәтижесінде аз шығын жұмсалады.
Каучукты вулканизациялау негізгі сатылардың бірі болып табылады. Табиғи каучуктың вулканизациялаушы агенті: күкірт . Бұл процесті ары қарай үдету мақсатында 2-меркаптобензтиазол (каптакс), сантокюр, дибензтиазолилдисульфид (альтакс), тетраметилтиурамдисульфид (тиурам) және т.б.
... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР
6
КІРІСПЕ
7
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
9
1
ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
9
1.1
Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) өсімдігінің биологиялық ерекшеліктері
9
1.2
Каучук түзуші тау-сағыздың биосинтетикалық қасиеттері, изопреноид синтезі
13
1.3
Тау-сағызды вегетативті және микроклонды көбейту
18
1.4
микроклонды көбейту әдістері
19
1.5
Микроклонды көбейту технологиясының кезеңдері
21
1.6
Суспензиялық культураны алу
22
1.7
In vitro жағдайында өсірілетін өсімдік клеткаларынан каучукты бөліп алу әдістері
26
2
зерттеу МАТЕРИАЛДАРЫ мен әдістері
29
2.1
Зерттеу объектісі
30
2.2
Зерттеу әдістері
30
3
ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ ЖӘНЕ ОЛАРДЫ ТАЛҚЫЛАУ
36
3.1
Өсімдік материалын залалсыздандыру режимінің оптимизациясы
36
3.1.1
Экспланттарды залалсыздандыру және асептикалық культураны алу
36
3.2
Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдігінің формаларын in vitro дақылдау. Тау-сағыздың жапырақ және тамыр экспланттары үшін оптималды қоректік орта құрамын анықтау
40
3.3
Тау-сағыздың залалсызданған тұқым материалынан in vitro асептикалық өскіндер алу
41
3.4
Тау-сағыз клетка культурасындағы каллусогенез процесі
45
ҚОРЫТЫНДЫ
53
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ
55
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН СӨЗДЕР
6-БАП - 6 -Бензиламинопурин
2,4-Д - 2,4- Дихлорфеноксисірке қышқылы
ИСҚ - Индолилсірке қышқылы
НСҚ - Нафтилсірке қышқылы
КІРІСПЕ
Тақырыптың өзектілігі: Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) күрделігүлділер тұқымдасы (Asteraceae) - Тянь-Шань ареалындағы жойылып бара жатқан эндемик өсімдік. Өте маңызды техникалық өсімдік, қоңыржай аймақтағы табиғи каучукқа ең бай шикізат көзі [1, 3].
Қазіргі таңда 80% әлемдік синтетикалық каучук бутадиен және изопреннен жасалады. 20% химиялық синтез арқылы стирол, хлоропрен, этилен және басқа да полимерден жасалады. Табиғи каучук 20% құрайды. Латекс (цис-1,4-полиизопрен) - каучук негізі. 2000 өсімдікте синтезделеді. Ол өндірістік масштабта Индонезия, Малайзия, Вьетнам елдерінде плантациялардан алынады. Табиғи каучук медицина, автомобиль шинасын жасауда, соның ішінде үлкен жүк тасушы және спорттық машиналарға қолданылады, себебі табиғи каучук синтетикалыққа қарағанда берік болып табылады. Табиғи каучукқа сұраныс артуы жаңа альтернативті көздер іздеуге себеп болды.
Қаратау каучукқа ең бай өсімдік - тау-сағыздың (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) Қазақстандағы табиғи өсетін аймағы [1].
Тау-сағыз өсімдігінің саны соғыс жылдары күрт төмендеді, себебі 1,4 млн өсімдік қазылып алынған болатын. Қазіргі таңда тау-сағыздың қоры қайта қалпына келу үстінде.
Тау-сағыз өсімдігінің ең құнды екенін ескере отырып, қандай да бір жоюшы фактор немесе өсуін тоқтататын шаралар мемлекетпен қудаланылады [2, 3].
Ғылыми жаңалығы: Тау-сағыз өсімдігінің жапырақ және тамыр эксплантарының дақылдануы үшін залалсыздандыру әдісін жетілдіру маңызды болып табылады. Зерттелген залалсыздандыратын агенттердің арасында ең тиімді 0,1% сулема және 70 % этанол екендігі анықталды. Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдіктерін in vitro культураға енгізу және каллусогенезді оңтайландыру үшін 2,4-Д, кинетин, БАП, ИСҚ фитогормондарының әртүрлі концентрациялары бар Мурасиге-Скуг (МС) және Гамборга-Эвелега В5 (В5) қоректік орталары қолданылды. 0,1% тиомочевинамен алдын ала өндеу және стратификациядан кейін төмен өну қабілеті бар тұқымдарынан тау-сағыздың асептикалық өскіндерін алу мүмкіндігі анықталды.
Практикалық маңыздылығы: Бұл жұмыстың өзектілігі бірден тау-сағыздың (Scorzonera tau-saghyz) өсіп жатқан ареалындағы санының қайта қалпына келтіру проблемасын шешуде. Егілетін материалдардың аздығы, Қазақстанда оларды өсіретін саябақтардың жоқ болуына байланысты маңызды культураны өсіру мен технологияларды дамыту негізгі өзекті мәселе болып табылады. Осыған орай жылдам көбейтудің альтернативті технологиясын жасау, соның ішінде микроклонды көбейту технологиясын дамыту коммерциялизацияландыруда маңызды болып табылады.
Зерттеу жұмысының мақсаты: Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдігін микроклонды көбейту үшін культивирлеудің оптималды жағдайларын анықтау.
Жұмыстың міндеттері:
1. Жабайы өсетін тау-сағыз өсімдігінің формаларын in vitro культурасына енгізу;
2. Тау-сағыз экспланттарын залалсыздандыру жағдайларын оптимизациялау;
3. Тау-сағыз клетка культурасы үшін қоректік орта құрамын оптимизациялау;
4. Микроклонды көбейту үшін тау-сағыздың асептикалық өскіндерін алу және оларды қалемшелеу.
Зерттеу объектісі:
Қаратау таулары аймағында өсетін Scorzonera tau-saghyz Lipsch. et Bosse жабайы өсетін эндемик өсімдіктердің түрлері; эксплант ретінде - 2-жылдық өсімдіктердің жапырақ сегменттері және тамыр сегменттері қолданылды.
Зерттеу әдістері:
* Залалсыздандыру әдісі: залалсыздандырушы агенттер ретінде 50% Na гипохлориді, калий перманганаты, асқын тотығы, 70% этанол, 0,1% сулема пайдаланылды;
* Микроклондық көбейту әдісі: жапырақ, тамыр экспланттарынан пайда болған регенеранттарын және асептикалық өсімдіктерінен алынған микроқалемшелерін 16 сағаттық фотопериодта, 25+-2º С температурада, 60% ылғалды жағдайларында өсіру;
* Статистикалық талдау әдісі.
"Жоғары дәрежеде табиғи каучук бар тау-сағыз өсімдігінің сорттарын алу мақсатында микроклонды көбейту әдісін жетілдіру" ғылыми жобасы бойынша жұмыс жүргізілді.
НЕГІЗГІ БӨЛІМ
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1 Тау-сағыз өсімдігінің биологиялық ерекшеліктері
Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz) - күрделігүлділер тұқымдасына жататын көпжылдық өсімдік. Көпжылдық кейде 2 жылдық шөптекті және бұта тәрізді болып келеді, 170 түрі бар. Шөлейтті өңірлерде, соның ішінде көбіне Орта Европа және Шығыс Азияда өседі. Жуандаған жер асты мүшелері жеуге жарамды түрлері кездеседі, мысалы S.turberosa, S.hispanica. Европа мен Америкаға көкөніс ретінде өсіріледі. Ең маңыздысы тау-сағыз өсімдігінің тамырында каучук болатыны анықталған. Біржылдық тау-сағыздың тамырында 5-6% каучук, 2 жылдықта 9-10 % , 3 жылдық 12-15 %. Көпжылдық өсімдік тамырының диаметрі 10см - ге жетеді, ал ұзындығы 4 м, биіктігі 25-40 см [2].
Ғылыми классификациясы:
Бөлім: Жабық тұқымды гүлділер
Класс: Қосжарнақтылар
Тұқымдас: Астрагүлділер
Туыс: Астрагүлділер
Түр: Тау-сағыз (Scorzonera tau-saghyz, Lipsch. et Bosse) [3].
Сыртқы түрі жартылай бұта түріндегі қысқа, жуан тамыр сабақтан тұрады (каудекс). Каудекс соңы бір немесе бірнеше астық тұқымдас өсімдігіне ұқсас біркелкі жапырақшалармен аяқталады. 1-4 гүл тостағаншасынан тұрады. Гүл шоғыры көптеген сары күлтешелерден (30-40) тұрады. Пісіп жетілген бақбақ өсімдігіне тән шар тәрізді болып, желмен жеңіл таралады. Тұқым - цилиндрлі, қабырғалы, үстіңгі бөлігінде ұшуға қабілетті айдары бар, ақ өскіншелермен.
Табиғи жағдайда өсімдік тұқыммен ғана емес, вегетативті жолмен сабақ пен тамырдың өскіндерімен көбееді. Вегетация уақыты ұзақ емеc −3-3,5 ай. Табиғи жағдайда 3 жылы ғана гүлдейді. Гүлдеу мамыр- маусым аралығында, ал шілде - тамыз аралығында аз мөлшерде жеміс түзеді. Вегетация кезінде өсімдік биомассаны аз түзеді. Культуральды жағдайда тау-сағыз салыстырмалы тез өседі, 2 жылы гүлдей береді. Тұқымның қалыпты өсуі топырақтың 20-25°С температурасында жүзеге асады. Егер 9°С - дан төмен болса, олар өспейді және 25°С-дан жоғары температурада өсу қабілеті төмендейді. Тұқымдар өнуі үшін жылумен қатар, топырақтың беткі қабаты жақсы ылғалданған болу керек. Сондықтан суарып отыру қажет. Егер аталған жағдайлар жасалған болса, тау-сағыздың өскіндері 5-6 күннен соң шығады.
Өскіндер 2 жапырақшадан тұратын ұзынша формада болады. 7-10 күнде өскінде нағыз жапырақтар пайда болады. Олардың өсуі келесі жаздың маусымы мен шілдесіне дейін жалғасады. Жаздың ыстық температурасында жапырақ өсуі тоқтатылып, ескілері шіріп кетеді, ал өсімдік жаздық тыныштыққа көшеді. Келесі жапырақ өсуі қыркүйектен басталады [3].
1 жылда тау-сағыз тамыры 1 м дейін өседі. 1 жылдық тамырдың салмағы орташа 2,5-5 г болады. Ал каучук құрғақ салмағының 3-7 % алады [6].
Тау-сағыздың вегетация уақыты 2 жылы көктемде басталады. 2 жылы тамырдың өсуі қарқынды жүреді және массасы 8-20 г жетеді. Кей жағдайда 40-80 г, ал каучук түзуі 7-12 % өседі.3 жылы өсімдік гүлдей бастайды. Тұқымның 1 га жерден жиналғаны 15-60 кг құрайды. 1 га 30-35 ц тамыр, соның ішінде 15-20% каучук құрғақ массасын құрайды, яғни 150-250 кг каучук [3] (Сурет 1).
Cурет 1. Scorzonera tau-saghyz
Каучук тамырының өзегінде және жер асты бұтақшаларында салыстырмалы көп мөлшерде болады. Табиғи каучукты алу үшін тау-сағыздың құрғақ тамырларын пайдаланады. Тамыр 40 % өнімнен тұрады. Өсімдікті 1929 жылы С.С.Зарецкий Қаратау өңірінен тапқан. Бұл өсімдік бұрыннан жергілікті тұрғындарға таныс еді. Егер тау-сағыздың тамырын бөлсе, каучуктың созылмалы жіпшелерін көруге болады. Каучук сонымен қатар тамырдан ғана емес, каудекстен және жапырақтан да анықталған [6].
Жапырақта басқа органдарға қарағанда каучук аз мөлшерде болады. Сабақта каучук түзетін глобуллалар орналасады. Әр түрлі жастағы өсімдіктердің глобула формасы мен өлшемі әр түрлі. Өсімдік жасы өскен сайын мүшелері үлкейіп, формасы ұзарады. Соған байланысты өсімдікте өзектегі каучук мөлшері өзгереді. Егер 1 жылдықта 1-8% каучук болса, 2-3 жылдықта 8-30 % каучук мөлшері болады [3].
Қазіргі кезде тау-сағыз "Қызыл кітапқа" енген. Бұл антропогендік фактор әсерінен болған, яғни соғыс жылдары 14 млн. өсімдік алынып пайдаланған. Кейін оның табиғи қоры толуы үшін ұзақ уакыт керек. Себебі өсімдіктен тұқымның түзілуі 3-4 - ші жылы ғана жүреді және жас кезінде өскіндердің өлімі көп кездеседі. Тау- сағыз сол аймақта өсетін басқа өсімдіктерге қарағанда бәсекеге төмен болып табылады [1].
Өсетін аймағын интенсивті түрде басқа өсімдіктер қамтуы тау-сағыздың жойылуына себеп болып табылады. Сырдарияның Қаратау тауларынан алғаш тау- сағыз табылған, содан бері геологиялық процестер жүргізіліп, топырақта түрлі өзгерістер болған. Бұл да өз әсерін тигізді, яғни шөл және шөлейтті аймақта өсетін өсімдіктің өсуін шектейді.
Топырақ өзгеруіне байланысты көптеген өсімдіктер тау-сағыздың өсетін аймағын кішірейтуде. Төмен бәсекелестігіне байланысты тау-сағыз өсімдігі саны азаюда [7].
Көптеген болжамдарға қарамастан табиғи каучук өндіру даму үстінде. 1963 жылы 2,17 млн. тонна, 1973- 3,45, ал 1981 жылы - 4 млн. тонна каучук өндірілді. Қазіргі таңда табиғи каучук өндіру ақталады. Төмен бағамен сатылса да, тиімді болып табылады. Табиғи каучуктың әлемдік нарықта бағасы синтетикалық полиизопренді каучуктың бағасына қарағанда төмен. Қазіргі таңда бағалы заттар өндіруде биотехнологиялық және гендік инженериялық әдістер қолдану арқылы табиғи каучукты тау-сағыз өсімдігінен өндіруге әбден болады [2].
Вегетативті көбею бұл өсімдіктің белгілі бір мүшелерінен, яғни тамыр немесе сабақтың бөлігінің дифференциациясы арқылы жыныссыз жолмен көбею процесі. Жабық тұқымды өсімдіктердің ішінде вегетативті жолмен көбінесе құлпынай, тау-сағыз, раушан, батат т.б өсімдіктер көбееді. Тау-сағыз өсімдігінің негізгі көбею жолы - вегетативті тамыр арқылы [21]
Клеткалық және гендік инженерия әдістері көмегімен, мысалы, тау-сағыздың каучук синтездейтін гені бақбақ өсімдігіне енгізуге болады. Бақбақ та өз алдына каучук синтездеуге қабілетті деп саналады. Бұл қол жетімді, бірақ бұл әдісті қолдану үшін тау-сағыздың барлық генетикалық әртүрлілігін және генетикалық картаны анықтау керек [5].
Қаратау аймағының табиғи жағдайларында тау-сағыздың 6 түрі табылған болатын. Олар ауылшаруашылықта пайдасы зор. Ең маңыздылары Қайнар-бастау аймағында өсетін тау-сағыз түрлері. Олардың бір-бірінен айырмашылығы жапырақ және гүлінің формасында.
Қайнар- бастау тау-сағызының жапырағы ұсақ және гүлі бүршіктелген тәріздес, сүтті жолы ақ түсті болып табылады. Басқа түрлерден айырмашылығы тез өну қабелеттілігінде. Екінші жылда өсімдіктің 5 % және 10% гүдей бастайды. Үшінші жылда гүлдеу 50%, ал тұқым өнімі 60 кг жетеді. Тамыры жақсы жетілген болып келеді.
Желаған-ата тау-сағыз түрі жуан жапырақтарымен ерекшеленеді. Гүлдері ұсақ. Дақылдау барысында бұл сорт жай өну қабілетіне ие екені анықталды. Төртінші жылы гүлдеу 20% ғана құрайды, ал тұқым өнімі 10-15 кг құрайды.
Леонтьевка тау-сағыз жуан лацентті жапырақ типіне ие. Гүлі жуан, сүтті жолы сары-жасыл түсті. Кеш пісіп жетіледі, үшінші жылы гүлдеу 10-15% құрайды [6].
Тау-сағыз өсімдігінің өсуі үшін органикалық массаға бай және құнарлы топырақ болу қажет. Негізгі топырақ дайындау оптимальді жағдайларды қарастыру сатысынан тұрады. Топарқты әртүрлі зиянкестерден тазарту керек.
Тау-сағыз көпжылдық өсімдік болғандықтан топыраққа мына заттардың қажет мөлшерде себілуі өте маңызды болып табылады: аммоний сульфаттары, суперфосфат, калий тұздары т.б.
Тамыр жүйесі жақсы жетілуі маңызды болғандықтан минералды тыңайтқыштар маңызды рөл атқарады. Тыңайтқыштарды күзде сепкен өте тиімді болып табылады. Азотты тыңайтқыштарды көктемде сепкен тиімді.
Тау-сағыз өсімдігі өну үшін жеткілікті дәрежеде бақылануда болу керек. Ол үшін өсудің бірінші жылында ылғал көп мөлшерде болу маңызды. Сондықтан суаруды 8-10 рет жүргізу керек. Көктем және жаз айларында көп мөлшерде суару жүргізіледі, ал қыс айларында минимум дәрежеде жүзеге асырылу қажет [9].
Тау-сағыздың тұқым түзуі үшінші жылы жүзеге асады. Тұқым пісіп жетілуі 5 сатыдан тұрады. Тұқымның түзілуі 3-4 - ші жылы ғана жүреді және жас кезінде өскіндердің өлімі көп кездеседі. Тау- сағыз сол аймақта өсетін басқа өсімдіктерге қарағанда бәсекеге төмен болып табылады Тұқымдарды жинаған кезде ең соңғы сатыдағы екеніне көңіл аудару керек. Яғни толықтай өнген тұқым болуы өте маңызды. Тау-сағыз тұқымдары қолмен жиналады. Кейін олар толықтай кебу керек, ол үшін белгілі уақыт оларды кептіреді. Тұқымдар өнуі үшін жылумен қатар, топырақтың беткі қабаты жақсы ылғалданған болу керек. Сондықтан суарып отыру қажет. Егер аталған жағдайлар жасалған болса, тау-сағыздың өскіндері 5-6 күннен соң шығады.
Тау-сағыз тамырларын жинау 3-4 жылдары жүзеге асады. Жаздық тыныштық қалыпқа көшкен кезге дейін. Тамырларын жинамас бұрын өсімдікті көп мөлшерде суару керек. Кейін тамырларды кетіру қажет. Оны ауада жүргізеді [5]
Тау-сағыз өсімдігінің таралу аймақтары: Қазақстан: Сырдария, Қаратау, Машат, Даубаба, Тәжікстан: Фан таулары, Өзбекстан: Ферғана солтүстігі, Қырғызстан: Талас Алатауы, Шатқал тауы, Түркістан қыраты, Исфир бассейні. Орта Азияның эндемик өсімдігі, Батыс Тянь-Шань, Қаратау, Тамир Алтайдың төмен немесе таулы, қыратты жерлерінде өседі [3].
Тау-сағыз өсімдігінің саны соғыс жылдары күрт азайды, сол кезде 14 млн. өсімдік қазып алынды. Қазіргі кезде жайлап қайта қалпына келуде.
Табиғи таралуының негізгі шектеуші факторы: төмен бәсекеге қабілеттілік, тұқымның ұзақ уақыт пайда болуы, геологиялық жұмыстар, малға азық болуы, каучук түзуші ретінде көп қолданылуы [9].
1.2 Каучук түзуші тау-сағыздың биосинтетикалық қасиеттері, изопреноид синтезі
Каучуктың полиизопреноидының түзілуі клетка паренхимасында жүзеге асады. Алдымен каучуктың бөлігі цитоплазмада, кейін вакуольде түзіледі. Каучуктың бастамасы қант, ацетат, пируват, мевалонат болып табылады. Каучук - эмперикалық формуласы С5Н8, изопреннің полимердену өнімі мен молекулалық массасының алуан түрлі спектрінен тұрады. 105-4x105 дейін, бұл 1500-60000 полимерге эквивалентті [9]. Изопреноид көмірсуларының атомдары пируваттың декарбоксильденуі нәтижесінде ацетаттан түзіледі. (Сурет 2).
Сурет 2. Каучук биосинтезі
Көміртегінің екі атомы бар ацетат молекуласы ацетаттың үш молекуласының конденсациясы мен бір атом көміртегінің бөлінуінен С5 молекуланы изопренге айналдырады
Изопреноидтар - көміртегі атомдарының тобынан тұратын табиғи қосылыс. Изопрендер терпен және олардың туындылары стероидтар , полиизопреноидтарға бөлінеді.Тірі организмдерде изопреноидтар сірке қышқылынан түзіледі. Изопреноидтарға каротиноид, мысалы витмин А, феромондар, каучук, ювенильді гормондар, гуттаперча жатады [22].
Келесі кезең үш молекула ацетаттың қосылып бұтақталған тізбек түзуі ацетил коферменті қатысымен жүреді. Келесі кезең мевалонатқа айналудан тұрады. Кейін мевалонаттың фосфорилденуі жүреді. Сол кезде пирофосфатмевалонат түзіледі [8].
Пирофосфатмевалонат ең негізгі изопреноид метаболизмінің реакциясына қатысады. Ол изопентилпирофосфат пайда болуы. Терпендердің, сесквитерпендердің және жоғарғы изопреноидтардың изопентилпирофосфаттан түзілуі цис-1,4- полиизопентилтрансфераза көмегімен изопентилпирофосфат қалдығының ұзарған изопреноид тізбегіне қосылуы нәтижесінде пайда болады. Бұндай полимеризация әдісі изопреноид синтезінің негізі болып табылады
Бұл әдіс арқылы каучук түзілуі фруктозадан 1-0-метил- L-инозитол арқылы алуға болады. Каучук синтезінің жылдамдығы көптеген жағдайларға байланысты. Мысалы, Гевея ағаш Hevea brasiliensis латексінде ол 5 мг. Судың жеткіліксіз болуы каучук түзілуін арттырады. Каучук синтезін сонымен қоса, этилен де стимулдейді [8].
Сүттіген шырынының кей бөліктерінде каучук емес, тритерпеноидтарды эфирлер болады. Латексте терпеноидтар және терпеноидты спирттер де болады. Бұл дезинфицирлеуге қабілеттілігін арттырады. Терпеноидтармен қатар латекстен басқа да қосылыстар анықталған. Вакуольде мекон және хелидон қышқылы, фенол болады (Сурет 3).
Сурет 3. Латекстегі хелидон (1) және мекон (2) қышқылы
Ең кең таралған амин қышқылы 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА). Латексте ДОФА 1,7% құрайды. Қорғаныш қызметін сүттіген шырынында лизоцим белоктары атқарады. Олар бактериалды полисахаридтік байланысты гидролиздейді [8] (Сурет 4).
Сурет 4. Изопреннің түзілу жолы
Латекс - (англ. latex, нем. Latex m, Kautschukmilch f) сулы ерітіндідегі дисперсті полимерлі заттардан тұратын эмульсия. Табиғатты өсімдіктің сүтті жолынан бөлінеді, соның ішінде бразилиялық гевея және бақбақ өсімдіктерінде т.б (Сурет 5, Кесте 1 ).
Кесте 1
Каучук түзуші өсімдіктердегі латекстің құрамы
Құрамындағы заттар
Өсімдік (%)
Гевея
Asclepias
Тау-сағыз
Су
70
70
51 - 64
Минералды заттар
0,26
1,4
--
Қанттар
0,79
4,0
--
Шайыр
1,22
23,6
1,3 - 3,4
Каучук
27,1
3,4
30,0 - 44,6
Азот
0,24
0,46
--
Сурет 5. Өсімдік кесіндісінен бөлінген латекс
Латекс құрамында коллоидты каучукты бөлшектер (глобула), беттік активті заттар эмульгаторлар болады. Латекстегі глобулалар ионогенді беттік-активті заттар арқылы тұрақтанған, көбінесе анион типті ионогендермен. Латекс полидиперсті жүйе. Алғашқы латекс глобуласының диаметрі 10-200 нм құрайды. Өндірістік масштабта әртүрлі мысалы, изопренді, бутадиенді, акрилді, карбоксилатты латекстер қолданылады [35].
Каучукты латекстен бөліп алу үшін форманы тұз ертіндісі бар ертіндіге салып, мысалы, хлорлы кальция бар. Ертінді құрамында оң зарядталған металл бөлшектері - катиондар бар. Латексті ертіндіге салған кезде катиондар диффундирленеді. Латекс құрамындағы теріс зарядталған бөлшектермен соқтығысқан соң оң зарядталған бөлшектер оларды зарядынан айырады. Каучук бөлшектері ертіндіде тұнба түзеді.
Табиғи латексті тек концентрленген күйде ғана қолданады. Табиғи латекстен жасалған заттар салқын температураға тұрақты (- 67°), жоғары физико-химиялық қасиет көрсетеді. Вулканизацияланған пленкалар 200 -- 350 кгсм2 құрайды.
Ең маңызды латекс қолданылатын сала болып адгезивтер түзу болып табылады. Ол шина, транспортерлік жіптер т.б жасауда маңызы зор. Басқа да мақсатта қолданылады: мата жасауда, фрикционды заттар жасауда, қағаз өндірісінде, тері өндеуде, электротехникада, жол құрылысында т.б салаларда кеңінен қолданылады [42].
Каучук - жоғары молекулалы көмірсутегі, эмпирикалық формуласы С5Н8. Құрылымдық жағынан изопрен полимерлену өнімі болып табылады. (Сурет 6).
Cурет 6. Каучуктың формуласы
Каучук бензолда, петролейндік эфирде, күкіртті эфирде ериді, бірақ ацетон және спиртте ерімейді. Каучук молекулалық массасы әртүрлі гомологты полимерлердің қоспасы. Каучук әртүрлі өсімдік тканьдерінде жиналуы мүмкін. Клетка паренхимасында түзіледі. Тау-сағыз, көк-сағыз, гевея сияқты өсімдіктерде көп мөлшерде жинақталады [14].
Өсімдіктегі сүтті жолда активті ферменттер көп мөлшерде болады. Олар протеолиттік және тотығу ферменттері. Ферменттердің көп болуы каучук биосинтезімен тығыз байланысты. Сүтті жолда каучук микроскопиялық бөлшек түрінде болады (глобула).
Латекстегі каучук мөлшері әр өсімдікте әртүрлі формада болып келеді. Каучук глобулаларының сырты жіңішке белокты қабықпен қапталған.
Каучук биосинтезіне тоқталар болсақ, қазіргі кезде зерттеулерге қарағанда каучук өсімдік ұлпалары бойымен жылжуға қабілетсіз. Сондықтан каучук жинақталатын өсімдік мүшелері биосинтез жүретін негізгі орын екені анықталды. Каучук биосинтезі үшін алғы зат көмірсулар және олардың туындылары саналады. Мысалы, тау-сағыз өсімдігінің тамырында жиналатын каучук түзілуінің алғы заты қант екені анықталды [23].
Ацетат, яғни ацетил қалдығы CH3CO- каучук биосинтезі үшін қажет негізгі зат болып табылады. Каучук және гутта биосинтезі каротиноидтар және терпендердің синтезімен тығыз байланысты. Бұл қосылыстардың барлығы өсімдікте А коферменті қатысуымен активті ацетилден түзіледі.
Табиғи каучук эластомерлер тобына жатады. Көптеген жылдар бойы табиғи каучук техникалық маңызы зор материал болып келеді.
Өсімдіктерде каучуктың түзілуі.
Табиғи каучук көп сатылы биохимиялық процестердің соңғы өнімі. Бұл процесс көптеген ферменттер арқылы жүзеге асырылады. Негізгі сатысын хроматографиялық анализ арқылы анықтауға болады. Каучуктың өсімдікте түзілуіне әртүрлі сыртқы орта факторлары да әсер етуі мүмкін. Сірке қышқылының болуы каучук түзілуін арттыратыны анықталынды [9].
1.3 Тау-сағызды вегетативті және микроклонды көбейту
Табиғи жағдайда тұқымға қарағанда көбінесе вегетативті жолмен көбейеді. Культурада тау-сағыздың тұқым арқылы көбеюі қарастырылады. Вегетативті көбею тамыр бөлігі арқылы жүзеге асырылады. Зерттеулерге қарағанда, тау-сағыз тамырынан ұзындығы 0,5 см жаңа өсімдік түзілетіні анықталған. Академик Лысенко бұл қасиетті қолданып тау-сағыздың тез өсуін қамтамассыз ету үшін қолданған [9].
Вегетативті көбею бұл өсімдіктің белгілі бір мүшелерінен, яғни тамыр немесе сабақтың бөлігінің дифференциациясы арқылы жыныссыз жолмен көбею процесі. Жабық тұқымды өсімдіктердің ішінде вегетативті жолмен көбінесе құлпынай, тау-сағыз, раушан, батат т.б өсімдіктер көбееді. Тау-сағыз өсімдігінің негізгі көбею жолы - вегетативті тамыр арқылы.
Клон деген жыныссыз жолмен, яғги вегетативтік көбею жолымен, түзілетін организм. Өсімдіктердің клондық микрокобеюі деген өсімдіктердің in vitro жағдайында жыныссыз жолмен көбеюі. Соның нәтижесінде пайда болған өсімдіктер бастапқы өсімдікпен және өзара бір-бірімен генетикалық тұрғыдан айнымастай бірдей болады. Клондық микрокөбейтудің мынадай артықшылықтары айтарлықтай жоғары: мысалы көбею коэффициенті өте жоғары, микрокөбеюмен қатар өсімдіктер вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтырылады, сұрыптау процесін жылдамдатылады, Жаңа сорттарды тез көбейтеді, вегетативтік жолмен көбейе алмайтын өсімдіктерді көбейтуге болады, үнемділік арнайы бөлмеде стеллаждарда орналасқан пробиркаларда жыл бойы мыңдаған өсімдіктерді қсіру арқылы теплицалар алаңы үнемделеді.
Клондық микрокөбейтудің түрлі әдістерін ғалымдар өтетін морфогенездің өзгешеліктеріне қарай жіктеді. Н.В. Катаева мен Р.Г. Бутенко былай жіктеуді ұсынады. Бірінші типті өсімдіктер бүтін өсімдікте бұрыннан боған меристемаларды (сабақтың апексі, қолтық және бұйыққан бүршіктері) активтендіру жолымен пайда болады. Екінші типті өсімдіктер in vitro жағдайында пайда болған бүршіктер мен эмбриоидтардан алынады.
Микроклонды көбейтудің мынадай артықшылықтыры:
1) Көбею коэффиценті өте жоғары (шөптектес өсімдіктерде бұталарда, ағаштарда, қылқан жапырақтыларда). Мысалы, гербера, бүлдірген, бақытгүл, раушанның бір өсімдігінен in vitro жағдайында бір жылдың ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер алуға болады. Алма ағашының бір бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мыңнан астам өркен шығады. Таңқурайдың бір бұтағы меристемаларын бөліп алып өсіріп жылына 50 мыңға дейін өсімдік алуға болады. Сонымен микроклоналды көбейтудің коэффиценті басқа вегетативтік көбею әдістерімен салыстырғанда мыңдаған есе артық.
2) Микроконалды көбейтумен қатар өсімдіктер вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтырылады.
3) Сұрыптау процесін жылдамдату. Жаңа сорттарды тез көбейтіп, оларды ауылшаруашылық өндірісінде пайдалану мерзімі едәуір қысқарады.
4) Вегетативтік жолмен көбейе алмайтын өсімдіктерді, мысалы, пальманы тек in vitro жағдайында көбейтуге болады. Осы әдіспен өнеркәсіп деңгейінде бірқатар өсімдіктерді көбейтеді.
5) Үнемділік. Арнайы бөлмеде стеллаждарда орналасқан пробиркаларда жыл бойы мыңдаған өсімдіктерді өсіру арқылы жылыжайлар алаңы үнемделеді.
6) Жас өсімдіктерді алу, яғни кәрі дарақтарды жасарту.
7) Өсу процесін жыл бойы үзбеуге болады, әсіресе бұл дамуында тыныштық кезеңі болатын өсімдіктерді көбейтуге тиімді [10].
1.4 Микроклонды көбейту әдістері
Микроклонды көбейтудің түрлі әдістерін ғалымдар ол кезде өтетін морфогенездің өзгешеліктеріне қарай жіктейді. Н.В. Катаева мен Р.Г. Бутенко былай жіктеуді ұсынады:
а) бұрыннан болған меристемалардан өскен өсімдіктер;
б) жаңадан пайда болған меристемалардан өскен өсімдіктер [11].
Бірінші типті өсімдіктер бүтін өсімдікте бұрыннан болған меристемаларды сабақтың апексі, қолтық пен тыныштық күйіндегі бүршіктерді активтендіру жолымен пайда болады. Бұл меристемадан шыққан өсімдіктер генетикалық жағынан аналық өсімдікпен пара пар, өйткені апекстерді in vitro жағдайында өсіргенде олар генетикалық тұрақтылығын сақтайды. Өсімдіктердің меристемалары in vivo жағдайында үздіксіз белсенді пролиферациялық күйде болады. Олардың генетикалық тұрақтылығы
ДНҚ- ның репарация жүйесінің активтілігі жоғары болғандықтан және де өзгерген клеткалардың вегативтік сұрыпталуына байланысты (Сурет 7).
Сурет 7. Алманың төбе бүршігінің көлденең кесіндісі
M - апикальды меристема; Л - жапырақ
Екінші типті өсімдіктер in vitro жағдайында пайда болған бүршіктер мен эмбриондардан алынады. Бұл өсімдіктерде маманданған және каллус клеткаларынан шыққандығына байланысты генетикалық өзгергіштіктер орын алуы мүмкін. Сондықтан, шыққан клондар бастапқы өсімдіктен біршама ауытқып кете береді. Сөйтіп бұл әдіс тек каллустары тұрақты немесе регенеранттарда пайда болған өзгерістер табиғи өзгергіштіктен аспайтын өсімдіктерге пайдалануға болады [].
Бүршіктер мен эмбриоидтар былай пайда болады:
1)Экспланттың маманданған клеткаларынан тікелей көбеймей мүшелерінің ұлпаларының, эпидермистен, субэпидермис ұлпаларынан, жапырақ мезофилінен т.б.
2) Экспланттан шыққан алғашқы каллустан
3) Көшіріп отырғызылған каллустан немсе суспензиядағы клеткалардан [11].
Қолтық бүршіктерін оятып, олардың дамуын қоздырып, олардан шыққан қолтық өркендерді пайдалану өсімдіктерді микрокөбейтудегі ең тараған әдіс. Бүтін өсімдікте қолтық бүршіктердің өсуін сабақ ұшындағы апекс тежейді. Қолтық меристемалардың өсуі сабақтың ұшын кесіп тастағанда немесе цитокинмен өңдеген соң басталады. Қоректік ортадағы цитокининдер жанама бүршіктердің жандануына әсер етеді және толып жатқан қолтық өркендердің дамуына әкеледі. Тез өсетін өркендердің шоғыры пайда болады, одан жеке өркендерді бөліп алып жаңа қоректік ортаға отырғызғанда, олар өсіп қайта шоғырланады. Бірақ барлық өркендерде тамыр пайда бола бермейді. Ал оларды цитокинині жоқ ортаға көшірсе, өзінен-өзі тамырлары өсіп шығады, әсіресе даражарнақты өсімдіктерде [24].
Қосалқы өркендердің экспланттан пайда болуы. Адвентивтік бүршіктердің эксплант ұлпаларынан тікелей пайда болуы өсімдіктердің лайықты жағдайда жетіспейтін мүшелерін қалпына келтіру қабілетіне негізделеді. Адвентивтік бүршіктерді өсімдіктердің қайсы болса да мүшелерінен және ұлпаларынан шығаруға болады, мысалы, бөліп алынған ұрықтан , жапырақтан, сабақтан, тұқым жарнағынан, пиязшықтың қыбыршағынан және түбіртегінен, тамыр бөлігінен, гүлшоғыры бастамасынан, т.б. [25].
Регенерант өсімдіктің каллустан пайда болуы. Микрокөбейтудің тағы бір көп таралған әдісі ол өсімдіктерді каллустан органогенез немесе эмбриоидогенез жолымен шығару. Морфогенездің басталуы қоректік ортадағы фитогормондардың ара қатысымен реттеледі. Органогенез арқылы регенерант өсімдіктерді алудың модельді жүйесі ретінде темекі бола алады. Қоректік ортада фитогормондардың концентрациясын өзгертіп отырып, каллустан немесе тікелей экспланттан өркендерді өсіруге болады. Мысалы, темекінің Nicotina tabacum мен N.occidentalis деген екі түрін бірі мен бірін будандастырғанда, будан ұрықтар түзілген. Бірақ бұлар табиғи жағдайда өне алмаған. Оларды in vitro өндіріп каллус алынды. Одан кейін каллуста сабақ бүршіктері мен тамырлардың пайда болуына жағдай туғызылады. Сөйтіп темекінің бағалы буданы көбейтіледі [26].
1.5 Микроклонды көбейту технологиясының кезеңдері
Клонды микрокөбейту технологиясын 4 сатыға бөлуге болады:
1) Донор - өсімдікті таңдап алу, экспланттарды бөлу және жақсы өсетін стерильді культураны алу.
2) Микрокөбею, яғни меристемалық клондар санының максималды дәрежеге жетуі;
3) Тамыр түзіп, ортаға адаптацияның қалыптасуы (+2°C, +10°C);
4) Жылыжайда өсімдіктерді өсіруі немесе егіс алқапта өсіруге дайындау [24].
Әр сатыда өзіндік қоректік орта қолданылуы керек.Сатыда стерильді, жақсы өсетін культура алу керек. Егер мүмкіндік болмаса қоректік ортаға антибиотик қосады (тетрациклин, бензилпеницилл) 100-200 мгл концентрацияда. Бұл сатыда Мурасиге -Скуг қоректік ортасы қолданылады және ауксин, цитокинин қосады.
Микрокөбею сатысында максимальды мөлшерде мериклондар алу мақсаты қойылады. МС ортасы қолданылады. Бұл сатыда цитокинин мен ауксиннің концентрацияда арақатынасы маңызды рөл атқарады. Цитокининнен БАП 1-10 мгл концентрация , ал ауксиннен ИСҚ және НСҚ концентрациясы 0,5 мгл қолданылады. Егер өсімікті цитокинин мөлшері жоғары қоректік ортада өсірсе өсімдіктің морфологиясының өзгеруіне алып келеді. Витрифицирленген бүршіктер түзілуі мүмкін. Минималды концентрацияда цитокинин бар қоректік ортада өсірілу керек [12].
Үшінші және төртінші сатыда микробүршіктердің тамырлануы және адаптация жүреді. Бұл сатыда қоректік орта Уайт ортасымен алмастырылады. Қант мөлшері 0,5-1% азаяды, цитокинин мүлдем қосылмайды, тек ауксин қосылады. β-индолил -3 май қышқылы, ИСҚ және НСҚ қосылады [25].
Микробүршіктердің тамырлануы екі әдіс арқылы жүргізіледі:
1. Микробүршіктерді ауксиннің стерильді концентрациялы ертіндісінде (20-50мгл) 2-24 сағат ұстайды, кейін гормонсыз агарозды ортаға көшіреді.
2. Микробүршіктердің 3-4 аптада кұрамында ауксин (1-5 мгл) аз концентрациясы бар қоректік ортада өсіру.
Регенерант- өсімдікті субстратқа отырғызу микроклонды көбейтудің ең маңызды сатысы болып табылады. Ол үшін көктем мен жаз ыңғайлы мезгіл болып есептеледі. Көпшілік өсімдіктерге субстрат ретінде топырақ , торф, пермет (1:1:1); торф, топырақ (3:1) қолданылады. Көшірілген өсімдіктерді жылыжайда 20-22°С температурада, 65-90% ылғалдылықта өсіреді [13].
Көптеген пайдалы өсімдіктер толып жатқан вирустар, бактериялар және саңырауқұлақтар қоздыратын ауруларға шалдығады. Соның зардабынан жыл сайын олардың өнімі төмендеп, сапасы нашарлайды. Клондық микрокөбейту кезінде стерильденген экспланттарды асептикалық жағдайда өсірудің арқасында өсімдіктер бактериялық және саңырауқұлақтық патогендерден сауықтырылады, бірақ сыртқы залалсыздандыру эксплантты вирустан тазарта алмайды.
1.6 Суспензиялық культураны алу
Суспензиялық культура дегеніміз - жеке немесе бір топ клеткалардың сұйық ортада өсірілуі. Химиялық заттар әсеріне ұшырату мүмкіндігі жеңіл гомогенді клетка популяциясын құрайды. Суспензиялық культура модельді жүйе ретінде, екінші реттік метаболизм жолдарын зерттеуде, ферменттер индукциясы және гендер экспрессиясы, бөгде қосылыстар деградациясы, цитологиялық зерттеулерде т.б. мақсаттарда қолданылады. Сұйық қоректік ортасы бар колбаға каллусты тканьді салу арқылы суспензиялы клетканы алады. Суспензияны арнайы араластырғыш аппарат көмегімен (100-120 айнмин) араластырады. Жаңа қоректік ортаға көшірер алдында каллустың үлкен агрегаттарынан 1-2 қабат марлі, нейлонды елеуіш көмегімен құтылады [14].
Суспензиялық культура модельді жүйе ретінде екінші реттік метаболиттерді зерттеуде, ферментер индукциясын зерттеуде, гендер экспрессиясына талдау жүргізгенде, бөгде қосылыстар деградациясын қарастырғанда және цитологиялық зерттеулер жүргізгенде кеңінен қолданылады [21].
Өсімдіктің жақсы линияларын алуда негізгі рөлді клеткалардың метаболизмге және жылдам көбеюге қабілеттілігі атқарады. Бұл линиялардың морфологиялық сипаттамасы:
* Дезагрегацияға жоғары қабілеттілігі;
* Клеткалардың морфологиялық біртектілігі;
* Трахеидтәрізді элементтердің болмауы.
Ең бірінші рет жаңа қоректік ортаға көшіргенде каллустың үлкен бөлшектерін және агрегаттарды алып, марлінің 1-2 орамы арқылы фильтрлейді. Суспензиялық культураны инициализациялау үшін 60-100мл сұйық ортаға 2-3 г жаңа каллусты культура клеткалары керек. Бірақ әр клетка культурасының линиясына төмен мөлшерде инокулят керек.
Суспензиялық клетка культурасындағы өсу дәрежесін бірнеше параметрлерге байланысты анықтауға болады:
1) Тұнбаға түскен клетка мөлшері. Суспензиялық культураның аздаған мөлшерін 15 мл пробиркаға алып центрифугалайды. Нәтижені пайыздық көрсеткішпен бағалайды;
2) Клетка саны. Фукс-Розенталь камерасында саналады;
3) Құрғақ массасы. Суспензиялық культураны ылғал фильтр арқылы фильтрлейді, клеткаларды дистелденген сумен жуып, суды вакуум арқылы сорып алады. Кейін құрғақ масса өлшенеді;
4) Белок мөлшеріне қарай талдау. Суспензиялық культураны фильтрде жинап, 70% этанол ертіндісімен екі реет жуып, ацетонмен кептіреді. Кейін Лоури әдісі арқылы белокты анықтайды;
5) Қоректік ортаның өткізгіштігі. Кондуктометр көмегімен анықталады;
6) Клеткалар өміршеңдігі. Цитоплазманың жылжуын микроскоп арқылы арнайы бояғыштар көмегімен (флюоресцеиндиацетат, соли тетразолия, синий Эванса) анықтайды. Алдын ала рн мөлшерін таңдап алады. Алынған нәтижелерге байланысты S-тәрізді формадағы өсу қисығын алады (Сурет 8).
Сурет 8. S- формалы өсу қисығы
Суспензия культурасының ерекшелігінің бірі жоғары тығыздығы, яғни клеткаларды культивирлеуде биомасса өскен сайын орта арта түседі. Ол адгезияға ұшыратады. Адгезия - клеткалардың бір-біріне жабысып, араластырғыш аппараттың жұмысына қиындық туғызады. Кейін көбік түзіледі. Ол биомассаның ары қарай дамуына кедергі келтіру мүмкін. Суспензиялы клетка культурасын екінші реттік метаболиттерді алу үшін қолданылады. Олар: өсімдік клеткаларында өндірілетін алкалоид, терпеноид, гликозид, полифенол, полисахарид, эфир майлары, пигменттер, антиканцерогендер (птотецин, харрингтонин), пептидтер (фитовирустардың ингибиторлары) [12].
Нәтижеден алынған өсу қисығы модельдегіден біршама өзгеше болуы мүмкін. Өсу қисығына популяцияның генетикалық сипаттамалары, инокулят саны, өсірілу жағдайлары (қоректік орта құрамы, рН көрсеткіші, араластыру жылдамдығы).Жылдамдықтың арасындағы дисбаланс әр сатыдағы өсімдіктің клеткаларының онтогенездік қабілетін сипаттайды.
Өсімдік клеткаларын кейінгі культивирленуі үшін микробиологиялық әдістер қолданылады.
Мерзімді өсіру - клеткаларды қоректік ортасы бар жабық ферментерға салады және оған қажетті жағдай енгізіп, нәтижесінде биомасса алады. Уақыт өту барысында клетканың популяция тығыздығы өсіп, қоректік орта концентрация азайып, оның пайдалы өнімдері төмендейді. Тұйық процесс болып табылады. Әр фаза өзінің физиологиялық параметрлерімен анықталады. Стацинарлы фаза өлу фазасына жақын. Нәрі біткеннен кейін мерзімді процесс тоқтайды. Бұл процесс барысында биомасса бөлінеді. Экономикалық жағынан тиімсіз. Культураны көп уақыт экспоненциалды ұстап тұру үшін жартылай мерзімді өсіру процесі қолданылады.
Жартылай мерзімді процесс мерзімді процестен айырмашылығы қоректік ортаға үнемі қосымша қоректік орта компоненттері қосылады да қадағаланып тұрады. Бұл экономикалық тиімді себебі, бұл процесс барысында биомасса жоғары [25].
Үздіксіз өсіру - экспоненциалды фаза тұрақты болып келеді. Культура жақсы өседі. Бұл процесс ескі қоректік орта жаңарып отырады. Ескісі бөлек шығарылады, дайын биомасса басқа ферментерға құйылып отырады. Экспоненциалды фаза үнемі сақталады. Автоматты реттеліп отырады. Үздіксіз өсіру кезінде қажетті жағдай тудыруда синхронды түрде клеткалар бөлінеді. 2-3 циклға дейін айналады. Үздіксіз жұмыс жасайтын аппараттардың батареясының негізгі артықшылығы жоғары өнімділікпен субстратты толық өңдеу, көп сатылы үрдістерде әртүрлі дақылдау режимін сақтауға қолайлы. Бірінші культиваторда режимдер орныққаннан кейін өсу процессі өтеді. Өскен культура биомассасы толыққан соң келесі ферментерға өтеді. Ескі қоректік орта басқа ферментерға төгіліп клетка культураларға жаңа қоректік ортаға келіп түседі. Экономикалық жағынан тиімді болып табылады.
Клеткаларды өсіру үшін эксплантты, қоректік ортаны, ыдыстарды, құрал-саймандарлы алдын ала залалсыздандыру қажет. Өсімдіктен эксплантты бөліп алуды және оны қоректік ортаға отырғызуды ламинар боксінде өткізеді. Әр түрлі тәсілмен залалсыздандырылған және дистилденген суда бірнеше мәрте жуылған объектілерден керекті ұлпалар бөлініп алынып оларды стирильденген қатты немесе сұйық ортаға отырғызады.
Клеткаларды өсіруге арналған қ.о. құрамы өте күрделі. Олардың құрамына макро және микроэлементтер, көмірсулар, витаминдер, амин қышқылдары, фитогормондар кіреді. Клеткаларды нәтижелі өсіру үшін ең алдымен лайықты орта қажет. Клеткаларға әсер ететін сыртқы факторлар: температура, жарық, осмос қысымы, оттегі [27].
Каллус ұлпасы клеткалардың ретсіз бөлінуі арқасында пайда болады. Каллустың туындауы және әрмен қарай өсуі фитогормондармен реттеледі. Каллус ұлпасын 3-4 апта сайын жана ортаға көшіріп отырады, өте ұзақ өсіруге болады. Ал қоректік орта құрамын өзгертіп, марфогенездің нәтижесінде регенерант өсімдікті алуға болады.
Клеткалар суспензиясы - жеке клеткаларды немесе олардың кішігірім топтарын аэрациясы мен араластыруын қамтамасыз етіп сұйық ортада өсіру. Сұйық ортада өскен клеткалар агарлы қатты ортада өсірген клеткалармен салыстырғанда, қоректік заттармен және оттегімен жақсырақ қамтамасыз етіледі. Жеке клеткаларды борпылдақ каллустан сұйық ортада шайқап шығарып алады. Клеткалардың суспензияда ең лайықты тығыздығы бир милилитрде 105-106 клетка шамасында болуы керек.
Клеткаларды сұйық ортада өсірудің екі әдісі бар: мерзімді (қорландырып) өсіру (суспензиядағы клеткаларды өсіру процесі белгілі бір уақыт ішінде жүргізіледі және де бұл кезде бастапқы құйылған қоректік орта жаңартылмай, өз нәрі сарқылғанша пайдаланылады) және ағынды ортада үзіліссіз өсіру (суспензиядағы клеткаларды өсіру процесі үздіксіз жүргізіледі және де ылғи жаңартылып отырылады).
Өсімдік клеткаларын сұйық ортада өсіргенде микроорганизмдерге арналған технологиялар мен аппараттар қолданылады. Клеткалар суспензиясын өсіру биореакторда хемостат және турбидостат принциптері арқылы жүргізіледі. Хемостат принципі бойынша үздіксіз өсіру процесі өсуді тежейтін белгілі бір фактордың әсерімен өтеді, популяция стационар күйіне көшеді, клеткалар физиология тұрғысынан біркелкі болады. Турбидостат принципі бойынша үздіксіз өсіргенде клеткалардың өсу қарқындылығын бір деңгейде ұстау, олардың суспензияда оптикалық тығыздығының реттелуі арқылы жүзеге асырылады. Онда фотоэлектр элементі болады, ол суспензияның, яғни лайлануын бақылайды, соның арқасында клеткалардың өсуі автоматтық жолмен берілетін жаңа қ.о.мен реттеледі. Хемостат және турбидостат ережесімен өсіру тәсілдері клеткалар популяциясын өсу күйінде тұрақтандыру үшін және оны ұзақ сақтау үшін қолданылады. Бұл өсіру әдістері клеткалардың өсуі мен метаболизміне әр түрлі факторлардың әсерін стандартты жағдайда зерттеу үшін өте құнды тәсілдер болып табылады [25].
1.7 In vitro жағдайында өсірілетін өсімдік клеткаларынан каучукты (изопреноид) бөліп алу әдістері
Табиғи каучук алу технологиясы:
1. Сілтілік әдіс. 3 этаптан тұрады:
1) 2% NaOH арқылы сілтілендіру;
2) Суда уату;
3) Будың көмегімен резиналық қалыпқа келтіру.
2. Центрифугалау әдісі. 3 сатылы:
1) Тегістеу;
2) Микробиологиялық ферментация;
3) Центрифугалау.
3. Эскью әдісі: фрезерлік тастарды суға салып кейін центрифугалауға негізделген. 1949 жылы пайда болған [15].
Эскью әдісі арқылы тау-сағыздың тамырынан табиғи каучук алуға болады. Ең алдымен өсімдікті біраз уақыт ауада кептіреді. Кейін кальций құрамында бар сода 0,1% ертіндісі көмегімен сілтілендіреді. Қалған бөлігінен арнайы шар тәрізді ұсақтағыш аппараттан өткізіп "құрт" тәрізді каучук түзілгенше өткізеді. Целлюлоза және т.б. қосылыстардан айыру үшін жуып, флотациялайды. Флотацияны пульпа қоректік ортасында жүргізеді. Кейін каучук алынады [13].
4. Еріткіш әдісі: 3% каучук еріткіште және жарылғыш заттар пайдаланылады. Эмульсиялық каучукты бөліп алу органикалық коагулянт қолдану арқылы жүзеге асады. Коагулянт ретінде фенол конденсация өнімдері (NHn(CH2-CH(R)-OH)m немесе N(CH2-CH(R)-OH)3), полигексаметиленгуанидингидрохлорид (метацид) т.б қолданылады. Каучук бөліп алу сусыз дегазация арқылы да алынады. Полимеризат 20% сополимерден тұрады. Ол горизонталь конденсаторға түседі де жоғары температурада қыздырылады. Сусыз жағдайда каучукты бөліп алу улкен артықшылықтарға ие. Себебі кептіру процесіне қажет көптеген қондырғыларды қажет етпейді, нәтижесінде аз шығын жұмсалады.
Каучукты вулканизациялау негізгі сатылардың бірі болып табылады. Табиғи каучуктың вулканизациялаушы агенті: күкірт . Бұл процесті ары қарай үдету мақсатында 2-меркаптобензтиазол (каптакс), сантокюр, дибензтиазолилдисульфид (альтакс), тетраметилтиурамдисульфид (тиурам) және т.б.
... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz