In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған жапырақ экспланттарының каллусогенез және морфогенез ерекшеліктері
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН ТЕРМИНДЕР МЕН СӨЗДЕР ... ... ... ... ... ... . 3
КІРІСПЕ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 4
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1. In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған экспланттардың каллусогенез белсенділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ...
6
1.2. In vitro жағдайында өскен стевияның каллустық ұлпаларында тәтті гликозидтердің түзілуі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
9
1.3. Стевияның клеткалар мен ұлпа культураларындағы морфогенез белсенділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
12
2 ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІСІ МЕН ӘДІСТЕРІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 17
3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ
3.1 In vitro жағдайында өскен стевия жапырақтарының каллус түзу қарқынына жарық пен қараңғының және қоректік орта құрамындағы гормондардың тигізетін әсері ... ... ... ... ... ... ... ... ...
19
3.2 Жапырақ экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларының морфогендік қабілеті ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
28
3.3 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан және сабақ экспланттарының каллус түзу белсенділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ...
29
3.4 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан түзілген каллус ұлпаларының морфогенездік қабілеті ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
33
ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 34
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИТТЕР ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 36
КІРІСПЕ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 4
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1. In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған экспланттардың каллусогенез белсенділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ...
6
1.2. In vitro жағдайында өскен стевияның каллустық ұлпаларында тәтті гликозидтердің түзілуі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
9
1.3. Стевияның клеткалар мен ұлпа культураларындағы морфогенез белсенділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
12
2 ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІСІ МЕН ӘДІСТЕРІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 17
3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ
3.1 In vitro жағдайында өскен стевия жапырақтарының каллус түзу қарқынына жарық пен қараңғының және қоректік орта құрамындағы гормондардың тигізетін әсері ... ... ... ... ... ... ... ... ...
19
3.2 Жапырақ экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларының морфогендік қабілеті ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
28
3.3 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан және сабақ экспланттарының каллус түзу белсенділігі ... ... ... ... ... ... ... ... ...
29
3.4 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан түзілген каллус ұлпаларының морфогенездік қабілеті ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
33
ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 34
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИТТЕР ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 36
Дүниежүзілік Денсаулық сақтау сараптамалық комитетінің болжамы бойынша 2010 жылы бүкіл әлемде 239,4 миллионға жуық адамның қант диабетіне шалдығу қауіпі төнуде. Бүгінгі таңда жүргізілген санақтың соңғы нәтижесі бойынша, әлемде қант диабетімен ауыратын адамдардың саны 175,4 миллионға жеткендігі белгілі.
Соңғы жылдары бірқатар елдерде тамақ өнеркәсібі мен медицинада қанттың орнына тәтті синтетикалық заттарды қосу кең өріс алған. Алайда бұл заттар химиялық жолмен алынатындықтан, адам денсаулығына зиян келтіретіреді. Осының негізінде бірқатар өркениетті елдерде тәтті синтетикалық қосылыстарды қолдануға тыйым салынды. Есесіне бүгінгі таңдағы жүргізіліп жатқан қарқынды ізденістерге - қантты және оны алмастырғыш тәтті синтетикалық қосылыстарды табиғи тәтті және төмен калориялы заттармен алмастыру проблемасы мұрындық болды.
Осының негізінде дитерпенді гликозидтерге өте бай стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) өсімдігіне аса назар аударылып, бірқатар елдерде ауыл шаруашылық дақыл ретінде стевияны көп мөлшерде өсіріп, өндіру жұмыстары алға басты.
Стевияның жер үсті бөлігінде құрғақ салмаққа шаққанда 6,5-11% дейін тәтті гликозидтер синтезделеді. Олар: стевиозид (7 %); ребаудиозид (A, B, C, D); олардың ішінде ребаудиозид A (2%), ребаудиозид (0,07%); стевиолбиозид (іздері). Олардың тәттілігі сахарозадан 150-400 есе артық болып келеді. Солардың ішінде ең тәттісі стевиозид. Стевиозид адам және жануар организміне зиянсыз төмен калориялы қосылыс. Осы қасиетіне байланысты стевия өсімдігін медицинада (қант диабеті, атеросклероз, панкреатит, кариес), тамақ өнеркәсібінде (печенье, кекс, сусындар, т.б.) және парфюмерияда кеңінен қолданылады.
Стевия тропикалық өсімдік болғандықтан, біздің республикамыздың қысқы төменгі температурасына төзімсіз, әрі дәні нашар жетіліп өнуге бейімсіз келеді. Осы себептерге байланысты қысқа мерзім ішінде вегетивті жолмен көбейту әдістерін жасау және оларды тәжірибеге ендіру мәселелері туындайды. Әдетте стевияны өсіру табиғи жағдайда вегетативті жолмен қалемшелеу арқылы, ал in vitro жағдайында микроклондық көбейту әдістерімен жүзеге асырады. Алайда, стевияны өсіріп, көп мөлшерде өнім алу және жерсіндіру бірқатар қиындықтар тудыруда. Осы мәселелерді шешу үшін стевияның көбею физиологиясының заңдылықтарын жан-жақты зерттеу қажет.
Біздің зерттеу жұмысымыз in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі экспланттардың каллусогенез және морфогенез ерекшеліктерін айқындау арқылы стевияның көбейту коэффициентін жоғарылататын әдістемелердің қатарын толықтыру мақсатында өрбіді.
Соңғы жылдары бірқатар елдерде тамақ өнеркәсібі мен медицинада қанттың орнына тәтті синтетикалық заттарды қосу кең өріс алған. Алайда бұл заттар химиялық жолмен алынатындықтан, адам денсаулығына зиян келтіретіреді. Осының негізінде бірқатар өркениетті елдерде тәтті синтетикалық қосылыстарды қолдануға тыйым салынды. Есесіне бүгінгі таңдағы жүргізіліп жатқан қарқынды ізденістерге - қантты және оны алмастырғыш тәтті синтетикалық қосылыстарды табиғи тәтті және төмен калориялы заттармен алмастыру проблемасы мұрындық болды.
Осының негізінде дитерпенді гликозидтерге өте бай стевия (Stevia rebaudiana Bertoni) өсімдігіне аса назар аударылып, бірқатар елдерде ауыл шаруашылық дақыл ретінде стевияны көп мөлшерде өсіріп, өндіру жұмыстары алға басты.
Стевияның жер үсті бөлігінде құрғақ салмаққа шаққанда 6,5-11% дейін тәтті гликозидтер синтезделеді. Олар: стевиозид (7 %); ребаудиозид (A, B, C, D); олардың ішінде ребаудиозид A (2%), ребаудиозид (0,07%); стевиолбиозид (іздері). Олардың тәттілігі сахарозадан 150-400 есе артық болып келеді. Солардың ішінде ең тәттісі стевиозид. Стевиозид адам және жануар организміне зиянсыз төмен калориялы қосылыс. Осы қасиетіне байланысты стевия өсімдігін медицинада (қант диабеті, атеросклероз, панкреатит, кариес), тамақ өнеркәсібінде (печенье, кекс, сусындар, т.б.) және парфюмерияда кеңінен қолданылады.
Стевия тропикалық өсімдік болғандықтан, біздің республикамыздың қысқы төменгі температурасына төзімсіз, әрі дәні нашар жетіліп өнуге бейімсіз келеді. Осы себептерге байланысты қысқа мерзім ішінде вегетивті жолмен көбейту әдістерін жасау және оларды тәжірибеге ендіру мәселелері туындайды. Әдетте стевияны өсіру табиғи жағдайда вегетативті жолмен қалемшелеу арқылы, ал in vitro жағдайында микроклондық көбейту әдістерімен жүзеге асырады. Алайда, стевияны өсіріп, көп мөлшерде өнім алу және жерсіндіру бірқатар қиындықтар тудыруда. Осы мәселелерді шешу үшін стевияның көбею физиологиясының заңдылықтарын жан-жақты зерттеу қажет.
Біздің зерттеу жұмысымыз in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі экспланттардың каллусогенез және морфогенез ерекшеліктерін айқындау арқылы стевияның көбейту коэффициентін жоғарылататын әдістемелердің қатарын толықтыру мақсатында өрбіді.
1. Батыгина Т.Б., Васильева В.П. Прикладные аспекты эмбриологии. Автономность зародыша и эмбриокультура цветковых растений // Ботанический журнал, -1987. -№ 2. -С. 155-160.
2. Валиханова Г.Ж., Рахимбаев И.Р. Культура клеток и биотехнология растений. Учебное пособие. Алма-Ата: изд. КазГУ. -1989. - 80 с.
3. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы. Л. -1974. - 206 с.
4. Дмитриева Н.Н. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений // Культура клеток растений. -М.: Наука, 1981. -С.113-123.
5. Бондарев Н.И., Носов А.Н., Корниенко А.В. Влияние факторов культиви- рования на рост и продуктивность каллусной и суспензионной культуры клеток стевии // Биотехнология, -1978, №7-8. –С.30-37.
6. Mahady G.B., Swanson S.M., Beecher C.W. Stevioside biosinthesis by callus, shoot and rooted-shoot cultures in vitro // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1992.-Vol.28.-P.151-157.
7. Дзюба О.О., Горботенко Л.Е. Изменчивость признаков у клонов стевии, полученных из каллусной ткани // Проблемы ботаники на рубеже веков. Тезис.докл. - Санкт-Петербург, -1998, 26-28 мая, -Т.1., -С.115.
8. Handro W.F., Hell K.G., Kerbauty G.B. Tissue culture of Stevia rebaudiana a sweetening plant // Planta medica.-1977.-Vol.32.-P.115-117.
9. Асрандина С.Ш. Стевия экспланттарынан түзілген каллустық ұлпалардың морфологиялық және гистологиялық ерекшеліктері // Междунар. конф. “Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы”. -Астана, -2004. –С.314-318.
10. Сарсенбаев Б. Стевиозид - природный заменитель сахара, перспективный подсластитель диетических продуктов питания//Пищевая технология и сервис. -1997.32.-С.24-25.
11. Крутошикова А., Угер М. Подслащивающие вещества в пищевой промышленности. Москва, Агропромиздат, -1988. -130 с.
12. Зубенко В.П., Ковальчук М.И. Выращивание рассады стевии // Сахарная свекла. -1992. №6.-С.28.
13. Brendle J.E., Starrat A.N., Gijzen M.N. Stevia rebaudiana:It’s agricultural, biological and chemical properties // Canadian journal of Plant Scoenae. -1998.-Vol.78. №4. -P.527-536.
14. Ouyang X., Hong W., Chen M., Wang D. The growth and differentiation of callus cultures of Stevia rebaudiana in relation to the stevioside accumulation // Journal of Tropical and Subtropical Botany. -1998.-Vol.6(1).-P.8-14.
15. Lee K.R., Choi B.S., Oh SL, Yamada Y. Studies on the callus culture of Stevia as a new sweetning sourse and formation of stevioside// Hanguk Sikp’um Kwahakhoe Chi.-1982.-Vol.14.-P.1749-183.
16. Komatsu K., Nozaki W., Takemura M., Nakaminami M. Production of natural swetner//Jon Kokai Tokyo Koho.Chem.Abstr.84:16317h.-Vol.19.-P.169.
17. Hsing YI., Su WF., Chang W.C. Accumulation of stevioside and rebaudioside A in callus culture of Stevia rebaudiana // Bot Bull Acad Sin. -1983. –V.24. –P 115-119.
18. Czygan F.C., Geissler S.A., Striedner J., Branunegg G. Contribution to the biotechnological production of sweetners from Stevia rebaudiana Bertoni III. Accumulation of secondary metabolites by means of a precursos and by elicitation of cell cultures // Acta Biotechnological. -1991. –Vol.11 (5). –P.505-509.
19. N.Sugyama, H.Yasuyki, F.Runnsuke, W.Mitsuru, W.Takanuri Growth condition of callus directed for accumulation of some useful components in carrot, kiwi, tomato and stevia plants // Scientific-Reports of the Faculty of Agriculture Meijo University.March.-1998.-Vol.34.-P.1-5.
20. Юртаева Н.М., Лобов В.П. Физиологическая и морфологическая характе- ристика каллюсов, полученных из различных форм Stevia rebaudiana Bertoni // Физиол. и биохимия культ.растений.-1998. –Т.30. №3. С.219-225.
21. Асрандина С.Ш. In vitro жағдайында өскен стевияның ұлпаларында тәтті гликозидтердің түзілуі // Ізденіс-Поиск, № 4, 2009, С.32-35.
22. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразножение растений. –М.1983. -97 с.
23. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений // Культура клеток растений и биотехнология. -М.: Наука, 1986. - С. 91 - 102.
24. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. -Наука, 1989. - 103 с.
25. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro эмбриоидогенез у покрытосеменных растений // Ботанический журнал., -1978, -№ 1, -С. 87-95.
26. Уалиханова Г.Ж. Өсімдіктер биотехнологиясы. -Алматы.- 2009.- 34-46 б.
27. Асрандина С.Ш., Шакенова А. Жағдайында стевияның жапырақ және сабақ каллустарының эмбриоидогенез белсенділігі // Зерттеуші-Исследователь, №4(48), 2010, С. 10-16.
28. Андронова В., Лемешев Н.К. Особенности микроклонального размноже- ния Stevia rebaudiana Bertoni //Бюллетень ВАСХНИЛ №204. –Р.55-60.
29. Ferreria C.M., Handro W. Stevia rebaudiana: production of natural sweetners // Biotechnology in Agroculture and Forestry 7. Medicinal and Aromatic Plants II. -1989. –P. 468-487.
30. Bespalhok F.J., Kozumi H. Embryogenetic callus formation and histological studies from Stevia rebaudiana Bertoni floret explants // Revista Brasilereira de Fisiologia Vegetal.Dec.-1997.-V.9(3). –P.185-188.
31. Bespalhok F.J., Hoshimoto J., Esteves L.G. Induction of somatic embryogenesis from leaf explants of Stevia rebaudiana // Bras.Fisiol.Veg.-1993.-V.5 (1). –P.51-53.
32. Wada Y., Tamura T., Kodama T., Yamaki T., Unchida Y. Callus culture and morfogenesis of Stevia rebaudiana Bertoni //Chem.Abstr. -1981. –V.36 94). –P.215-219.
33. Mroginski L., Flachsland E., Davina J. Regeneration of plants from anther of Stevia rebaudiana Bertoni cultivated in vitro // Biocell. -1996. V. 2091). P.87-90.
2. Валиханова Г.Ж., Рахимбаев И.Р. Культура клеток и биотехнология растений. Учебное пособие. Алма-Ата: изд. КазГУ. -1989. - 80 с.
3. Батыгина Т.Б. Эмбриология пшеницы. Л. -1974. - 206 с.
4. Дмитриева Н.Н. Проблема регуляции морфогенеза и дифференциации в культуре клеток и тканей растений // Культура клеток растений. -М.: Наука, 1981. -С.113-123.
