Криосақтау

Пән: Медицина
Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 15 бет
Таңдаулыға:

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ

ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ АГРАРЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

Кафедрасы

«Криосақтау»

курстық жұмыс

Орындаған:

Тексерген:

Мазмұны

Кіріспе . . . 3

1. Генофендтарды in vitro сақтау . . . 4

1. 1. Генофондтарды in vitro сақтау (гендер банкі) . . . 4

1. 2. Клеткалардың өсуін бәсеңдету . . . 5

1. 3. Клеткаларды мұздатып сақтау . . . 7

1. 4. Клеткаларды мұздатуға дайындау . . . 10

2. Криопротекторлар . . . 11

2. 1. Криопротекторлар . . . 11

2. 2. Мұздату мен сақтау . . . 11

2. 3. Еріту және криопротекторлардан тазарту . . . 12

2. 4. Клеткаларды қайтадан өсіру және оны талдау . . . 13

Қорытынды 15

Пайдаланған әдебиеттер тізімі 16

Кіріспе

Биотехнология - биологиялық процестер мен объектілердің пайдалануға негізделген, экономикалық жағынан тиімді де маңызды заттар өңдіру және жоғары өнімділігі бар микроорганизмдер штаммдарын алу, өсімдіктердің сорттары мен формаларын, жануарлар асыл тұқымдарын шығаратын ғылым мен өндірістің жаңа бағыты.

Осы биотехнология саласында көптеген басқа да салалары бар. Солардың ішінде, мысалы, клеткалық және гендік инженеря әдістері. Клетканы жасанды жрлмен будандастырып, яғни протоплстарды қосып, будан клетка алып, одан будан өсімдіктерді шығаруға болады - бұл клеткалық инженерияәдісі. Тікелей ДНҚ-ы деңгейінде генетикалық әрекет жасау арқылы генетикалық трансформацияны іске асырып, өсімдіктердің толықтай жаңа формаларын алу - гендік инженерия міндеті. Осымен қоса гаплоидтық технология, яғни клеткаларды жасанды қоректік ортада өсіру әдісі арқылы алынады. Өсімдік клеткалары in vitro жағдайында тұтас өсімдікке тән биосинтездік қабілеттілігін сақтайды, сондықтан экономикалық маңызды клеткалық зат алмасу өнімдерінің көзі бола алады. Өсірілетін клеткалардың бұндай ерекшеліктері өндірістік жолмен құнды заттарды алу мақсатында жаңа технологиялар жасау үшін пайдаланылуда.

Міне, осы әдістер арқылы алынған жаңа сорттар мен бұрынғы сорттарды жақсарту үшін және де азайып бара жатқан түрлерін сақтап қалу мақсатында ғылымда жаңа криосақтау, яғни мұздатып сақтау әдісі кең даму үстінде.

1. Генофондты in vitro сақтау.

1. 1. Генофондты in vitro сақтау (гендер банкі) .

Жаңа сорттарды шығағу және бұрынғы сорттарды жақсарту үшін генетикалық материалдар қажет. Сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан түрлерді, құнды селекциялық объектілерді және қосымша метоболизмнен түзілетін заттарды беретін бағалы клеткаларды сақтау мақсатымен гендер банкісін жасау әдістері зерттелуде.

Тірі организмдерде төмен температураның әсерін зерттейтін биологияның бір саласы - криобиологияның қарқынды дамуына байланысты, сұйық азотта /-196ºС/ мұздату арқылы өсімдіктердің жасанды ортада өскен ұлпаларын сақтаудың криогендік әдістері қолданыла бастады. Бұл жасанды ортада өскен объектілердің ұзақ уақыт өзгеріссіз сақталуын қамтамасыз етеді. Қандай болса да ұлпаларды ұзақ уақыт қайта-қайта жаңа ортаға ауыстырып отырғызып өсіргенде, оларда гендік, храмасомалық және геномдық деңгейде жүретін өзгерістер көбейеді.

Өсімдік шаруашылығында сорттар жиі алмастырылып тұруы қажет. Ол жағдай бірнеше себептерге байланысты:

1) біраз мерзімнен соң сорттардың кейбір құнды белгілері біртіндеп жоғала бастайды;

2) ауру қоздырушы кейбір микроорганизмдер мен зиянкес жәндіктердің өте қауіпті жаңа популяциялары пайда болады да, оларға төтеп беру қиынға соғады;

3) климат өзгереді;

4) топырақтың құнарлығы төмендейді және тағы да көптеген жағдайлар. Мысалы, бидай мен басқа астық дақылдары сорттарының шаруашылықта пайдаланатын орташа мерзімі әдетте 5 - 10 жыл болады. Жаңа сорттарды шығару үшін әр алуан бағалы генетикалық материалдар қажет. Сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан түрлердің генофондын және селекция үшін бағалы обьектілер мен штамдарды сақтау үшін in vitro жағдайында гендер қорын (гендер банкі) жасау жөнінде зерттеулер өткізілуде.

Гендердің негізгі көзі ұрық, соңғы кезде биотехнология әдістері дамып, селекцияда қолданыла бастаған соң, генетикалық материал in vitro өсірілетін клеткалар мен ұлпалар түрінде қажет болып жатар. Гендерді in vitro сақтау әдісі әдеттегі жағдайда ұрықтары сақталмайтын өсімдіктерге қолайлы, вегетативтік жолмен көбейетін және табиғатта жоғалып бара жатқан түрлер үшін лайықты. Құнды заттарды беретін жаңа клеткалар линияларын жасау үшін эталон клеткалары бола алатын клеткалар коллекциясын да сақтау керек. Сонымен, бірталай теориялық және практикалық мәселелерді шешуге клеткаларды сақтаудың ыңғайлы әдістері қажет екені сөзсіз.

Көптеген жылдар бойы бастапқы клеткаларды сақтау мақсатымен оларды ең қолайлы жағдайда өсіруді қолданды. Бірақ бұнда клеткаларда генетикалық өзгерістер өрістеуі ықтимал. Сонымен қатар, бұл еңбек пен қаражат көп жұмсалатын жұмыс. Өсірілетін клеткаларды сақтаудың екі жолы бар: олардың өсуін барынша бәсеңдету немесе оларды мұздатып сақтау - криосақтау.

1. 2. Клеткалардың өсуін бәсеңдету.

Бұл тәсілдің міндеті, клеткалардың өсу кинетикасын өзгерту, жаңа қоректік ортаға көшіру уақыт аралығын барынша созу, мысалы, 3-4 айға, тіпті бір жылға дейін. Қазір белгілі факторлардың әсерімен өсуді бәсеңдету өркендер мен регенеранттарға қолданылады.

Өсуді бәсеңдету үшін ең әрекетті жол, ол температура мен жарықты төмендету. Температура өсімдіктің суыққа төзімділігіне қарап іріктеліп алынады. Мысалы, картоп клеткаларының коллекциясын сақтағанда температура 10ºС, ал алма үшін 1ºС болады. Әдетте 20º - 25ºС температурада өсетін клеткаларға 4º - 10ºС, ал 30ºС өсетін клеткаларға 15º- 20ºС температура қолайлы.

Өсімдіктердің өсуін сонымен қатар қоректік ортаға қосылған кейбір заттар тежейді. Мысалы, маннит пен сорбит осмотиктер ретінде, сахароза жоғары концентрацияда және өсуді тежейтін арнайы заттар (малеин қышқылының гидролизі, сукцинаттың 2, 2 - метилгидразиті, хлорхолинхлорид, абсциз қышқылы, n - диметилсукцинамин қышқылы) . Өсуді тежеу үшін гипоксияны да қолданады, яғни оттегін азайтады. Гипоксияны туғызу үшін 90% азот пен 10% оттегі қоспасын пайдаланады. Кейде оттегі концентрациясымен бірге атмосфера қысымын да төмендетеді. Қоректік орта сарқылмау және сорғымау үшін оның көлемін ұлғайтады. Сұйық орта қолданылғанда, оған оқтын-оқтын қоректік заттар қосылып тұрады.

Көптеген клеткалардың өсуі осы тәсілдермен қаншама бәсеңдетілсе де, өсуді мүлдем тоқтату мүмкін емес. Сондықтан өсуді толығымен тоқтату жолы, ол клеткаларды мұздату.

1. 3. Клеткаларды мұздатып сақтау.

Мұздатып сақтау (криосақтау) - клеткаларды қатты мұздатып алып өте төмен температурада сақтау, мысалы сұйық азот температурасында (-196ºС) . Бұл клеткалардың генетикалық сипаттамасы қай мерзімде болса да тұрақты сақталуына кепіл болады. Бұл әдіспен әр түрлі материалды сақтауға болады - протопластардан ұрық пен тұқымға дейін. Қазіргі уақытта клеткаларды, ұлпаларды, мүшелерді қатты мұздатып сақтау медицина мен мал шаруашылығында кеңінен пайдаланады. Ал өсімдіктерге келсек, өқінішке орай, жағдай басқаша. Басты қиындығы, ол өсімдік клеткаларына тән ерекшеліктері және мұздың оларға әсері. Өсімдік клеткалары көлемі үлкен, вакуолі зор, суы көп болғандықтан мұздату және еріту кезеңдерінде олар қатты зақымданады. Ол мұздың клетка ішінде де, сыртында да қатуына байланысты. Әдетте, мұз алдымен клетканы қоршаған сыртқы ерітінді де пайда болады. Цитоплазманың өзінің қату нүктесі 1ºС, бірақ клеткалар -10º-15ºС дейін қатпай тұрады, себебі плазмалемма оған дейін мұздың кристалдарының клетка ішіне кіруін бөгейді. Мұз кристалдары клетка ішінде өсе бастаса, мембраналарды қиратады. Температура баяу төмендесе, клетканың бос суы жарым-жартылай сыртқа шығып үлгереді де, сыртқы ерітіндіде мұзға айналады. Ал мұздату өте жедел өтсе, клетканың дегидратациясы жүріп үлгермейді де, мұз цитоплазма ішінде түзіле бастайды. Бәсең мұздатқанда клетка ішінде мұз кристалдары пайда болуы мүмкін, бірақ бұнда клетканың едәуір сорғуымен протоплазманың сығылысуы болмай қалмайды. Протоплазманың сорғылуы, мұз түзілу салдарынан сыртқы ерітіндінің концентрациясы өсу себебінен болады. Шектен тыс плазмолиз және соның нәтижесінде пайда болатын осмостық стресс (әсіресе кейін өтетін деплазмолизде) клетканы зақымдайды.

Сонымен, мұздатқанда клетканың құруының себебі, ол ішінде мұз түзіліп оның мембраналары механикалық қиратылуы. Демек, криомұздату әдісінде қолданылатын тәсілдердің міндеті, осы екі факторлардың зиян әсерін төмендету. Клеткалардың тірі қалуы көптеген факторларға байланысты. Олар: генетикалық және морфофизиологиялық ерекшеліктері; суыққа шынықтыруға қабілеті; түрлі криопротекторлардың құрамы мен мөлшері; осызаттар мен судың клеткаға сіңу деңгейі; температураны төмендету жылдамдығы; еріту жағдайлары. Клеткаларды мұздатып сақтау жұмысының этаптары (1-сурет) :

1) клеткаларды дайындау; 2) криопротекторды қосу; 3) бағдарламаны мұздату; 4) сұйфқ азотта сақтау; 5) тез еріту; 6) криопротекторды кетіру; 7) қайтадан өсіру және регенеранттарды алу;

1. 4. Клеткаларды мұздатуға дайындау.

Өте төмен температура жағдайында клеткаларды, меристемаларды, өркен апекстерін, ұрықты, тозаңды сақтауға болады. Бірақ осындай әр түрлі обьектілерді криосақтау үшін бірнеше тәсілдер мен жағдайлар қажет.

Осы әдіс клеткалар суспензиясы үшін жете зерттеліп дайындалған. Ірі, вакуольденген клеткаларға қарағанда мұздатуға майда, меристема тәрізді клеткалар төзімді келеді. Құрылымдары күрделі меристемалар, ұрықтар, эмбриоидтарға мұздату кездегі әрбір этаптың жағдайларын ерекше бақылау қажет.

Клеткалар суспензиясын мұздатуға дайындағанда меристема тәрізді клеткаларды неғұрлым көбейту керек. Оған жету үшін клеткаларды осмотик қосып ұзақ өсіру, клеткалардың бөлінуін барынша синхрондау және жаңа қоректік ортаға жиі көшіріп отыру керек. Сонда клеткалардың көлемі кішірейіп, олардың көбі тірі қалады. Клеткалардың тіршілікке икемділігі кейбір амин қышқылдарды қосып өсіргенде, ішінде қант мөлшері өсу нәтижесінде арта түседі. Клеткалар суспензиясын дайындағанда өте бір маңызды жәйт, оның концентрациясын көтеру, яғни оны қойылту. Мысалы, сәбіз клеткаларының суспензиядағы тығыздығын 2-3 есе арттырғанда, олардың тіршілікке қабілеттілігі едәуір өскен. Мұздатуға дайындау талаптары әр түрлі клеткаларға жеке эксперимент бойынша іріктеліп алынады.

2. Криопротекторлар.

2. 1. Криопротекторлар.

Криопротектор - клетканың мұздап қату нүктесін төмендетіп, клетка ішіндегі сумен байланысып, клетканы механикалық және осмостық бүлінуден қорғайтын зат. Криопротекторларға диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, пролин, сахароза жатады. Сахароза жақсы табиғи протекторы. Криопротекторлардың өздері осмостық стреске себепкер болмаулары үшін олардың концентрациялары жеке іріктеліп алынады.

ДМСО клеткаға өте жақсы енеді, бұл ірі тығыз құрылымдарға, мысалы меристема үщін өте маңызды. Оларды мұздатуға дайындағанда ортаға 5% ДМСО қосып өсіреді. Бұл кезде апекс бойында (ұзындығы 0, 3-0, 5 мм) тиімді қорғайтын ДМСО концентрациясы пайда болады. Мысалы, дәрілік түймедағы (ромашка) клеткаларын алдын ала ДМСО қосқан ортада өсіріп, кейін мұздатқанда ДМСО, глицерин және сахароза қоспасынбергенде, жақсы нәтижеге жеткен. Клеткаларды мұздатып сақтау мәселелерін көптен бері зерттеп жүрген А. С. Попов көрсеткендей, бірқатар өсімдік клеткалар суспензияларын нітижелі қорғау үшін криопротекторлардың қоспаларын және криопротекторлар мен осмотиктер (сорбит, маннит) қоспаларының әр түрлі концентрациясын пайдалану қажет.

2. 2. Мұздату мен сақтау.

Ең ыңғайлы мұздату бағдарламасын таңдап алудың маңызы зор. Мұздату баяу, бірте-бірте, жылдам, өте тез, лезде өткізіледі. Баяу біртіндеп мұздатқанда температура 0ºС-тан-40ºС арасында минутына 0, 5º-1ºС төмендейді. Жылдам мұздатқанда объект криопротектор қосылған ампуласымен шапшаң сұйық азотқа салынады. Ал өте тез мұздатқанда объектінің өзі сұйық азотқа лезде салынады. Тозаңда құрғақ түрінде арнаулы пластмасса мапулаларға бітеп жапсырып сұйық азотқа салады.

Москвадағы ИФР-де криобанктің деректері бойынша, бағдарламалы мұздату жақсы нәтиже берген. Бұл үшін арнаулы қондырғыш қажет, оның камерасына бағдарламаланған жылдамдықпен сұйық азоттың буы беріліп тұрады. Басқа түрлі мұздатқышта клеткаларбалқу температурасы төмен сұйық зат құйылған камераға салынады. Ол камера электрмұздатқышпен суытылып тұрады. Оның температурасы бағдарлама бойынша реттеліп тұрады. Ең қарапайым аспаптар, ол Дьюар ыдыстары мен пенопластан жасалған қораптар. Лабораториялық мұздатқыштар (-20ºС) мен құрғақ мұзы (-78ºС ) бар камералар клеткаларды сақтауға жарамайды, себебі оларда клетка ішінде мұз пайда болуын бақылау мүмкін емес.

2. 3. Еріту және криопротекторлардан тазарту.

Еріту процесі және одан соң клеткалардың өсуін бұрынғы қалыпқа келтіру кезеңдері өте жауапты да қиын. Өте баяу еріткенде клеткаларда қайтадан мұз пайда болып, зақымдауы мүмкін. Ал тез еріткенде ондай жағдай болмайды. Ампуланы жылы су (40ºС) құйылған ыдысқа салады, немесе обьект үстіне жылы қоректік ортаны тамшылатып құйып ерітеді. Бірақ кейбір жағдайда ептеп қана, баяу еріткен қолайлы болады. Мұзды еріткен соң криопротекторды кетіру керек, оны әдетте суықта істейді. Клеткаларда өтетін физикалық өзгерістердің көбі мұздату мен еріту кезінде болады. Бірақ сонда да, ерітіп алынған клеткалардың бүлінуі болғандығанынан, оларға ерекше күтім қажет. Кейде клеткаларды жумай (криопротекторлар шамамен қалады) жаңа қоректік ортаға көшіреді. Ал көбінесе, криопротекторды жуып кетіреді.

2. 4. Клеткаларды қайтадан өсіру және оларды талдау.

Клеткалар мұздатып сақталған кезде олардың қандай күйде екенін білу мүмкін емес. Ал, ерітіп алған соң, оларды одан әрі пайдалану үшін міндетті түрде сапалық жағдайын білу керек. Ол үшін тіршілікке икемділікті анықтайтын әдістер (тестер) пайдаланылады. Бұл тестерді клеткаларды, ұлпаларды анықтауға болады.

Микроскоп арқылы көрінетін құрылымдары (клеткалар суспензиясы, протопластар, каллустар және басқа кішігірім құрылымдар) , Эванстың көк боуымен, феносафранинбен бояйды. Каллустар мен тығыз ірі құрылымдарды тетразолий тұздарымен бояйды.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.