Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық зерттеу
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...8
1 Әдебиетті шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..10
1.1 Жеміс дақылдарының вирустық аурулары және олардың зияндылығы ... 10
1.2 Вирустарды идентификациялау әдісі: полимеразалы тізбекті реакция ... ...13
1.3 Алма ағашы мен алмұрттың in vitro клональды көбеюі ... ... ... ... ... ... ... ... .24
1.4 Микроегу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...30
2 Зерттеу бөлімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..31
2.1Зерттеу нысандары мен әдістемесі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 31
3 Тәжірибелік зерттеу нәтижесі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..38
4 Экономикалық бөлім ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..45
4.1 Жеміс дақылдарының көшеттерінің 1 мың данасын биотехнологиялық (in vitro) әдіспен өсірудің экономикалық тиімділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..45
5 Еңбек және қоршаған ортагы қорғау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...46
Қорытынды ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 56
Қолданылған әдебиеттер тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 57
1 Әдебиетті шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..10
1.1 Жеміс дақылдарының вирустық аурулары және олардың зияндылығы ... 10
1.2 Вирустарды идентификациялау әдісі: полимеразалы тізбекті реакция ... ...13
1.3 Алма ағашы мен алмұрттың in vitro клональды көбеюі ... ... ... ... ... ... ... ... .24
1.4 Микроегу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...30
2 Зерттеу бөлімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..31
2.1Зерттеу нысандары мен әдістемесі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 31
3 Тәжірибелік зерттеу нәтижесі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..38
4 Экономикалық бөлім ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..45
4.1 Жеміс дақылдарының көшеттерінің 1 мың данасын биотехнологиялық (in vitro) әдіспен өсірудің экономикалық тиімділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..45
5 Еңбек және қоршаған ортагы қорғау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...46
Қорытынды ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 56
Қолданылған әдебиеттер тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 57
Ауыл шаруашылығына адам тіршілігі үшін қажетті өнімдерді, бірінші кезекте тағам өнімдерін өндіруді жаңа деңгейге көтеруге мүмкіндік беретін алдыңғы қатарлы, ғылымды көп қажет ететін технологияларды енгізу соңғы жылдардың негізгі мәселелерінің біріне айналды, бұл туралы Қазақстан халқына өз жолдауында Н.А.Назарбаев айтып кетті [1]. Әлемнің жетекші елдерінің ұлттық экономикаларының осы мәселені шешу жөніндегі басым бағыттарының бірі биотехнология болып отыр. ХХ ғасырдың соңында отырғызу материалын сауықтыру үшін өсімдіктердің клеткаларының, ұлпалары мен органдарының оқшауланған өскіндері технологиялары айтарлықтай тарала бастады. Қазіргі таңда осы технологиялардың құрылымының ауылшаруашылық өсімдіктерінің гендік модификациясының тиімділігін арттыруға тиісті болатын клеткалық-инженерлік технологиялар жағына өзгеруі байқалып отыр.
Ауылшаруашылық биотехнологиясы саласындағы болашақтағы дамудың негізгі бағыттары болып:
- ауылшаруашылық өнімдерінің өнімділігін, оның тағамдық құндылығын арттыру;
- сұрыпты жасап шығару мерзімдерін қысқарта және шығындарын төмендете отырып, биотикалық және абиотикалық факторларға төзімділікке ие болып келетін сұрыптар селекциясының тиімділігін арттыру;
- өсімдіктердің мәдени және жабайы түрлерінің гендік алуан түрлілігін сақтап қалу;
- өсімдіктерді жылдам шағынклоналды дамыту және вирустық пен микоплазмалы инфекциядан сауықтыру;
- жаңа препараттарды: өсімдіктерді әртүрлі аурулардан және зиянкестерден қорғау құралдарын, өсу мен дамуды реттегіштерді, тағамдық және азықтық заттарды және дәрілік препараттарды жасап шығару болып табылады.
Осы мәселелерді түпкілікті шешу ауылшаруашылық биотехнологиясының жаңа технологияларын қалыптастырумен және дәстүрлі бағыттарын жетілдірумен тікелей байланысты болып отыр, мұның өзі өз кезегінде өсімдік организмін клеткалық және молекулалық деңгейлерде іргелі зерттеулермен байланысты болып келеді.
Ауылшаруашылық өсімдіктерінің өнімділік деңгейін арттырудың ғылыми негізделген тәсілдерін жасап шығару әлемнің барлық елдерінде өзектілігі жоғары мәселе болып келген және болып қалуда да, өйткені әлем халқының саны артып келеді, оның тамақ өнімдеріне, оның ішінде өсімдік шаруашылығы өнімдеріне деген қажеттілігі арта түсуде. Өсімдік шаруашылығы салаларын дамытудың жалғыз ғана жолы – оны үнемі сұрып жаңарту арқылы қарқынды ету, өнім өндірудің, оның ішінде сапасы жоғары отырғызу материалын өндірудің қарқынды технологияларын енгізу. Әлемнің жетекші елдерінің ұлттық экономикаларының осы мәселені шешудегі басым бағыттарының бірі биотехнология болып отыр.
Ауылшаруашылық биотехнологиясы саласындағы болашақтағы дамудың негізгі бағыттары болып:
- ауылшаруашылық өнімдерінің өнімділігін, оның тағамдық құндылығын арттыру;
- сұрыпты жасап шығару мерзімдерін қысқарта және шығындарын төмендете отырып, биотикалық және абиотикалық факторларға төзімділікке ие болып келетін сұрыптар селекциясының тиімділігін арттыру;
- өсімдіктердің мәдени және жабайы түрлерінің гендік алуан түрлілігін сақтап қалу;
- өсімдіктерді жылдам шағынклоналды дамыту және вирустық пен микоплазмалы инфекциядан сауықтыру;
- жаңа препараттарды: өсімдіктерді әртүрлі аурулардан және зиянкестерден қорғау құралдарын, өсу мен дамуды реттегіштерді, тағамдық және азықтық заттарды және дәрілік препараттарды жасап шығару болып табылады.
Осы мәселелерді түпкілікті шешу ауылшаруашылық биотехнологиясының жаңа технологияларын қалыптастырумен және дәстүрлі бағыттарын жетілдірумен тікелей байланысты болып отыр, мұның өзі өз кезегінде өсімдік организмін клеткалық және молекулалық деңгейлерде іргелі зерттеулермен байланысты болып келеді.
Ауылшаруашылық өсімдіктерінің өнімділік деңгейін арттырудың ғылыми негізделген тәсілдерін жасап шығару әлемнің барлық елдерінде өзектілігі жоғары мәселе болып келген және болып қалуда да, өйткені әлем халқының саны артып келеді, оның тамақ өнімдеріне, оның ішінде өсімдік шаруашылығы өнімдеріне деген қажеттілігі арта түсуде. Өсімдік шаруашылығы салаларын дамытудың жалғыз ғана жолы – оны үнемі сұрып жаңарту арқылы қарқынды ету, өнім өндірудің, оның ішінде сапасы жоғары отырғызу материалын өндірудің қарқынды технологияларын енгізу. Әлемнің жетекші елдерінің ұлттық экономикаларының осы мәселені шешудегі басым бағыттарының бірі биотехнология болып отыр.
1. Назарбаев Н.А. Послание президента Республика Казахстана в 2010 г.
« Жаңа он жылдық- жаңа экономикалық өрлеу- Қазақстанның жаңа мүмкіндіктері»
2. Долгих .С.Г. Биотехнология диагностики вирусных болезней, оздоровления и размножения плодовых культур в Казахстане. Алматы-2007
3. Власов Ю.И. Вирусные и микоплазменные болезней – М., Колос, 1992-207с
4. Вердеревская Т.Д., Маринеску В.Г Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда – Кишинев: Штиница, 1985-312с
5. Власов Ю.И., Ларина. Э.И. Сельскохозяйственная вирусология – М., 1982
6. Помазков Ю.И. Изучение вирусных заболеваний плодовых и ягодных культур в ССР.// Сб.: Выращивание безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур – М., 1992
7. Весьминш Л., Вердеревская Т.Д. Инфекционные заболевания культурных растений Молдавии – Кишинев, 1996, вып 6.
8. Татаринов А.Н. Вредоносность гуттаперчивости и вирусных болезней яблони./ Садоводство и виноградарство- М., 1994. С.5-6
9. Тулеуов Ж.Т. Поражаемость груши вирусными болезнями. // Вестник с.-х. науки Казахстана, 1989
10. Тулеуов Ж.Т. Распространенность и вредоносность вируса хлоротической пятнистости листьев яблони. // Вестник с.-х. науки Казахстана, 1988,
11. Тулеуов Ж.Т. К вопросу изучения вирусных заболеваний плодовых культур в Казахстане. // XVI планово- методическое совещание по координации научно-исследовательских работ по защите с.-х. растений от вредителей, болезней и сорняков по зонам Казахстана и Киргизстана на 1974г.- Алма-Ата, 1994
12. Тулеуов Ж.Т. Вирусное заболевания яблони и разработка мер борьбы с ними в зонах плодоводства Казахской ССР. // Автореф.канд. с.-х.наук – Тбилиси, 1982-22 с.
13. Тулеуов Ж.Т. Влияние латентных вирусов на листья яблони. // Вестник с.-х.науки Казахстана,1988,11-с.50-53
14. Избасаров Д.С., Клоконос Н.П. Технология оздоровления и размножения ягодных культур в Казахстане – Алматы, 2002-200 с.
15. Тулеуов Ж.Т., Исин М.М. Вирусное болезни плодовых.// Защита растений, 1976,7-с.47
16. Ковальчук И.Ю., Тулеуов Ж.Т. Вирусы, поражающие косточковые культуры в Алма-Атинской области.// Материалы ХХХ конференции молодых ученых – Алматы, 1987-с.104.
17. Долгих С.Г. Вирусные болезни земляники в Алма-Атинской области.// Проблемы эффективности и качества в плодоводстве и виноградарстве на современном этапе- Алма-Ата: Кайнар,1981-с.53.
18. Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Методические указания по выявлению и идентификации вирусов и микоплазм, поражающих плодовые и ягодные культуры- М.,1980-32с.
19. Рекомендации по выращиванию безвирусного посадочного материала семечковых культур-Алма-Ата,1989-20с.
20. Семина Н.П. Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве-Мичуринск,1989-с.17-21.
21. Долгих С.Г. Биотехнологические особенности клонального размножения апорта // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана,-№ 5,2007.
22. Malinowski T. The influense of plant viruses sequence variation on the reliability of PCR based detection methods.// Improvement and unification of Plant Disease diagnostics. Skierniwice-Poland.2004-p.50.
23. Зеленин А.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В. Введение в геномику растений // Молекулярная биология, 2000, Т.35, Вып.3-с.339-348.
24. Айтхожина Н.А., Калиев А.Б., Филатов В.Д. Использование продуктов генно-инженерных технологий для маркирования генотипов. // Биотехнология-теория и практика, 1997, №3-с. 13-15.
25. Bloch W.A. biochemical perspective of the polymerase chain reaction. // Biochemistry.1991. V.30 – p.2735-2747.
26. Булат С.А., Мироненко Н.В., Кабоев О.К. и др. Заявка на изобретение «Способ идентификации видов организмов» № 4757254, приоритет от 20.11.1989 г. Положительное решение от 5.01.1990.
27. Welsh J.. McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl.Acids Res. 1990. V.18 – p.7213-7235.
28. Williams J.G.K.. Kubelik A.R.. Livak K.J. et.al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucl.Acids Res.. 1990.V.18-p.6531-6535.
29. Булат С.А., Кобаев О.К., Мироненко Н.В., Ибатуллин Ф.М., Лучкина Л.А., Суслов А.В. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика, 1992, Т.28 – с.19-28.
30. Сиволап Ю.М. ДНК-типирование в генетико-селекционных исследованиях растений. // Материалы международной конференции: Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы-Алматы, 2004 – с.241-246.
31. Абдугалиева С.И. Молекулярные маркеры для идентификации, оценки и использования генетических ресурсов в селекции растений // Материалы международной конференции: Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетическая ресурсы- Алматы, 2004-с,50-55
32. Сухов К.С., Развязкина Г.М. Биология вирусов и вирусные болезней растений.- М.: Наука. 1995.
32. Сухов К.С. Общая вирусология.- М.: Высшая школа, 1965
33. Попов М.Г. Дикие плодовые заросли окрестности Алма-Аты в заилийском Ала-Тау. – КазкрайОГИЗ,1935
34, Литвиненко И.С. Увеличение устойчивости плодовых растений к повышенным температурам при термическом обеззараживании их от вирусных и микоплазменных болезней.// Плодоводство Нечерноземной полосы.- М., 1984- с 112-120.
35. Долгих С.Г. Особенности культивирования изолированных апексов семечковых культур. // Материалы научно-практической конференции содружества независимых Государств, ч. 2. Каз.СХИ.- Алма-Ата, 1992 – с.51-54.
36. Долгих С.Г., Карычев К.Г., Остаркова Л.В. Клональное микроразмножение и оздоровление сортов и подвоев яблони./// Сб. трудов Каз. НИИПиВ « Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве», 1997, т. 13- с.3-7.
37 . Долгих С.Г. Особенности культивирования Апорта in vitro./ / Сб.трудов Каз.НИИПиВ, 2001, т.16-с.37-40.
38. Литвиненко И.С. Изучение реакции плодовых растений на термическое обеззараживание от вирусов. // Выращивание посадочного материала плодовых и ягодных культур.-М.,1981.
39. Долгих С.Г., Избасаров Д.С. Способ выращивания саженцов семечковых культур in vitro// Патент № 46336 от 11,06,2004.
40. Долгих С.Г. Техника микропрививки яблони in vitro // Биотехнология: теория и практика, 1997, №3-с.25.
41. Долгих С.Г. Изучение роста и развития микропривитых растений яблони in vitro .// Сб.трудов Каз. НИИПиВ. 1998, т.14-с. 83-87.
42, Джеймс Е. Хранение клеток в условиях низких температур.// Биотехнология сельскохозяйственных растений , 1987-с.153-175.
43. Бутенко Р.Г. Культура изолированных протопластов, клеток и тканей в решении задач физиологии растений.// Новые направления в физиологии растений.- М: Наука, 1985-286 с.
44. Биотехнология сельскохозяйственных растений, 1987-357 с.
45. Валиханова Г.Ж., Рахимбаев И.Р. Культура клеток по биотехнологии растений. Алма-Ата, 1989-с.80.
46. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений.- Минск: Навука і тэхніка, 1996-с.246.
47. Долгих С.Г., Клоконос Н.П. Учебное пособие по сельскохозяйственной биотехнологии.- Алматы, 2006-170с.
48. Джигадло М.И., Джигадло Е.Н. Улучшение сортимента и прогрессивные проблемы возделывания плодовых и ягодных культур.- Орел, 1988-с.65-67.
49. Долгих С.Г. Параметрическое регулирование микроразмножения яблони. // Материалы конференции профессор-преподавательского состава КазСХИ-А-Ата, 1993-с.78-79.
50. Долгих С.Г., Соловьева И.И. Особенности культивирования апексов груши. //Материалы научно-практической конференции содружества независимых Государств. Ч.2, КазСХИ-А-Ата, 1992-с22-23.
51. Долгих С.Г., Нелилов С.Н., Бодагова О.П., Проскуряков М.А. Размножение различных пород растений с применением биостимуляторов нового покаления. // Состояние и перспективы рационального использования и охраны агроэкосистем, Алматы, 1994-с.17-19.
52. Клоконос Н.П., Долгих С.Г. Усовершенствование эффективнрй технологии клонального микроразмножения плодово-ягодных культур. // Материалы международной научно-практической конференции « Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии», книга 11- Алматы, 2000-с. 141-142.
53. Корнацкий С.А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздорвленного посадочног материала. //Автореферат, к.с.-х.н-М,1991.
54. Долгих С.Г. Влияние бактериальных препаратов на контаминацию яблони in vitro. // Новости науки Казахстана, 1997, №3-с.73-74.
55. Леонтьев- Орлов О.А., Трушечкин В.Г., Высоцкий В.А. Особенности культивирования изолированных апексов яблони in vitro. // Плодоводство в Нечерноземной полосе. – М., 1988,-с.21-30.
56. Ильина Е.И. Опыт ускоренного размножения яблони in vitro . // Ускорение научно-технического прогресса в плодоводстве и виноградарстве и задачи молодых ученых.-Алма-Ата, 1987-с.27-28.
57. Туровская Н.И. Микроразмножение груши. // Садоводство.-М, 1987,№-с 22-24.
58. Туровская Н.И. Регулирование процесса ризогенеза при микроразмножения яблони. // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве.- Мичуринск, 1989- с.8-13.
59. Туровская Н.И. Микроразмножение яблони и груши in vitro. // Садоводства и виноградарство. –М, 1994, 31-с. 10-12.
60. Долгих С.Г. Параметрическое регулирование клонального микроразмножениия яблони. // Сб.трудов. Каз.НИИПиВ « Научные достижение в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве» 1997, т,13-с7-
« Жаңа он жылдық- жаңа экономикалық өрлеу- Қазақстанның жаңа мүмкіндіктері»
2. Долгих .С.Г. Биотехнология диагностики вирусных болезней, оздоровления и размножения плодовых культур в Казахстане. Алматы-2007
3. Власов Ю.И. Вирусные и микоплазменные болезней – М., Колос, 1992-207с
4. Вердеревская Т.Д., Маринеску В.Г Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда – Кишинев: Штиница, 1985-312с
5. Власов Ю.И., Ларина. Э.И. Сельскохозяйственная вирусология – М., 1982
6. Помазков Ю.И. Изучение вирусных заболеваний плодовых и ягодных культур в ССР.// Сб.: Выращивание безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур – М., 1992
7. Весьминш Л., Вердеревская Т.Д. Инфекционные заболевания культурных растений Молдавии – Кишинев, 1996, вып 6.
8. Татаринов А.Н. Вредоносность гуттаперчивости и вирусных болезней яблони./ Садоводство и виноградарство- М., 1994. С.5-6
9. Тулеуов Ж.Т. Поражаемость груши вирусными болезнями. // Вестник с.-х. науки Казахстана, 1989
10. Тулеуов Ж.Т. Распространенность и вредоносность вируса хлоротической пятнистости листьев яблони. // Вестник с.-х. науки Казахстана, 1988,
11. Тулеуов Ж.Т. К вопросу изучения вирусных заболеваний плодовых культур в Казахстане. // XVI планово- методическое совещание по координации научно-исследовательских работ по защите с.-х. растений от вредителей, болезней и сорняков по зонам Казахстана и Киргизстана на 1974г.- Алма-Ата, 1994
12. Тулеуов Ж.Т. Вирусное заболевания яблони и разработка мер борьбы с ними в зонах плодоводства Казахской ССР. // Автореф.канд. с.-х.наук – Тбилиси, 1982-22 с.
13. Тулеуов Ж.Т. Влияние латентных вирусов на листья яблони. // Вестник с.-х.науки Казахстана,1988,11-с.50-53
14. Избасаров Д.С., Клоконос Н.П. Технология оздоровления и размножения ягодных культур в Казахстане – Алматы, 2002-200 с.
15. Тулеуов Ж.Т., Исин М.М. Вирусное болезни плодовых.// Защита растений, 1976,7-с.47
16. Ковальчук И.Ю., Тулеуов Ж.Т. Вирусы, поражающие косточковые культуры в Алма-Атинской области.// Материалы ХХХ конференции молодых ученых – Алматы, 1987-с.104.
17. Долгих С.Г. Вирусные болезни земляники в Алма-Атинской области.// Проблемы эффективности и качества в плодоводстве и виноградарстве на современном этапе- Алма-Ата: Кайнар,1981-с.53.
18. Келдыш М.А., Помазков Ю.И. Методические указания по выявлению и идентификации вирусов и микоплазм, поражающих плодовые и ягодные культуры- М.,1980-32с.
19. Рекомендации по выращиванию безвирусного посадочного материала семечковых культур-Алма-Ата,1989-20с.
20. Семина Н.П. Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве-Мичуринск,1989-с.17-21.
21. Долгих С.Г. Биотехнологические особенности клонального размножения апорта // Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана,-№ 5,2007.
22. Malinowski T. The influense of plant viruses sequence variation on the reliability of PCR based detection methods.// Improvement and unification of Plant Disease diagnostics. Skierniwice-Poland.2004-p.50.
23. Зеленин А.В., Бадаева Е.Д., Муравенко О.В. Введение в геномику растений // Молекулярная биология, 2000, Т.35, Вып.3-с.339-348.
24. Айтхожина Н.А., Калиев А.Б., Филатов В.Д. Использование продуктов генно-инженерных технологий для маркирования генотипов. // Биотехнология-теория и практика, 1997, №3-с. 13-15.
25. Bloch W.A. biochemical perspective of the polymerase chain reaction. // Biochemistry.1991. V.30 – p.2735-2747.
26. Булат С.А., Мироненко Н.В., Кабоев О.К. и др. Заявка на изобретение «Способ идентификации видов организмов» № 4757254, приоритет от 20.11.1989 г. Положительное решение от 5.01.1990.
27. Welsh J.. McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucl.Acids Res. 1990. V.18 – p.7213-7235.
28. Williams J.G.K.. Kubelik A.R.. Livak K.J. et.al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. // Nucl.Acids Res.. 1990.V.18-p.6531-6535.
29. Булат С.А., Кобаев О.К., Мироненко Н.В., Ибатуллин Ф.М., Лучкина Л.А., Суслов А.В. Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов // Генетика, 1992, Т.28 – с.19-28.
30. Сиволап Ю.М. ДНК-типирование в генетико-селекционных исследованиях растений. // Материалы международной конференции: Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы-Алматы, 2004 – с.241-246.
31. Абдугалиева С.И. Молекулярные маркеры для идентификации, оценки и использования генетических ресурсов в селекции растений // Материалы международной конференции: Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетическая ресурсы- Алматы, 2004-с,50-55
32. Сухов К.С., Развязкина Г.М. Биология вирусов и вирусные болезней растений.- М.: Наука. 1995.
32. Сухов К.С. Общая вирусология.- М.: Высшая школа, 1965
33. Попов М.Г. Дикие плодовые заросли окрестности Алма-Аты в заилийском Ала-Тау. – КазкрайОГИЗ,1935
34, Литвиненко И.С. Увеличение устойчивости плодовых растений к повышенным температурам при термическом обеззараживании их от вирусных и микоплазменных болезней.// Плодоводство Нечерноземной полосы.- М., 1984- с 112-120.
35. Долгих С.Г. Особенности культивирования изолированных апексов семечковых культур. // Материалы научно-практической конференции содружества независимых Государств, ч. 2. Каз.СХИ.- Алма-Ата, 1992 – с.51-54.
36. Долгих С.Г., Карычев К.Г., Остаркова Л.В. Клональное микроразмножение и оздоровление сортов и подвоев яблони./// Сб. трудов Каз. НИИПиВ « Научные достижения в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве», 1997, т. 13- с.3-7.
37 . Долгих С.Г. Особенности культивирования Апорта in vitro./ / Сб.трудов Каз.НИИПиВ, 2001, т.16-с.37-40.
38. Литвиненко И.С. Изучение реакции плодовых растений на термическое обеззараживание от вирусов. // Выращивание посадочного материала плодовых и ягодных культур.-М.,1981.
39. Долгих С.Г., Избасаров Д.С. Способ выращивания саженцов семечковых культур in vitro// Патент № 46336 от 11,06,2004.
40. Долгих С.Г. Техника микропрививки яблони in vitro // Биотехнология: теория и практика, 1997, №3-с.25.
41. Долгих С.Г. Изучение роста и развития микропривитых растений яблони in vitro .// Сб.трудов Каз. НИИПиВ. 1998, т.14-с. 83-87.
42, Джеймс Е. Хранение клеток в условиях низких температур.// Биотехнология сельскохозяйственных растений , 1987-с.153-175.
43. Бутенко Р.Г. Культура изолированных протопластов, клеток и тканей в решении задач физиологии растений.// Новые направления в физиологии растений.- М: Наука, 1985-286 с.
44. Биотехнология сельскохозяйственных растений, 1987-357 с.
45. Валиханова Г.Ж., Рахимбаев И.Р. Культура клеток по биотехнологии растений. Алма-Ата, 1989-с.80.
46. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение новых плодово-ягодных растений.- Минск: Навука і тэхніка, 1996-с.246.
47. Долгих С.Г., Клоконос Н.П. Учебное пособие по сельскохозяйственной биотехнологии.- Алматы, 2006-170с.
48. Джигадло М.И., Джигадло Е.Н. Улучшение сортимента и прогрессивные проблемы возделывания плодовых и ягодных культур.- Орел, 1988-с.65-67.
49. Долгих С.Г. Параметрическое регулирование микроразмножения яблони. // Материалы конференции профессор-преподавательского состава КазСХИ-А-Ата, 1993-с.78-79.
50. Долгих С.Г., Соловьева И.И. Особенности культивирования апексов груши. //Материалы научно-практической конференции содружества независимых Государств. Ч.2, КазСХИ-А-Ата, 1992-с22-23.
51. Долгих С.Г., Нелилов С.Н., Бодагова О.П., Проскуряков М.А. Размножение различных пород растений с применением биостимуляторов нового покаления. // Состояние и перспективы рационального использования и охраны агроэкосистем, Алматы, 1994-с.17-19.
52. Клоконос Н.П., Долгих С.Г. Усовершенствование эффективнрй технологии клонального микроразмножения плодово-ягодных культур. // Материалы международной научно-практической конференции « Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии», книга 11- Алматы, 2000-с. 141-142.
53. Корнацкий С.А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздорвленного посадочног материала. //Автореферат, к.с.-х.н-М,1991.
54. Долгих С.Г. Влияние бактериальных препаратов на контаминацию яблони in vitro. // Новости науки Казахстана, 1997, №3-с.73-74.
55. Леонтьев- Орлов О.А., Трушечкин В.Г., Высоцкий В.А. Особенности культивирования изолированных апексов яблони in vitro. // Плодоводство в Нечерноземной полосе. – М., 1988,-с.21-30.
56. Ильина Е.И. Опыт ускоренного размножения яблони in vitro . // Ускорение научно-технического прогресса в плодоводстве и виноградарстве и задачи молодых ученых.-Алма-Ата, 1987-с.27-28.
57. Туровская Н.И. Микроразмножение груши. // Садоводство.-М, 1987,№-с 22-24.
58. Туровская Н.И. Регулирование процесса ризогенеза при микроразмножения яблони. // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве.- Мичуринск, 1989- с.8-13.
59. Туровская Н.И. Микроразмножение яблони и груши in vitro. // Садоводства и виноградарство. –М, 1994, 31-с. 10-12.
60. Долгих С.Г. Параметрическое регулирование клонального микроразмножениия яблони. // Сб.трудов. Каз.НИИПиВ « Научные достижение в биотехнологии, виноградарстве и ягодоводстве» 1997, т,13-с7-
ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТІРЛІГІ
ҚАЗАҚСТАН ИНЖЕНЕРЛІК-ТЕХНОЛОГИЯЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ
Дүкенбаева Б.С
Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық зерттеу
ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫС
050701- Биотехнология мамандығы
Алматы- 2010 ж
Қазақстан Республикасы білім және ғылым министірлігі
Қазақстан инженерлік-технологиялық университеті
Қорғауға жіберілді
каф.мең.,ҚР ҰИА академигі,т.ғ.д.,
проф ____________ Джерембаева Н.Е.
______________________2010ж.
ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫС
тақырыбы: Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық зерттеу
050701- Биотехнология мамандығы бойынша
Орындаған Дүкенбаева Б. С.
Ғылыми жетекшісі
Долгих С.Г.
Алматы- 2010 ж.
Қорғау__________________________
МАК хаттамасы__________________
МАК бағасы _____________________
МАК хатшысы __________________
ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫСҚА
ТҮСІНІКТЕМЕЛІК ЖАЗБА
тақырыбы: Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық зерттеу
Студент
Дүкенбаевава Б. С.
Жетекші
Долгих С.Г.
КЕҢЕСШІЛЕР:
негізгі бөлім бойынша
б.ғ.к.,доц. Долгих С.Г
экономикалық бөлім бойынша _ аға оқыт. Артықбаева Л.К.
еңбек және қоршаған ортаны ____________аға оқыт. Касымов Н.Ж. қорғау
бойынша
нормабақылаушы т.ғ.к.,
доц. Сурашов А.А.
кафедра меңгерушісі
проф.,Джерембаева Н.Е.
Факультеті инженерлік-технологиялық
Мамандық 050701- Биотехнология
Кафедра Азық-түлік өнімдері және өңдеу өндірістерінің технологиясы мен
жабдықтары
Дипломдық жұмысты орындауға берілген
ТАПСЫРМА
Студент Дүкенбаева Бағдат Саматқызы _
Жұмыс тақырыбы: Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық
зерттеу
ЖОО № 211 бұйрығы бойынша 10 желтоқсан 2009 ж. бекітілген
Аяқталған жұмыстың өткізілген уақыты 15 мамыр 2010 ж.
Жұмысты орындаудың бастапқы мәліметтері:
1. Алма мен алмұрт жеміс дақылдарының өсу ұлпалары
2. In vitro жағдайында жеміс дақылдарын микроклональды көбейту әдістемесі
3. Стерильді жағдайда жұмыс жасау әдісі
4. Өсімдіктерді микроклональді көбейту тәсілдері
Дипломдық жұмыста қарастырылған мәселелер тіркесі немесе жұмыстың қысқаша
мазмұны:
Кіріспе ( зерттеу мақсаты, тақырып өзектілігі, тәжірибелік мағынасы )
Теориялық бөлім ( зерттеу бағыты бойынша жасалған деректерге әдебиеттік
шолу)
Тәжірибелік бөлім ( зерттеу әдісі мен зерттеу нысаны, тәжірибелік зерттеу
нәтижесі)
Экономикалық бөлім ( өзіндік құн және кіріс есебі)
Еңбек және қоршаған ортаны қорғау ( қоршаған ортаны қорғау,ғимарат
зертханасындағы еңбекті қорғау және техникалық қауіпсіздік)
Қорытынды
Сызбалық материалдар тізімі ( слайдтар, кестелер, графиктер және басқа.):
1. Бастапқы өсімдік материалдарды стерилдеу.
2. Амплификация өнімдерінің электрофореграммасы.
3. Өңдеудің стерильдеуші затының және экспозициясының алма мен алмұрт ағашы
апекстерінің контаминациясына әсері,
4. Алмұрттың Лесная красавица сұрыбының және алманың Апорт сұрыбының
апекстерін бөлшектеу мерзімдерінің экспланттарына бейімделгіштігіне әсері.
К 5. Жаңа буындағы биостимулятордың алма мен алмұрттың сорттары мен
өскіндеріне әсері.
6 Жеміс дақылдарын in vitro егу технологиясы .
7. Микроеккеннен кейін меристеманың ұшының аман қалғыштығы.
8. Алма мен алмұрттың өз тамырлары бар көшеттерін шығарудың жаңа және
дәстүрлі технологияларын экономикалық бағалау.
Пайдалануға ұсынылатын әдебиеттер:
1.Назарбаев Н.Ә., ҚР Президентінің Қазақстан халқына жолдауы Жаңа он
жылдық – жаңа экономикалық өрлеу – Қазақстанның жаңа мүмкіндіктері 2010
жыл. 2. Долгих С.Г. Биотехнология диагностики вирусных болезней,
оздоровления и размножения плодовых культур в Казахстане, Алматы.- 2007.-
225С 3. Долгих С.Г. Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по
биотехнологии растений, Алматы.- 2007.-87С; 5. Валиханова Г.Ж.
Биотехнология растений: - Алматы: Коннык, 1996._
Дипломдық жұмыстың бөлімдері бойынша тиісті кеңес беру және оны өткізу
мерзімдері:
Раздел Консультант Сроки Подпись
Негізгі бөлім б.ғ.к.,Долгих С.Г 01.03.10-25.03.10
Тәжірибелік бөлім б.ғ.к.,Долгих С.Г 25.03.10-20.04.10
Экономикалық бөлім аға оқыт.Артықбаева Л.Қ 20.04.10-03.05.10
Еңбек және қоршаған 03.04.10-12.05.10
ортаны қорғау аға оқыт.. Касымов Н.Ж.
Қорытынды б.ғ.к.,Долгих С.Г. 12.05.10-15.05.10
Дипломдық жұмыстың орындалу
ГРАФИГІ
№ Тарау аттары, қарастырылғанЖетекшіге (кеңесшіге) Ескерту
пп мәселелер тіркесі өткізетін уақыты
1 Негізгі бөлім 01.03.10-25.03.10
2 Тәжірибелік бөлім 25.03.10-20.04.10
3 Экономикалық бөлім 20.04.10-03.05.10
4 Еңбек және қоршаған ортаны 03.04.10-12.05.10
қорғау
5 Қорытынды 12.05.10-15.05.10
Тапсырма беру күні 10 12 2009г.
Кафедра меңгерушісі _____________________________проф.Д жерембаева Н.Е
Жұмыс жетекшісі ______________________________ Долгих С.Г
Тапсырманы орындауға
қабылдап алған студент_________________________Дүк енбаева Б.С
МАЗМҰНЫ
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...8
1 Әдебиетті
шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ..10
1.1 Жеміс дақылдарының вирустық аурулары және олардың зияндылығы ... 10
1.2 Вирустарды идентификациялау әдісі: полимеразалы тізбекті реакция
... ...13
1.3 Алма ағашы мен алмұрттың in vitro клональды
көбеюі ... ... ... ... ... ... ... . ... 24
1.4 Микроегу
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ...30
2 Зерттеу бөлімі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ..31
2.1Зерттеу нысандары мен әдістемесі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .31
3 Тәжірибелік зерттеу нәтижесі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
..38
4 Экономикалық
бөлім ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ...45
4.1 Жеміс дақылдарының көшеттерінің 1 мың данасын биотехнологиялық
(in vitro) әдіспен өсірудің экономикалық тиімділігі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...45
5 Еңбек және қоршаған ортагы қорғау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 46
Қорытынды
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... 56
Қолданылған әдебиеттер тізімі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
57
Кіріспе
Ауыл шаруашылығына адам тіршілігі үшін қажетті өнімдерді, бірінші
кезекте тағам өнімдерін өндіруді жаңа деңгейге көтеруге мүмкіндік беретін
алдыңғы қатарлы, ғылымды көп қажет ететін технологияларды енгізу соңғы
жылдардың негізгі мәселелерінің біріне айналды, бұл туралы Қазақстан
халқына өз жолдауында Н.А.Назарбаев айтып кетті [1]. Әлемнің жетекші
елдерінің ұлттық экономикаларының осы мәселені шешу жөніндегі басым
бағыттарының бірі биотехнология болып отыр. ХХ ғасырдың соңында отырғызу
материалын сауықтыру үшін өсімдіктердің клеткаларының, ұлпалары мен
органдарының оқшауланған өскіндері технологиялары айтарлықтай тарала
бастады. Қазіргі таңда осы технологиялардың құрылымының ауылшаруашылық
өсімдіктерінің гендік модификациясының тиімділігін арттыруға тиісті болатын
клеткалық-инженерлік технологиялар жағына өзгеруі байқалып отыр.
Ауылшаруашылық биотехнологиясы саласындағы болашақтағы дамудың негізгі
бағыттары болып:
- ауылшаруашылық өнімдерінің өнімділігін, оның тағамдық құндылығын
арттыру;
- сұрыпты жасап шығару мерзімдерін қысқарта және шығындарын төмендете
отырып, биотикалық және абиотикалық факторларға төзімділікке ие болып
келетін сұрыптар селекциясының тиімділігін арттыру;
- өсімдіктердің мәдени және жабайы түрлерінің гендік алуан түрлілігін
сақтап қалу;
- өсімдіктерді жылдам шағынклоналды дамыту және вирустық пен
микоплазмалы инфекциядан сауықтыру;
- жаңа препараттарды: өсімдіктерді әртүрлі аурулардан және зиянкестерден
қорғау құралдарын, өсу мен дамуды реттегіштерді, тағамдық және азықтық
заттарды және дәрілік препараттарды жасап шығару болып табылады.
Осы мәселелерді түпкілікті шешу ауылшаруашылық биотехнологиясының жаңа
технологияларын қалыптастырумен және дәстүрлі бағыттарын жетілдірумен
тікелей байланысты болып отыр, мұның өзі өз кезегінде өсімдік организмін
клеткалық және молекулалық деңгейлерде іргелі зерттеулермен байланысты
болып келеді.
Ауылшаруашылық өсімдіктерінің өнімділік деңгейін арттырудың ғылыми
негізделген тәсілдерін жасап шығару әлемнің барлық елдерінде өзектілігі
жоғары мәселе болып келген және болып қалуда да, өйткені әлем халқының саны
артып келеді, оның тамақ өнімдеріне, оның ішінде өсімдік шаруашылығы
өнімдеріне деген қажеттілігі арта түсуде. Өсімдік шаруашылығы салаларын
дамытудың жалғыз ғана жолы – оны үнемі сұрып жаңарту арқылы қарқынды ету,
өнім өндірудің, оның ішінде сапасы жоғары отырғызу материалын өндірудің
қарқынды технологияларын енгізу. Әлемнің жетекші елдерінің ұлттық
экономикаларының осы мәселені шешудегі басым бағыттарының бірі
биотехнология болып отыр. Бақша шаруашылығының өнімдерін көбейтудің
айтарлықтай резерві вирустық және микоплазмалық аурулардан келетін
шығындарды төмендетуден тұрады. Жеміс дақылдарының вирустық созылмалы
ауруларымен тудырылатын, өнімнің үлкен және тұрақты шығындары питомник
шаруашылығын вирусологиялық бақылаудың қазіргі заманға сай, сенімді
экспресс-әдістерін қолдана отырып, вирустан аман отырғызу материалын
өндіруге көшіруді талап етуде.
Соңғы кездері ғалымдар мен практиктердің көңілін серологиялық әдістер,
PCR-талдау, секвестрлеу және ұлпалар өскіні секілді молекулалық және
клеткалық технологияларды қолдана отырып, өсімдіктерді диагностикалау,
сауықтыру және жылдамдата көбейту әдістері аулап отыр. Қазіргі таңда осы
әдіснаманы қолдану вирустық ауруларды, жасанды қоректік орталарда
оқшауланған ұлпалар мен органдар өскіндерін диагностикалауда; вируссыз
өсімдіктерді жылдамдата клоналды дамытуда, оның ішінде жеміс дақылдарын
шағынкөбейту әдістерін жасап шығаруда айқындаушы фактор болып отыр. Бұдан
өзге, биотехнологиялық әдістермен өсімдіктің кез келген құнды клонын,
сонымен қатар әдеттегі жағдайларда қиын көбейтілетін өсімдік түрлерін
қажетті мөлшерде жылдам көбейтуге, пробиркадағы өсімдіктерді төмен
температураларда ұзақ мерзім сақтауға және өсімдіктердің құнды формаларының
банкін құруға, карантинді нысандарды енгізіп алу қаупінсіз,
пробиркалардағы өсімдік материалымен алмасуға болады. Осы міндеттерді
шешуде инновациялық тәсіл айқындаушы тәсіл болып табылады.
Зерттеулердің мақсаты – инновациялық технологияларды дәнді дақылдардың
вирустық ауруларын диагностикалауға енгізу және оларды ұлпа өскіні арқылы
сауықтыру мүмкіндігін зерттеу.
1 ӘДЕБИЕТТІ ШОЛУ
1. Жеміс дақылдарының вирустық аурулары және олардың зияндылығы
Жеміс дақылдарының вирустық аурулары, әсіресе үлкен зияндылығы бар
аурулары, өткен ғасырдың екінші жартысынан бастап терең зерттелуде.
Аурудың созылмалы өтуіне ие бола отырып, өсімдіктерді жүйелі түрде
зақымдай отырып, вирустар мен микоплазмалар өсімдікке кері қайтпастай
метаболизм өзгерістерін әкеле отырып, әртүрлі патологиялық өзгерістер
туындатады, бұл көп жағдайда өсімдіктің өліміне алып келеді. Бұл жеміс
шаруашылығына шамасы вирустардың таралу дәрежесіне, олардың зияндылығына
және сұрыптың ауруды қабылдағыштығына байланысты болып келетін экономикалық
шығын келтіріп отырады. Зақымдауының жүйелілігіне орай, инфекция өсімдіктің
барлық органдарын зақымдайды. Жеміс өсімдіктерінде вирустық аурулар, ауру
жұқтырмаған өсімдіктермен салыстырғанда, жас өркендер мен тамырлардың дамуы
мен өсу қарқындылығын 2 еседен көп шамада тоқтатып тастайды [2]. Кейбір
вирустық аурулар өнімнің мөлшері мен сапасын күрт төмендетіп жібереді.
Жеміс өсімдіктерінің вирустық ауруларын зерттеудегі маңызды сәт болып
фитопатогенді вирустардың жалпы систематикасындағы ауру қоздырғыштардың
орнын анықтау болып табылады. Бұл жекелеген вирустық аурулардың
қоздырғыштары мен оларды зерттеу барысында бөліп алынған вирустар
арасындағы өзара қатынастарды зерттеген кезде мүмкін болады [3].
Т.Д.Вердеревская мен В.Г.Маринескудің [4] мәліметтері бойынша,
бұлардың патогенді әсері анықталған, жеміс дақылдарының вирустық ауруларын
қоздырғыштар бес топқа біріктірілген:
НЕПО-вирустар; ИЛАР-вирустар; ПОТИ-вирустар; КЛОСТЕРО-вирустар және
алма ағашының әжімділік вирусы тобы.
НЕПО-вирустар тобы. Өзінің nepovirus атауын осы топ бұл вирустардың
нематодтармен (nematode) таралатындығынан, ал олардың бөлшектері диаметрі
30 нм жуық көпқырлылықтар (polyhedra) болып келетіндіктен алған. Олардың
көпшілігі тиісті симптомдар: қожайын өсімдіктерде сақиналы теңбілдіктер,
ақтаңдақтар, өліеттену симптомдарын тудыратындықтан, бұл вирустар сондай-ақ
сақиналы теңбілдіктер вирустары деп те аталады.
Илар-вирустар тобы – бұл екі және одан да көп лабильді бөлшектері бар
вирустар. Әдетте қоңыржай аймақтардағы жеміс ағаштарын зақымдайтын, маңызды
экономикалық мәні бар көптеген вирустардың вириондары екі және одан да көп
типтердің бөлшектерімен көрсетілген; экстрактта хелаттаушы агенттер немесе
қалпына келтірушілер болмаған кезде бұл вирустар тұрақсыз болып келеді.
Вирустардың сфералы бөлшектерінде 15-25% РНК болады, олардың диаметрлері
2035 нм. Осы топтың көптеген вирустары тозаңның немесе дәндердің көмегімен
беріледі.
Илар-вирустар (ilarvirus: isometric labile particles, causing ring
spot, яғни сақиналы теңбілдік симптомдарын индукциялайтын изотермиялық,
лабильді бөлшектері бар вирустар). Илар-вирустар жеміс ағаштарының маңызды
патогендері болып табылады және анықтау үшін негізгі құрамдас бөліктер
ретінде көптеген фитосанитарлық сертификациялық бағдарламаларға енеді [5].
Алма ағашының әжімділік вирустары тобы алма ағашының әжімділік вирусын
(Apple stem grooving virus) енгізеді және ағаштың әжімділік ауруын Virgina
crab, шетінеуін V.Crab, қосылған жерлердің өліеттенуін және алмұрттың
шетінеуін тудырады [6].
Жеміс дақылдарының ең зиянды вирустық және микоплазмалық аурулары:
Алма ағашының мозаикасы көктемде жапырақтарда ашық-сары және ақ
мозаика бояуы түрінде көрініс табады.
Алма ағашы бұтақтарының жалпақтығы тек штамб пен бұтақтарды
зақымдайды, бұларда ісіктер, жаншылу, кейініректе – үсік шалғанға ұқсас
жарықшақтар пайда болады.
Жемістердің қатқыл қабықтары және жұлдызшалы жарылуы одан кейін
бұлардың жұлдызшалы жарылуы жүре отырып, жемістердің қабығында қоңыр,
қатқылданып кеткен дақтардың пайда болуын тудырады. Өліеттенулер, олардың
ұштарының шетінеуін, жапырақтардың хлороздық боялуын және гүлдерінің
кешеуілдетіп шешек атуын тудыра отырып, жас өркендерде де пайда болады.
Жемістердің жасыл әжімделуі жаншылудың терең жатқан жерінде өліеттену
зақымдалуын тудыра отырып, жемістердің пішінін қатты немесе ішінара
өзгертеді, зақымдалған жемістер тауарлық құндылығын толығымен жоғалтып
алады.
Қоңыр сақиналы теңбілдік жұмсағын зақымдамай, жемістердің қабығында
пайда болады. Дапырақтарда әлсіз мозаикалық және әртүрлі дәрежедегі пішін
өзгерту болады.
Латентті вирустар – жеміс дақылдарында ең кең таралған – жапырақтардың
хлорозды теңбілдігі, ағаштың шұңқырлығы, ергежейлілік, алма ағашының
мозаикалылығы, алма ағашының түктілігі, алма ағашы қабығының қауыздылығы.
Латентті вирустармен зақымданған өсімдіктерде аурулардың көзге көрінер
симптомдары болмайды. Олар тек өте бейім келетін сұрыптарда көзге көрінеді,
алайда ауру жұқтыру өнімге әсерін тигізіп, оның шығыны 20-50% құрайды.
Латентті вирустар көбінесе жапырақтардың хлорозды теңбілдігі, алма
ағашының шұңқырлығы және шарка вирустарымен бір кешенде кездеседі. Алма
сұрыптары мен подвойларының осы латентті топтың қоздырғыштарын жұқтыруы өте
жоғары – 85% дейін [7].
Алмұрттың сақиналы мозаикасы көктемде жапырақтарда ақшыл-жасыл түсті
сақиналар мен доғалар түрінде көрініс табады. Жемістердің бетінде қоңыр
сақиналар пайда болады.
Алмұрт пен айва (беке) жемістерінің тастылығы жемістердің пішінін
өзгертуін және жұмсағында склеренхиманың механикалық клеткаларының
жинақталуын тудырады, сондықтан зақымданған жемістер тауарлық және дәмдік
қасиеттерінен айырылады.
Алманың пролиферациясы бұтақталған балауса бұтақтардың (жезтырнақ
сыпырғыштарының) молынан пайда болуын, гүлдердің тым өсіп кетуін,
ағаштардың ерте, күзгі боялуын және ұзын жеміс сағақтарындағы ұсақ
жемістердің қалыптасуын тудырады.
Алмұрттың жапырақтарының жолақтарының сарғыштануы және қызыл
теңбілділігі. Жаздың ортасында жапырақ жолақтары мен жақын жатқан ұлпалар
сары-жасыл түске боялады. Күздің басында дәл сол жапырақтарда жолақтардың
ұзына бойына қызыл және қызыл-қоңыр теңбілдер пайда болады.
Алмұрттың шетінеуі – бұл ағаштардың күні ьұрын, күзгі боялуы, өсуінің
басылуы және жылдам немесе баяу шетінеуі.
Қазақстанда аудандастырылған және болашағы бар алма сұрыптарының,
сондай-ақ вегетативті көбейетін подвойлардың латентті вирустарды қоса
отырып, 87,2%-ға дейін вирустар жұқтыратындығы анықталған. Жекелеген Апорт,
Ренет, Бурхардт, Кандиль Синап сұрыптары – 100%. Нақтылы алар болсақ,
Алматы облысы бойынша мозаика 18,2%-ға дейін, жемістердің жасыл әжімділігі
– 31,1%-ға дейін, жемістердің жұлдызшалы жарылуы – 34,0%-ға дейін,
жапырақтардың хлорозды теңбілдігі – 81%-ға дейін, ағаштың
әжімділігі – 17%-ға дейін, қосылған жердің шетінеуі – 72%-ға дейін, ағаштың
шұңқырлығы – 78%-ға дейін таралып отыр.
Вирус жұқтырған өсімдіктерде ұлпалардың және тамыр жүйесінің
құрылымында терең өзгерістер жүреді. Мысалы, жапырақтар вирустармен ауырған
кезде, флоэма клеткаларының бұзылуына және шетінеуіне орай сарғыштана
бастайды, ал ксилема тамырларында тиллдер пайда болады. Вирустар ісіктер
пайда бола отырып, флоэма паренхималарының меристемалық клеткаларының
аномальды өсуіне ықпал етеді, ал ксилеманың шамадан тыс өсуі жас
өркендердің пішінін өзгертуіне алып келеді. Ауру өсімдіктерде өрбитін осы
патологиялық процестердің барлығы биохимиялық құрамның өзгеруіне және
физиологиялық процестерге әсерін тигізеді. Мысалы, алма ағашының вирустық
аурулары өсімдіктегі қоректік заттардың балансын бұзады: жалпы қант 17,8%-
ға, қышқылдық – 10,9%-ға артады, хлорофилл мөлшері 6,6%-ға және С
витаминінің мөлшері – 17,5%-ға төмендейді [8].
Вирустық аурулардың сыртқы симптомдары вирус изоляттарының
вируленттілігіне, зақымданған дақылдардың төзімділігіне, аурудың даму
дәрежесіне, ауа-райы жағдайларына байланысты қатты өзгереді. Жеміс
дақылдарының бірлесе таралатын вирустарын диагностикалау үшін нақтылы
вирусқа сезімтал шөптесін өсімдіктер-индикаторлар қолданылады. Олар
тудыратын симптомдар бойынша ұқсас, бірақ дербес вирустарды ажырату үшін
дифференциатор өсімдіктер қолданылады. Қоспалардан жекелеген вирустарды
бөліп алу үшін сүзгі-өсімдіктер қолданылады.
Вирустардың термотұрақтылық, инфекциялық және оның сақталу уақыты,
зақымданған ұлпалардағы концентрациясы секілді қасиеттері шөптесін
индикаторлардың шырынында зерттеледі. Вирустарды шөптесін индикаторларға
көшіргеннен кейін, оларды иммунологиялық және биохимиялық зерттеу
мақсатанды, вирустар тазарту мен концентрациялауға оңайлықпен беріледі.
Вирустарды жеміс өсімдіктерінің шырынынан тазартып алу мүмкін емес,
бұл тотықтырғыш ферменттердің, әсіресе полифенолоксидазаның жоғары
белсенділігімен және фенолдардың тотығуының гидролизденген және
конденсацияланған танин мен хинон, полифенолдардың
тотығуынан туындылар түріндегі өнімдерінің жинақталуымен байланысты болып
келеді.
Таниндер мен хинондар вирус бөлшектерімен ерімейтін кешендер түзе
отырып бірігеді, олар тұнбаға түседі де, вирустар жоғалып кетеді немесе
хинондармен біріккен кезде инактивациялнады. Онымен қоймай, вирустардың
қалыпты тазартылуына жеміс шырындарының қою, шырышты болып келетіндігі және
жоғары қышқылдыққа ие болатындығы кедергісін келтіріп отырады.
Оның үстіне жеміс дақылдарына осылардан жекелеген вирустардың
препараттарын алу қиынға соғатын вирус кешендерінің бар болуы тән.
1.1 Вирустарды идентафикациялау әдісі: полимеразалы тізбекті реакция
1985 жылы К.Мюллис өз қызметкерлерімен бірігіп, in vitro жағдайындағы ДНК-
ның реттілігін клондау әдісін жасап шығарды, бұл әдісті полимеразды
тізбекті реакция (ПТР) деп атады. Бұл әдіс гендердің өте көп мөлшердегі
көшірмесін алуға мүмкіндік береді. Ген дегеніміз- бұл нуклеотидтердің бір-
бірімен реттілік негізінде байланысы, және олардың көп дәрежеде
көшірмелерін алуға мүмкіндік беретін ДНҚ сегменті.
ХХ ғасырдың 90-шы жылдары полимеразалы тізбекті реакциямен - PCR-мен
байланысты болып келетін, молекулалық-гендік полиморфизмді анықтаудың жаңа
технологиясы жасап шығарылды. Полимеразалы тізбекті реакцияда вирус
геномының дезоксирибонуклеин қышқылына спецификалы амплификацияға
негізделген диагностикалық әдістер өсімдіктерді қорғауда кеңірек
қолданылатын әдістерге айнала бастады. PCR дезоксирибонуклеин қышқылының
спецификалы реттілігін кеңейту рәсімі болып табылады. дезоксирибонуклеин
қышқылының қызығушылық тудырып отырған саласын фланктеуші реттілікке
қатынас бойынша комплементарлы болатындай етіп жобаланған праймерлер жұбы
дезоксирибонуклеин қышқылы матрицасымен ренатурацияланады және
дезоксирибонуклеин қышқылы полимеразасының кеңеюінің қалыпты функцисы
матрица желісінің реттілігін көшіретін праймерлерді кеңейту үшін
қолданылады. Реакция өнімдері тікелей таңбалау жолымен табылуы мүмкін.
Салыстырмалы түрде қысқа кезең ішінде PCR-талдау, полимеразалы тізбекті
реакцияда патогеннің геномды дезоксирибонуклеин қышқылының спецификалы
ұлғаюына санымен және сипатымен ерекшеленетін варианттарды біріктіре
отырып, дезоксирибонуклеин қышқылының өзгергіштігін зерттеудің ең кең
таралған әдісі болып шыға келді [9].
PCR әдісі шағын биологиялық үлгіден дезоксирибонуклеин қышқылының
реттілігін өте жылдам амплификациялауға мүмкіндік береді [10]. Ол
дезоксирибонуклеин қышқылында потенциалды патогенді гендердің болуын
анықтауға, сонымен қатар векторларға енгізу үшін немесе одан кейінгі
секвенирлеу мақсатында реттіліктерді амплификациялауға мүмкіндік береді.
PCR әдісі шағынорганизмдерді – қайнап жатқан гейзерлердің маңында өмір
сүретін Thermus aquaticus шағыноорганизмдерін ашқаннан кейін жасап
шығарылған болатын. Олардың термотөзімді ферменттері, оның ішінде
дезоксирибонуклеин қышқылы-полимераза, жоғары температуралар кезінде өз
белсенділігін сақтап қалады. Бұл дезоксирибонуклеин қышқылы-полимераза бір
тізбекті дезоксирибонуклеин қышқылымен денатурацияланған,
амплификацияланушы беткейдің шеттері бойынша орналасқан спецификалы 20-30
мүшелі затравкалардың – праймерлердің 4 дезоксирибонуклеотидтер қоспасына
әсерін тигізеді. Алдымен 93-950С температура кезінде дезоксирибонуклеин
қышқылының екі тізбекті молекуласының (фрагментінің) термиялық
денатурациясын (жайылуын) жүзеге асырады, бұл комплементарлы тізбектердің
бөлінуіне алып келеді, ал содан соң сынамаларды 600С дейін салқындатады,
бұл праймерлер мен бір тізбекті дезоксиолигонуклеотидтерге бірігуге
мүмкіндік береді, сонымен қатар Taq-полимеразаның жұмысын іске қосады.
Дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған спиралін тұрақтандыратын сутектік
байланыстар мен жазықтықаралық өзара әсерлесулер айтарлықтай әлсіз болып
келеді және температураны 950С дейін арттырған кезде тізбектердің бөлінуі
жүреді. Мұндай процесті қос тізбектің балқуы, немесе оның денатурациясы деп
атайды. Денатурация – қайтарымды процесс. Дезоксирибонуклеин қышқылының қос
тізбекті құрылымының одан кейін қалпына келуі тіптен тізбектер толығымен
алшақтанған кезде де жүріп отырады. Ренатурация, реассоциация немесе отжиг
деп аталатын, қайтадан бірігу процесі температураны төмендеткен кезде,
комплементарлы негіздердің өзара әрекеттесуі есебінен жүріп отырады.
Бастапқыда нақтылы гендік локустарды амплификациялау және талдау үшін
жасап шығарылған және әмбебап праймерлерді пайдалана отырып,
модификацияланған варианттардағы осы локустардың нуклеотидтік реттілігін
алдын ала білуге негізделген полимеразалы тізбекті реакция кез келген
организмдердің геномдарын егжей-тегжейлі талдау үшін жарамды болып шықты.
Осы жасап шығаруға байланысты, талданып отырған локустардың құрылымы туралы
қандай да бір ақпаратқа деген қажеттілік керексіз боп қалды. Вирустар мен
плазмидтерді қоса отырып, іс жүзінде кез келген организм осылардың
маркерлері болып геномның анонимді локустары болып табылатын гендік
талдауға ұшыратыла алады [11].
AP-PCR (arbitrary primed PCR) – ді жасап шығару кез келген геномдардың
дезоксирибонуклеин қышқылын праймдейтін еркін немесе әмбебап
олигонуклеотидтерді пайдаланудың арқасында мүмкін болып отыр. Осы
праймерлермен амплификацияланған дезоксирибонуклеин қышқылының негізгі
қасиеті болып түрспецификалылығы, яғни биологиялық түр шеңберінде
организмнің PCR паттерндерінің ұқсастығы табылды [12]. Алайда
организмдердің кейбір түрлері, қолданылатын әмбебап праймерлерге тәуелсіз,
гетерогенді PCR паттерндермен сипатталады. Осылардың бір бөлігі аталған түр
особьтарында ұқсас немесе сәйкес PCR-паттерндер, ал қалған бөлігі –
гетерогенді (вариабельді праймерлер) PCR-паттерндер бере алатын,
праймерлердің өздерінің әрекеттерінде де айырмашылық бар.