5. Бондарев Н.И., Носов А.Н., Корниенко А.В. Влияние факторов культиви- рования на рост и продуктивность каллусной и суспензионной культуры клеток стевии // Биотехнология, -1978, №7-8. –С.30-37.
6. Mahady G.B., Swanson S.M., Beecher C.W. Stevioside biosinthesis by callus, shoot and rooted-shoot cultures in vitro // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1992.-Vol.28.-P.151-157.
7. Дзюба О.О., Горботенко Л.Е. Изменчивость признаков у клонов стевии, полученных из каллусной ткани // Проблемы ботаники на рубеже веков. Тезис.докл. - Санкт-Петербург, -1998, 26-28 мая, -Т.1., -С.115.
8. Handro W.F., Hell K.G., Kerbauty G.B. Tissue culture of Stevia rebaudiana a sweetening plant // Planta medica.-1977.-Vol.32.-P.115-117.
9. Асрандина С.Ш. Стевия экспланттарынан түзілген каллустық ұлпалардың морфологиялық және гистологиялық ерекшеліктері // Междунар. конф. “Развитие ключевых направлений сельскохозяйственных наук в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы”. -Астана, -2004. –С.314-318.
10. Сарсенбаев Б. Стевиозид - природный заменитель сахара, перспективный подсластитель диетических продуктов питания//Пищевая технология и сервис. -1997.32.-С.24-25.
11. Крутошикова А., Угер М. Подслащивающие вещества в пищевой промышленности. Москва, Агропромиздат, -1988. -130 с.
12. Зубенко В.П., Ковальчук М.И. Выращивание рассады стевии // Сахарная свекла. -1992. №6.-С.28.
13. Brendle J.E., Starrat A.N., Gijzen M.N. Stevia rebaudiana:It’s agricultural, biological and chemical properties // Canadian journal of Plant Scoenae. -1998.-Vol.78. №4. -P.527-536.
14. Ouyang X., Hong W., Chen M., Wang D. The growth and differentiation of callus cultures of Stevia rebaudiana in relation to the stevioside accumulation // Journal of Tropical and Subtropical Botany. -1998.-Vol.6(1).-P.8-14.
15. Lee K.R., Choi B.S., Oh SL, Yamada Y. Studies on the callus culture of Stevia as a new sweetning sourse and formation of stevioside// Hanguk Sikp’um Kwahakhoe Chi.-1982.-Vol.14.-P.1749-183.
16. Komatsu K., Nozaki W., Takemura M., Nakaminami M. Production of natural swetner//Jon Kokai Tokyo Koho.Chem.Abstr.84:16317h.-Vol.19.-P.169.
17. Hsing YI., Su WF., Chang W.C. Accumulation of stevioside and rebaudioside A in callus culture of Stevia rebaudiana // Bot Bull Acad Sin. -1983. –V.24. –P 115-119.
18. Czygan F.C., Geissler S.A., Striedner J., Branunegg G. Contribution to the biotechnological production of sweetners from Stevia rebaudiana Bertoni III. Accumulation of secondary metabolites by means of a precursos and by elicitation of cell cultures // Acta Biotechnological. -1991. –Vol.11 (5). –P.505-509.
19. N.Sugyama, H.Yasuyki, F.Runnsuke, W.Mitsuru, W.Takanuri Growth condition of callus directed for accumulation of some useful components in carrot, kiwi, tomato and stevia plants // Scientific-Reports of the Faculty of Agriculture Meijo University.March.-1998.-Vol.34.-P.1-5.
20. Юртаева Н.М., Лобов В.П. Физиологическая и морфологическая характе- ристика каллюсов, полученных из различных форм Stevia rebaudiana Bertoni // Физиол. и биохимия культ.растений.-1998. –Т.30. №3. С.219-225.
21. Асрандина С.Ш. In vitro жағдайында өскен стевияның ұлпаларында тәтті гликозидтердің түзілуі // Ізденіс-Поиск, № 4, 2009, С.32-35.
22. Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразножение растений. –М.1983. -97 с.
23. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений // Культура клеток растений и биотехнология. -М.: Наука, 1986. - С. 91 - 102.
24. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно. -Наука, 1989. - 103 с.
25. Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro эмбриоидогенез у покрытосеменных растений // Ботанический журнал., -1978, -№ 1, -С. 87-95.
26. Уалиханова Г.Ж. Өсімдіктер биотехнологиясы. -Алматы.- 2009.- 34-46 б.
27. Асрандина С.Ш., Шакенова А. Жағдайында стевияның жапырақ және сабақ каллустарының эмбриоидогенез белсенділігі // Зерттеуші-Исследователь, №4(48), 2010, С. 10-16.
28. Андронова В., Лемешев Н.К. Особенности микроклонального размноже- ния Stevia rebaudiana Bertoni //Бюллетень ВАСХНИЛ №204. –Р.55-60.
29. Ferreria C.M., Handro W. Stevia rebaudiana: production of natural sweetners // Biotechnology in Agroculture and Forestry 7. Medicinal and Aromatic Plants II. -1989. –P. 468-487.
30. Bespalhok F.J., Kozumi H. Embryogenetic callus formation and histological studies from Stevia rebaudiana Bertoni floret explants // Revista Brasilereira de Fisiologia Vegetal.Dec.-1997.-V.9(3). –P.185-188.
31. Bespalhok F.J., Hoshimoto J., Esteves L.G. Induction of somatic embryogenesis from leaf explants of Stevia rebaudiana // Bras.Fisiol.Veg.-1993.-V.5 (1). –P.51-53.
32. Wada Y., Tamura T., Kodama T., Yamaki T., Unchida Y. Callus culture and morfogenesis of Stevia rebaudiana Bertoni //Chem.Abstr. -1981. –V.36 94). –P.215-219.
33. Mroginski L., Flachsland E., Davina J. Regeneration of plants from anther of Stevia rebaudiana Bertoni cultivated in vitro // Biocell. -1996. V. 2091). P.87-90.
әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті
Биология факультеті
Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасы
БІТІРУ ЖҰМЫСЫ
IN VITRO ЖАҒДАЙЫНДА СТЕВИЯДАН ОҚШАУЛАНЫП АЛЫНҒАН ЖАПЫРАҚ ЭКСПЛАНТТАРЫНЫҢ
КАЛЛУСОГЕНЕЗ ЖӘНЕ МОРФОГЕНЕЗ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ
Орындаған
4 - курс студенті: ___________________________________ _А.С. Шакенова
( қолы, күні )
Ғылыми жетекші
б.ғ.к., доцент: ___________________________________ ____C.Ш. Асрандина
( қолы, күні )
Норма бақылаушысы
ассистент: ___________________________________ _______С.Б. Оразова
( қолы, күні )
Қорғауға жіберілді:
Кафедра меңгерушісі
б.ғ.б., профессор: ___________________________________ _Т.А. Карпенюк
( қолы, күні )
Алматы, 2010
МАЗМҰНЫ
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН ТЕРМИНДЕР МЕН СӨЗДЕР ... ... ... ... ... ... . 3
КІРІСПЕ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...4
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ..
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1.In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған
экспланттардың каллусогенез 6
белсенділігі ... ... ... ... ... .. ... ... ... ..
1.2.In vitro жағдайында өскен стевияның каллустық ұлпаларында
тәтті гликозидтердің түзілуі 9
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ...
1.3.Стевияның клеткалар мен ұлпа культураларындағы морфогенез
белсенділігі ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ...12
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ...
2 ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІСІ МЕН 17
ӘДІСТЕРІ ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ...
3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ
3.1 In vitro жағдайында өскен стевия жапырақтарының каллус түзу
қарқынына жарық пен қараңғының және қоректік орта құрамындағы
гормондардың тигізетін 19
әсері ... ... ... ... ... ... ... . ... ..
3.2 Жапырақ экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларының
морфогендік 28
қабілеті ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... .
3.3 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан және сабақ
экспланттарының каллус түзу белсенділігі 29
... ... ... ... ... ... ... ... .. ..
3.4 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан түзілген каллус
ұлпаларының морфогенездік 33
қабілеті ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ...
ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ...34
... ... ... ... ... ... ... ...
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИТТЕР 36
ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН ТЕРМИНДЕР МЕН СӨЗДЕР
БАП 6-бензиламинопурин
2,4 Д 2,4-дихлорфеноксисірке қышқылы
ИМҚ индолил-3май қышқылы
ГҚ гибериллин қышқылы
ИСҚ индолил-3-сірке қышқылы
НСҚ нафтил сірке қышқылы
МС Мурасиге-Скуг ортасы
ЛС Линсмайер-Скуг ортасы
ЭК эмбриогенді каллус
ЭКК эмбриогенді клеткалар кешені
КІРІСПЕ
Дүниежүзілік Денсаулық сақтау сараптамалық комитетінің болжамы бойынша
2010 жылы бүкіл әлемде 239,4 миллионға жуық адамның қант диабетіне шалдығу
қауіпі төнуде. Бүгінгі таңда жүргізілген санақтың соңғы нәтижесі бойынша,
әлемде қант диабетімен ауыратын адамдардың саны 175,4 миллионға жеткендігі
белгілі.
Соңғы жылдары бірқатар елдерде тамақ өнеркәсібі мен медицинада қанттың
орнына тәтті синтетикалық заттарды қосу кең өріс алған. Алайда бұл заттар
химиялық жолмен алынатындықтан, адам денсаулығына зиян келтіретіреді.
Осының негізінде бірқатар өркениетті елдерде тәтті синтетикалық
қосылыстарды қолдануға тыйым салынды. Есесіне бүгінгі таңдағы жүргізіліп
жатқан қарқынды ізденістерге - қантты және оны алмастырғыш тәтті
синтетикалық қосылыстарды табиғи тәтті және төмен калориялы заттармен
алмастыру проблемасы мұрындық болды.
Осының негізінде дитерпенді гликозидтерге өте бай стевия (Stevia
rebaudiana Bertoni) өсімдігіне аса назар аударылып, бірқатар елдерде ауыл
шаруашылық дақыл ретінде стевияны көп мөлшерде өсіріп, өндіру жұмыстары
алға басты.
Стевияның жер үсті бөлігінде құрғақ салмаққа шаққанда 6,5-11% дейін
тәтті гликозидтер синтезделеді. Олар: стевиозид (7 %); ребаудиозид (A, B,
C, D); олардың ішінде ребаудиозид A (2%), ребаудиозид (0,07%);
стевиолбиозид (іздері). Олардың тәттілігі сахарозадан 150-400 есе артық
болып келеді. Солардың ішінде ең тәттісі стевиозид. Стевиозид адам және
жануар организміне зиянсыз төмен калориялы қосылыс. Осы қасиетіне
байланысты стевия өсімдігін медицинада (қант диабеті, атеросклероз,
панкреатит, кариес), тамақ өнеркәсібінде (печенье, кекс, сусындар, т.б.)
және парфюмерияда кеңінен қолданылады.
Стевия тропикалық өсімдік болғандықтан, біздің республикамыздың қысқы
төменгі температурасына төзімсіз, әрі дәні нашар жетіліп өнуге бейімсіз
келеді. Осы себептерге байланысты қысқа мерзім ішінде вегетивті жолмен
көбейту әдістерін жасау және оларды тәжірибеге ендіру мәселелері
туындайды. Әдетте стевияны өсіру табиғи жағдайда вегетативті жолмен
қалемшелеу арқылы, ал in vitro жағдайында микроклондық көбейту әдістерімен
жүзеге асырады. Алайда, стевияны өсіріп, көп мөлшерде өнім алу және
жерсіндіру бірқатар қиындықтар тудыруда. Осы мәселелерді шешу үшін
стевияның көбею физиологиясының заңдылықтарын жан-жақты зерттеу қажет.
Біздің зерттеу жұмысымыз in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып
алынған әр түрлі экспланттардың каллусогенез және морфогенез ерекшеліктерін
айқындау арқылы стевияның көбейту коэффициентін жоғарылататын
әдістемелердің қатарын толықтыру мақсатында өрбіді.
Бітіру жұмысы 37 беттен, 8 кестеден, 11 суреттен, 33 әдебиеттен
тұрады.
Негізгі сөздер: in vitro, тотипотенттік, пролиферация, эксплант,
клетка культурасы, ұлпа культурасы, каллусогенез, морфогенез, каллус,
геммогенез, ризогенез, эмбриогенез, Мурасиге-Скуг ортасы, фитогормондар
(ауксиндер: НСҚ, 2,4 Д; цитокининдер: БАП, кинетин, зеатин), гликозидтер.
Зерттеу объектілері: in vitro жағдайында өскен Stevia rebaudiana
Bertoni оқшауланып алынған жапырақ; жапырақтың жас бөлігі мен сағағы;
сабақ кесінділерінен алынған экспланттар.
Зерттеу әдістемелері: in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған
оқшаулап алынған ұлпалар мен мүшелерді өсіру Р.Г.Бутенконың, Ф.Л.Калинин,
В.В. Сарнацкая және В.Б. Полищуктың әдістемелері бойынша жүргізілді.
Қоректік орталар Мурасиге-Скуг нұсқасы бойынша дайындалды. Қоректік
орталар құрамына фитогормондар: акусиндер мен цитокининдер қосылды.
Зерттеу объектілері температурасы 25±20С, 16 сағаттық фотопериодтық
жарық және қараңғы камераларда өсірілді. Ауаның ылғалдылығы 55-60 % болды.
Мақсаты: in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі
экспланттардың каллусогенез және морфогенез ерекшеліктерін айқындау арқылы
стевияның көбейту коэффициентін жоғарылататын әдістемелерді жасау.
Міндеттері:
- In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі
экспланттардың (толық жапырақ тақтасының және жапырақтың жас бөлігі мен
сағағының, сабақ кесіндісі) каллусогенез белсенділігіне қоректік орта
құрамындағы экзогенді фитогормондардың және жарық пен қараңғының тигізетін
әсерін зерттеу.
- Әр түрлі экспланттардан түзілген каллус ұлпалардың сыртқы
морфологиялық белгілеріне сипаттама беру және олардың өсу қарқындылығын
анықтау.
- Каллустық ұлпалардың моргогендік белсенділігіне қоректік орта
құрамындағы экзогенді фитогормондардың және жарықтың тигізетін әсерін
анықтау.
Алынған нәтижелер: in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр
түрлі экспланттардың (толық жапырақ тақтасының және жапырақтың жас бөлігі
мен сағағының, сабақ кесіндісі) каллусогенез және морфогенез белсенділігі
эксплант тегінен, жас ерекшелігінен, қоректік орта құрамындағы экзогенді
фитогормондардың табиғатынан және олардың концентрациялары мен өзара
қатынасынан, сондай-ақ, жарық пен қараңғыдан тәулді болатыны анықталды.
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1. In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған экспланттардың
каллусогенез белсенділігі
Өсімдік клеткаларын, ұлпаларын және мүшелерін жасанды ортада өсіріп,
олардың дамуын зерттеу арқылы бірқатар морфофизиологиялық және биохимиялық
процестердің негізін ашуға және оларды бақылауға мүмкіндік туатыны белгілі.
Клеткалар мен ұлпалар тіршілігіндегі регуляция механизмдерін анықтау
мақсатында in vitro культураларын өсіріп, олардың даму ерекшеліктерінің
сыртқы орта жағдайларымен (қоректік орта құрамы, жарық, ылғал т.б.)
байланысын айқындауға болады. Бұл зерттеулердің негізіне өсімдік
клеткаларына тән - тотипотенттік қасиет жатады.
Тотипотенттік – жекешеленген клеткалардың көбейе өсіп, толыққанды
бүтін организмге айналу қабілеті. Көп клеткалы организмдердің әр
клеткасында толық нәсілдік мағлұматтар жиынтығы болады. Тотипотенттік
осыған негізделген.
Теориялық тұрғыдан қарастырғанда өсімдік организмінің әр бір клеткасы
тотипотентті, яғни кез келген клетканы белгілі бір жағдайда тиісті даму
жолына түсіруге болады. Оқшауланып алынған клеткалардың культуралары
олардың потенциалдық мүмкіншіліктерін анықтауға қолайлы модель болып
табылады 1.
Кез келген өсімдіктің оқшауланып алынған мүшелері мен ұлпаларын
қолайлы жағдайда өсіргенде олардан маманданбаған клеткалар тобы – каллус
түзіледі. Ал таби жағдайда, каллус өсімдіктің жарақаттанған жерінде
шорлана бітіп қорғаныштық және бұзылған анатомиялық құрылымдарды қалпына
келтіру үшін қоректік заттарды жинау қызметін атқарады 2.
Каллус деп клеткалардың пролиферациялану нәтижесінде түзілген
ұлпаларды атайды. Пролиферация – бастапқы клеткалардың бөліну жолымен жедел
көбеюі. Маманданған клеткалардың пролиферациялануын дедифферация деп
атайды. Бұл процестің негізінде гендердің дифференциалды активтілігі
жатады. Клеткалардың құрылымы мен қызметі гендердің активтілігіне
байланысты. Организмдегі клеткалардың құрылымы мен атқаратын қызметінің
өзгеруіне себепші әр түрлі гендердің экспрессиясы болып табылады. Яғни,
клеткалардың мамандануы көптеген гендердің әрекеттесуіне байланысты.
Организмнің барлық клеткаларында гендері бірдей боса да, олардың бәрі бір
мезгілде әрекеттенбейді. Әдетте гендердің біразы ғана (5%) белсенді болады
3.
In vitro жағдайында каллус көбінесе алғашқы немесе қайталама
меристемадан пайда болады. Сондай-ақ, меристемаға немесе өткізгіш ұлпаларға
жанасып жатқан паренхимадан да пайда болады. Каллусұлпасы жұқа қабырғалы
анық анатомиялық құрылысы жоқ паренхималық клеткалардан тұратын аморфты
масса. Каллус ұлпаларының бәрі бірдей, біркелкі болмайды. Каллустар
морфологиялық белгілері (тығыздығы, ылғалдыдлығы, түктенуі, түсі) және өсу
қарқындылығы мен көгеру қабілеті жағынан әр алуан болады. Каллустың түсі
ақшыл, жасыл, сұр, сарғыш, қоңыр, қызғылт болады. Каллус құрамында
хлорофилл немесе антоциан пигменттері болуы мүмкін. Шығу тегіне және өсіру
жағдайына байланысты каллустар тұтас тығыз немесе борпылдақ, шашыраңқы
болып келеді.
Каллус клеткаларының құрылуы, бөлінуі және көбейіп өсуі фитогормондар
(ауксиндер мен цитокининдер) табиғатына тәуелді болады. Мәселен,
қосжарнақты өсімдіктердің көптеген түрлерінде каллус ұлпаларының түзілуі
ауксин мен цитокининнің әсерімен жүзеге асады.
Ал астық тұқымдастарда цитокинин клеткалардың бөлінуін тежейтіндіктен
каллустың түзілуі көбінесе тек ауксин әсерімен жүреді. Сонымен қатар,
каллус клеткаларының түзілуі мен өсу белсенділігіне қоректік орта құрамы
мен оның рН көрсеткіші және температура, жарық, осмос қысымытағы басқа
жағдайлар әсер етеді. Сондай-ақ, өсімдік түрі, жасымен физиологиялық күйі,
экспланттың тегі мен оның көлемі, кейде оны қоректік ортаға орналастыру
ретінде де байланысты болады.
Сонымен, кез келген өсімдіктің мүшелері мен ұлпаларынан жасанды
қоректік ортада каллус өсіріп алуға болады. Каллус клеткаларында
морфогенездің әр түрлі процестері өтуі мүмкін. Оларға сомалық эмбриогенез
немесе органогенез жолдарымен даму қабілеті тән. Соның арқасында жеке-дара
клеткалардан бүтін регенерант өсімдік өндіріп шығаруға болады. Бұл
регенерация процесі өсімдіктің тотипотенттілігін дәлелдейді 4. Осы жолмен
тез, қысқа уақыт аралығында тиімді морфогенді каллус алу өсімдікті
вегетативті жолмен көбейтуге негіз болады.
Соңғы жылдары бірқатар ТМД және шетел зерттеушілері стевияның
морфогенез ерекшеліктерін зерттеу және көбейту коэффициентін жоғарылату
мақсатында ізденіс жұмысатарын жүргізуге белсенді кіріскен.
Стевиядан оқшауланып алынған экспланттан тікелей немесе каллус арқылы
регенерант өсімдік алудың түрлі жолдары жасалған.
Бірқатар ғалымдардың зерттеу жұмыстарында стевияның жапырақ
экспланттарынң каллус түзу белсенділігіне және олардың өсу қарқыны мен
морфогендік қабілеттеріне физикалық, трофикалық және гормоналды
факторлардың тигізетін әсерін анықтау көзделген.
Мәселен, Н.И.Бондарев, А.Н.Носов және А.В.Корниенко 5 стевияның
жапырақтарынан түзілген каллус ұлпаларының өсу динамикасына өсіру
жағдайларының (температура,жарық) трофикалық (көмірсу, витамин және
минералды заттар), гормоналды факторлардың әсерін зерттеген. Зерттеу
нәтижесінде, қаллустың өсу қарқынына 25±10С температура қолайлы болған.
Каллус клеткаларының өсу қарқынына жарық түрліше әсер еткен. Яғни, бір
каллус ұлпаларының өсуі қарқынды жүрсе, екіншілерінде бәсеңдеп,
үшіншілерінде жарыққа тәуелділік байқалмаған.
Сондай-ақ, каллус ұлпаларының өсу белсенділігі қоректік орта
құрамындағы көмірсулардың табиғатына байланысты түрліше жүретіні де
байқалған. Галактоза, арабиноза және рафиноза қосылған ортада каллустардың
түршілігі жойылатыны, ал рамноза мен сорбит қосылған ортада каллус
ұлпаларының өсу қарқыны өте баяу болатыны көрсетілген. Қоректік орта
құрамына мальтоза қосылған ортада каллус ұлпаларының өсуі елеулі мөлшерде,
ал фруктоза мен глюкоза қосылған ортада едәуір жоғарылайтыны (51 %)
айқындалған. Ең жоғары көрсеткіш 60,8 % сахароза қосылған қоректік
орталарда болған. Қоректік орта құрамындағы сахарозаның мөлшерін азайтқанда
каллус биомассасының жинақталуы едәуір бәсеңдеп, ұлпа клеткалардың
дегенерацияға ұшырайтындығы байқалған. Ал сахаролзаның жоғарғы
концентрациясы ұлпа биомассасының тығыздығын арттырғанымен, оның тәжірибеге
қолдану тиімділігін төмендеткен. Сонымен, каллус ұлпасының өсу
белсенділігіне қоректік орта құрамындағы көмірсулар едәуір әсер ететіндігі
байқалған. Стевияның каллус культурасы көптеген өсімдік клеткаларына тән
сахарозадан басқа фруктоза мен глюкозаны сіңіретіні айқындалған. Әйтсе де,
фруктоза мен глюкозаға қарағанда сахарозаны қолдану тиімді деген қорытынды
жасауға болады.
Сонымен қатар, стевия жапырақтарының каллус түзу қабілетіне әсер
ететін әр түрлі өсуді реттегіш гормондар табиғаты мен олардың лайықты
концентрациялары айқындалған. Мәселен, G.B.Mahady, S.M.Swanson, C.W.Beecher
6 жапырақ экспланттарының каллус түзу белсенділігін қоректік орта
құрамына бірдей концентрацияда (0,5 мгл) қосылған НСҚ мен БАП әсерімен, ал
О.О.Дзюба мен Л.Е.Горботенко 7 тек БАП (2мгл) әсерімен жүзеге асырған.
W.F.Handro, K.G.Hell, G.B.Kerbauty 8 ерттеулерінде стевияның жапырақ
дискілері мен сабақ кесінділерінің каллус түзу қабілеті бірқатар өсу
гормонларының (ИСҚ, 2,4Д, кинетин, зеатин) тигізетін әсеріне байланысты
болған.
Сондай-ақ, жапырақ каллустарының өсу қарқыны әр түрлі гормондар
қатынасында (2 мгл НСҚ мен 0,4 мгл БАП 8 ; 0,2 мг ИМҚ мен 0,3 мгл
2,4 Д 6; 2,4 Д (800 мМ) мен цитокининнің (БАП,кинетин,зеатин) қосылған
МСорталарында жоғары көрсеткішке ие болған. Ал 0,8 мгл 2,4 Д мен 0,5 мгл
БАП 6; ИСҚ немесе цитокининдер жекелей қосылған 8 орталарда ұлпалардың
өсу қарқыны едәуір төмен болатыны байқалған. Каллус ұлпаларының өсуіне
аденин (20 мгл) мен цитокининдер қосылысы әсерін тигізбейтіні байқалған
8.
С.Ш. Асрандинаның 9 зерттеулерінде стевияның әр түрлі мүшелерінен
(жапырақ, сабақ, гүлшоғы) оқшауланып алынған экспланттардың каллусогенездік
қабілеті бірдей емесжәне олар әр түрлі ішкі және сыртқы факторлардан
(эксплант тегіне, жас ерекшелігіне, ауланына, қоректік орта құрамына, өсу
гормондарының табиғаты мен олардың концентрацияларынан, жарық пен
қараңғыға) тәуелді болатындығын зерттеген.
1.2. In vitro жағдайында өскен стевияның каллустық ұлпаларында тәтті
гликозидтердің түзілуі
Өсімдіктер медицина мен халық шаруашылығында кең пайдаланатын алуан
түрлі қосымша метаболиттерді синтездейтіні белгілі. In vitro жағдайында
өсірілетін өсімдік клеткалары мен ұлпалары да қосымша метаболиттерді түзуге
қабілетті болады. Олардың синтездеу қабілеті жыл мерзімінен тәуелсіз
болғандықтан, жыл бойы метаболитті заттарды түзетін қайнар көздер бола
алады. Сондай-ақ, өсірілген клеткалар биотрансформацияны жүзеге асыруға
қабілетті болады, яғни кейбір арзан, қоры мол қосындыларды басқа бағалы
заттарға айналдыра алады.
Сонымен in vitro жағдайында өсімдіктердің клеткалар мен ұлпа
культураларын өсіру арқылы олардың морфогенез ерекшеліктерін жан-жақты
зерттеп, өсімдіктің көбейту коэффициентін жоғарылатуға болады. Сонымен
қатар, клеткалар мен ұлпа культуралары экономикалық маңызы зор заттарды
өндірудің қайнар көзі болып табылады.
Соңғы жылдары бірқатар шетел және ТМД елдерінде ауыл шаруашылық дақыл
ретінде дитерпенді гликозидтерге өте бай стевия (Stevia rebaudiana Bertoni)
өсімдігіне аса назар аударған. Оны көп мөлшерде өсіріп, жоғары сапалы өнім
алу өндірісі дамыған.
Stevia rebaudiana Bertoni өсімдігін дитерпенді гликозидтерге өте бай
табиғи қант алмастырғыштардың перспективті альтернативасы ретінде қолдануға
болады. Стевия Бразилия мен Парагвайдың жергілікті көпжылдық шөптесін
өсімдігі. Оның жапырақтарында 6,5-11% мөлшерде дитерпенді гликозидтер
түзіледі. Олардың тәттілігі сахарозадан 150-400 есе артық. Солардың ішінде
ең тәттісі стевиозид. Стевиозид адам және жануар организміне зиянсыз төмен
калориялы қосылыс. Осы қасиетіне байланысты стевия өсімдігі медицинада,
тамақ өнеркәсібінде және парфюмерияда кеңінен қолданылады 10-12.
Дитерпенді гликозидтердің өсімдік мүшелерінде таралу заңдылығын
J.E.Brendle 13 айқындаған. Стевиозидтің ең көп мөлшерде стевияның
жапырақтарында 3-8 %, ал гүлдерінде 0,9 % және сабағында 0,3% жинақталады.
Стевияның жапырақ экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларында
стевиозидтің түзілуі жөнінде қарама-қарйшы пікірталас бар. Мәселен, қытай
ғалымдары X.Ouyang, W.Hong, M.Chen, D.Wang 14 жапырақ экспланттарынан
түзілген каллус ұлпаларын 2 мгл БАП және 0,5 мгл НСҚ қосылған МС
ортасында 6 ай бойы өсіріп, олардың өсуі мен дифференциациясын бақылаған.
Сондай-ақ, түзілген әр түрлі каллус ұлпаларындағы стевиозидтің түзілу
мүмкіндігін зерттеген. Зерттеу нәтижесінде: жасыл, тығыз, баяу өсетін
каллустар құрамында стевиозид концентрациясы жоғары (5,37 %) болатындығы
анықталған.
Электронды микроскоп көмегімен бұл каллус клеткалары қатты
вакуольденген, хлоропластары толық дамыған қоймалжың пластоглобұла
стромаларынан тұратынын байқаған. Ал сары, тығыз, баяу өсетін каллустар
құрамында стевиозид аз (2,13 %) түзілетіндігін атап, олардың
клеткаларындағы пластидтері көптеген крахмал дәндерімен бірнеше ыдыраған
ламаллалардан, ал кейбір пластидтері крахмал дәндеріне толы болатындығын
атаған. Сонымен қатар: сары, борпылдақ, тез өсетін каллустардың құрамында
стевиозид өте аз (0,96 %) түзілетінін және бұл каллустардың клеткаларында
ұсақ ламеллалардан тұратын қарапайым пластидтердің болатындығы дәлелденген.
Сондай-ақ, геммогенез процесі жүрген жасыл, тығыз каллустарда стевиозид
мөлшері 5,78 % - ке жететіндігін көрсеткен.
Басқа да қытый ғалымдары K.R.Lee, B.S.Choi, SL Oh, Y.Yamada 15 және
жапон ғалымдары K.Komatsu, W.Nozaki, M.Takemura, M.Nakaminami 16;
YI.Hsing, WF.Su, W.C.Chang 17 стевияның каллустық клеткаларында
гликозидтердің түзілетіндігін көрсеткен.
F.C.Czygan, S.A.Geissler, J.Striedner, G.Branunegg 18 стевияның
суспензия культурасындағы клеткаларды стевиозидтің із ашарымен (гиббереллин
А) қоректендірудің нәтижесінде стевиозидтің түзілуі алғашқы бірінші
тәулікте басталатындығын байқаған. Стевиозидтің көп мөлшерде түзілуі бір
аптадан кейін жүзеге асатындығын көрсеткен. Ал стевиозидтің із ашарлары
қосылмаған қоректік орталарда стевиозид 2-7 апта аралығында түзілетіндігін
анықтаған.
Жапон ғалымдары: N.Sugyama, H.Yasuyki, F.Runnsuke, W.Mitsuru,
W.Takanuri 19 өз зерттеулерінде стевия жапырақтарынан түзілген каллустың
өсу белсенділігі мен олардың құрамында синтезделетін қосымша метаболит
өнімдерінің жинақталу қарқынына әр түрлі факторлардың тигізетін әсерін
зерттеген. Нәтижесінде, каллус ұлпаларының өсу қарқыны жарық ортада (3000
люкс) ортада ең жоғарғы көрсеткішке ие болған. Сонымен қатар, каллустарды
өсіру мерзімінде қоректік ортадағы қант мөлшерінің кемуі ұлпалардың өсу
қарқынын олардағы екінші реттік метаболит өнімдерінің синтезделуін
тежейтінін байқаған. Ал хлорофилл мен каротиноид мөлшерінің
өзгермейтіндігін анықтаған. Сондай-ақ, қоректік ортада NO3 NH4 (4:2)
қатынасында және жоғары концентрацияда бейорганикалық фосфатты қосқанда,
каллус ұлпаларының өсу қарқынымен қатар ондағы синтезделетін өнімдердің
мөлшері едәуір жоғарылайтынын байқаған. Н.М.Юртаева мен В.П.Лобов 20
жапырақ қаллустарында стевиозидтің іздері ғана болатындығын байқаған.
Алайда бірқатар ғалымдардың: G.B.Mahady, S.M.Swanson, C.W.Beecher
W.F.Handro, K.G.Hell, G.B.Kerbauty 6 зерттеулерінде стевияның каллус
культурасында стевиозидтің түзілмейтіндігін жоғары тиімді сұйық
хромотография (ЖТСХ) және табақшалы хроматография (ТХ) әдістерімен
айқындаған. Зерттеуге 0,5 мгл БАП пен 0,5 мгл НСҚ қосылған МС ортасында 2-
кі ай бойы өсірілген жасыл, борпылдақ каллус ұлпаларын қолданған.
С.Ш. Асрандинаның 21 ізденістерінде G.B.Mahady, S.M.Swanson,
C.W.Beecher W.F.Handro, K.G.Hell, G.B.Kerbauty зерттеулеріне сәйкес,
стевияның жапырақ және сабақ қаллустарында сткевиозид түзілмейтіндігі
анықталған. Яғни, жапырақ және сабақ экспланттарынан түзілген калус
ұлпаларында тәтті гликозидтерді (стевиозидті) синтездеу қабілеті
жойылғандығы байқалған. Ал каллус ұлпаларынан түзілген сабақтың тәтті болуы
олардағы стевиозидтің синтезделу қабілеті қайта жанданатынын дәлелдеуі
мүмкін деген болжам жасаған.
С.Ш. Асрандинаның пікірінше алынған нәтижелер бірқатар қытай
ғалымдарының мәліметтеріне қайшы келуі әр түрлі факторларға байланысты
болуы ықтимал. Яғни, стевия өсімдігінің жас ерекшелігі мен эксплант алынған
орны, эксплант тегі, каллус жасы, өсіру жағдайы сәйкес келмеуі. Сондай-ақ,
каллустарды өсіруге алынған қоректік орта құрамы және өсу гормондарының
табиғаты мен олардың концентрацияларының сәйкес келмеуіне байланысты болар
деген тұжырым жасаған.
Сонымен, С.Ш. Асрандинаның зерттеуінде стевияның жапырақ және сабақ
экспланттарынан пайда болған каллустарда стевиозид түзілмейтіндігі
анықталған. Ал керісінше, геммогенез процесі жүретін морфогенді каллустарда
және олардан өсіп шыққан өркендерде стевиозид түзілетіні анықталған. Осыған
байланысты, стевиозидтің түзілуі тек маманданаған (дифференциалданған)
клеткаларға ғана тән деген тұжырым жасалған.
Қорыта айтқанда, жоғарыда келтірілген деректер біршама қайшы болса да,
көптеген зерттеушілер ұлпаның генетикалық сипаттамасына көңіл қояды. Бірақ,
кей жағдайда өсіруге алынған ұпада қажетті заттардың мөлшері жоғары болуы
оның осы ұлпада синтезделмей, тек басқа ұлпалардан тасымалданып
жеткізілгенін көрсетуі мүмкін. Сондықтан өсіруге алынған экспланттың тегіне
де назар аудару керек.
Өсірілген клеткалардың қосымша метаболизмінде толыққанды өсімдікпен
салыстырғанда едәуір өзгерістер пайда болуы мүмкін. Ретсіз бөлініп жатқан
каллус клеткаларында заттың мөлшері шамалы болатыны әдебиет мәліметтерінде
кездеседі.
Сондай-ақ, кейбір өсімдіктерден (оймақгүл Digitalis Lanata) алынған
каллус клеткаларының биосинтездік қабілеті жоғалып, ал регенерант -
өсімдікте биосинтездік қабілеті қайта жанданатыны белгілі. Яғни, өсімдік
клеткасындағы қосымша метаболизмнің дамуы дифференциалдану процесімен
тығыз байланысты. Дифференциалданған клеткалар көбінесе қосымша заттарды
каллус клеткаларына қарағанда көбірек синтездейді. Әйтсе де, бұл біріңғай
заңдылық емес. Клеткалар афтотрофтық қоректенуден гетеротрофтық
қоректенуге көшу салдарынан өзінің генетикалық мүмкіншіліктерін толық
жүзеге асыра алмайды.
Сонымен, жасанды қоректік ортада өсірілген клеткаларда генетикалық
ақпарат сақталады, бірақ оның жүзеге асуы үшін ерекше жайдайлар тудыру
қажет.
1.3. Стевияның клеткалар мен ұлпа культураларындағы морфогенез
белсенділігі
Н.В.Катаеваның 22 жасаған классификациясы бойынша клондық
микрокөбейту әдісі бірнеше түрге бөлінеді. Олар: 1) өсімдікті меристемалар
(сабақтағы апикалды меристемалар мен сабақ бойындағы тыныштық күйінде
жатқан қолтық бүршіктер, жер асты мүшелеріндегі бүршіктер, жапырақтағы
интеркалярлы меристемалар) арқылы көбейту. Бұл жолмен көбейтілген
өсімдіктер ата-аналық формалармен генетикалық табиғаты бірдей болады.
2) өсімдіктерді бүршік немесе эмбриоидтың түзілуі нәтижесінде алу. Бұл
жолмен көбейтілген өсімдіктер маманданған ұлпа клеткаларынан немесе
маманданбаған каллус клеткаларынан түзіледі. Оларға генетикалық өзгергіштік
тән, сондықтан олар ата-анасынан өзгешеленуі мүмкін. Бұл әдісті өсімдіктен
түзілген каллус клеткалары генетикалық тұрақты немесе өсімдіктің
өзгергіштігі табиғи өзгергіштік деңгейінен аспайтын өсімдік түріне ғана
қолданылады.
Жоғарыда айтылған әдістің екінші түріне қысқаша шолу жасайтын болсақ,
in vitro жағдайында көптеген өсімдіктерден алынған экспланттардан тікелей
мүше түзілетіні әдеби мәліметтерден белгілі. Регенерацияның бұл түрінде
оқшауланып алынған ұлпаның бірлі – жарым клеткалары дедифференциалданып,
меристемалық оқақтар түзеді. Ал келешекте осы меристемалық ошақтар кірме
(адвентивті) бүршіктің түзілуіне бастама болады. Сондай-ақ, адвентивті
өркендер бүйір және латеральды меристемалардан да қалыптасуы мүмкін. Әйтсе
де, В.А. Высоцкийдің 23
пікірінше бұл жолмен көбейтілген өсімдіктерден біртекті ұрпақтар алу қиынға
соғады.
Клеткалар суспензиясы арқылы жүзеге асатын органогенез индукциясы мен
сомалық эмбриоидогенез процесі микроклондық көбейту жолдарының бірі болып
табылатыны белгілі. Бірінші жағдайда экспланттың жарақаттанған аймағында
клеткалардың дедифференциалдануы нәтижесінде бағытсыз бөлініп, өзара ретсіз
орналасқан паренхималық клеткалардан құралған каллус ұлпасы пайда болады.
Лайықты жағдайда ол клеткалар, немесе клеткалар торптары кірме (адвентивті)
бүршікке, өркенге немесе тамырға бастама болады. Екінші жағдайда, сомалық
ұрықтың пайда болуы (эмбриоидогенез) тікелей және жанама жолдармен жүруі
мүмкін. Мұнда да жарақаттанған бөлікте каллус түзіледі. Оның жеке
клеткаларының бөлінуінен сомалық ұрықтар (эмбриоидтар) қалыптасады. Қолайлы
жағдайларда регенерация процесі арқылы олардан біртұтас организм дамиді.
Т.Б.Батыгинаның 1 зерттеулерінде эмбриогенді каллустағы эмбриогенді
клеткалар кешеніне (ЭКК) төмендегідей сипаттама берілген. ЭКК перифериялық
(3-6 қабат) клеткалар ірі ядролы, тығыз цитоплазмалы, майда вакуольдері
ядроны қоршай орналасады және ірі крахмал дәндері болады. Сонымен қатар,
перифериялық клеткалардың арасында сопақша келген, крахмалдан бос клеткалар
кездеседі, олардың цитоплазмалары қатты вакуольденгендіктен бос сияқты
көрінеді.
ЭКК орталық клеткалардың ядролары мен цитоплазмалары тығыз, ірі
орталық вакуолі мен көптеген майда крахмал дәндері болады. Орталық
клеткалардың сыртқы қабықшалары перифериялық клеткаларға қарағанда қалыңдау
келеді. ЭКК сыртқы қабатында жатқан клеткалар орталық клеткаларға қарағанда
жоғары дегидрогеназалық ырықтығымен сипатталады және олада РНҚ мөлшері
жоғары болады 24.
Т.Б.Батыгинаның, В.Е.Васильеваның және Т.Б.Маметьеваның 25
ізденістерінде эмбриогенді каллус ұлпаларын горонсыз ортаға көшіру
нәтижесінде ЭКК-нің перифериялық қабатында асинхронды бөлінетін көптеген
эмбриоидтар түзілетінін байқаған. ЭКК қалық қабатында немесе сыртқы
жағында оқшау жатқан инициаль клеткаларының біркелкі бөлінбеуі оның
полярлық қасиетіне байланысты болады. Инициаль клеткасы реактивті жүйеге
ұқсас болып келеді. Ондағы заттар белгілі бір градиентпен тарайды. Оның
апикалды полюсы протеин синтезделетін және өсу мен морфогенез аймағы болып
табылады. Ал базалды полюсы осмостық белсенді заттарға бай болады. Апикалды
клетканың бөлінуінен түзілген клеткалар эмбриоидқа бастама берсе, ал
базалды клетканың бөлінуінен пайда болған клеткалар суспензорды
қалыптастырады. Осының негізінде инициаль клеткасының біркелкі бөлінбеуі
оның полярлық ерекшеліктеріне байланысты болады.
Келесі бөлінуі қатты вакуольденген базалды клеткада жүзеге асырылады.
Бірқатар ғылыми ізденістерде клеткалардың бөлінуі параллель бағытта
жүретіндігі тұралы деректер кездеседі 26.
Осындай бөлінудің нәтижесінде 15 клеткадан тұратын проэмбриоид
қалыптасады. Ол базалды ұшымен меристемалық аймаққа бекініп тұрады. Оның
келесі дамуы барысында қалың қабатпен оқшауланған жүрек және торпедо
пішінді эмбриоидтар қалыптасады. Бұл даму сатыларында эмбриоидтар ЭКК
–нен бөлініп, толық диффиринциалданып өз бетінше ЭКК-дан тәуелсіз даму
жолына түсетіні бірқатар ғалымдардың зерттеу жұмыстарында көрсетілген 25.
Эмбриоидтардың қалыптасуы кезінде ЭКК-нің перифериясында ұзын, сопақша бос
клеткалардың қалыптасуы көбейеді. Мұндай крахмалдан бос клеткалардың түзілу
табиғаты толық зерттелмеген. Әйтсе де олардың ЭКК –нің перифериялық
қабатында және клеткалардың қалың қабатында да пайда болатындығы жөнінде
бірқатар дәлелдер бар 27.
Әдеби мәліметтерде эмбриогенді каллустағы ЭКК –дегі өзгеріске
ұшырамаған, цитоплазмаға бай майда клеткалар қайта пролиферацияланып жаңа
ЭКК бастама болатыны дәлелденген. Осыған байланысты перифирияда жатқан
клеткалар екі түрлі, яғни бірі эмбриоидогенезге қатысатындар, ал екінші
түрлері тек агрегатты пролиферацияға қатысатындарға бөлінетіні айқындалған.
Осы екі түрге жататын клеткалардың арасында өзара құрылысы мен
цитогенетикалық реакциялары бойынша айтарлықтай ерекшеліктер байқалмаған.
Эмбриогенді каллустарды гормонсыз ортаға немесе гормон концентрациялары
төмен қоректік орталарға көшіргенде каллус ұлпасынан эмбриоидтар дамитыны
немесе бүршіктердің өсіп шығатыны әдеби мәліметтерден белгілі.
Н.В.Катаеваның 23 пікірінше бұл әдіс теориялық тұрғыдан қарағанда
өсімдіктің көбейту коэффициентін едәуір жоғарылатады. Мәселен, каллус
ұлпасының бір бөлігі немесе суспензиясы миллионға жуық клеткалардан тұратын
болса, клеткалардың әрқайсысы біртұтас өсімдікке бастама беруі мүмкін.
Алайда, маманданған клеткалар дефференциалданып каллус ұлпасының
маманданбаған клеткаларына айналу кезінде бірқатар цитогенетикалық
өзгерістерге ұшырайды. Осының салдарынан кейде клеткаларда хромосомалардың
плоидтық жиынтығы өзгеріске ұшырап, біртекті емес ұрпақ алу қауіпы туады.
Сонымен, микроклондық көбейту әдістерінің әрқайсысының өзіндік
артықшылығы мен кемшіліктері болады. Сондықтан бұл әдістерді қолданылатын
тәжірибенің мақсаты мен міндеттеріне сай таңдайды.
Стевия экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларының морфогенезін
гормондардың әсерімен реттеуге болатыны белгілі. Мәселен, бірқатар
ғалымдардың зерттеулерінде каллустардың геммогенезі 1-2 мгл БАП қосылған
агарлы 7 МС және 1 мгл БАП қосылған суспензия 6 орталарында, ал
ризогенезі 2,4 Д мен кинетин қосылған агарлы 8 және 1 мгл НСҚ қосылған
суспензия 7 ортасында жүзеге асатыны байқалған. Барлық жағдайларда
қоректік орта негізіне МС ортасы қолданылған.
О.О.Дзюба мен Л.Е.Горботенко зерттеулерінде 7 жапырақ каллустарынан
алынған стевия – регенераттары өзара морфологиялық белгілермен
ерекшелінетіндігі анықталған. Олардың зерттеулерінде стевия –регенерантары
8 түрге жіктелген. Авторлардың жасаған зерттеулерінде өзгергіштіктің тағы
бір айғағы ретінде жапырақтарының морфологиялық белгілерінің түрленуі дәлел
болатынын айтқан. Қорыта айтқанда, жапырақ каллустарынан алынған стевия
регенеранттары өзара морфологиялық белгілермен ерекшеленетіндігі
анықталған. Авторлар осы әдіс арқылы стевияның құнды формаларын сұрыптап
алуға мүмкіндік туатынын атап кеткен.
Е.В.Андронова мен Н.К.Лемешевтің 28, C.M.Ferreria мен W.Handro
29 зерттеулерінде стевияның жапырақ экспланттарынан тікелей адвентивті
бүршіктердің түзілуі жарық камерада 2 мгл БАП қосылған МС немесе ЛС
қоректік орталарында, ал қараңғы камерада 2 мгл БАП және 2 мгл НСҚ
қосылған ЛС қоректік ортасында жүзеге асатындығын байқаған. Сонымен қатар,
жапырақ экспланттардан тікелей адвентивті бүршіктердің түзілуі қараңғы
ортаға (30 %) қарағанда жарықта (50%) жоғары болатыны айқындалған.
Стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі мүшелерден түзілген сомалық
эмбриоидтарды алу мақсатында бірқатар ізденіс жұмыстарыжасалған. Эксплант
ретінде стевияның гүлдері, жапырақтары мен сабақ кесінділері қолданылған.
Мысалы, Бразилия зерттеушілері F.J.Bespalhok, H.Kozumi 29 стевияның
гүлдерін 2,4 Д мен кинетин қосылған МС орталарында өсіру нәтижесінде, гүл
күлтелерінің төменгі бөлігінде және гүл түйінінде эмбриогенді каллус
ұлпаларын алған.
F.J.Bespalhok, J.Hoshimoto және L.G. Esteves Vieira 31
ізденістерінде сомалық эмбриоидтарды стевия жапырақтарынан өсіруді
көздеген. Қоректік ортаға (МС) 2,4Д, БАП қосқан.Зерттеу барысында, 21
тәулік бойы қараңғы камерада өсірілген экспланттарды, 16 сағаттық
фотопериодты жарық камераға ауыстырып, 7 тәулік бойы өсірген. Осыдан кейін
экспланттарды қайтадан қараңғы камераға ауыстырған. Түзілген эмбриоидтардың
дамуын зерттеу мақсатында сахарозаның мөлшері азайтылған, гормонсыз МС
ортасына көшірген.Сомалық эмбриоидтардың санын стериомикроскоп көмегімен
санаған. Нәтижесінде, жапырақ экспланттардан түзілген каллустарда екі
аптадан кейін сомалық эмбриоидтардың түзілуі жүзеге асқан.
Y.Wada 32 стевия жапырақтарынан сомалық эмбриоидтарды цитокинин
қосылған қоректік ортада алған. C.M.Ferreria мен W.Handro 30 2,4 Д
қосылған қоректік ортада стевияның сабақ сегменттерінен
түзілгенкаллустардан сомалық эмбриоидтар өсіріп алған. Әйтсе де, осы
аталып отырған ізденістерде жапырақ каллустардан түзілген сомалық
эмбриоидтардан регенеран өсімдік алу тәжірибелері нәтижесіз аяқталған.
С.Ш. Асрандинаның 9 зерттеулерінде стевияның жапырақ
экспланттарынан БАП және НСҚ қосылған МС орталарында морфогенді каллус
ұлпаларын алған. Эмбриогенді каллус алу мақсатында гормонсыз МС және
кинетин қосылған ЛС орталарын қолданған.
Стевияның клеткалар суспензиясын өсіру мақсатында жапырақ пен гүл
тозаңдары қолданылған. Стевияның жекеленген клеткаларының суспензияда өсу
мен даму қарқынына әр түрлі факторлардың тигізетін әсерлері анықталған.
Мәселен, Н.И.Бондарев, А.Н.Носов және А.В.Корниенко 5 зерттеулерінде
стевияның клетка культураларының суспензияда қарқынды өсуіне 25±10С
температура қолайлы болатынын анықтаған. Сондай-ақ, стевияның клетка
культураларының өсуі мен биомассасының жинақталуына сахароза тежеуші
факторлардың бірі екенін айқындаған. Яғни, қоректік орта құрамындағы
сахарозаның кемуі суспензия клеткаларының биомассаларының төмендеуіне
несесе клеткалардың деградацияға ұшарауына ықпал еткен. Ал сахарозаның
концентрациясын 2-5% өсіргенде клеткалардың өсу кезеңінің ұзаруына
байланысты өсу қарқыны өзгеріссіз қалатыны және клеткалардың құрғақ
салмағының пропорционалды түрде артатыны байқалған.
Клеткалардың өсу қарқыны МС ортасындағы минералды тұздар мөлшеріне де
тәуелді болады. Мысалы, минералды тұздардың концентрацияларын ½ ден 2 ге
дейін жоғарылатқанда клеткалардың өсу қарқыны мен биомассаларының
жинақталуы артқан. Алайда клеткалардың өсу циклі қысқарған.
L.Mroginski, E.Flachsland, J.Davina 33 стевияның гүл тозаңдарынан
әр түрлі гормондар қосылған МС ортасында борпылдақ каллус ұлпасын алған.
Сол каллус ұлпасын суспензияда өсіру арқылы каллустың геммогенезі жүзеге
асатынын байқаған.
Қорыта айтқанда, стевия клтекаларының суспензияда өсуі мен
биомассасының жинақталу қарқыны физикалық, трофикалық факторлардың және
фитогормондар әсеріне тәуелді болатыны айқындалған.
Сонымен, жоғарыда айтылған зерттеулердің нәтижелерін талдай отырып,
in vitro жағдайында стевияның каллус және морфогенез ерекшеліктерін зерттеу
және микроклондық көбейту мәселелерінің төңірегінде әлі де болса бір
көзқарасың жоқтығын, бірнеше пікірталастың орын алатынын байқауға болады.
Демек, аталған мәселелерді шешу үшін әлі де көптеген ізденіс жұмыстарын
жүргізу қажеттілігі туындайды. Сол себептен, біз өз зерттеуімізде,
стевияның оқшауланып алынған ұлпалар мен мүшелерінің каллус және морфогенез
ерекшеліктерін айқындау әдістерін толықтыра түсуді көздедік.
2. ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІЛЕРІ МЕН ӘДІСТЕМЕЛЕРІ
Зерттеу объектілері: in vitro жағдайында өскен Stevia rebaudiana
Bertoni оқшауланып алынған жапырақ; жапырақтың жас бөлігі мен сағағы;
сабақ кесінділерінен алынған экспланттар.
Оқшаулап алынған ұлпалар мен мүшелерді өсіру Р.Г.Бутенконың (1964)
41, Ф.Л.Калинин, В.В. Сарнацкая және В.Б. Полищуктың (1980) 42
әдістемелері бойынша жүргізілді.
Қоректік орталар Мурасиге-Скуг нұсқасы бойынша дайындалды (кесте 1).
Қоректік орта құрамына минералды тұздар, көмірсулар, витаминдер,
фитогормондар, амин қышқылдардары кіреді. Клеткалар in vitro жағдай
көмірсутегіне мұқтаж, себебі олар гетеротрофты қоректенеді. Көмірсугегі
ретінде сахароза немесе глюкоза қосылады.
Кесте 1- Мурасиге-Скуг қоректік ортасының нұсқасы
Компаненттер концентрациясы, мгл.
Макроэлементтер
KNO3 1900
NH4NO3 160
MgSO4 × 7H2O 370
CaCl2 × 2H2O 440
KH2PO4 170
Микроэлементтер
MnSO4 × 4H2O 22,3
KJ 0,83
H2BO3 6,2
ZnSO4 × 7H2O 8,6
CuSO4 × 5H2O 0,025
Na2MoO4× 2H2O 0,25
CoCl2 × 6H2O 0,025
Темір хелаты
FeSO4 × 7H2O 27,8
Na2ЭДТА 37,3
Органикалық заттар
Мезо-инозит 100
Тиамин - HCl 0,1
Никотин қышқылы 0,5
Пиридоксин - HCl 0,5
Сахароза 30000
pH 5,6-5,8
Қоректік орталар құрамына фитогормондар: акусиндер (2,4 Д, НСҚ) мен
цитокининдер (БАП, кинетин) қосылды.
Зерттеу объектілері температурасы 25±20С, 16 сағаттық фотопериодтық
жарық және қараңғы камераларда өсірілді. Ауаның ылғалдылығы 55-60 % болды.
In vitro жағдайында өскен стевиядан оқшауланып алынған жапырақ
экспланттарының каллус түзу белсенділігін анықтау мақсатында төмендегі
қоректік орталар қолданылды:
1) МС+ 0,5 мгл 2,4 Д;
2) МС +1,0 мгл 2,4 Д;
3) МС +1,5 мгл 2,4 Д;
4) МС+ 0,5 мгл 2,4 Д және 0,1 мгл кинетин;
5) МС+1,0 мгл 2,4 Д және 0,3 мгл кинетин;
6) МС+ 1,5 мгл 2,4 Д және 0,5 мгл кинетин.
Жапырақтың жас бөлігі мен сағағының каллус түзі қабілетін зерттеу үшін
келесі қоректік орталар қолданылды:
1) МС+ 2 мгл БАП;
2) МС+2 мгл БАП және 2 мгл НСҚ;
3) МС+1 мгл 2,4 Д және 2 мгл БАП;
4) МС+2 мгл 2,4 Д және 1 мгл БАП.
Жапырақтың жас бөлігі ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Биология факультеті
Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиологиясы кафедрасы
БІТІРУ ЖҰМЫСЫ
IN VITRO ЖАҒДАЙЫНДА СТЕВИЯДАН ОҚШАУЛАНЫП АЛЫНҒАН ЖАПЫРАҚ ЭКСПЛАНТТАРЫНЫҢ
КАЛЛУСОГЕНЕЗ ЖӘНЕ МОРФОГЕНЕЗ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ
Орындаған
4 - курс студенті: ___________________________________ _А.С. Шакенова
( қолы, күні )
Ғылыми жетекші
б.ғ.к., доцент: ___________________________________ ____C.Ш. Асрандина
( қолы, күні )
Норма бақылаушысы
ассистент: ___________________________________ _______С.Б. Оразова
( қолы, күні )
Қорғауға жіберілді:
Кафедра меңгерушісі
б.ғ.б., профессор: ___________________________________ _Т.А. Карпенюк
( қолы, күні )
Алматы, 2010
МАЗМҰНЫ
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН ТЕРМИНДЕР МЕН СӨЗДЕР ... ... ... ... ... ... . 3
КІРІСПЕ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...4
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ..
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1.In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған
экспланттардың каллусогенез 6
белсенділігі ... ... ... ... ... .. ... ... ... ..
1.2.In vitro жағдайында өскен стевияның каллустық ұлпаларында
тәтті гликозидтердің түзілуі 9
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ...
1.3.Стевияның клеткалар мен ұлпа культураларындағы морфогенез
белсенділігі ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ...12
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ...
2 ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІСІ МЕН 17
ӘДІСТЕРІ ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ...
3 ЗЕРТТЕУ НӘТИЖЕЛЕРІ МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ
3.1 In vitro жағдайында өскен стевия жапырақтарының каллус түзу
қарқынына жарық пен қараңғының және қоректік орта құрамындағы
гормондардың тигізетін 19
әсері ... ... ... ... ... ... ... . ... ..
3.2 Жапырақ экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларының
морфогендік 28
қабілеті ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... .
3.3 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан және сабақ
экспланттарының каллус түзу белсенділігі 29
... ... ... ... ... ... ... ... .. ..
3.4 Жапырақтың жас бөлігі мен сағағынан түзілген каллус
ұлпаларының морфогенездік 33
қабілеті ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ...
ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ...34
... ... ... ... ... ... ... ...
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИТТЕР 36
ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН ТЕРМИНДЕР МЕН СӨЗДЕР
БАП 6-бензиламинопурин
2,4 Д 2,4-дихлорфеноксисірке қышқылы
ИМҚ индолил-3май қышқылы
ГҚ гибериллин қышқылы
ИСҚ индолил-3-сірке қышқылы
НСҚ нафтил сірке қышқылы
МС Мурасиге-Скуг ортасы
ЛС Линсмайер-Скуг ортасы
ЭК эмбриогенді каллус
ЭКК эмбриогенді клеткалар кешені
КІРІСПЕ
Дүниежүзілік Денсаулық сақтау сараптамалық комитетінің болжамы бойынша
2010 жылы бүкіл әлемде 239,4 миллионға жуық адамның қант диабетіне шалдығу
қауіпі төнуде. Бүгінгі таңда жүргізілген санақтың соңғы нәтижесі бойынша,
әлемде қант диабетімен ауыратын адамдардың саны 175,4 миллионға жеткендігі
белгілі.
Соңғы жылдары бірқатар елдерде тамақ өнеркәсібі мен медицинада қанттың
орнына тәтті синтетикалық заттарды қосу кең өріс алған. Алайда бұл заттар
химиялық жолмен алынатындықтан, адам денсаулығына зиян келтіретіреді.
Осының негізінде бірқатар өркениетті елдерде тәтті синтетикалық
қосылыстарды қолдануға тыйым салынды. Есесіне бүгінгі таңдағы жүргізіліп
жатқан қарқынды ізденістерге - қантты және оны алмастырғыш тәтті
синтетикалық қосылыстарды табиғи тәтті және төмен калориялы заттармен
алмастыру проблемасы мұрындық болды.
Осының негізінде дитерпенді гликозидтерге өте бай стевия (Stevia
rebaudiana Bertoni) өсімдігіне аса назар аударылып, бірқатар елдерде ауыл
шаруашылық дақыл ретінде стевияны көп мөлшерде өсіріп, өндіру жұмыстары
алға басты.
Стевияның жер үсті бөлігінде құрғақ салмаққа шаққанда 6,5-11% дейін
тәтті гликозидтер синтезделеді. Олар: стевиозид (7 %); ребаудиозид (A, B,
C, D); олардың ішінде ребаудиозид A (2%), ребаудиозид (0,07%);
стевиолбиозид (іздері). Олардың тәттілігі сахарозадан 150-400 есе артық
болып келеді. Солардың ішінде ең тәттісі стевиозид. Стевиозид адам және
жануар организміне зиянсыз төмен калориялы қосылыс. Осы қасиетіне
байланысты стевия өсімдігін медицинада (қант диабеті, атеросклероз,
панкреатит, кариес), тамақ өнеркәсібінде (печенье, кекс, сусындар, т.б.)
және парфюмерияда кеңінен қолданылады.
Стевия тропикалық өсімдік болғандықтан, біздің республикамыздың қысқы
төменгі температурасына төзімсіз, әрі дәні нашар жетіліп өнуге бейімсіз
келеді. Осы себептерге байланысты қысқа мерзім ішінде вегетивті жолмен
көбейту әдістерін жасау және оларды тәжірибеге ендіру мәселелері
туындайды. Әдетте стевияны өсіру табиғи жағдайда вегетативті жолмен
қалемшелеу арқылы, ал in vitro жағдайында микроклондық көбейту әдістерімен
жүзеге асырады. Алайда, стевияны өсіріп, көп мөлшерде өнім алу және
жерсіндіру бірқатар қиындықтар тудыруда. Осы мәселелерді шешу үшін
стевияның көбею физиологиясының заңдылықтарын жан-жақты зерттеу қажет.
Біздің зерттеу жұмысымыз in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып
алынған әр түрлі экспланттардың каллусогенез және морфогенез ерекшеліктерін
айқындау арқылы стевияның көбейту коэффициентін жоғарылататын
әдістемелердің қатарын толықтыру мақсатында өрбіді.
Бітіру жұмысы 37 беттен, 8 кестеден, 11 суреттен, 33 әдебиеттен
тұрады.
Негізгі сөздер: in vitro, тотипотенттік, пролиферация, эксплант,
клетка культурасы, ұлпа культурасы, каллусогенез, морфогенез, каллус,
геммогенез, ризогенез, эмбриогенез, Мурасиге-Скуг ортасы, фитогормондар
(ауксиндер: НСҚ, 2,4 Д; цитокининдер: БАП, кинетин, зеатин), гликозидтер.
Зерттеу объектілері: in vitro жағдайында өскен Stevia rebaudiana
Bertoni оқшауланып алынған жапырақ; жапырақтың жас бөлігі мен сағағы;
сабақ кесінділерінен алынған экспланттар.
Зерттеу әдістемелері: in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған
оқшаулап алынған ұлпалар мен мүшелерді өсіру Р.Г.Бутенконың, Ф.Л.Калинин,
В.В. Сарнацкая және В.Б. Полищуктың әдістемелері бойынша жүргізілді.
Қоректік орталар Мурасиге-Скуг нұсқасы бойынша дайындалды. Қоректік
орталар құрамына фитогормондар: акусиндер мен цитокининдер қосылды.
Зерттеу объектілері температурасы 25±20С, 16 сағаттық фотопериодтық
жарық және қараңғы камераларда өсірілді. Ауаның ылғалдылығы 55-60 % болды.
Мақсаты: in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі
экспланттардың каллусогенез және морфогенез ерекшеліктерін айқындау арқылы
стевияның көбейту коэффициентін жоғарылататын әдістемелерді жасау.
Міндеттері:
- In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі
экспланттардың (толық жапырақ тақтасының және жапырақтың жас бөлігі мен
сағағының, сабақ кесіндісі) каллусогенез белсенділігіне қоректік орта
құрамындағы экзогенді фитогормондардың және жарық пен қараңғының тигізетін
әсерін зерттеу.
- Әр түрлі экспланттардан түзілген каллус ұлпалардың сыртқы
морфологиялық белгілеріне сипаттама беру және олардың өсу қарқындылығын
анықтау.
- Каллустық ұлпалардың моргогендік белсенділігіне қоректік орта
құрамындағы экзогенді фитогормондардың және жарықтың тигізетін әсерін
анықтау.
Алынған нәтижелер: in vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған әр
түрлі экспланттардың (толық жапырақ тақтасының және жапырақтың жас бөлігі
мен сағағының, сабақ кесіндісі) каллусогенез және морфогенез белсенділігі
эксплант тегінен, жас ерекшелігінен, қоректік орта құрамындағы экзогенді
фитогормондардың табиғатынан және олардың концентрациялары мен өзара
қатынасынан, сондай-ақ, жарық пен қараңғыдан тәулді болатыны анықталды.
1 ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1. In vitro жағдайында стевиядан оқшауланып алынған экспланттардың
каллусогенез белсенділігі
Өсімдік клеткаларын, ұлпаларын және мүшелерін жасанды ортада өсіріп,
олардың дамуын зерттеу арқылы бірқатар морфофизиологиялық және биохимиялық
процестердің негізін ашуға және оларды бақылауға мүмкіндік туатыны белгілі.
Клеткалар мен ұлпалар тіршілігіндегі регуляция механизмдерін анықтау
мақсатында in vitro культураларын өсіріп, олардың даму ерекшеліктерінің
сыртқы орта жағдайларымен (қоректік орта құрамы, жарық, ылғал т.б.)
байланысын айқындауға болады. Бұл зерттеулердің негізіне өсімдік
клеткаларына тән - тотипотенттік қасиет жатады.
Тотипотенттік – жекешеленген клеткалардың көбейе өсіп, толыққанды
бүтін организмге айналу қабілеті. Көп клеткалы организмдердің әр
клеткасында толық нәсілдік мағлұматтар жиынтығы болады. Тотипотенттік
осыған негізделген.
Теориялық тұрғыдан қарастырғанда өсімдік организмінің әр бір клеткасы
тотипотентті, яғни кез келген клетканы белгілі бір жағдайда тиісті даму
жолына түсіруге болады. Оқшауланып алынған клеткалардың культуралары
олардың потенциалдық мүмкіншіліктерін анықтауға қолайлы модель болып
табылады 1.
Кез келген өсімдіктің оқшауланып алынған мүшелері мен ұлпаларын
қолайлы жағдайда өсіргенде олардан маманданбаған клеткалар тобы – каллус
түзіледі. Ал таби жағдайда, каллус өсімдіктің жарақаттанған жерінде
шорлана бітіп қорғаныштық және бұзылған анатомиялық құрылымдарды қалпына
келтіру үшін қоректік заттарды жинау қызметін атқарады 2.
Каллус деп клеткалардың пролиферациялану нәтижесінде түзілген
ұлпаларды атайды. Пролиферация – бастапқы клеткалардың бөліну жолымен жедел
көбеюі. Маманданған клеткалардың пролиферациялануын дедифферация деп
атайды. Бұл процестің негізінде гендердің дифференциалды активтілігі
жатады. Клеткалардың құрылымы мен қызметі гендердің активтілігіне
байланысты. Организмдегі клеткалардың құрылымы мен атқаратын қызметінің
өзгеруіне себепші әр түрлі гендердің экспрессиясы болып табылады. Яғни,
клеткалардың мамандануы көптеген гендердің әрекеттесуіне байланысты.
Организмнің барлық клеткаларында гендері бірдей боса да, олардың бәрі бір
мезгілде әрекеттенбейді. Әдетте гендердің біразы ғана (5%) белсенді болады
3.
In vitro жағдайында каллус көбінесе алғашқы немесе қайталама
меристемадан пайда болады. Сондай-ақ, меристемаға немесе өткізгіш ұлпаларға
жанасып жатқан паренхимадан да пайда болады. Каллусұлпасы жұқа қабырғалы
анық анатомиялық құрылысы жоқ паренхималық клеткалардан тұратын аморфты
масса. Каллус ұлпаларының бәрі бірдей, біркелкі болмайды. Каллустар
морфологиялық белгілері (тығыздығы, ылғалдыдлығы, түктенуі, түсі) және өсу
қарқындылығы мен көгеру қабілеті жағынан әр алуан болады. Каллустың түсі
ақшыл, жасыл, сұр, сарғыш, қоңыр, қызғылт болады. Каллус құрамында
хлорофилл немесе антоциан пигменттері болуы мүмкін. Шығу тегіне және өсіру
жағдайына байланысты каллустар тұтас тығыз немесе борпылдақ, шашыраңқы
болып келеді.
Каллус клеткаларының құрылуы, бөлінуі және көбейіп өсуі фитогормондар
(ауксиндер мен цитокининдер) табиғатына тәуелді болады. Мәселен,
қосжарнақты өсімдіктердің көптеген түрлерінде каллус ұлпаларының түзілуі
ауксин мен цитокининнің әсерімен жүзеге асады.
Ал астық тұқымдастарда цитокинин клеткалардың бөлінуін тежейтіндіктен
каллустың түзілуі көбінесе тек ауксин әсерімен жүреді. Сонымен қатар,
каллус клеткаларының түзілуі мен өсу белсенділігіне қоректік орта құрамы
мен оның рН көрсеткіші және температура, жарық, осмос қысымытағы басқа
жағдайлар әсер етеді. Сондай-ақ, өсімдік түрі, жасымен физиологиялық күйі,
экспланттың тегі мен оның көлемі, кейде оны қоректік ортаға орналастыру
ретінде де байланысты болады.
Сонымен, кез келген өсімдіктің мүшелері мен ұлпаларынан жасанды
қоректік ортада каллус өсіріп алуға болады. Каллус клеткаларында
морфогенездің әр түрлі процестері өтуі мүмкін. Оларға сомалық эмбриогенез
немесе органогенез жолдарымен даму қабілеті тән. Соның арқасында жеке-дара
клеткалардан бүтін регенерант өсімдік өндіріп шығаруға болады. Бұл
регенерация процесі өсімдіктің тотипотенттілігін дәлелдейді 4. Осы жолмен
тез, қысқа уақыт аралығында тиімді морфогенді каллус алу өсімдікті
вегетативті жолмен көбейтуге негіз болады.
Соңғы жылдары бірқатар ТМД және шетел зерттеушілері стевияның
морфогенез ерекшеліктерін зерттеу және көбейту коэффициентін жоғарылату
мақсатында ізденіс жұмысатарын жүргізуге белсенді кіріскен.
Стевиядан оқшауланып алынған экспланттан тікелей немесе каллус арқылы
регенерант өсімдік алудың түрлі жолдары жасалған.
Бірқатар ғалымдардың зерттеу жұмыстарында стевияның жапырақ
экспланттарынң каллус түзу белсенділігіне және олардың өсу қарқыны мен
морфогендік қабілеттеріне физикалық, трофикалық және гормоналды
факторлардың тигізетін әсерін анықтау көзделген.
Мәселен, Н.И.Бондарев, А.Н.Носов және А.В.Корниенко 5 стевияның
жапырақтарынан түзілген каллус ұлпаларының өсу динамикасына өсіру
жағдайларының (температура,жарық) трофикалық (көмірсу, витамин және
минералды заттар), гормоналды факторлардың әсерін зерттеген. Зерттеу
нәтижесінде, қаллустың өсу қарқынына 25±10С температура қолайлы болған.
Каллус клеткаларының өсу қарқынына жарық түрліше әсер еткен. Яғни, бір
каллус ұлпаларының өсуі қарқынды жүрсе, екіншілерінде бәсеңдеп,
үшіншілерінде жарыққа тәуелділік байқалмаған.
Сондай-ақ, каллус ұлпаларының өсу белсенділігі қоректік орта
құрамындағы көмірсулардың табиғатына байланысты түрліше жүретіні де
байқалған. Галактоза, арабиноза және рафиноза қосылған ортада каллустардың
түршілігі жойылатыны, ал рамноза мен сорбит қосылған ортада каллус
ұлпаларының өсу қарқыны өте баяу болатыны көрсетілген. Қоректік орта
құрамына мальтоза қосылған ортада каллус ұлпаларының өсуі елеулі мөлшерде,
ал фруктоза мен глюкоза қосылған ортада едәуір жоғарылайтыны (51 %)
айқындалған. Ең жоғары көрсеткіш 60,8 % сахароза қосылған қоректік
орталарда болған. Қоректік орта құрамындағы сахарозаның мөлшерін азайтқанда
каллус биомассасының жинақталуы едәуір бәсеңдеп, ұлпа клеткалардың
дегенерацияға ұшырайтындығы байқалған. Ал сахаролзаның жоғарғы
концентрациясы ұлпа биомассасының тығыздығын арттырғанымен, оның тәжірибеге
қолдану тиімділігін төмендеткен. Сонымен, каллус ұлпасының өсу
белсенділігіне қоректік орта құрамындағы көмірсулар едәуір әсер ететіндігі
байқалған. Стевияның каллус культурасы көптеген өсімдік клеткаларына тән
сахарозадан басқа фруктоза мен глюкозаны сіңіретіні айқындалған. Әйтсе де,
фруктоза мен глюкозаға қарағанда сахарозаны қолдану тиімді деген қорытынды
жасауға болады.
Сонымен қатар, стевия жапырақтарының каллус түзу қабілетіне әсер
ететін әр түрлі өсуді реттегіш гормондар табиғаты мен олардың лайықты
концентрациялары айқындалған. Мәселен, G.B.Mahady, S.M.Swanson, C.W.Beecher
6 жапырақ экспланттарының каллус түзу белсенділігін қоректік орта
құрамына бірдей концентрацияда (0,5 мгл) қосылған НСҚ мен БАП әсерімен, ал
О.О.Дзюба мен Л.Е.Горботенко 7 тек БАП (2мгл) әсерімен жүзеге асырған.
W.F.Handro, K.G.Hell, G.B.Kerbauty 8 ерттеулерінде стевияның жапырақ
дискілері мен сабақ кесінділерінің каллус түзу қабілеті бірқатар өсу
гормонларының (ИСҚ, 2,4Д, кинетин, зеатин) тигізетін әсеріне байланысты
болған.
Сондай-ақ, жапырақ каллустарының өсу қарқыны әр түрлі гормондар
қатынасында (2 мгл НСҚ мен 0,4 мгл БАП 8 ; 0,2 мг ИМҚ мен 0,3 мгл
2,4 Д 6; 2,4 Д (800 мМ) мен цитокининнің (БАП,кинетин,зеатин) қосылған
МСорталарында жоғары көрсеткішке ие болған. Ал 0,8 мгл 2,4 Д мен 0,5 мгл
БАП 6; ИСҚ немесе цитокининдер жекелей қосылған 8 орталарда ұлпалардың
өсу қарқыны едәуір төмен болатыны байқалған. Каллус ұлпаларының өсуіне
аденин (20 мгл) мен цитокининдер қосылысы әсерін тигізбейтіні байқалған
8.
С.Ш. Асрандинаның 9 зерттеулерінде стевияның әр түрлі мүшелерінен
(жапырақ, сабақ, гүлшоғы) оқшауланып алынған экспланттардың каллусогенездік
қабілеті бірдей емесжәне олар әр түрлі ішкі және сыртқы факторлардан
(эксплант тегіне, жас ерекшелігіне, ауланына, қоректік орта құрамына, өсу
гормондарының табиғаты мен олардың концентрацияларынан, жарық пен
қараңғыға) тәуелді болатындығын зерттеген.
1.2. In vitro жағдайында өскен стевияның каллустық ұлпаларында тәтті
гликозидтердің түзілуі
Өсімдіктер медицина мен халық шаруашылығында кең пайдаланатын алуан
түрлі қосымша метаболиттерді синтездейтіні белгілі. In vitro жағдайында
өсірілетін өсімдік клеткалары мен ұлпалары да қосымша метаболиттерді түзуге
қабілетті болады. Олардың синтездеу қабілеті жыл мерзімінен тәуелсіз
болғандықтан, жыл бойы метаболитті заттарды түзетін қайнар көздер бола
алады. Сондай-ақ, өсірілген клеткалар биотрансформацияны жүзеге асыруға
қабілетті болады, яғни кейбір арзан, қоры мол қосындыларды басқа бағалы
заттарға айналдыра алады.
Сонымен in vitro жағдайында өсімдіктердің клеткалар мен ұлпа
культураларын өсіру арқылы олардың морфогенез ерекшеліктерін жан-жақты
зерттеп, өсімдіктің көбейту коэффициентін жоғарылатуға болады. Сонымен
қатар, клеткалар мен ұлпа культуралары экономикалық маңызы зор заттарды
өндірудің қайнар көзі болып табылады.
Соңғы жылдары бірқатар шетел және ТМД елдерінде ауыл шаруашылық дақыл
ретінде дитерпенді гликозидтерге өте бай стевия (Stevia rebaudiana Bertoni)
өсімдігіне аса назар аударған. Оны көп мөлшерде өсіріп, жоғары сапалы өнім
алу өндірісі дамыған.
Stevia rebaudiana Bertoni өсімдігін дитерпенді гликозидтерге өте бай
табиғи қант алмастырғыштардың перспективті альтернативасы ретінде қолдануға
болады. Стевия Бразилия мен Парагвайдың жергілікті көпжылдық шөптесін
өсімдігі. Оның жапырақтарында 6,5-11% мөлшерде дитерпенді гликозидтер
түзіледі. Олардың тәттілігі сахарозадан 150-400 есе артық. Солардың ішінде
ең тәттісі стевиозид. Стевиозид адам және жануар организміне зиянсыз төмен
калориялы қосылыс. Осы қасиетіне байланысты стевия өсімдігі медицинада,
тамақ өнеркәсібінде және парфюмерияда кеңінен қолданылады 10-12.
Дитерпенді гликозидтердің өсімдік мүшелерінде таралу заңдылығын
J.E.Brendle 13 айқындаған. Стевиозидтің ең көп мөлшерде стевияның
жапырақтарында 3-8 %, ал гүлдерінде 0,9 % және сабағында 0,3% жинақталады.
Стевияның жапырақ экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларында
стевиозидтің түзілуі жөнінде қарама-қарйшы пікірталас бар. Мәселен, қытай
ғалымдары X.Ouyang, W.Hong, M.Chen, D.Wang 14 жапырақ экспланттарынан
түзілген каллус ұлпаларын 2 мгл БАП және 0,5 мгл НСҚ қосылған МС
ортасында 6 ай бойы өсіріп, олардың өсуі мен дифференциациясын бақылаған.
Сондай-ақ, түзілген әр түрлі каллус ұлпаларындағы стевиозидтің түзілу
мүмкіндігін зерттеген. Зерттеу нәтижесінде: жасыл, тығыз, баяу өсетін
каллустар құрамында стевиозид концентрациясы жоғары (5,37 %) болатындығы
анықталған.
Электронды микроскоп көмегімен бұл каллус клеткалары қатты
вакуольденген, хлоропластары толық дамыған қоймалжың пластоглобұла
стромаларынан тұратынын байқаған. Ал сары, тығыз, баяу өсетін каллустар
құрамында стевиозид аз (2,13 %) түзілетіндігін атап, олардың
клеткаларындағы пластидтері көптеген крахмал дәндерімен бірнеше ыдыраған
ламаллалардан, ал кейбір пластидтері крахмал дәндеріне толы болатындығын
атаған. Сонымен қатар: сары, борпылдақ, тез өсетін каллустардың құрамында
стевиозид өте аз (0,96 %) түзілетінін және бұл каллустардың клеткаларында
ұсақ ламеллалардан тұратын қарапайым пластидтердің болатындығы дәлелденген.
Сондай-ақ, геммогенез процесі жүрген жасыл, тығыз каллустарда стевиозид
мөлшері 5,78 % - ке жететіндігін көрсеткен.
Басқа да қытый ғалымдары K.R.Lee, B.S.Choi, SL Oh, Y.Yamada 15 және
жапон ғалымдары K.Komatsu, W.Nozaki, M.Takemura, M.Nakaminami 16;
YI.Hsing, WF.Su, W.C.Chang 17 стевияның каллустық клеткаларында
гликозидтердің түзілетіндігін көрсеткен.
F.C.Czygan, S.A.Geissler, J.Striedner, G.Branunegg 18 стевияның
суспензия культурасындағы клеткаларды стевиозидтің із ашарымен (гиббереллин
А) қоректендірудің нәтижесінде стевиозидтің түзілуі алғашқы бірінші
тәулікте басталатындығын байқаған. Стевиозидтің көп мөлшерде түзілуі бір
аптадан кейін жүзеге асатындығын көрсеткен. Ал стевиозидтің із ашарлары
қосылмаған қоректік орталарда стевиозид 2-7 апта аралығында түзілетіндігін
анықтаған.
Жапон ғалымдары: N.Sugyama, H.Yasuyki, F.Runnsuke, W.Mitsuru,
W.Takanuri 19 өз зерттеулерінде стевия жапырақтарынан түзілген каллустың
өсу белсенділігі мен олардың құрамында синтезделетін қосымша метаболит
өнімдерінің жинақталу қарқынына әр түрлі факторлардың тигізетін әсерін
зерттеген. Нәтижесінде, каллус ұлпаларының өсу қарқыны жарық ортада (3000
люкс) ортада ең жоғарғы көрсеткішке ие болған. Сонымен қатар, каллустарды
өсіру мерзімінде қоректік ортадағы қант мөлшерінің кемуі ұлпалардың өсу
қарқынын олардағы екінші реттік метаболит өнімдерінің синтезделуін
тежейтінін байқаған. Ал хлорофилл мен каротиноид мөлшерінің
өзгермейтіндігін анықтаған. Сондай-ақ, қоректік ортада NO3 NH4 (4:2)
қатынасында және жоғары концентрацияда бейорганикалық фосфатты қосқанда,
каллус ұлпаларының өсу қарқынымен қатар ондағы синтезделетін өнімдердің
мөлшері едәуір жоғарылайтынын байқаған. Н.М.Юртаева мен В.П.Лобов 20
жапырақ қаллустарында стевиозидтің іздері ғана болатындығын байқаған.
Алайда бірқатар ғалымдардың: G.B.Mahady, S.M.Swanson, C.W.Beecher
W.F.Handro, K.G.Hell, G.B.Kerbauty 6 зерттеулерінде стевияның каллус
культурасында стевиозидтің түзілмейтіндігін жоғары тиімді сұйық
хромотография (ЖТСХ) және табақшалы хроматография (ТХ) әдістерімен
айқындаған. Зерттеуге 0,5 мгл БАП пен 0,5 мгл НСҚ қосылған МС ортасында 2-
кі ай бойы өсірілген жасыл, борпылдақ каллус ұлпаларын қолданған.
С.Ш. Асрандинаның 21 ізденістерінде G.B.Mahady, S.M.Swanson,
C.W.Beecher W.F.Handro, K.G.Hell, G.B.Kerbauty зерттеулеріне сәйкес,
стевияның жапырақ және сабақ қаллустарында сткевиозид түзілмейтіндігі
анықталған. Яғни, жапырақ және сабақ экспланттарынан түзілген калус
ұлпаларында тәтті гликозидтерді (стевиозидті) синтездеу қабілеті
жойылғандығы байқалған. Ал каллус ұлпаларынан түзілген сабақтың тәтті болуы
олардағы стевиозидтің синтезделу қабілеті қайта жанданатынын дәлелдеуі
мүмкін деген болжам жасаған.
С.Ш. Асрандинаның пікірінше алынған нәтижелер бірқатар қытай
ғалымдарының мәліметтеріне қайшы келуі әр түрлі факторларға байланысты
болуы ықтимал. Яғни, стевия өсімдігінің жас ерекшелігі мен эксплант алынған
орны, эксплант тегі, каллус жасы, өсіру жағдайы сәйкес келмеуі. Сондай-ақ,
каллустарды өсіруге алынған қоректік орта құрамы және өсу гормондарының
табиғаты мен олардың концентрацияларының сәйкес келмеуіне байланысты болар
деген тұжырым жасаған.
Сонымен, С.Ш. Асрандинаның зерттеуінде стевияның жапырақ және сабақ
экспланттарынан пайда болған каллустарда стевиозид түзілмейтіндігі
анықталған. Ал керісінше, геммогенез процесі жүретін морфогенді каллустарда
және олардан өсіп шыққан өркендерде стевиозид түзілетіні анықталған. Осыған
байланысты, стевиозидтің түзілуі тек маманданаған (дифференциалданған)
клеткаларға ғана тән деген тұжырым жасалған.
Қорыта айтқанда, жоғарыда келтірілген деректер біршама қайшы болса да,
көптеген зерттеушілер ұлпаның генетикалық сипаттамасына көңіл қояды. Бірақ,
кей жағдайда өсіруге алынған ұпада қажетті заттардың мөлшері жоғары болуы
оның осы ұлпада синтезделмей, тек басқа ұлпалардан тасымалданып
жеткізілгенін көрсетуі мүмкін. Сондықтан өсіруге алынған экспланттың тегіне
де назар аудару керек.
Өсірілген клеткалардың қосымша метаболизмінде толыққанды өсімдікпен
салыстырғанда едәуір өзгерістер пайда болуы мүмкін. Ретсіз бөлініп жатқан
каллус клеткаларында заттың мөлшері шамалы болатыны әдебиет мәліметтерінде
кездеседі.
Сондай-ақ, кейбір өсімдіктерден (оймақгүл Digitalis Lanata) алынған
каллус клеткаларының биосинтездік қабілеті жоғалып, ал регенерант -
өсімдікте биосинтездік қабілеті қайта жанданатыны белгілі. Яғни, өсімдік
клеткасындағы қосымша метаболизмнің дамуы дифференциалдану процесімен
тығыз байланысты. Дифференциалданған клеткалар көбінесе қосымша заттарды
каллус клеткаларына қарағанда көбірек синтездейді. Әйтсе де, бұл біріңғай
заңдылық емес. Клеткалар афтотрофтық қоректенуден гетеротрофтық
қоректенуге көшу салдарынан өзінің генетикалық мүмкіншіліктерін толық
жүзеге асыра алмайды.
Сонымен, жасанды қоректік ортада өсірілген клеткаларда генетикалық
ақпарат сақталады, бірақ оның жүзеге асуы үшін ерекше жайдайлар тудыру
қажет.
1.3. Стевияның клеткалар мен ұлпа культураларындағы морфогенез
белсенділігі
Н.В.Катаеваның 22 жасаған классификациясы бойынша клондық
микрокөбейту әдісі бірнеше түрге бөлінеді. Олар: 1) өсімдікті меристемалар
(сабақтағы апикалды меристемалар мен сабақ бойындағы тыныштық күйінде
жатқан қолтық бүршіктер, жер асты мүшелеріндегі бүршіктер, жапырақтағы
интеркалярлы меристемалар) арқылы көбейту. Бұл жолмен көбейтілген
өсімдіктер ата-аналық формалармен генетикалық табиғаты бірдей болады.
2) өсімдіктерді бүршік немесе эмбриоидтың түзілуі нәтижесінде алу. Бұл
жолмен көбейтілген өсімдіктер маманданған ұлпа клеткаларынан немесе
маманданбаған каллус клеткаларынан түзіледі. Оларға генетикалық өзгергіштік
тән, сондықтан олар ата-анасынан өзгешеленуі мүмкін. Бұл әдісті өсімдіктен
түзілген каллус клеткалары генетикалық тұрақты немесе өсімдіктің
өзгергіштігі табиғи өзгергіштік деңгейінен аспайтын өсімдік түріне ғана
қолданылады.
Жоғарыда айтылған әдістің екінші түріне қысқаша шолу жасайтын болсақ,
in vitro жағдайында көптеген өсімдіктерден алынған экспланттардан тікелей
мүше түзілетіні әдеби мәліметтерден белгілі. Регенерацияның бұл түрінде
оқшауланып алынған ұлпаның бірлі – жарым клеткалары дедифференциалданып,
меристемалық оқақтар түзеді. Ал келешекте осы меристемалық ошақтар кірме
(адвентивті) бүршіктің түзілуіне бастама болады. Сондай-ақ, адвентивті
өркендер бүйір және латеральды меристемалардан да қалыптасуы мүмкін. Әйтсе
де, В.А. Высоцкийдің 23
пікірінше бұл жолмен көбейтілген өсімдіктерден біртекті ұрпақтар алу қиынға
соғады.
Клеткалар суспензиясы арқылы жүзеге асатын органогенез индукциясы мен
сомалық эмбриоидогенез процесі микроклондық көбейту жолдарының бірі болып
табылатыны белгілі. Бірінші жағдайда экспланттың жарақаттанған аймағында
клеткалардың дедифференциалдануы нәтижесінде бағытсыз бөлініп, өзара ретсіз
орналасқан паренхималық клеткалардан құралған каллус ұлпасы пайда болады.
Лайықты жағдайда ол клеткалар, немесе клеткалар торптары кірме (адвентивті)
бүршікке, өркенге немесе тамырға бастама болады. Екінші жағдайда, сомалық
ұрықтың пайда болуы (эмбриоидогенез) тікелей және жанама жолдармен жүруі
мүмкін. Мұнда да жарақаттанған бөлікте каллус түзіледі. Оның жеке
клеткаларының бөлінуінен сомалық ұрықтар (эмбриоидтар) қалыптасады. Қолайлы
жағдайларда регенерация процесі арқылы олардан біртұтас организм дамиді.
Т.Б.Батыгинаның 1 зерттеулерінде эмбриогенді каллустағы эмбриогенді
клеткалар кешеніне (ЭКК) төмендегідей сипаттама берілген. ЭКК перифериялық
(3-6 қабат) клеткалар ірі ядролы, тығыз цитоплазмалы, майда вакуольдері
ядроны қоршай орналасады және ірі крахмал дәндері болады. Сонымен қатар,
перифериялық клеткалардың арасында сопақша келген, крахмалдан бос клеткалар
кездеседі, олардың цитоплазмалары қатты вакуольденгендіктен бос сияқты
көрінеді.
ЭКК орталық клеткалардың ядролары мен цитоплазмалары тығыз, ірі
орталық вакуолі мен көптеген майда крахмал дәндері болады. Орталық
клеткалардың сыртқы қабықшалары перифериялық клеткаларға қарағанда қалыңдау
келеді. ЭКК сыртқы қабатында жатқан клеткалар орталық клеткаларға қарағанда
жоғары дегидрогеназалық ырықтығымен сипатталады және олада РНҚ мөлшері
жоғары болады 24.
Т.Б.Батыгинаның, В.Е.Васильеваның және Т.Б.Маметьеваның 25
ізденістерінде эмбриогенді каллус ұлпаларын горонсыз ортаға көшіру
нәтижесінде ЭКК-нің перифериялық қабатында асинхронды бөлінетін көптеген
эмбриоидтар түзілетінін байқаған. ЭКК қалық қабатында немесе сыртқы
жағында оқшау жатқан инициаль клеткаларының біркелкі бөлінбеуі оның
полярлық қасиетіне байланысты болады. Инициаль клеткасы реактивті жүйеге
ұқсас болып келеді. Ондағы заттар белгілі бір градиентпен тарайды. Оның
апикалды полюсы протеин синтезделетін және өсу мен морфогенез аймағы болып
табылады. Ал базалды полюсы осмостық белсенді заттарға бай болады. Апикалды
клетканың бөлінуінен түзілген клеткалар эмбриоидқа бастама берсе, ал
базалды клетканың бөлінуінен пайда болған клеткалар суспензорды
қалыптастырады. Осының негізінде инициаль клеткасының біркелкі бөлінбеуі
оның полярлық ерекшеліктеріне байланысты болады.
Келесі бөлінуі қатты вакуольденген базалды клеткада жүзеге асырылады.
Бірқатар ғылыми ізденістерде клеткалардың бөлінуі параллель бағытта
жүретіндігі тұралы деректер кездеседі 26.
Осындай бөлінудің нәтижесінде 15 клеткадан тұратын проэмбриоид
қалыптасады. Ол базалды ұшымен меристемалық аймаққа бекініп тұрады. Оның
келесі дамуы барысында қалың қабатпен оқшауланған жүрек және торпедо
пішінді эмбриоидтар қалыптасады. Бұл даму сатыларында эмбриоидтар ЭКК
–нен бөлініп, толық диффиринциалданып өз бетінше ЭКК-дан тәуелсіз даму
жолына түсетіні бірқатар ғалымдардың зерттеу жұмыстарында көрсетілген 25.
Эмбриоидтардың қалыптасуы кезінде ЭКК-нің перифериясында ұзын, сопақша бос
клеткалардың қалыптасуы көбейеді. Мұндай крахмалдан бос клеткалардың түзілу
табиғаты толық зерттелмеген. Әйтсе де олардың ЭКК –нің перифериялық
қабатында және клеткалардың қалың қабатында да пайда болатындығы жөнінде
бірқатар дәлелдер бар 27.
Әдеби мәліметтерде эмбриогенді каллустағы ЭКК –дегі өзгеріске
ұшырамаған, цитоплазмаға бай майда клеткалар қайта пролиферацияланып жаңа
ЭКК бастама болатыны дәлелденген. Осыған байланысты перифирияда жатқан
клеткалар екі түрлі, яғни бірі эмбриоидогенезге қатысатындар, ал екінші
түрлері тек агрегатты пролиферацияға қатысатындарға бөлінетіні айқындалған.
Осы екі түрге жататын клеткалардың арасында өзара құрылысы мен
цитогенетикалық реакциялары бойынша айтарлықтай ерекшеліктер байқалмаған.
Эмбриогенді каллустарды гормонсыз ортаға немесе гормон концентрациялары
төмен қоректік орталарға көшіргенде каллус ұлпасынан эмбриоидтар дамитыны
немесе бүршіктердің өсіп шығатыны әдеби мәліметтерден белгілі.
Н.В.Катаеваның 23 пікірінше бұл әдіс теориялық тұрғыдан қарағанда
өсімдіктің көбейту коэффициентін едәуір жоғарылатады. Мәселен, каллус
ұлпасының бір бөлігі немесе суспензиясы миллионға жуық клеткалардан тұратын
болса, клеткалардың әрқайсысы біртұтас өсімдікке бастама беруі мүмкін.
Алайда, маманданған клеткалар дефференциалданып каллус ұлпасының
маманданбаған клеткаларына айналу кезінде бірқатар цитогенетикалық
өзгерістерге ұшырайды. Осының салдарынан кейде клеткаларда хромосомалардың
плоидтық жиынтығы өзгеріске ұшырап, біртекті емес ұрпақ алу қауіпы туады.
Сонымен, микроклондық көбейту әдістерінің әрқайсысының өзіндік
артықшылығы мен кемшіліктері болады. Сондықтан бұл әдістерді қолданылатын
тәжірибенің мақсаты мен міндеттеріне сай таңдайды.
Стевия экспланттарынан түзілген каллус ұлпаларының морфогенезін
гормондардың әсерімен реттеуге болатыны белгілі. Мәселен, бірқатар
ғалымдардың зерттеулерінде каллустардың геммогенезі 1-2 мгл БАП қосылған
агарлы 7 МС және 1 мгл БАП қосылған суспензия 6 орталарында, ал
ризогенезі 2,4 Д мен кинетин қосылған агарлы 8 және 1 мгл НСҚ қосылған
суспензия 7 ортасында жүзеге асатыны байқалған. Барлық жағдайларда
қоректік орта негізіне МС ортасы қолданылған.
О.О.Дзюба мен Л.Е.Горботенко зерттеулерінде 7 жапырақ каллустарынан
алынған стевия – регенераттары өзара морфологиялық белгілермен
ерекшелінетіндігі анықталған. Олардың зерттеулерінде стевия –регенерантары
8 түрге жіктелген. Авторлардың жасаған зерттеулерінде өзгергіштіктің тағы
бір айғағы ретінде жапырақтарының морфологиялық белгілерінің түрленуі дәлел
болатынын айтқан. Қорыта айтқанда, жапырақ каллустарынан алынған стевия
регенеранттары өзара морфологиялық белгілермен ерекшеленетіндігі
анықталған. Авторлар осы әдіс арқылы стевияның құнды формаларын сұрыптап
алуға мүмкіндік туатынын атап кеткен.
Е.В.Андронова мен Н.К.Лемешевтің 28, C.M.Ferreria мен W.Handro
29 зерттеулерінде стевияның жапырақ экспланттарынан тікелей адвентивті
бүршіктердің түзілуі жарық камерада 2 мгл БАП қосылған МС немесе ЛС
қоректік орталарында, ал қараңғы камерада 2 мгл БАП және 2 мгл НСҚ
қосылған ЛС қоректік ортасында жүзеге асатындығын байқаған. Сонымен қатар,
жапырақ экспланттардан тікелей адвентивті бүршіктердің түзілуі қараңғы
ортаға (30 %) қарағанда жарықта (50%) жоғары болатыны айқындалған.
Стевиядан оқшауланып алынған әр түрлі мүшелерден түзілген сомалық
эмбриоидтарды алу мақсатында бірқатар ізденіс жұмыстарыжасалған. Эксплант
ретінде стевияның гүлдері, жапырақтары мен сабақ кесінділері қолданылған.
Мысалы, Бразилия зерттеушілері F.J.Bespalhok, H.Kozumi 29 стевияның
гүлдерін 2,4 Д мен кинетин қосылған МС орталарында өсіру нәтижесінде, гүл
күлтелерінің төменгі бөлігінде және гүл түйінінде эмбриогенді каллус
ұлпаларын алған.
F.J.Bespalhok, J.Hoshimoto және L.G. Esteves Vieira 31
ізденістерінде сомалық эмбриоидтарды стевия жапырақтарынан өсіруді
көздеген. Қоректік ортаға (МС) 2,4Д, БАП қосқан.Зерттеу барысында, 21
тәулік бойы қараңғы камерада өсірілген экспланттарды, 16 сағаттық
фотопериодты жарық камераға ауыстырып, 7 тәулік бойы өсірген. Осыдан кейін
экспланттарды қайтадан қараңғы камераға ауыстырған. Түзілген эмбриоидтардың
дамуын зерттеу мақсатында сахарозаның мөлшері азайтылған, гормонсыз МС
ортасына көшірген.Сомалық эмбриоидтардың санын стериомикроскоп көмегімен
санаған. Нәтижесінде, жапырақ экспланттардан түзілген каллустарда екі
аптадан кейін сомалық эмбриоидтардың түзілуі жүзеге асқан.
Y.Wada 32 стевия жапырақтарынан сомалық эмбриоидтарды цитокинин
қосылған қоректік ортада алған. C.M.Ferreria мен W.Handro 30 2,4 Д
қосылған қоректік ортада стевияның сабақ сегменттерінен
түзілгенкаллустардан сомалық эмбриоидтар өсіріп алған. Әйтсе де, осы
аталып отырған ізденістерде жапырақ каллустардан түзілген сомалық
эмбриоидтардан регенеран өсімдік алу тәжірибелері нәтижесіз аяқталған.
С.Ш. Асрандинаның 9 зерттеулерінде стевияның жапырақ
экспланттарынан БАП және НСҚ қосылған МС орталарында морфогенді каллус
ұлпаларын алған. Эмбриогенді каллус алу мақсатында гормонсыз МС және
кинетин қосылған ЛС орталарын қолданған.
Стевияның клеткалар суспензиясын өсіру мақсатында жапырақ пен гүл
тозаңдары қолданылған. Стевияның жекеленген клеткаларының суспензияда өсу
мен даму қарқынына әр түрлі факторлардың тигізетін әсерлері анықталған.
Мәселен, Н.И.Бондарев, А.Н.Носов және А.В.Корниенко 5 зерттеулерінде
стевияның клетка культураларының суспензияда қарқынды өсуіне 25±10С
температура қолайлы болатынын анықтаған. Сондай-ақ, стевияның клетка
культураларының өсуі мен биомассасының жинақталуына сахароза тежеуші
факторлардың бірі екенін айқындаған. Яғни, қоректік орта құрамындағы
сахарозаның кемуі суспензия клеткаларының биомассаларының төмендеуіне
несесе клеткалардың деградацияға ұшарауына ықпал еткен. Ал сахарозаның
концентрациясын 2-5% өсіргенде клеткалардың өсу кезеңінің ұзаруына
байланысты өсу қарқыны өзгеріссіз қалатыны және клеткалардың құрғақ
салмағының пропорционалды түрде артатыны байқалған.
Клеткалардың өсу қарқыны МС ортасындағы минералды тұздар мөлшеріне де
тәуелді болады. Мысалы, минералды тұздардың концентрацияларын ½ ден 2 ге
дейін жоғарылатқанда клеткалардың өсу қарқыны мен биомассаларының
жинақталуы артқан. Алайда клеткалардың өсу циклі қысқарған.
L.Mroginski, E.Flachsland, J.Davina 33 стевияның гүл тозаңдарынан
әр түрлі гормондар қосылған МС ортасында борпылдақ каллус ұлпасын алған.
Сол каллус ұлпасын суспензияда өсіру арқылы каллустың геммогенезі жүзеге
асатынын байқаған.
Қорыта айтқанда, стевия клтекаларының суспензияда өсуі мен
биомассасының жинақталу қарқыны физикалық, трофикалық факторлардың және
фитогормондар әсеріне тәуелді болатыны айқындалған.
Сонымен, жоғарыда айтылған зерттеулердің нәтижелерін талдай отырып,
in vitro жағдайында стевияның каллус және морфогенез ерекшеліктерін зерттеу
және микроклондық көбейту мәселелерінің төңірегінде әлі де болса бір
көзқарасың жоқтығын, бірнеше пікірталастың орын алатынын байқауға болады.
Демек, аталған мәселелерді шешу үшін әлі де көптеген ізденіс жұмыстарын
жүргізу қажеттілігі туындайды. Сол себептен, біз өз зерттеуімізде,
стевияның оқшауланып алынған ұлпалар мен мүшелерінің каллус және морфогенез
ерекшеліктерін айқындау әдістерін толықтыра түсуді көздедік.
2. ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІЛЕРІ МЕН ӘДІСТЕМЕЛЕРІ
Зерттеу объектілері: in vitro жағдайында өскен Stevia rebaudiana
Bertoni оқшауланып алынған жапырақ; жапырақтың жас бөлігі мен сағағы;
сабақ кесінділерінен алынған экспланттар.
Оқшаулап алынған ұлпалар мен мүшелерді өсіру Р.Г.Бутенконың (1964)
41, Ф.Л.Калинин, В.В. Сарнацкая және В.Б. Полищуктың (1980) 42
әдістемелері бойынша жүргізілді.
Қоректік орталар Мурасиге-Скуг нұсқасы бойынша дайындалды (кесте 1).
Қоректік орта құрамына минералды тұздар, көмірсулар, витаминдер,
фитогормондар, амин қышқылдардары кіреді. Клеткалар in vitro жағдай
көмірсутегіне мұқтаж, себебі олар гетеротрофты қоректенеді. Көмірсугегі
ретінде сахароза немесе глюкоза қосылады.
Кесте 1- Мурасиге-Скуг қоректік ортасының нұсқасы
Компаненттер концентрациясы, мгл.
Макроэлементтер
KNO3 1900
NH4NO3 160
MgSO4 × 7H2O 370
CaCl2 × 2H2O 440
KH2PO4 170
Микроэлементтер
MnSO4 × 4H2O 22,3
KJ 0,83
H2BO3 6,2
ZnSO4 × 7H2O 8,6
CuSO4 × 5H2O 0,025
Na2MoO4× 2H2O 0,25
CoCl2 × 6H2O 0,025
Темір хелаты
FeSO4 × 7H2O 27,8
Na2ЭДТА 37,3
Органикалық заттар
Мезо-инозит 100
Тиамин - HCl 0,1
Никотин қышқылы 0,5
Пиридоксин - HCl 0,5
Сахароза 30000
pH 5,6-5,8
Қоректік орталар құрамына фитогормондар: акусиндер (2,4 Д, НСҚ) мен
цитокининдер (БАП, кинетин) қосылды.
Зерттеу объектілері температурасы 25±20С, 16 сағаттық фотопериодтық
жарық және қараңғы камераларда өсірілді. Ауаның ылғалдылығы 55-60 % болды.
In vitro жағдайында өскен стевиядан оқшауланып алынған жапырақ
экспланттарының каллус түзу белсенділігін анықтау мақсатында төмендегі
қоректік орталар қолданылды:
1) МС+ 0,5 мгл 2,4 Д;
2) МС +1,0 мгл 2,4 Д;
3) МС +1,5 мгл 2,4 Д;
4) МС+ 0,5 мгл 2,4 Д және 0,1 мгл кинетин;
5) МС+1,0 мгл 2,4 Д және 0,3 мгл кинетин;
6) МС+ 1,5 мгл 2,4 Д және 0,5 мгл кинетин.
Жапырақтың жас бөлігі мен сағағының каллус түзі қабілетін зерттеу үшін
келесі қоректік орталар қолданылды:
1) МС+ 2 мгл БАП;
2) МС+2 мгл БАП және 2 мгл НСҚ;
3) МС+1 мгл 2,4 Д және 2 мгл БАП;
4) МС+2 мгл 2,4 Д және 1 мгл БАП.
Жапырақтың жас бөлігі ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz