Олигодезоксирибонуклеотидтерді химиялық синтездеу әдістері

Пән: Химия
Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 4 бет
Таңдаулыға:

әл - Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті Биология факультеті Биотехнология мамандығы

Тақырыбы: химиялық синтездеу әдістері

Тексерген: б. ғ. д., профессор Кенжебаева С. С.

Орындаған: І курс магистранты Байқара Баршагүл

Алматы, 2009

ДНҚ - ны химиялық синтездейтін автоматты құралдардың (ДНҚ - синтезатор) пайда болуымен ұзындығы ≤50 нуклеотидтік бір тізбекті олигонуклеотидтерді алу жеңілдеу түсті. Кез - келген ДНҚ - синтезатордың негізгі компоненті клапандар мен насостар жүйесі. Олардың көмегімен қатаң белгіленген программамен реакциялық қоспаға өсіп жатқан тізбекке қажетті мономерлі қалдықтардың қосылуын қамтамасыз ететін нуклеотидтер мен реагенттерді енгізеді. ДНҚ - ның химиялық синтездің биологиялық синтезге қарағанда ерекшелігі тізбектің 5' - гидроксильді соңына кез келген жаңа нуклеотидті қосуға болады. Барық реакциялар бір реакциялық колонкада жүреді, ал олардың әр қайсысының жүру ұзақтығы мен жуу уақыты компъютер көмегімен бақыланады.

Фосфорамидті әдіс

Ондағы алғашқы құрылыс блоктары модифицирленген болып табылады. Модификация дезоксиаденозин мен дезоксицитидиннің аминотоптарына бензолды топтардың, ал дезоксигуанозиннің аминотоптарына - изобутирильдің қосылуынан тұрады. Аминотобы жоқ тимидин модификацияланбайды. Мұндай модификация тізбектің өсуі кезінде нуклеозидтерді қажетсіз кері реакциялардан қорау үшін қажет. Синтез қатты фазада (ДНҚ өсіп жатқан тізбегі қатты тасымалдағышқа бекінеді) жүреді. Ол барлық реакцияларды бір емкоста өтуді, әр сатысынан кейін қажетсіз реагенттерді жуып тастауға және реакцияның толық жүруін қамтамасыз ететін жаға реагенттерді қосуға мүмкіндік береді.

Көпсатылы синтездің этаптары суретте көрсетілген. Бірінші нуклеозид (азоты негіз + қант) инертті қатты тасымалдағышқа бекінеді. Қатты тасымалдығыш ретінде әдетте саңылауларының мөлшері бірдей кеуекті әйнек шарлар пайдаланылады. Синтезделетін тізбектің 3'-соңындағы нуклеозиді боатын бірінші нуклеозидтің 3'-гидроксильді тобы тасымалдаушымен ковалентті байланысқан спейсерлі молекулаға бекітіледі. Бірінші нуклеотидтің 5'-гидроксильді тобының реакциялық қоспаға екінші нуклеотидті қоспас бұрын спецификалық емес әсерлесуін алдын алу үшін, оларды диметокситритильді (ДМТ) топтың көмегімен қорғап тұрады. Мұндай топ өсіп жатқан тізбекке байланысатын әр нуклеотидте болады, сонымен қатар онда диизопопиламинді тобы бар. Ол өз кезегінде метильдің қалдығымен қорғалған 3'-фосфидті тобына байланысқан. Мұндай молекулярлы конфигурация фосфорамидті деп аталады.

Цикл бірінші нуклеозидтің әйнек шарикке байланысуынан басталады. Кейін су мен басқа нуклеофильді заттарды бөліп таста үшін коллонканы қандай да бір сусыз реагентпен (мысалы, ацетонитрил) жуылады және ацетонитрильді коллонка шығару үшін ол арқылы аргонды үрлейді. Содан соң үшхлорсірке қышқылының көмегімен 5'-гидроксильді тобының реакцияға қабілеттілігін жасау үшін (экспонирлау) нуклеотидке байланысқан 5'-ДМТ (детритилдену) бөліп алады. Үшхлорсірке қышқылын бөліп тастау үшін коллонканы қайтадан ацетонитрилмен жуып, ацетонитрилден құтылу үшін аргонмен үрлейді. Процесс екінші сатыда коллонкаға бір уақытта келесі нуклеозид (фосфорамид түрінде) пен тетразол (активтенуі мен қосылуы) енгізетіндей етіп программаланған. Тетразол 3'-фосфидті топтың бірінші нуклеозидтің 5'-гидроксильді тобымен ковалентті байланыс түзетін фосфорамидитті активтендіреді. Байланыспаған фосфорамидит пен тетразолды аргонмен үрлеу арқылы бөліп тастайды.

Бірінші саты біткеннен кейін тасымалдаушыға бекітілген нуклеозидтер толығымен фосфорамидпен байланыспайтындықтан, олардың екінші сатыда қослатын нуклеозидтермен байланыспауын қамтамасыз ету керек. Ол үшін реакцияға түспеген 5'-гидроксильді топты сірке ангидриді мен диметиламинопиридин (кэптеу) көмегімен ацетилдейді. Егер мұны істемесе, онда бірнеше циклден кейін синтезделіп жатқан олигонуклеотидтер ұзындығы мен нуклеотидтерің қатарласып келуі бойынша әр түрлі болады.

Екінші сатыда нуклеотидтер арасында түзілген фосфиттриэфирлі байланыс тұрақсыз және сілті немесе қышқылды ортада тез үзіліп кетуі мүмкін. Сондықтан да фофиттриэфирді йод қоспасының көмегімен тұрақты бесвалентті фосфитэфирге дейін тотықтырады. Содан кейін коллонканы жуады да, барлық циклді қайталайды (детритильдеу, активтендіру мен байланыстыру, кэптеу, тотықтыру) . Барлық айтылған процестер өсіп жатқан тізбекке программа бойынша соңғы нуклеозид келіп байланысқанша жүргізіледі. Синтезделген олигонуклеозид әйнек шарикпен байланысқан; әр фосфаттриэфирдің метилді тобы болады; әр гуанин, цитозин және адениннің аминотобы, ал соңғы нуклеотидтің 5'-соңында ДМТ - топ орналасады.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.