Праймерлерді әдетте, алдын ала дезоксирибонуклеин қышқылының
амплификацияланатын генімен шекаралас жатқан нуклеотидтік реттілігін
анықтап алып, химиялық синтездеу әдісімен алады. Гендердің шекаралас
учаскелері белгісіз болған кезде дезоксирибонуклеин қышқылымен байланыса
алатын кездейсоқ праймерлер қолданылады. Праймерлер бастапқы (аналық)
дезоксирибонуклеин қышқылының бір тізбекті фрагменттерінің қыздырумен
денатурацияланған гомологиялық учаскелеріне (комплементарлық принцип
бойынша) өздері келіп жанасады. Олар іс жүзінде екі мақсат үшін қызмет
атқарады: біріншіден, дезоксирибонуклеин қышқылы-полимеразаның жұмысын іске
қосады, екіншіден, оның әсерін шектеп тастайды, ферментті
дезоксирибонуклеин қышқылын көшірудің қажетті учаскесінің шеңберінде
бекітіп тастағандай болады.
ПТР-анализдің жалпы түрі 1-суретте көрсетілген.
1-сурет. ПТР-анализдің жалпы түрі.
PCR циклді сипатқа ие. Бірінші және ішінара екінші циклдерде түзілетін
дезоксирибонуклеин қышқылы көшірмелері (ампликондар) амплификацияланатын
геннің шекараларына сәйкес келмейді (бірінші циклда барлық ампликондар және
екінші циклда ампликондардың бір бөлігі екінші – антимәндік праймердің
байланысуы жүре қоймаған учаскелерде созылыңқылау болып шығады). Үшінші
циклдан бастап ампликондардың ұзындығы стандартты бола бастайды, яғни
дезоксирибонуклеин қышқылы-матрицалары фрагменттерінің праймерлердің 3-
ұштары арасындағы нуклеотидтер жұбының санына сәйкес келеді. Ампликондар
геометриялық прогрессияда жинақталады және амплификация өнімдерінің
арасында басымырақ бола бастайды. Синтезделген дезоксирибонуклеин қышқылы
фрагменттерінің өздері одан әрі синтез жүріп жатқан матрица болып қызмет
ететіндіктен, процесс тізбекті сипатқа ие болып келеді. (Сурет-2).
3-4 қадамнан 30-40 цикл:
1 қадам: ДНК денатурациясы
94ºС-та 1 минут
2 қадам: праймерлерлік қыздыру
Тура және кері праймерлер
540С-та 45 секунд
3 қадам: праймерлік реттіліктің артуы
720С-та 2 минут
Сурет-2. ПТР-полимеразды тізбекті
реакция.
(http:allserv.rug.ac.be~avierstr principlespcr.html)
Полимеразалы тізбекті реакцияны жүргізу үшін дезоксирибонуклеин қышқылы
үлгісі дезоксирибонуклеин қышқылы-полимераза ферменті, барлық төрт
нуклеотидтен қоспасы және праймерлер ерітіндісі – көбейтіліп отырған
үлгінің ұштарындағы дезоксирибонуклеин қышқылының қарама-қарсы учаскелеріне
комплементарлы келетін, шамамен алғанда 20 нуклеотидтерден тұратын
синтетикалық учаскелердің ерітінділерінен тұратын пробиркаға
орналастрылады. Одан кейін ерітінді 90-950С дейін қыздырылады,
дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған желісі жалғыз желіге ыдырайды,
500С дейін салқындатады – праймерлер дезоксирибонуклеин қышқылының
комплементарлы учаскелеріне бірігеді, 700С дейін қыздырады – полимераза,
праймерлерді пайдалана отырып, жалғыз желілерді қосарланған желіге дейін
құрады.
Ескерту: 1 цикл: 1 қадам: дезоксирибонуклеин қышқылы денатурациясы (1
минут 94° С кезінде), 2 қадам: праймерлерді қыздыру, тікелей және кері
праймерлер ( 45 секунд 54° С кезінде), 3 қадам: праймерлердің реттілігін,
дәйектілігін арттыра түсу ( 2 минут 72 ° С кезінде), дезоксирибонуклеин
қышқылының алғашқы екі молекуласын алу.
Цикл қайталанады да, 5 минуттан кейін ерітіндіде дезоксирибонуклеин
қышқылының бірдей қосарланған тізбектерінің саны бастапқы ерітіндіге
қарағанда 2 есе, 10 мин кейін – 4 есе, 1,5 сағаттан кейін, 20 циклден соң –
милллион есе, ал отыз
4 цикл циклдан соң, 2,5
сағаттан кейін – миллиард есе көбірек болады(сурет-3).
4 цикл
Берілген ген
3 цикл
2 цикл
1 цикл
ДНҚ матрицасы
35 цикл
22 =
4 көшірме 23 =
8көшірме 16
көшірме 32 көшірме 236 =
68 биллион
көшірме
Сурет-3. ДНҚ амплифициясының схемасы.
1,2, және 3 суреттерде ПТР-анализдің негізгі қадамдары көрсетілген.
Дезоксирибонуклеин қышқылын 90°С кезінде денатурациялауға ұшыратады;
Денатурациялау температурасы мен уақыты екі талап ретіндегі ымырашылдық
ретінде таңдап алынады: 1) матрицаны жақсылап денатурациялау, 2) матрица
мен Taq полимеразаны қатты зақымдамау. Мәселе дезоксирибонуклеин қышқылының
қызырған кезде бұзылатындығында болып отыр. Ыдырау жылдамдығы буферге
байланысты болып келеді (96,5°С кезінде: Н2О -2.5; ТЕ-7.5; 20mM Tris,
рН9,0-~10). Taq полимеразаның ыдырау уақыты температураға байланысты мына
шаманы құрайды: 92.5°С - 130, 95.0°С - 40, 97.5°С - 5 -6. Денатурация
уақыты қолданылатын пробиркалардың түріне қатты байланысты болып келеді.
Қабырғалары жұқа 0.2 ml пробиркалар үшін 94°С кезінде 10-15 секунд
жеткілікті.
50°С кезінде амплификацияланатын беткей праймерлерін қыздыру жұмысын
жүргізеді. Жоғарырақ температура – жоғарырақ спецификалылық, бірақ ол
праймерлердің аталған жұбы үшін сындарлы температурадан асып кетсе болғаны,
өнімнің мөлшері төмендей бастайды. Әдетте қыздыру температурасы
олигонуклеотидтердің балқу температурасына қарағанда 1-2°С-ға төменірек
таңдап алынады.
Праймерлік реттілікті арттыра түсу 70°С кезінде жүреді; осы кезеңде
дезоксирибонуклеин қышқылының негізгі синтезі жүріп отырады. Осы
температура кезінде полимеразалық белсенділік (ол таңбаның шамадан тыс
алынған, денатурацияланған және қыздырылған дезоксирибонуклеин қышқылына
енгізілуі бойынша анықталады) максималды шамада болады. Синтездеу уақыты
Taq полимеразаның жұмыс жылдамдығымен анықталады: 75 -80°С~ 150
нуклеот.сек., 70°С60 нуклеот.сек., 55°С= 24 нуклеот.сек., 37°С=
1.5 нуклеот.сек., 22°С= 0.25 нуклеот.сек.
Бүкіл циклді бірнеше рет қайталайды; Теориялық тұрғыдан 30 циклден соң 250
млн. көшірме алуға болады.
Циклдердің саны әдетте 20-35 болып келеді. Циклдердің тым көп
саны PCR реакцияның қанығуымен қолайсыздыққа ұшыратады: 1) праймерлер
бойынша шектеулер: праймер ретінде дайын өнімді пайдаланудың нәтижесінде
ұзын өнімдердің синтезделуі; 2) нуклеотидтер бойынша шектеулербір тізбекті
өнімдердің үлкен үлесі, қысқа өнімдердің синтезделуі.
5) Реакция қоспасынан амплификацияланған дезоксирибонуклеин қышқылын
бөліп алады. PCR-талдаудың аяқталуына бақылау жасау тәсілдерінің бірі –
реакция қоспасына (крезол қызылсыз) 0,1-ге дейін EtBr (J-gml
(реакцияға дейін-ақ) қосу. Егер PCR-ден кейін пробиркаларды UV-мен
жарықтандырса, осыларда қос тізбекті дезоксирибонуклеин қышқылының
жетерліктей мөлшері түзілгендері ғана жарқырайтын болады.
Синтездеу циклдерін (сынамаларды жоғарыда көрсетілген температуралар
шегінде қыздыру мен салқындатуды қосатын) көп мәрте қайталаған кезде
дезоксирибонуклеин қышқылының спецификалы фрагменттерінің саны
экспоненциалды арта түседі, бұл қолда бар фрагменттердің шамалы санынан
гель-электрофорез әдісімен идентификациялауға болатын көшірмелердің үлкен
санын алуға мүмкіндік береді.(сурет-4).
Рестикциондық эндонуклеазалар днк өлшемдері бойынша ерекшеленетін
бірқатар фрагменттерге бөледі, оларды гель-электрофорездермен бөлуге
болады. Дезоксирибонуклеин қышқылының теріс зарядталған фрагменттері оң
электрод жағына қарай қоныс аударады, бұл ретте фрагмент неғұрлым кішірек
болса, ол соғұрлым жылдамырақ қозғалады. Фрагменттердің өлшемдерін анықтау
үшін қатарлас жатқан көрші жолда дезоксирибонуклеин қышқылының белгілі
өлшемдегі стандартты фрагменттерін бөлуді жүргізеді. Электрофорезден кейін
алынған жолақтарды гельді этидий бромидімен бояу арқылы визуалдандырады, ол
дезоксирибонуклеин қышқылы молекуласына жапсарласып (интеркаляцияланып), УФ-
сәулелерде флюоресценттеледі. Гельді фотосуретке түсіріп алып, алынған
фрагменттердің санын анықтайды. Осы әдіс үшін детекцияның төменгі шегі 25
нг дезоксирибонуклеин қышқылын құрайды. Радиоактивті изотоп фосформен
-32(32 Р) таңбаланған дезоксирибонуклеин қышқылын қолданған кезде рентген
пленкасы 1-2 нг дезоксирибонуклеин қышқылын анықтауға мүмкіндік береді.
Фрагменттің өлшемін дезоксирибонуклеин қышқылының стандартты
фрагменттерінің қоныс аударуымен салыстыру арқылы анықтайды.
Одан әрі блоттинг жүргізеді, ол дезоксирибонуклеин қышқылының бөлінген
фрагменттерін гельден нитроцеллюлозалы немесе нейлон мембраналарға
көшіруден тұрады. Көшіру капиллярлық күштердің әсер етуімен жүргізіледі.
Мембранаға көшірілген дезоксирибонуклеин қышқылын қыздыру арқылы немесе
химиялық реакцияның көмегімен бекітеді, осыдан кейін спецификалы жолақтарды
осының дезоксирибонуклеин қышқылының реттілігі анықталып отырған геннің
реттілігіне комплементарлы болып келетін таңбаланған, радиоактивті ген
зондымен анықтайды. Зонд генмен гибридтеледі, байланыспаған зондты шаю
барысында кетіреді, ал гибридтелген зондты визуалдандырады. Осылайша,
эксперимент түрінде бізді қызықтырып отырған геннің бар екендігін растауға
болады. Соңғы кездері дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған спиралінің
термиялық жазылуын клеткадағы дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған
спиралін дара спиральға ыдырататын хеликаза (гректің helix – спираль
сөзінен) ферментін қоса отырып алмастыру есебінен PCR-талдау жүргізу
уақытын қысқарту қолдан келіп отыр.
PCR-талдау әдістерін шартты түрде моно- және полилокусты, доминантты
және ко- доминантты, би- және полиаллельді деп бөлуге болады. Көрсетілген
PCR-маркерлердің көпшілігі доминантты сипатқа ие және полилокусты,
биаллельді болып табылады. Полилокусты жүйелердің ерекшелігі бір мезгілде
10-30 ампликондарды талдау мүмкіндігі болып табылады. . Полилокусты
маркерлер: 1) агрономиялық маңызды белгілердің түрлері – донорлары мен
мәдени түрлер арасындағы филогендік өзара қатынастарды зерттеу үшін; 2)
гендік қашықтықтарды анықтау және бір түрдің сұрыптары арасындағы гендік
қашықтау дәрежесін көрсететін дендрограммалар құру үшін; 3) ампликондардың
белгілермен ілінісуін анықтау үшін және т.б. қолданылады. Полилокусты RAPD-
талдаудың ерекше қасиеті дезоксирибонуклеин қышқылы-матрицасының реттілігі
туралы ақпаратсыз, праймерлерді синтездеу мүмкіндігі болып табылады.
4-сурет. ПТР-анализ өнімін электрофорез әдісінде идентификациялау.
Праймерлердің реттілігі еркін, бірақ бұл ретте ол бірқатар талаптарға
- ГЦ-жұптардың мөлшеріне жауап береді. Еркін амплификацияланған полиморфты
дезоксирибонуклеин қышқылы бүкіл геном бойынша спецификалы емес
облыстардағы өзгерістерді бақылау әдісі болып келеді. Потенциалды түрде
бүкіл таңдап алынған дезоксирибонуклеин қышқылы бойынша жүздеген сайттармен
гибридтеле алатын, еркін таңдап алынған реттіліктегі бірлі-жарым қысқа
праймер (10 нуклеотидтік негіз) қолданылады. Праймер бір бірінен 2 килобаза
шегіндегі қарама-қарсы орналасқан желілердің екі сайтында ренатурацияланған
кезде, аралық реттілік кеңейе түседі. реттіліктің, енгізілудің және
бөлінулердің мутациялары, осының бәрі кеңейтілген ферменттердің алынған
құрылымындағы полиморфизмге алып келеді. PARD-тың көмегімен бірден бастап
жиырмаға дейін жолақ табылады. Осылар кезінде праймерлердің әртүрлі
ұзындықтары мен концентрациялары қолданылатын, осы әдістің әртүрлі
модификациялары бар. RAPD модификациялары PCR типтері болып табылады:AP-
PCR, ISSR, IRAP, PEMAP, SSAP (2 кесте) ISSR – де праймерлер ретінде
шағынсателлитердің белгілі реттіліктері қолданылады, бұл көшірме алынуын
арттыра түседі және бір мезгілде дезоксирибонуклеин қышқылының бір
фракциясының геномдарын зерттеу ауқымын шектейді. Полиморфизм диапазонын
кеңейту үшін IRAP пен REMAP-та праймерлер ретінде ретранспозондардың LTR
учаскелері қолданылады.
Ко- доминантты PCR-маркерлер арасында шағынсателлиті реттіліктерді
фланктейтін праймерлермен операция жүргізетін SSRP жүйесі ең кең таралымын
тауып отыр. Бір локусты полиаллель жүйе хромосомалардың қатаң белгіленген
учаскелеріндегі өзгергіштікті детекторлауға мүмкіндік береді, бұл геннің
әртүрлі аллельдерін талдау үшін маңызды болып табылады. Гипервариабельді 15-
20 шағынсателлит локустардың өзгергіштігін талдау ауылшаруашылық
өсімдіктерінің сұрыптарын ерекше дифференциациялауға мүмкіндік береді.
Сұрып өзінің қасиеттері, белгілері бойынша басқа өсімдіктерден
ерекшеленетін генотипті көрсетеді. Генотип әр организмде ерекшеленетін
аллельдер жинағымен сипатталады. UPOV-пен қабылданған, сұрыптарды
идентификациялау ауылшаруашылық өсімдіктерінің сұрыптарын DUS-тесттің үш
критерийі: ерекшелік, біртектілік және тұрақтылық бойынша анықтайды.
Молекулалық-гендік полиморфизмді зерттеу үшін қолданылатын PCR-
талдаудың негізгі әдістері 1 кестеде көрсетілген.
Молекулалық генетика саласындағы айтарлықтай прогресс, жекелей алар
болсақ, SSR-маркерлер жүйесін жасап шығару, DUS-тестті толықтыруға
мүмкіндік береді. Өсімдіктердің әртүрлі сұрыптары және жабайы түрлер өз
генотипінде гендердің тіршілік жағдайларына бейімделуді және шаруашылық
тұрғысынан құнды белгілердің дамуының қажетті деңгейін қамтамасыз ететін
ерекше комбинацияларын үйлестіріп отырады. Гендер жинағының, және демек,
дезоксирибонуклеин қышқылы фрагменттерінің ерекшеліктері шағынсателлитті
локустардың аллельді құрамы болып келеді. Локус, мұнда төменгі индекс
ретінде ампликонның (аллельдің) молекулалық салмағы көрініс табатын, латын
әліппесінің әрпімен кодталады.
1 кесте. PCR-талдаудың негізгі әдістері [13].
PCR типіТұқым Праймер типі Полиморфизм типі Ампли-ко
қуалау ндар
типі саны
SSRP К Шағынсателлиттің қарапайым Қайталану 1-2
қайталануын шектейтін, ұзындығындағы
белгілі реттіліктегі (санындағы)
праймерлер жұбы өзгерістер
AFLP К* 1 кезең: адаптерлерге Нүктелік мутация, 30
толығымен комплиментарлы инсерция, делеция
праймерлер; ІІ кезең:
праймерлерде 1-ден 3-ке
дейін адапторларға
комплементарлы емес
негіздер бар
SSAP Д** 1 этап; праймерлер толықтайНүктелік мутация, 30
адаптерлерге транспозиция
комплиментарлы,
ІІ кезең: бір праймерде
1-ден 3-ке дейін
адапторларға комплементарлы
емес негіздер бар, екінші
праймер LTR комплементарлы
RAPD Д Жалғыз, еркін (декамер) Нүктелік мутация, 10-30
праймер инсерция, делеция
АР-PCR Д Жалғыз, еркін (10 п.о.) Нүктелік мутация, 10-30
праймер инсерция, делеция
DAF Д Жеке, еркін (октамер) Нүктелік мутация, 30
праймер инсерция, делеция
ISSR Д Қосымша 1-3 негізі бар, Нүктелік мутация, 10-30
жалғыз, шағынсателлиттік инсерция, делеция
қайталау
IRAP Д Праймер немесе екі праймер Нүктелік мутация, 10-30
LTR комплиментарлы инсерция, делеция
REMAP Д Бір праймер LTR Нүктелік мутация, 10-30
комплиментарлы, екінші инсерция, делеция
праймер-шағынсателлиттік
қайталау
SNP Д RAPD,AP- PCR кезінде дара, Нүктелік мутация, 10-30
AFLP кезінде бірнеше инсерция, делеция
К* - кодоминантты , Д** - доминантты.
Амплификация фрагменті ұзындығының полиморфизмі принципі (AFLP)
геномдық дезоксирибонуклеин қышқылының ретсрикциясының гидролизаты
нәтижесінде алынған барлық фрагменттердің іріктеп алынған жинағының PCR
амплификациясы болып келеді. Геномдық дезоксирибонуклеин қышқылы рестрикция
энзимімен гидролизденеді және адаптер – молекулалармен байланысады. Негізгі
реттіліктен (адаптер бөлігінен), рестрикция энзимінің спецификалы
реттілігінен және 1-3 селективті нуклеотидтерден тұратын PCR праймерлері
толықтай комплементарлы реттілігі бар фрагменттерді ғана кеңейтеді. Бұл
кезде гельдік электрофорез нәтижесінде бөлініп алынатын және әдетте
доминантты маркер ретінде бағаланатын көптеген геномдық сайттардан (әр
реакция кезінде әдетте 50-100 фрагмент) көптеген геномдық сайттардан
фрагменттер түзіледі.
Дезоксирибонуклеин қышқылы-технологиялар осыларға агрономиялық маңызы
бар көрсеткіштердің көпшілігі, оның ішінде вирус инфекциясына төзімділік те
жататын сандық полигенді белгілердің (QTL) локустарын таңбалауға мүмкіндік
береді.
1.3 Алма ағашы мен алмұрттың in vitro клональды көбеюі
Клональды көбею – бұл гендік ерекшеліктерін сақтай отырып, сұрыптарды,
клондарды, түрлерді жылдам репродукциялау. Бұл, мысалға, бұтақшалау секілді
вегетативтік көбеюдің түрлерінің бірі, бірақ толықтай асептика
жағдайларында, арнайы жасап шығарылған қоректік орталарда, бақыланатын
температура мен жарық режимі кезінде жүргізіледі. Бастапқы материал болып
меристемалық ұштар немесе тұтас бүршіктер қызмет етеді. Дұрыс іріктеп
алынған жағдайлар кезінде, бірнеше аптадан кейін, аталған экспланттар
бірнеше жас өркенді продуциялайды, бұлар өз кезегінде, қайта отырғызған
кезде, жаңа қоректік ортада қосымша жас өркен түзеді. Осылайша, өсірудің
бірнеше айы ішінде, бірнеше мыңдаған жас өркен алынып отырады.
Бақша шаруашылығында биотехнология әдістерін қолдану жоғары
экономикалық әсерді қамтамасыз етеді. Бұл әсер қысқа мерзім ішінде жоғары
өнімділікке және көбею коэффициентіне ие болып келетін, сапасы жоғары
отырғызу материалын алумен байланысты болып келеді. Бұл ретте өндіріске
жаңа үлгілерді енгізу мерзімі 2-3 жылға қысқарады, коллекциялық материалды
сақтау алаңдары 50-100 есе азаяды, жаңа гибридтік түрлерді алу мерзімі 2-5
жылға қысқарады және қазірде бар сұрыптарды жекелеген белгілері, қасиеттері
бойынша жақсарту мүмкіндігі пайда болады. Бүгінгі таңда бақша
шаруашылығында клональды шағынкөбею ең кеңінен енгізілген. Отырғызу
материалын жасап шығару жүйесіне енгізілген бұл әдіс, дәстүрлі бұталау және
ұлаумен салыстырғанда, бірқатар дау тудырмайтын басымдылықтарды қамтамасыз
етеді. Алайда, басқа қандай болсын тәсіл секілді, in vitro ұлпалар мен
органдар өскіні бірқатар артықшылықтар мен кемшіліктерге ие болып келеді.
Артықшылықтарына: кешенді сауықтыру мүмкіндігі; көбеюдің жоғары
коэффициенті; процестің икемділігі; қысқа уақыт ішінде өсімдіктердің
көптеген санын алу мүмкіндігі; оптималды мерзімдерде отырғызу үшін
пробиркада өсірілген өсімдіктерді сақтау және жинақтау; кәдімгі жағдайларда
репродукцияға төмен қабілетитілікке ие болатын үлгілерді тираждауды жүргізу
мүмкіндігі; бұтақтардың ризогенезге қабілеттілігінің артуы, ағашты
өсімдіктерде жас өркендердің үлкен санының түзілуі есебінен, одан әрі
көбеюге потенциалды қабілеттілігі арта түскен материалдың алынуы. Екінші
жағынан алғанымызда, биотехнологиялық әдістер үшін, қоспаны өсімдіктерді
стерильді емес жағдайларға отырғызғанға дейін кетіруге болмайтындықтан,
бастапқы үлгілерді барлық көрсеткіштер бойынша мұқият іріктеп алу қажет
болады. Әдістің кемшіліктеріне in vitro операциядан кейін материалды
стерильді емес жағдайларда өсіру үшін, өсімдіктердің стандартты
көрсеткіштерге қол жеткізуі үшін қосымша шығындар қажет екендігі де жатады.
Солай бола тұрса да, бірқатар жағдайларда сауықтырылған отырғызу материалын
алу үшін жалғыз ғана тәсіл болып дербес немесе термотерапиямен үйлескен
сауықтыру тәсілі ретінде қолданылатын, оқшауланған апекстер өскіні болып
табылады.
Қазіргі таңда шағынклоналды көбейту мыналар үшін қолданылып отырады:
- селекцияда – in vitro алынған гендік инженерияның барлық өнімдерін
қоса отырып, жекелеген генотиптердің немесе жаңа, болашағы бар
сұрыптардың шамалы санын ұстап тұру және көбейту үшін;
- оларды өнеркәсіп өндірісіне енгізуге кететін шығындарды және
уақытта үнемдей отырып, жаңадан шығарылған сұрыптарды жылдам
(бірнеше айлар ішінде бірнеше мың есеге дейін) көбейту үшін:
- вируссыз материалдардың көп мөлшерін жылдам алу үшін. Бірнеше айлар
ішінде in vitro өсірген кезде еденде 4 жыл ішінде алынатын санын
алуға болады;
- ағашты өсімдіктерде жыныстық көбею процесінің ұзақтығына орай
баяуырақ жүзеге асырылатын көбею мен селекцияны жылдамдату үшін
қолданылады. Онымен қоймай, осы түрлердің көпшілігі вегетативтік
көбейтуге зор қиындықпен беріледі.
Тестілеу, индикаторларды ұстап тұру, зертханалық жабжықтарды және
теплица алаңдарын амортизациялау аясында биотехнологиялық әдістермен
өндірілген өсімдіктердің өзіндік құны айтарлықтай төмен болып келеді. Ал
енді сауықтыру тиімділігінің артуы бұл әдістерді сауықтырылған отырғызу
материалын өндіру үшін стандартты етіп жіберді.
Клоналды шағынкөбейтудің міндетті шарты процестің барлық кезеңдерінде:
экспланттан бастап егістіктегі өсімдіктерге дейін гендік тұрақтылығын
толығымен сақтап қалатын нысандарды пайдалану болып табылады. Бұл шарттарды
сабақтық шығу тегі бар органдардың қуыс бүршіктері және апекстер, яғни
меристемалар қанағаттандырады. Өсімдіктің меристемалық ұлпалары үздіксіз
эмбриондық-белсенді күйде ұсталып тұрады. Олар дезоксирибонуклеин қышқылы
репарация жүйелерінің жоғары белсенділігіне орай гендік өзгерістерге
төзімді келеді.
Питомник шаруашылығында сондай-ақ вирустар мен патогенді
шағынорганизмдерден сауықтыру және өсімдіктерді көбейту үшін оқшауланған
ұлпалар мен органдар өскіні де қолданылады. Осыф тәсілмен вирустардан және
басқа да патогендерден босану осыларда көбею тәсілінің өзі аурулардың
таралуына ықпал ететін, вегетативті дамитын өсімдіктерде ғана мүмкін
болады. Вирустық аурулармен кәдімгі химиялық әдістермен күресу мүмкін емес,
өйткені вирустардың тіршілік әрекеті қожайын-өсімдік клеткасының
метаболизмімен тығыз байланысқан. Вирустық аурулармен күресудің негізгі
жолы – in vitro клоналды шағынкөбею әдісін қолдана отырып, сау отырғызу
материалын алу.
Клоналды шағынкөбею – бұл бастапқыға ұқсас өсімдіктерді жылдам,
жыныссыз алу үшін in vitro техникасын пайдалану. Дәстүрлі әдіспен
салыстырғандағы, өсімдіктердің шағынкөбеюінің артықшылығы көбеюдің жоғары
коэффициенттері (1:1 млн), аналық және көбейтілетін өсімдіктер алып жататын
алаңдардың үнемделуіне алып келетін, процестің миниатюралануы; себілген
материалдың ювенильді фазадан шығуынсыз көбеюі. Жұмыстардың көпшілігін жыл
бойы зертхана жағдайларында орындайды және өсімдіктерді белгілі бір
мерзімге қарай алады. Пробиркадағы өсімдіктерді төмен температура кезінде
ұзақ уақыт сақтау өсімдіктердің құнды формаларының банкін құруға және
оның ішінде халықаралық ауқымда да, карантинді нысандарды енгізу қаупінсіз,
пробиркадағы өсімдіктерді алмасуды жүргізуге мүмкіндік береді [14].
Сақталып отырған құнды генотиптерді және сауықтырылған өсімдіктерді қажет
болған жағдайда селекциялау процесіне жылдам қосуға, әлде қайталап ауру
құқтыру қаупінсіз, сауықтырылған материал жасаудың қолданылып отырған
схемаларына қосуға болады, бұл өз кезегінде тестілеу мен сауықтыруға
кететін материалдық және еңбек ресурстарын үнемдеуге мүмкіндік береді.
Генетиктер мен селекционерлер үшін бұл әдістер индукцияланған мутагенез
кезінде, өсу нүктесінің бірлі-жарым, мутацияланған клеткаларын толығымен
дамыған өсімдік сатысына дейін жеткізу есебінен, алынатын мутациялар
спектрін кеңейтуге мүмкіндік береді. Ерте сатыларда екпе материалдарының
гендік ұқсас көшірмелерін алу мүмкіндігі пайда болады, бұл одан әрі жерде
сыртқы ортаның қандай да болсын факторының организмнің қалыптасуындағы
ролін анық бөліп көрсетуге мүмкіндік береді.
Аталған технологияның үлкен артықшылығы сондай-ақ in vitro жағдайында
кәдімгі тәсілдермен көбеймейтін, немесе нашар көбейетін өсімдіктердің,
мысалы, алма ағашының жиірек көбейетіндігі және тамырланатындығы болып
табылады. Өсімдіктердің шағынклоналды көбеюінің көбеюдің дәстүрлі тәсілі
алдындағы, әсіресе оның рентабельділігі тұрғысынан артықшылықтарының айдан
анық болғандығы соншалықты, оның бұдан әрі жетілдірілуіне және дамытылуына
сөзсіз ықпал етіп, дем береді. Бұл біздің қазіргі заманымызда көкейтесті
болып отыр.
Өсімдіктердің клоналды шағындамуының көбею коэффициенті, өсімдіктердің
гендік тұрақтылығына қатысты сенімділігі, өсімдіктердің белгілі біртүрі
үшін қолдану бойынша ерекшеленетін бірнеше үлгісін бөліп көрсетуге болады
[245]. Осы үлгілердің ішінде:
1) өсімдіктер ұлпаларының каллусынан органогенезді немесе соматикалық
эмбриогенезді индукциялау;
2) экспланттар ұлпасынан адвентивті жас өркендердің дамуы;
3) қуыстардағы меристемалардың даму индукциясы көңіл қоюымызға
лайықты.
Биотехнологияда көбеюдің үшінші үлгісі – апикальды басымдылықты алып
тастауға негізделген, қуыстағы жас өркендердің пролиферациясы ең көп
таралып отыр. Бұл әдіс отырғызу материалын жасау кезінде өнеркәсіптік болып
алып үлгерді және жеміс дақылдарын көбейтуге қатысты ең сенімді әдіс болып
табылады. Бұл тәсіл апикальды басымдылықты алып тастауға негізделген, бұл
екі жолмен жүзеге асырылуы мүмкін [15].
1. Қалыпты пропорциялардағы жас өркендерді алып, одан кейін бұларды
көбейту циклын қайталау үшін екінші реттік эксплант ретінде қолданылатын
бір бүршікті шағынбұтақшаларға бөлу. Картопты, жүзімді көбейткен кезде
бұл әдіс жиі қолданылып отырады. Екі ай ішінде 10 шағынбұтақша беретін бір
жас өркен алуға болады деген шартпен, осындай тәсілдің теориялық мүмкіндігі
шамамен алғанда жылына 100 мың – 1 млн. жас өркен құрайды.
2. Апикальды басымдылықты цитокининдердің көмегімен алып тастау
түйінаралықтары салыстырмалы түрде қысқа келетін жас өркендердің
қалыптасуына алып келеді, ал қуыстағы бүршіктер мен меристемалық
төмпешіктер жаңа жас өркендерге бастау береді. Қуыстағы бүршіктерді
индукциялау үшін ортадағы фитогормондардың концентрациясын дұрыс таңдап алу
өте маңызды болып келеді. Цитокининдердің көп мөлшері өсімдік морфологиясын
өзгертуі мүмкін және кейіпсіз пішіндердің пайда болуына алып келеді.
Цитокининдердің жоғары концентрацияларының улы әсерінің нәтижесінде
экспланттар тіптен шетінеп те кетеді.
Ортадағы фитогормондардың дұрыс таңдап алынған концентрациясы кезінде
біртекті емес тұқым алу тәуекелі минималды, мутацияның пайда болу жиілігі
көбейтудің дәстүрлі тәсілдеріне қарағанда ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
ҚАЗАҚСТАН ИНЖЕНЕРЛІК-ТЕХНОЛОГИЯЛЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ
Дүкенбаева Б.С
Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық зерттеу
ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫС
050701- Биотехнология мамандығы
Алматы- 2010 ж
Қазақстан Республикасы білім және ғылым министірлігі
Қазақстан инженерлік-технологиялық университеті
Қорғауға жіберілді
каф.мең.,ҚР ҰИА академигі,т.ғ.д.,
проф ____________ Джерембаева Н.Е.
______________________2010ж.
ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫС
тақырыбы: Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық зерттеу
050701- Биотехнология мамандығы бойынша
Орындаған Дүкенбаева Б. С.
Ғылыми жетекшісі
Долгих С.Г.
Алматы- 2010 ж.
Қорғау__________________________
МАК хаттамасы__________________
МАК бағасы _____________________
МАК хатшысы __________________
ДИПЛОМДЫҚ ЖҰМЫСҚА
ТҮСІНІКТЕМЕЛІК ЖАЗБА
тақырыбы: Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық зерттеу
Студент
Дүкенбаевава Б. С.
Жетекші
Долгих С.Г.
КЕҢЕСШІЛЕР:
негізгі бөлім бойынша
б.ғ.к.,доц. Долгих С.Г
экономикалық бөлім бойынша _ аға оқыт. Артықбаева Л.К.
еңбек және қоршаған ортаны ____________аға оқыт. Касымов Н.Ж. қорғау
бойынша
нормабақылаушы т.ғ.к.,
доц. Сурашов А.А.
кафедра меңгерушісі
проф.,Джерембаева Н.Е.
Факультеті инженерлік-технологиялық
Мамандық 050701- Биотехнология
Кафедра Азық-түлік өнімдері және өңдеу өндірістерінің технологиясы мен
жабдықтары
Дипломдық жұмысты орындауға берілген
ТАПСЫРМА
Студент Дүкенбаева Бағдат Саматқызы _
Жұмыс тақырыбы: Биотехнология саласында жеміс дақылдарын инновациялық
зерттеу
ЖОО № 211 бұйрығы бойынша 10 желтоқсан 2009 ж. бекітілген
Аяқталған жұмыстың өткізілген уақыты 15 мамыр 2010 ж.
Жұмысты орындаудың бастапқы мәліметтері:
1. Алма мен алмұрт жеміс дақылдарының өсу ұлпалары
2. In vitro жағдайында жеміс дақылдарын микроклональды көбейту әдістемесі
3. Стерильді жағдайда жұмыс жасау әдісі
4. Өсімдіктерді микроклональді көбейту тәсілдері
Дипломдық жұмыста қарастырылған мәселелер тіркесі немесе жұмыстың қысқаша
мазмұны:
Кіріспе ( зерттеу мақсаты, тақырып өзектілігі, тәжірибелік мағынасы )
Теориялық бөлім ( зерттеу бағыты бойынша жасалған деректерге әдебиеттік
шолу)
Тәжірибелік бөлім ( зерттеу әдісі мен зерттеу нысаны, тәжірибелік зерттеу
нәтижесі)
Экономикалық бөлім ( өзіндік құн және кіріс есебі)
Еңбек және қоршаған ортаны қорғау ( қоршаған ортаны қорғау,ғимарат
зертханасындағы еңбекті қорғау және техникалық қауіпсіздік)
Қорытынды
Сызбалық материалдар тізімі ( слайдтар, кестелер, графиктер және басқа.):
1. Бастапқы өсімдік материалдарды стерилдеу.
2. Амплификация өнімдерінің электрофореграммасы.
3. Өңдеудің стерильдеуші затының және экспозициясының алма мен алмұрт ағашы
апекстерінің контаминациясына әсері,
4. Алмұрттың Лесная красавица сұрыбының және алманың Апорт сұрыбының
апекстерін бөлшектеу мерзімдерінің экспланттарына бейімделгіштігіне әсері.
К 5. Жаңа буындағы биостимулятордың алма мен алмұрттың сорттары мен
өскіндеріне әсері.
6 Жеміс дақылдарын in vitro егу технологиясы .
7. Микроеккеннен кейін меристеманың ұшының аман қалғыштығы.
8. Алма мен алмұрттың өз тамырлары бар көшеттерін шығарудың жаңа және
дәстүрлі технологияларын экономикалық бағалау.
Пайдалануға ұсынылатын әдебиеттер:
1.Назарбаев Н.Ә., ҚР Президентінің Қазақстан халқына жолдауы Жаңа он
жылдық – жаңа экономикалық өрлеу – Қазақстанның жаңа мүмкіндіктері 2010
жыл. 2. Долгих С.Г. Биотехнология диагностики вирусных болезней,
оздоровления и размножения плодовых культур в Казахстане, Алматы.- 2007.-
225С 3. Долгих С.Г. Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по
биотехнологии растений, Алматы.- 2007.-87С; 5. Валиханова Г.Ж.
Биотехнология растений: - Алматы: Коннык, 1996._
Дипломдық жұмыстың бөлімдері бойынша тиісті кеңес беру және оны өткізу
мерзімдері:
Раздел Консультант Сроки Подпись
Негізгі бөлім б.ғ.к.,Долгих С.Г 01.03.10-25.03.10
Тәжірибелік бөлім б.ғ.к.,Долгих С.Г 25.03.10-20.04.10
Экономикалық бөлім аға оқыт.Артықбаева Л.Қ 20.04.10-03.05.10
Еңбек және қоршаған 03.04.10-12.05.10
ортаны қорғау аға оқыт.. Касымов Н.Ж.
Қорытынды б.ғ.к.,Долгих С.Г. 12.05.10-15.05.10
Дипломдық жұмыстың орындалу
ГРАФИГІ
№ Тарау аттары, қарастырылғанЖетекшіге (кеңесшіге) Ескерту
пп мәселелер тіркесі өткізетін уақыты
1 Негізгі бөлім 01.03.10-25.03.10
2 Тәжірибелік бөлім 25.03.10-20.04.10
3 Экономикалық бөлім 20.04.10-03.05.10
4 Еңбек және қоршаған ортаны 03.04.10-12.05.10
қорғау
5 Қорытынды 12.05.10-15.05.10
Тапсырма беру күні 10 12 2009г.
Кафедра меңгерушісі _____________________________проф.Д жерембаева Н.Е
Жұмыс жетекшісі ______________________________ Долгих С.Г
Тапсырманы орындауға
қабылдап алған студент_________________________Дүк енбаева Б.С
МАЗМҰНЫ
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...8
1 Әдебиетті
шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ..10
1.1 Жеміс дақылдарының вирустық аурулары және олардың зияндылығы ... 10
1.2 Вирустарды идентификациялау әдісі: полимеразалы тізбекті реакция
... ...13
1.3 Алма ағашы мен алмұрттың in vitro клональды
көбеюі ... ... ... ... ... ... ... . ... 24
1.4 Микроегу
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ...30
2 Зерттеу бөлімі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ..31
2.1Зерттеу нысандары мен әдістемесі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .31
3 Тәжірибелік зерттеу нәтижесі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
..38
4 Экономикалық
бөлім ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ...45
4.1 Жеміс дақылдарының көшеттерінің 1 мың данасын биотехнологиялық
(in vitro) әдіспен өсірудің экономикалық тиімділігі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...45
5 Еңбек және қоршаған ортагы қорғау
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 46
Қорытынды
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
... ... ... ... ... ... ... ... 56
Қолданылған әдебиеттер тізімі
... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
57
Кіріспе
Ауыл шаруашылығына адам тіршілігі үшін қажетті өнімдерді, бірінші
кезекте тағам өнімдерін өндіруді жаңа деңгейге көтеруге мүмкіндік беретін
алдыңғы қатарлы, ғылымды көп қажет ететін технологияларды енгізу соңғы
жылдардың негізгі мәселелерінің біріне айналды, бұл туралы Қазақстан
халқына өз жолдауында Н.А.Назарбаев айтып кетті [1]. Әлемнің жетекші
елдерінің ұлттық экономикаларының осы мәселені шешу жөніндегі басым
бағыттарының бірі биотехнология болып отыр. ХХ ғасырдың соңында отырғызу
материалын сауықтыру үшін өсімдіктердің клеткаларының, ұлпалары мен
органдарының оқшауланған өскіндері технологиялары айтарлықтай тарала
бастады. Қазіргі таңда осы технологиялардың құрылымының ауылшаруашылық
өсімдіктерінің гендік модификациясының тиімділігін арттыруға тиісті болатын
клеткалық-инженерлік технологиялар жағына өзгеруі байқалып отыр.
Ауылшаруашылық биотехнологиясы саласындағы болашақтағы дамудың негізгі
бағыттары болып:
- ауылшаруашылық өнімдерінің өнімділігін, оның тағамдық құндылығын
арттыру;
- сұрыпты жасап шығару мерзімдерін қысқарта және шығындарын төмендете
отырып, биотикалық және абиотикалық факторларға төзімділікке ие болып
келетін сұрыптар селекциясының тиімділігін арттыру;
- өсімдіктердің мәдени және жабайы түрлерінің гендік алуан түрлілігін
сақтап қалу;
- өсімдіктерді жылдам шағынклоналды дамыту және вирустық пен
микоплазмалы инфекциядан сауықтыру;
- жаңа препараттарды: өсімдіктерді әртүрлі аурулардан және зиянкестерден
қорғау құралдарын, өсу мен дамуды реттегіштерді, тағамдық және азықтық
заттарды және дәрілік препараттарды жасап шығару болып табылады.
Осы мәселелерді түпкілікті шешу ауылшаруашылық биотехнологиясының жаңа
технологияларын қалыптастырумен және дәстүрлі бағыттарын жетілдірумен
тікелей байланысты болып отыр, мұның өзі өз кезегінде өсімдік организмін
клеткалық және молекулалық деңгейлерде іргелі зерттеулермен байланысты
болып келеді.
Ауылшаруашылық өсімдіктерінің өнімділік деңгейін арттырудың ғылыми
негізделген тәсілдерін жасап шығару әлемнің барлық елдерінде өзектілігі
жоғары мәселе болып келген және болып қалуда да, өйткені әлем халқының саны
артып келеді, оның тамақ өнімдеріне, оның ішінде өсімдік шаруашылығы
өнімдеріне деген қажеттілігі арта түсуде. Өсімдік шаруашылығы салаларын
дамытудың жалғыз ғана жолы – оны үнемі сұрып жаңарту арқылы қарқынды ету,
өнім өндірудің, оның ішінде сапасы жоғары отырғызу материалын өндірудің
қарқынды технологияларын енгізу. Әлемнің жетекші елдерінің ұлттық
экономикаларының осы мәселені шешудегі басым бағыттарының бірі
биотехнология болып отыр. Бақша шаруашылығының өнімдерін көбейтудің
айтарлықтай резерві вирустық және микоплазмалық аурулардан келетін
шығындарды төмендетуден тұрады. Жеміс дақылдарының вирустық созылмалы
ауруларымен тудырылатын, өнімнің үлкен және тұрақты шығындары питомник
шаруашылығын вирусологиялық бақылаудың қазіргі заманға сай, сенімді
экспресс-әдістерін қолдана отырып, вирустан аман отырғызу материалын
өндіруге көшіруді талап етуде.
Соңғы кездері ғалымдар мен практиктердің көңілін серологиялық әдістер,
PCR-талдау, секвестрлеу және ұлпалар өскіні секілді молекулалық және
клеткалық технологияларды қолдана отырып, өсімдіктерді диагностикалау,
сауықтыру және жылдамдата көбейту әдістері аулап отыр. Қазіргі таңда осы
әдіснаманы қолдану вирустық ауруларды, жасанды қоректік орталарда
оқшауланған ұлпалар мен органдар өскіндерін диагностикалауда; вируссыз
өсімдіктерді жылдамдата клоналды дамытуда, оның ішінде жеміс дақылдарын
шағынкөбейту әдістерін жасап шығаруда айқындаушы фактор болып отыр. Бұдан
өзге, биотехнологиялық әдістермен өсімдіктің кез келген құнды клонын,
сонымен қатар әдеттегі жағдайларда қиын көбейтілетін өсімдік түрлерін
қажетті мөлшерде жылдам көбейтуге, пробиркадағы өсімдіктерді төмен
температураларда ұзақ мерзім сақтауға және өсімдіктердің құнды формаларының
банкін құруға, карантинді нысандарды енгізіп алу қаупінсіз,
пробиркалардағы өсімдік материалымен алмасуға болады. Осы міндеттерді
шешуде инновациялық тәсіл айқындаушы тәсіл болып табылады.
Зерттеулердің мақсаты – инновациялық технологияларды дәнді дақылдардың
вирустық ауруларын диагностикалауға енгізу және оларды ұлпа өскіні арқылы
сауықтыру мүмкіндігін зерттеу.
1 ӘДЕБИЕТТІ ШОЛУ
1. Жеміс дақылдарының вирустық аурулары және олардың зияндылығы
Жеміс дақылдарының вирустық аурулары, әсіресе үлкен зияндылығы бар
аурулары, өткен ғасырдың екінші жартысынан бастап терең зерттелуде.
Аурудың созылмалы өтуіне ие бола отырып, өсімдіктерді жүйелі түрде
зақымдай отырып, вирустар мен микоплазмалар өсімдікке кері қайтпастай
метаболизм өзгерістерін әкеле отырып, әртүрлі патологиялық өзгерістер
туындатады, бұл көп жағдайда өсімдіктің өліміне алып келеді. Бұл жеміс
шаруашылығына шамасы вирустардың таралу дәрежесіне, олардың зияндылығына
және сұрыптың ауруды қабылдағыштығына байланысты болып келетін экономикалық
шығын келтіріп отырады. Зақымдауының жүйелілігіне орай, инфекция өсімдіктің
барлық органдарын зақымдайды. Жеміс өсімдіктерінде вирустық аурулар, ауру
жұқтырмаған өсімдіктермен салыстырғанда, жас өркендер мен тамырлардың дамуы
мен өсу қарқындылығын 2 еседен көп шамада тоқтатып тастайды [2]. Кейбір
вирустық аурулар өнімнің мөлшері мен сапасын күрт төмендетіп жібереді.
Жеміс өсімдіктерінің вирустық ауруларын зерттеудегі маңызды сәт болып
фитопатогенді вирустардың жалпы систематикасындағы ауру қоздырғыштардың
орнын анықтау болып табылады. Бұл жекелеген вирустық аурулардың
қоздырғыштары мен оларды зерттеу барысында бөліп алынған вирустар
арасындағы өзара қатынастарды зерттеген кезде мүмкін болады [3].
Т.Д.Вердеревская мен В.Г.Маринескудің [4] мәліметтері бойынша,
бұлардың патогенді әсері анықталған, жеміс дақылдарының вирустық ауруларын
қоздырғыштар бес топқа біріктірілген:
НЕПО-вирустар; ИЛАР-вирустар; ПОТИ-вирустар; КЛОСТЕРО-вирустар және
алма ағашының әжімділік вирусы тобы.
НЕПО-вирустар тобы. Өзінің nepovirus атауын осы топ бұл вирустардың
нематодтармен (nematode) таралатындығынан, ал олардың бөлшектері диаметрі
30 нм жуық көпқырлылықтар (polyhedra) болып келетіндіктен алған. Олардың
көпшілігі тиісті симптомдар: қожайын өсімдіктерде сақиналы теңбілдіктер,
ақтаңдақтар, өліеттену симптомдарын тудыратындықтан, бұл вирустар сондай-ақ
сақиналы теңбілдіктер вирустары деп те аталады.
Илар-вирустар тобы – бұл екі және одан да көп лабильді бөлшектері бар
вирустар. Әдетте қоңыржай аймақтардағы жеміс ағаштарын зақымдайтын, маңызды
экономикалық мәні бар көптеген вирустардың вириондары екі және одан да көп
типтердің бөлшектерімен көрсетілген; экстрактта хелаттаушы агенттер немесе
қалпына келтірушілер болмаған кезде бұл вирустар тұрақсыз болып келеді.
Вирустардың сфералы бөлшектерінде 15-25% РНК болады, олардың диаметрлері
2035 нм. Осы топтың көптеген вирустары тозаңның немесе дәндердің көмегімен
беріледі.
Илар-вирустар (ilarvirus: isometric labile particles, causing ring
spot, яғни сақиналы теңбілдік симптомдарын индукциялайтын изотермиялық,
лабильді бөлшектері бар вирустар). Илар-вирустар жеміс ағаштарының маңызды
патогендері болып табылады және анықтау үшін негізгі құрамдас бөліктер
ретінде көптеген фитосанитарлық сертификациялық бағдарламаларға енеді [5].
Алма ағашының әжімділік вирустары тобы алма ағашының әжімділік вирусын
(Apple stem grooving virus) енгізеді және ағаштың әжімділік ауруын Virgina
crab, шетінеуін V.Crab, қосылған жерлердің өліеттенуін және алмұрттың
шетінеуін тудырады [6].
Жеміс дақылдарының ең зиянды вирустық және микоплазмалық аурулары:
Алма ағашының мозаикасы көктемде жапырақтарда ашық-сары және ақ
мозаика бояуы түрінде көрініс табады.
Алма ағашы бұтақтарының жалпақтығы тек штамб пен бұтақтарды
зақымдайды, бұларда ісіктер, жаншылу, кейініректе – үсік шалғанға ұқсас
жарықшақтар пайда болады.
Жемістердің қатқыл қабықтары және жұлдызшалы жарылуы одан кейін
бұлардың жұлдызшалы жарылуы жүре отырып, жемістердің қабығында қоңыр,
қатқылданып кеткен дақтардың пайда болуын тудырады. Өліеттенулер, олардың
ұштарының шетінеуін, жапырақтардың хлороздық боялуын және гүлдерінің
кешеуілдетіп шешек атуын тудыра отырып, жас өркендерде де пайда болады.
Жемістердің жасыл әжімделуі жаншылудың терең жатқан жерінде өліеттену
зақымдалуын тудыра отырып, жемістердің пішінін қатты немесе ішінара
өзгертеді, зақымдалған жемістер тауарлық құндылығын толығымен жоғалтып
алады.
Қоңыр сақиналы теңбілдік жұмсағын зақымдамай, жемістердің қабығында
пайда болады. Дапырақтарда әлсіз мозаикалық және әртүрлі дәрежедегі пішін
өзгерту болады.
Латентті вирустар – жеміс дақылдарында ең кең таралған – жапырақтардың
хлорозды теңбілдігі, ағаштың шұңқырлығы, ергежейлілік, алма ағашының
мозаикалылығы, алма ағашының түктілігі, алма ағашы қабығының қауыздылығы.
Латентті вирустармен зақымданған өсімдіктерде аурулардың көзге көрінер
симптомдары болмайды. Олар тек өте бейім келетін сұрыптарда көзге көрінеді,
алайда ауру жұқтыру өнімге әсерін тигізіп, оның шығыны 20-50% құрайды.
Латентті вирустар көбінесе жапырақтардың хлорозды теңбілдігі, алма
ағашының шұңқырлығы және шарка вирустарымен бір кешенде кездеседі. Алма
сұрыптары мен подвойларының осы латентті топтың қоздырғыштарын жұқтыруы өте
жоғары – 85% дейін [7].
Алмұрттың сақиналы мозаикасы көктемде жапырақтарда ақшыл-жасыл түсті
сақиналар мен доғалар түрінде көрініс табады. Жемістердің бетінде қоңыр
сақиналар пайда болады.
Алмұрт пен айва (беке) жемістерінің тастылығы жемістердің пішінін
өзгертуін және жұмсағында склеренхиманың механикалық клеткаларының
жинақталуын тудырады, сондықтан зақымданған жемістер тауарлық және дәмдік
қасиеттерінен айырылады.
Алманың пролиферациясы бұтақталған балауса бұтақтардың (жезтырнақ
сыпырғыштарының) молынан пайда болуын, гүлдердің тым өсіп кетуін,
ағаштардың ерте, күзгі боялуын және ұзын жеміс сағақтарындағы ұсақ
жемістердің қалыптасуын тудырады.
Алмұрттың жапырақтарының жолақтарының сарғыштануы және қызыл
теңбілділігі. Жаздың ортасында жапырақ жолақтары мен жақын жатқан ұлпалар
сары-жасыл түске боялады. Күздің басында дәл сол жапырақтарда жолақтардың
ұзына бойына қызыл және қызыл-қоңыр теңбілдер пайда болады.
Алмұрттың шетінеуі – бұл ағаштардың күні ьұрын, күзгі боялуы, өсуінің
басылуы және жылдам немесе баяу шетінеуі.
Қазақстанда аудандастырылған және болашағы бар алма сұрыптарының,
сондай-ақ вегетативті көбейетін подвойлардың латентті вирустарды қоса
отырып, 87,2%-ға дейін вирустар жұқтыратындығы анықталған. Жекелеген Апорт,
Ренет, Бурхардт, Кандиль Синап сұрыптары – 100%. Нақтылы алар болсақ,
Алматы облысы бойынша мозаика 18,2%-ға дейін, жемістердің жасыл әжімділігі
– 31,1%-ға дейін, жемістердің жұлдызшалы жарылуы – 34,0%-ға дейін,
жапырақтардың хлорозды теңбілдігі – 81%-ға дейін, ағаштың
әжімділігі – 17%-ға дейін, қосылған жердің шетінеуі – 72%-ға дейін, ағаштың
шұңқырлығы – 78%-ға дейін таралып отыр.
Вирус жұқтырған өсімдіктерде ұлпалардың және тамыр жүйесінің
құрылымында терең өзгерістер жүреді. Мысалы, жапырақтар вирустармен ауырған
кезде, флоэма клеткаларының бұзылуына және шетінеуіне орай сарғыштана
бастайды, ал ксилема тамырларында тиллдер пайда болады. Вирустар ісіктер
пайда бола отырып, флоэма паренхималарының меристемалық клеткаларының
аномальды өсуіне ықпал етеді, ал ксилеманың шамадан тыс өсуі жас
өркендердің пішінін өзгертуіне алып келеді. Ауру өсімдіктерде өрбитін осы
патологиялық процестердің барлығы биохимиялық құрамның өзгеруіне және
физиологиялық процестерге әсерін тигізеді. Мысалы, алма ағашының вирустық
аурулары өсімдіктегі қоректік заттардың балансын бұзады: жалпы қант 17,8%-
ға, қышқылдық – 10,9%-ға артады, хлорофилл мөлшері 6,6%-ға және С
витаминінің мөлшері – 17,5%-ға төмендейді [8].
Вирустық аурулардың сыртқы симптомдары вирус изоляттарының
вируленттілігіне, зақымданған дақылдардың төзімділігіне, аурудың даму
дәрежесіне, ауа-райы жағдайларына байланысты қатты өзгереді. Жеміс
дақылдарының бірлесе таралатын вирустарын диагностикалау үшін нақтылы
вирусқа сезімтал шөптесін өсімдіктер-индикаторлар қолданылады. Олар
тудыратын симптомдар бойынша ұқсас, бірақ дербес вирустарды ажырату үшін
дифференциатор өсімдіктер қолданылады. Қоспалардан жекелеген вирустарды
бөліп алу үшін сүзгі-өсімдіктер қолданылады.
Вирустардың термотұрақтылық, инфекциялық және оның сақталу уақыты,
зақымданған ұлпалардағы концентрациясы секілді қасиеттері шөптесін
индикаторлардың шырынында зерттеледі. Вирустарды шөптесін индикаторларға
көшіргеннен кейін, оларды иммунологиялық және биохимиялық зерттеу
мақсатанды, вирустар тазарту мен концентрациялауға оңайлықпен беріледі.
Вирустарды жеміс өсімдіктерінің шырынынан тазартып алу мүмкін емес,
бұл тотықтырғыш ферменттердің, әсіресе полифенолоксидазаның жоғары
белсенділігімен және фенолдардың тотығуының гидролизденген және
конденсацияланған танин мен хинон, полифенолдардың
тотығуынан туындылар түріндегі өнімдерінің жинақталуымен байланысты болып
келеді.
Таниндер мен хинондар вирус бөлшектерімен ерімейтін кешендер түзе
отырып бірігеді, олар тұнбаға түседі де, вирустар жоғалып кетеді немесе
хинондармен біріккен кезде инактивациялнады. Онымен қоймай, вирустардың
қалыпты тазартылуына жеміс шырындарының қою, шырышты болып келетіндігі және
жоғары қышқылдыққа ие болатындығы кедергісін келтіріп отырады.
Оның үстіне жеміс дақылдарына осылардан жекелеген вирустардың
препараттарын алу қиынға соғатын вирус кешендерінің бар болуы тән.
1.1 Вирустарды идентафикациялау әдісі: полимеразалы тізбекті реакция
1985 жылы К.Мюллис өз қызметкерлерімен бірігіп, in vitro жағдайындағы ДНК-
ның реттілігін клондау әдісін жасап шығарды, бұл әдісті полимеразды
тізбекті реакция (ПТР) деп атады. Бұл әдіс гендердің өте көп мөлшердегі
көшірмесін алуға мүмкіндік береді. Ген дегеніміз- бұл нуклеотидтердің бір-
бірімен реттілік негізінде байланысы, және олардың көп дәрежеде
көшірмелерін алуға мүмкіндік беретін ДНҚ сегменті.
ХХ ғасырдың 90-шы жылдары полимеразалы тізбекті реакциямен - PCR-мен
байланысты болып келетін, молекулалық-гендік полиморфизмді анықтаудың жаңа
технологиясы жасап шығарылды. Полимеразалы тізбекті реакцияда вирус
геномының дезоксирибонуклеин қышқылына спецификалы амплификацияға
негізделген диагностикалық әдістер өсімдіктерді қорғауда кеңірек
қолданылатын әдістерге айнала бастады. PCR дезоксирибонуклеин қышқылының
спецификалы реттілігін кеңейту рәсімі болып табылады. дезоксирибонуклеин
қышқылының қызығушылық тудырып отырған саласын фланктеуші реттілікке
қатынас бойынша комплементарлы болатындай етіп жобаланған праймерлер жұбы
дезоксирибонуклеин қышқылы матрицасымен ренатурацияланады және
дезоксирибонуклеин қышқылы полимеразасының кеңеюінің қалыпты функцисы
матрица желісінің реттілігін көшіретін праймерлерді кеңейту үшін
қолданылады. Реакция өнімдері тікелей таңбалау жолымен табылуы мүмкін.
Салыстырмалы түрде қысқа кезең ішінде PCR-талдау, полимеразалы тізбекті
реакцияда патогеннің геномды дезоксирибонуклеин қышқылының спецификалы
ұлғаюына санымен және сипатымен ерекшеленетін варианттарды біріктіре
отырып, дезоксирибонуклеин қышқылының өзгергіштігін зерттеудің ең кең
таралған әдісі болып шыға келді [9].
PCR әдісі шағын биологиялық үлгіден дезоксирибонуклеин қышқылының
реттілігін өте жылдам амплификациялауға мүмкіндік береді [10]. Ол
дезоксирибонуклеин қышқылында потенциалды патогенді гендердің болуын
анықтауға, сонымен қатар векторларға енгізу үшін немесе одан кейінгі
секвенирлеу мақсатында реттіліктерді амплификациялауға мүмкіндік береді.
PCR әдісі шағынорганизмдерді – қайнап жатқан гейзерлердің маңында өмір
сүретін Thermus aquaticus шағыноорганизмдерін ашқаннан кейін жасап
шығарылған болатын. Олардың термотөзімді ферменттері, оның ішінде
дезоксирибонуклеин қышқылы-полимераза, жоғары температуралар кезінде өз
белсенділігін сақтап қалады. Бұл дезоксирибонуклеин қышқылы-полимераза бір
тізбекті дезоксирибонуклеин қышқылымен денатурацияланған,
амплификацияланушы беткейдің шеттері бойынша орналасқан спецификалы 20-30
мүшелі затравкалардың – праймерлердің 4 дезоксирибонуклеотидтер қоспасына
әсерін тигізеді. Алдымен 93-950С температура кезінде дезоксирибонуклеин
қышқылының екі тізбекті молекуласының (фрагментінің) термиялық
денатурациясын (жайылуын) жүзеге асырады, бұл комплементарлы тізбектердің
бөлінуіне алып келеді, ал содан соң сынамаларды 600С дейін салқындатады,
бұл праймерлер мен бір тізбекті дезоксиолигонуклеотидтерге бірігуге
мүмкіндік береді, сонымен қатар Taq-полимеразаның жұмысын іске қосады.
Дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған спиралін тұрақтандыратын сутектік
байланыстар мен жазықтықаралық өзара әсерлесулер айтарлықтай әлсіз болып
келеді және температураны 950С дейін арттырған кезде тізбектердің бөлінуі
жүреді. Мұндай процесті қос тізбектің балқуы, немесе оның денатурациясы деп
атайды. Денатурация – қайтарымды процесс. Дезоксирибонуклеин қышқылының қос
тізбекті құрылымының одан кейін қалпына келуі тіптен тізбектер толығымен
алшақтанған кезде де жүріп отырады. Ренатурация, реассоциация немесе отжиг
деп аталатын, қайтадан бірігу процесі температураны төмендеткен кезде,
комплементарлы негіздердің өзара әрекеттесуі есебінен жүріп отырады.
Бастапқыда нақтылы гендік локустарды амплификациялау және талдау үшін
жасап шығарылған және әмбебап праймерлерді пайдалана отырып,
модификацияланған варианттардағы осы локустардың нуклеотидтік реттілігін
алдын ала білуге негізделген полимеразалы тізбекті реакция кез келген
организмдердің геномдарын егжей-тегжейлі талдау үшін жарамды болып шықты.
Осы жасап шығаруға байланысты, талданып отырған локустардың құрылымы туралы
қандай да бір ақпаратқа деген қажеттілік керексіз боп қалды. Вирустар мен
плазмидтерді қоса отырып, іс жүзінде кез келген организм осылардың
маркерлері болып геномның анонимді локустары болып табылатын гендік
талдауға ұшыратыла алады [11].
AP-PCR (arbitrary primed PCR) – ді жасап шығару кез келген геномдардың
дезоксирибонуклеин қышқылын праймдейтін еркін немесе әмбебап
олигонуклеотидтерді пайдаланудың арқасында мүмкін болып отыр. Осы
праймерлермен амплификацияланған дезоксирибонуклеин қышқылының негізгі
қасиеті болып түрспецификалылығы, яғни биологиялық түр шеңберінде
организмнің PCR паттерндерінің ұқсастығы табылды [12]. Алайда
организмдердің кейбір түрлері, қолданылатын әмбебап праймерлерге тәуелсіз,
гетерогенді PCR паттерндермен сипатталады. Осылардың бір бөлігі аталған түр
особьтарында ұқсас немесе сәйкес PCR-паттерндер, ал қалған бөлігі –
гетерогенді (вариабельді праймерлер) PCR-паттерндер бере алатын,
праймерлердің өздерінің әрекеттерінде де айырмашылық бар.
Праймерлерді әдетте, алдын ала дезоксирибонуклеин қышқылының
амплификацияланатын генімен шекаралас жатқан нуклеотидтік реттілігін
анықтап алып, химиялық синтездеу әдісімен алады. Гендердің шекаралас
учаскелері белгісіз болған кезде дезоксирибонуклеин қышқылымен байланыса
алатын кездейсоқ праймерлер қолданылады. Праймерлер бастапқы (аналық)
дезоксирибонуклеин қышқылының бір тізбекті фрагменттерінің қыздырумен
денатурацияланған гомологиялық учаскелеріне (комплементарлық принцип
бойынша) өздері келіп жанасады. Олар іс жүзінде екі мақсат үшін қызмет
атқарады: біріншіден, дезоксирибонуклеин қышқылы-полимеразаның жұмысын іске
қосады, екіншіден, оның әсерін шектеп тастайды, ферментті
дезоксирибонуклеин қышқылын көшірудің қажетті учаскесінің шеңберінде
бекітіп тастағандай болады.
ПТР-анализдің жалпы түрі 1-суретте көрсетілген.
1-сурет. ПТР-анализдің жалпы түрі.
PCR циклді сипатқа ие. Бірінші және ішінара екінші циклдерде түзілетін
дезоксирибонуклеин қышқылы көшірмелері (ампликондар) амплификацияланатын
геннің шекараларына сәйкес келмейді (бірінші циклда барлық ампликондар және
екінші циклда ампликондардың бір бөлігі екінші – антимәндік праймердің
байланысуы жүре қоймаған учаскелерде созылыңқылау болып шығады). Үшінші
циклдан бастап ампликондардың ұзындығы стандартты бола бастайды, яғни
дезоксирибонуклеин қышқылы-матрицалары фрагменттерінің праймерлердің 3-
ұштары арасындағы нуклеотидтер жұбының санына сәйкес келеді. Ампликондар
геометриялық прогрессияда жинақталады және амплификация өнімдерінің
арасында басымырақ бола бастайды. Синтезделген дезоксирибонуклеин қышқылы
фрагменттерінің өздері одан әрі синтез жүріп жатқан матрица болып қызмет
ететіндіктен, процесс тізбекті сипатқа ие болып келеді. (Сурет-2).
3-4 қадамнан 30-40 цикл:
1 қадам: ДНК денатурациясы
94ºС-та 1 минут
2 қадам: праймерлерлік қыздыру
Тура және кері праймерлер
540С-та 45 секунд
3 қадам: праймерлік реттіліктің артуы
720С-та 2 минут
Сурет-2. ПТР-полимеразды тізбекті
реакция.
(http:allserv.rug.ac.be~avierstr principlespcr.html)
Полимеразалы тізбекті реакцияны жүргізу үшін дезоксирибонуклеин қышқылы
үлгісі дезоксирибонуклеин қышқылы-полимераза ферменті, барлық төрт
нуклеотидтен қоспасы және праймерлер ерітіндісі – көбейтіліп отырған
үлгінің ұштарындағы дезоксирибонуклеин қышқылының қарама-қарсы учаскелеріне
комплементарлы келетін, шамамен алғанда 20 нуклеотидтерден тұратын
синтетикалық учаскелердің ерітінділерінен тұратын пробиркаға
орналастрылады. Одан кейін ерітінді 90-950С дейін қыздырылады,
дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған желісі жалғыз желіге ыдырайды,
500С дейін салқындатады – праймерлер дезоксирибонуклеин қышқылының
комплементарлы учаскелеріне бірігеді, 700С дейін қыздырады – полимераза,
праймерлерді пайдалана отырып, жалғыз желілерді қосарланған желіге дейін
құрады.
Ескерту: 1 цикл: 1 қадам: дезоксирибонуклеин қышқылы денатурациясы (1
минут 94° С кезінде), 2 қадам: праймерлерді қыздыру, тікелей және кері
праймерлер ( 45 секунд 54° С кезінде), 3 қадам: праймерлердің реттілігін,
дәйектілігін арттыра түсу ( 2 минут 72 ° С кезінде), дезоксирибонуклеин
қышқылының алғашқы екі молекуласын алу.
Цикл қайталанады да, 5 минуттан кейін ерітіндіде дезоксирибонуклеин
қышқылының бірдей қосарланған тізбектерінің саны бастапқы ерітіндіге
қарағанда 2 есе, 10 мин кейін – 4 есе, 1,5 сағаттан кейін, 20 циклден соң –
милллион есе, ал отыз
4 цикл циклдан соң, 2,5
сағаттан кейін – миллиард есе көбірек болады(сурет-3).
4 цикл
Берілген ген
3 цикл
2 цикл
1 цикл
ДНҚ матрицасы
35 цикл
22 =
4 көшірме 23 =
8көшірме 16
көшірме 32 көшірме 236 =
68 биллион
көшірме
Сурет-3. ДНҚ амплифициясының схемасы.
1,2, және 3 суреттерде ПТР-анализдің негізгі қадамдары көрсетілген.
Дезоксирибонуклеин қышқылын 90°С кезінде денатурациялауға ұшыратады;
Денатурациялау температурасы мен уақыты екі талап ретіндегі ымырашылдық
ретінде таңдап алынады: 1) матрицаны жақсылап денатурациялау, 2) матрица
мен Taq полимеразаны қатты зақымдамау. Мәселе дезоксирибонуклеин қышқылының
қызырған кезде бұзылатындығында болып отыр. Ыдырау жылдамдығы буферге
байланысты болып келеді (96,5°С кезінде: Н2О -2.5; ТЕ-7.5; 20mM Tris,
рН9,0-~10). Taq полимеразаның ыдырау уақыты температураға байланысты мына
шаманы құрайды: 92.5°С - 130, 95.0°С - 40, 97.5°С - 5 -6. Денатурация
уақыты қолданылатын пробиркалардың түріне қатты байланысты болып келеді.
Қабырғалары жұқа 0.2 ml пробиркалар үшін 94°С кезінде 10-15 секунд
жеткілікті.
50°С кезінде амплификацияланатын беткей праймерлерін қыздыру жұмысын
жүргізеді. Жоғарырақ температура – жоғарырақ спецификалылық, бірақ ол
праймерлердің аталған жұбы үшін сындарлы температурадан асып кетсе болғаны,
өнімнің мөлшері төмендей бастайды. Әдетте қыздыру температурасы
олигонуклеотидтердің балқу температурасына қарағанда 1-2°С-ға төменірек
таңдап алынады.
Праймерлік реттілікті арттыра түсу 70°С кезінде жүреді; осы кезеңде
дезоксирибонуклеин қышқылының негізгі синтезі жүріп отырады. Осы
температура кезінде полимеразалық белсенділік (ол таңбаның шамадан тыс
алынған, денатурацияланған және қыздырылған дезоксирибонуклеин қышқылына
енгізілуі бойынша анықталады) максималды шамада болады. Синтездеу уақыты
Taq полимеразаның жұмыс жылдамдығымен анықталады: 75 -80°С~ 150
нуклеот.сек., 70°С60 нуклеот.сек., 55°С= 24 нуклеот.сек., 37°С=
1.5 нуклеот.сек., 22°С= 0.25 нуклеот.сек.
Бүкіл циклді бірнеше рет қайталайды; Теориялық тұрғыдан 30 циклден соң 250
млн. көшірме алуға болады.
Циклдердің саны әдетте 20-35 болып келеді. Циклдердің тым көп
саны PCR реакцияның қанығуымен қолайсыздыққа ұшыратады: 1) праймерлер
бойынша шектеулер: праймер ретінде дайын өнімді пайдаланудың нәтижесінде
ұзын өнімдердің синтезделуі; 2) нуклеотидтер бойынша шектеулербір тізбекті
өнімдердің үлкен үлесі, қысқа өнімдердің синтезделуі.
5) Реакция қоспасынан амплификацияланған дезоксирибонуклеин қышқылын
бөліп алады. PCR-талдаудың аяқталуына бақылау жасау тәсілдерінің бірі –
реакция қоспасына (крезол қызылсыз) 0,1-ге дейін EtBr (J-gml
(реакцияға дейін-ақ) қосу. Егер PCR-ден кейін пробиркаларды UV-мен
жарықтандырса, осыларда қос тізбекті дезоксирибонуклеин қышқылының
жетерліктей мөлшері түзілгендері ғана жарқырайтын болады.
Синтездеу циклдерін (сынамаларды жоғарыда көрсетілген температуралар
шегінде қыздыру мен салқындатуды қосатын) көп мәрте қайталаған кезде
дезоксирибонуклеин қышқылының спецификалы фрагменттерінің саны
экспоненциалды арта түседі, бұл қолда бар фрагменттердің шамалы санынан
гель-электрофорез әдісімен идентификациялауға болатын көшірмелердің үлкен
санын алуға мүмкіндік береді.(сурет-4).
Рестикциондық эндонуклеазалар днк өлшемдері бойынша ерекшеленетін
бірқатар фрагменттерге бөледі, оларды гель-электрофорездермен бөлуге
болады. Дезоксирибонуклеин қышқылының теріс зарядталған фрагменттері оң
электрод жағына қарай қоныс аударады, бұл ретте фрагмент неғұрлым кішірек
болса, ол соғұрлым жылдамырақ қозғалады. Фрагменттердің өлшемдерін анықтау
үшін қатарлас жатқан көрші жолда дезоксирибонуклеин қышқылының белгілі
өлшемдегі стандартты фрагменттерін бөлуді жүргізеді. Электрофорезден кейін
алынған жолақтарды гельді этидий бромидімен бояу арқылы визуалдандырады, ол
дезоксирибонуклеин қышқылы молекуласына жапсарласып (интеркаляцияланып), УФ-
сәулелерде флюоресценттеледі. Гельді фотосуретке түсіріп алып, алынған
фрагменттердің санын анықтайды. Осы әдіс үшін детекцияның төменгі шегі 25
нг дезоксирибонуклеин қышқылын құрайды. Радиоактивті изотоп фосформен
-32(32 Р) таңбаланған дезоксирибонуклеин қышқылын қолданған кезде рентген
пленкасы 1-2 нг дезоксирибонуклеин қышқылын анықтауға мүмкіндік береді.
Фрагменттің өлшемін дезоксирибонуклеин қышқылының стандартты
фрагменттерінің қоныс аударуымен салыстыру арқылы анықтайды.
Одан әрі блоттинг жүргізеді, ол дезоксирибонуклеин қышқылының бөлінген
фрагменттерін гельден нитроцеллюлозалы немесе нейлон мембраналарға
көшіруден тұрады. Көшіру капиллярлық күштердің әсер етуімен жүргізіледі.
Мембранаға көшірілген дезоксирибонуклеин қышқылын қыздыру арқылы немесе
химиялық реакцияның көмегімен бекітеді, осыдан кейін спецификалы жолақтарды
осының дезоксирибонуклеин қышқылының реттілігі анықталып отырған геннің
реттілігіне комплементарлы болып келетін таңбаланған, радиоактивті ген
зондымен анықтайды. Зонд генмен гибридтеледі, байланыспаған зондты шаю
барысында кетіреді, ал гибридтелген зондты визуалдандырады. Осылайша,
эксперимент түрінде бізді қызықтырып отырған геннің бар екендігін растауға
болады. Соңғы кездері дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған спиралінің
термиялық жазылуын клеткадағы дезоксирибонуклеин қышқылының қосарланған
спиралін дара спиральға ыдырататын хеликаза (гректің helix – спираль
сөзінен) ферментін қоса отырып алмастыру есебінен PCR-талдау жүргізу
уақытын қысқарту қолдан келіп отыр.
PCR-талдау әдістерін шартты түрде моно- және полилокусты, доминантты
және ко- доминантты, би- және полиаллельді деп бөлуге болады. Көрсетілген
PCR-маркерлердің көпшілігі доминантты сипатқа ие және полилокусты,
биаллельді болып табылады. Полилокусты жүйелердің ерекшелігі бір мезгілде
10-30 ампликондарды талдау мүмкіндігі болып табылады. . Полилокусты
маркерлер: 1) агрономиялық маңызды белгілердің түрлері – донорлары мен
мәдени түрлер арасындағы филогендік өзара қатынастарды зерттеу үшін; 2)
гендік қашықтықтарды анықтау және бір түрдің сұрыптары арасындағы гендік
қашықтау дәрежесін көрсететін дендрограммалар құру үшін; 3) ампликондардың
белгілермен ілінісуін анықтау үшін және т.б. қолданылады. Полилокусты RAPD-
талдаудың ерекше қасиеті дезоксирибонуклеин қышқылы-матрицасының реттілігі
туралы ақпаратсыз, праймерлерді синтездеу мүмкіндігі болып табылады.
4-сурет. ПТР-анализ өнімін электрофорез әдісінде идентификациялау.
Праймерлердің реттілігі еркін, бірақ бұл ретте ол бірқатар талаптарға
- ГЦ-жұптардың мөлшеріне жауап береді. Еркін амплификацияланған полиморфты
дезоксирибонуклеин қышқылы бүкіл геном бойынша спецификалы емес
облыстардағы өзгерістерді бақылау әдісі болып келеді. Потенциалды түрде
бүкіл таңдап алынған дезоксирибонуклеин қышқылы бойынша жүздеген сайттармен
гибридтеле алатын, еркін таңдап алынған реттіліктегі бірлі-жарым қысқа
праймер (10 нуклеотидтік негіз) қолданылады. Праймер бір бірінен 2 килобаза
шегіндегі қарама-қарсы орналасқан желілердің екі сайтында ренатурацияланған
кезде, аралық реттілік кеңейе түседі. реттіліктің, енгізілудің және
бөлінулердің мутациялары, осының бәрі кеңейтілген ферменттердің алынған
құрылымындағы полиморфизмге алып келеді. PARD-тың көмегімен бірден бастап
жиырмаға дейін жолақ табылады. Осылар кезінде праймерлердің әртүрлі
ұзындықтары мен концентрациялары қолданылатын, осы әдістің әртүрлі
модификациялары бар. RAPD модификациялары PCR типтері болып табылады:AP-
PCR, ISSR, IRAP, PEMAP, SSAP (2 кесте) ISSR – де праймерлер ретінде
шағынсателлитердің белгілі реттіліктері қолданылады, бұл көшірме алынуын
арттыра түседі және бір мезгілде дезоксирибонуклеин қышқылының бір
фракциясының геномдарын зерттеу ауқымын шектейді. Полиморфизм диапазонын
кеңейту үшін IRAP пен REMAP-та праймерлер ретінде ретранспозондардың LTR
учаскелері қолданылады.
Ко- доминантты PCR-маркерлер арасында шағынсателлиті реттіліктерді
фланктейтін праймерлермен операция жүргізетін SSRP жүйесі ең кең таралымын
тауып отыр. Бір локусты полиаллель жүйе хромосомалардың қатаң белгіленген
учаскелеріндегі өзгергіштікті детекторлауға мүмкіндік береді, бұл геннің
әртүрлі аллельдерін талдау үшін маңызды болып табылады. Гипервариабельді 15-
20 шағынсателлит локустардың өзгергіштігін талдау ауылшаруашылық
өсімдіктерінің сұрыптарын ерекше дифференциациялауға мүмкіндік береді.
Сұрып өзінің қасиеттері, белгілері бойынша басқа өсімдіктерден
ерекшеленетін генотипті көрсетеді. Генотип әр организмде ерекшеленетін
аллельдер жинағымен сипатталады. UPOV-пен қабылданған, сұрыптарды
идентификациялау ауылшаруашылық өсімдіктерінің сұрыптарын DUS-тесттің үш
критерийі: ерекшелік, біртектілік және тұрақтылық бойынша анықтайды.
Молекулалық-гендік полиморфизмді зерттеу үшін қолданылатын PCR-
талдаудың негізгі әдістері 1 кестеде көрсетілген.
Молекулалық генетика саласындағы айтарлықтай прогресс, жекелей алар
болсақ, SSR-маркерлер жүйесін жасап шығару, DUS-тестті толықтыруға
мүмкіндік береді. Өсімдіктердің әртүрлі сұрыптары және жабайы түрлер өз
генотипінде гендердің тіршілік жағдайларына бейімделуді және шаруашылық
тұрғысынан құнды белгілердің дамуының қажетті деңгейін қамтамасыз ететін
ерекше комбинацияларын үйлестіріп отырады. Гендер жинағының, және демек,
дезоксирибонуклеин қышқылы фрагменттерінің ерекшеліктері шағынсателлитті
локустардың аллельді құрамы болып келеді. Локус, мұнда төменгі индекс
ретінде ампликонның (аллельдің) молекулалық салмағы көрініс табатын, латын
әліппесінің әрпімен кодталады.
1 кесте. PCR-талдаудың негізгі әдістері [13].
PCR типіТұқым Праймер типі Полиморфизм типі Ампли-ко
қуалау ндар
типі саны
SSRP К Шағынсателлиттің қарапайым Қайталану 1-2
қайталануын шектейтін, ұзындығындағы
белгілі реттіліктегі (санындағы)
праймерлер жұбы өзгерістер
AFLP К* 1 кезең: адаптерлерге Нүктелік мутация, 30
толығымен комплиментарлы инсерция, делеция
праймерлер; ІІ кезең:
праймерлерде 1-ден 3-ке
дейін адапторларға
комплементарлы емес
негіздер бар
SSAP Д** 1 этап; праймерлер толықтайНүктелік мутация, 30
адаптерлерге транспозиция
комплиментарлы,
ІІ кезең: бір праймерде
1-ден 3-ке дейін
адапторларға комплементарлы
емес негіздер бар, екінші
праймер LTR комплементарлы
RAPD Д Жалғыз, еркін (декамер) Нүктелік мутация, 10-30
праймер инсерция, делеция
АР-PCR Д Жалғыз, еркін (10 п.о.) Нүктелік мутация, 10-30
праймер инсерция, делеция
DAF Д Жеке, еркін (октамер) Нүктелік мутация, 30
праймер инсерция, делеция
ISSR Д Қосымша 1-3 негізі бар, Нүктелік мутация, 10-30
жалғыз, шағынсателлиттік инсерция, делеция
қайталау
IRAP Д Праймер немесе екі праймер Нүктелік мутация, 10-30
LTR комплиментарлы инсерция, делеция
REMAP Д Бір праймер LTR Нүктелік мутация, 10-30
комплиментарлы, екінші инсерция, делеция
праймер-шағынсателлиттік
қайталау
SNP Д RAPD,AP- PCR кезінде дара, Нүктелік мутация, 10-30
AFLP кезінде бірнеше инсерция, делеция
К* - кодоминантты , Д** - доминантты.
Амплификация фрагменті ұзындығының полиморфизмі принципі (AFLP)
геномдық дезоксирибонуклеин қышқылының ретсрикциясының гидролизаты
нәтижесінде алынған барлық фрагменттердің іріктеп алынған жинағының PCR
амплификациясы болып келеді. Геномдық дезоксирибонуклеин қышқылы рестрикция
энзимімен гидролизденеді және адаптер – молекулалармен байланысады. Негізгі
реттіліктен (адаптер бөлігінен), рестрикция энзимінің спецификалы
реттілігінен және 1-3 селективті нуклеотидтерден тұратын PCR праймерлері
толықтай комплементарлы реттілігі бар фрагменттерді ғана кеңейтеді. Бұл
кезде гельдік электрофорез нәтижесінде бөлініп алынатын және әдетте
доминантты маркер ретінде бағаланатын көптеген геномдық сайттардан (әр
реакция кезінде әдетте 50-100 фрагмент) көптеген геномдық сайттардан
фрагменттер түзіледі.
Дезоксирибонуклеин қышқылы-технологиялар осыларға агрономиялық маңызы
бар көрсеткіштердің көпшілігі, оның ішінде вирус инфекциясына төзімділік те
жататын сандық полигенді белгілердің (QTL) локустарын таңбалауға мүмкіндік
береді.
1.3 Алма ағашы мен алмұрттың in vitro клональды көбеюі
Клональды көбею – бұл гендік ерекшеліктерін сақтай отырып, сұрыптарды,
клондарды, түрлерді жылдам репродукциялау. Бұл, мысалға, бұтақшалау секілді
вегетативтік көбеюдің түрлерінің бірі, бірақ толықтай асептика
жағдайларында, арнайы жасап шығарылған қоректік орталарда, бақыланатын
температура мен жарық режимі кезінде жүргізіледі. Бастапқы материал болып
меристемалық ұштар немесе тұтас бүршіктер қызмет етеді. Дұрыс іріктеп
алынған жағдайлар кезінде, бірнеше аптадан кейін, аталған экспланттар
бірнеше жас өркенді продуциялайды, бұлар өз кезегінде, қайта отырғызған
кезде, жаңа қоректік ортада қосымша жас өркен түзеді. Осылайша, өсірудің
бірнеше айы ішінде, бірнеше мыңдаған жас өркен алынып отырады.
Бақша шаруашылығында биотехнология әдістерін қолдану жоғары
экономикалық әсерді қамтамасыз етеді. Бұл әсер қысқа мерзім ішінде жоғары
өнімділікке және көбею коэффициентіне ие болып келетін, сапасы жоғары
отырғызу материалын алумен байланысты болып келеді. Бұл ретте өндіріске
жаңа үлгілерді енгізу мерзімі 2-3 жылға қысқарады, коллекциялық материалды
сақтау алаңдары 50-100 есе азаяды, жаңа гибридтік түрлерді алу мерзімі 2-5
жылға қысқарады және қазірде бар сұрыптарды жекелеген белгілері, қасиеттері
бойынша жақсарту мүмкіндігі пайда болады. Бүгінгі таңда бақша
шаруашылығында клональды шағынкөбею ең кеңінен енгізілген. Отырғызу
материалын жасап шығару жүйесіне енгізілген бұл әдіс, дәстүрлі бұталау және
ұлаумен салыстырғанда, бірқатар дау тудырмайтын басымдылықтарды қамтамасыз
етеді. Алайда, басқа қандай болсын тәсіл секілді, in vitro ұлпалар мен
органдар өскіні бірқатар артықшылықтар мен кемшіліктерге ие болып келеді.
Артықшылықтарына: кешенді сауықтыру мүмкіндігі; көбеюдің жоғары
коэффициенті; процестің икемділігі; қысқа уақыт ішінде өсімдіктердің
көптеген санын алу мүмкіндігі; оптималды мерзімдерде отырғызу үшін
пробиркада өсірілген өсімдіктерді сақтау және жинақтау; кәдімгі жағдайларда
репродукцияға төмен қабілетитілікке ие болатын үлгілерді тираждауды жүргізу
мүмкіндігі; бұтақтардың ризогенезге қабілеттілігінің артуы, ағашты
өсімдіктерде жас өркендердің үлкен санының түзілуі есебінен, одан әрі
көбеюге потенциалды қабілеттілігі арта түскен материалдың алынуы. Екінші
жағынан алғанымызда, биотехнологиялық әдістер үшін, қоспаны өсімдіктерді
стерильді емес жағдайларға отырғызғанға дейін кетіруге болмайтындықтан,
бастапқы үлгілерді барлық көрсеткіштер бойынша мұқият іріктеп алу қажет
болады. Әдістің кемшіліктеріне in vitro операциядан кейін материалды
стерильді емес жағдайларда өсіру үшін, өсімдіктердің стандартты
көрсеткіштерге қол жеткізуі үшін қосымша шығындар қажет екендігі де жатады.
Солай бола тұрса да, бірқатар жағдайларда сауықтырылған отырғызу материалын
алу үшін жалғыз ғана тәсіл болып дербес немесе термотерапиямен үйлескен
сауықтыру тәсілі ретінде қолданылатын, оқшауланған апекстер өскіні болып
табылады.
Қазіргі таңда шағынклоналды көбейту мыналар үшін қолданылып отырады:
- селекцияда – in vitro алынған гендік инженерияның барлық өнімдерін
қоса отырып, жекелеген генотиптердің немесе жаңа, болашағы бар
сұрыптардың шамалы санын ұстап тұру және көбейту үшін;
- оларды өнеркәсіп өндірісіне енгізуге кететін шығындарды және
уақытта үнемдей отырып, жаңадан шығарылған сұрыптарды жылдам
(бірнеше айлар ішінде бірнеше мың есеге дейін) көбейту үшін:
- вируссыз материалдардың көп мөлшерін жылдам алу үшін. Бірнеше айлар
ішінде in vitro өсірген кезде еденде 4 жыл ішінде алынатын санын
алуға болады;
- ағашты өсімдіктерде жыныстық көбею процесінің ұзақтығына орай
баяуырақ жүзеге асырылатын көбею мен селекцияны жылдамдату үшін
қолданылады. Онымен қоймай, осы түрлердің көпшілігі вегетативтік
көбейтуге зор қиындықпен беріледі.
Тестілеу, индикаторларды ұстап тұру, зертханалық жабжықтарды және
теплица алаңдарын амортизациялау аясында биотехнологиялық әдістермен
өндірілген өсімдіктердің өзіндік құны айтарлықтай төмен болып келеді. Ал
енді сауықтыру тиімділігінің артуы бұл әдістерді сауықтырылған отырғызу
материалын өндіру үшін стандартты етіп жіберді.
Клоналды шағынкөбейтудің міндетті шарты процестің барлық кезеңдерінде:
экспланттан бастап егістіктегі өсімдіктерге дейін гендік тұрақтылығын
толығымен сақтап қалатын нысандарды пайдалану болып табылады. Бұл шарттарды
сабақтық шығу тегі бар органдардың қуыс бүршіктері және апекстер, яғни
меристемалар қанағаттандырады. Өсімдіктің меристемалық ұлпалары үздіксіз
эмбриондық-белсенді күйде ұсталып тұрады. Олар дезоксирибонуклеин қышқылы
репарация жүйелерінің жоғары белсенділігіне орай гендік өзгерістерге
төзімді келеді.
Питомник шаруашылығында сондай-ақ вирустар мен патогенді
шағынорганизмдерден сауықтыру және өсімдіктерді көбейту үшін оқшауланған
ұлпалар мен органдар өскіні де қолданылады. Осыф тәсілмен вирустардан және
басқа да патогендерден босану осыларда көбею тәсілінің өзі аурулардың
таралуына ықпал ететін, вегетативті дамитын өсімдіктерде ғана мүмкін
болады. Вирустық аурулармен кәдімгі химиялық әдістермен күресу мүмкін емес,
өйткені вирустардың тіршілік әрекеті қожайын-өсімдік клеткасының
метаболизмімен тығыз байланысқан. Вирустық аурулармен күресудің негізгі
жолы – in vitro клоналды шағынкөбею әдісін қолдана отырып, сау отырғызу
материалын алу.
Клоналды шағынкөбею – бұл бастапқыға ұқсас өсімдіктерді жылдам,
жыныссыз алу үшін in vitro техникасын пайдалану. Дәстүрлі әдіспен
салыстырғандағы, өсімдіктердің шағынкөбеюінің артықшылығы көбеюдің жоғары
коэффициенттері (1:1 млн), аналық және көбейтілетін өсімдіктер алып жататын
алаңдардың үнемделуіне алып келетін, процестің миниатюралануы; себілген
материалдың ювенильді фазадан шығуынсыз көбеюі. Жұмыстардың көпшілігін жыл
бойы зертхана жағдайларында орындайды және өсімдіктерді белгілі бір
мерзімге қарай алады. Пробиркадағы өсімдіктерді төмен температура кезінде
ұзақ уақыт сақтау өсімдіктердің құнды формаларының банкін құруға және
оның ішінде халықаралық ауқымда да, карантинді нысандарды енгізу қаупінсіз,
пробиркадағы өсімдіктерді алмасуды жүргізуге мүмкіндік береді [14].
Сақталып отырған құнды генотиптерді және сауықтырылған өсімдіктерді қажет
болған жағдайда селекциялау процесіне жылдам қосуға, әлде қайталап ауру
құқтыру қаупінсіз, сауықтырылған материал жасаудың қолданылып отырған
схемаларына қосуға болады, бұл өз кезегінде тестілеу мен сауықтыруға
кететін материалдық және еңбек ресурстарын үнемдеуге мүмкіндік береді.
Генетиктер мен селекционерлер үшін бұл әдістер индукцияланған мутагенез
кезінде, өсу нүктесінің бірлі-жарым, мутацияланған клеткаларын толығымен
дамыған өсімдік сатысына дейін жеткізу есебінен, алынатын мутациялар
спектрін кеңейтуге мүмкіндік береді. Ерте сатыларда екпе материалдарының
гендік ұқсас көшірмелерін алу мүмкіндігі пайда болады, бұл одан әрі жерде
сыртқы ортаның қандай да болсын факторының организмнің қалыптасуындағы
ролін анық бөліп көрсетуге мүмкіндік береді.
Аталған технологияның үлкен артықшылығы сондай-ақ in vitro жағдайында
кәдімгі тәсілдермен көбеймейтін, немесе нашар көбейетін өсімдіктердің,
мысалы, алма ағашының жиірек көбейетіндігі және тамырланатындығы болып
табылады. Өсімдіктердің шағынклоналды көбеюінің көбеюдің дәстүрлі тәсілі
алдындағы, әсіресе оның рентабельділігі тұрғысынан артықшылықтарының айдан
анық болғандығы соншалықты, оның бұдан әрі жетілдірілуіне және дамытылуына
сөзсіз ықпал етіп, дем береді. Бұл біздің қазіргі заманымызда көкейтесті
болып отыр.
Өсімдіктердің клоналды шағындамуының көбею коэффициенті, өсімдіктердің
гендік тұрақтылығына қатысты сенімділігі, өсімдіктердің белгілі біртүрі
үшін қолдану бойынша ерекшеленетін бірнеше үлгісін бөліп көрсетуге болады
[245]. Осы үлгілердің ішінде:
1) өсімдіктер ұлпаларының каллусынан органогенезді немесе соматикалық
эмбриогенезді индукциялау;
2) экспланттар ұлпасынан адвентивті жас өркендердің дамуы;
3) қуыстардағы меристемалардың даму индукциясы көңіл қоюымызға
лайықты.
Биотехнологияда көбеюдің үшінші үлгісі – апикальды басымдылықты алып
тастауға негізделген, қуыстағы жас өркендердің пролиферациясы ең көп
таралып отыр. Бұл әдіс отырғызу материалын жасау кезінде өнеркәсіптік болып
алып үлгерді және жеміс дақылдарын көбейтуге қатысты ең сенімді әдіс болып
табылады. Бұл тәсіл апикальды басымдылықты алып тастауға негізделген, бұл
екі жолмен жүзеге асырылуы мүмкін [15].
1. Қалыпты пропорциялардағы жас өркендерді алып, одан кейін бұларды
көбейту циклын қайталау үшін екінші реттік эксплант ретінде қолданылатын
бір бүршікті шағынбұтақшаларға бөлу. Картопты, жүзімді көбейткен кезде
бұл әдіс жиі қолданылып отырады. Екі ай ішінде 10 шағынбұтақша беретін бір
жас өркен алуға болады деген шартпен, осындай тәсілдің теориялық мүмкіндігі
шамамен алғанда жылына 100 мың – 1 млн. жас өркен құрайды.
2. Апикальды басымдылықты цитокининдердің көмегімен алып тастау
түйінаралықтары салыстырмалы түрде қысқа келетін жас өркендердің
қалыптасуына алып келеді, ал қуыстағы бүршіктер мен меристемалық
төмпешіктер жаңа жас өркендерге бастау береді. Қуыстағы бүршіктерді
индукциялау үшін ортадағы фитогормондардың концентрациясын дұрыс таңдап алу
өте маңызды болып келеді. Цитокининдердің көп мөлшері өсімдік морфологиясын
өзгертуі мүмкін және кейіпсіз пішіндердің пайда болуына алып келеді.
Цитокининдердің жоғары концентрацияларының улы әсерінің нәтижесінде
экспланттар тіптен шетінеп те кетеді.
Ортадағы фитогормондардың дұрыс таңдап алынған концентрациясы кезінде
біртекті емес тұқым алу тәуекелі минималды, мутацияның пайда болу жиілігі
көбейтудің дәстүрлі тәсілдеріне қарағанда ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz