Глютаматтың алмасуындағы негізгі белсенді ферментке цитокинин медиаторының әсері
Қысқартылған терминдер ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 4
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 5
1.Әдебиетке шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 6
1.1.Глютамат айналымы және оған қатысатын негізгі ферменттер ... ... ... ... 6
1.1.1 ГДГ.ның глютамат айналымындағы маңызы ... ... ... ... ... ... ... ... .. 10
1.1.2 МДГ.ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігін, физико.химиялық қасиеттерін және реттелін зерттеу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 13
1.2 Цитокининді байланыстырушы белоктар және
цитокинин медиаторы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 17
1.3 Өсімдік клеткаларындағы гормональды сигнальды трансдукцияның іске асырылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 18
2.Тәжірибелік бөлім ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 21
2.1. Зерттеу материалдар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 21
2.2.Зерттеу әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 21
3. Алынған нәтижелер және оларды талдау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 23
3.1 НАДФ.ГДГ ферментінің активтілігін анықтайтын әдіс ... ... ... ... .. 25
Қорытынды ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 29
Пайдаланған әдебиеттер тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 30
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 5
1.Әдебиетке шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 6
1.1.Глютамат айналымы және оған қатысатын негізгі ферменттер ... ... ... ... 6
1.1.1 ГДГ.ның глютамат айналымындағы маңызы ... ... ... ... ... ... ... ... .. 10
1.1.2 МДГ.ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігін, физико.химиялық қасиеттерін және реттелін зерттеу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 13
1.2 Цитокининді байланыстырушы белоктар және
цитокинин медиаторы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 17
1.3 Өсімдік клеткаларындағы гормональды сигнальды трансдукцияның іске асырылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 18
2.Тәжірибелік бөлім ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 21
2.1. Зерттеу материалдар ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 21
2.2.Зерттеу әдістері ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 21
3. Алынған нәтижелер және оларды талдау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 23
3.1 НАДФ.ГДГ ферментінің активтілігін анықтайтын әдіс ... ... ... ... .. 25
Қорытынды ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 29
Пайдаланған әдебиеттер тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 30
Әрбір өсімдіктің физиологиялық қалпы оларда жүретін биохимиялық процесстердің қарқындылығымен сипатталады. Өсімдік клеткасының метаболизмінде ең маңызды орын алатын – глутаматтың алмасу процестері. Осы амин қышқылының алмасуы негізінен азоттың, көмірсулардың және энергетикалық процестердің қиылысу нүктесі болып табылады. Сол себептен қандай да болмасын стресс глутамат алмасуына зиян келтірсе, бүкіл өсімдіктің өсу және даму процестері тежеледі.
Глутаматтың алмасуы түрлі белсенді ферменттердің қатысуымен жүретіні белгілі. Осы амин қышқылының алмасуының негізгі жолы ГДГ- мен глутаматтың ыдырау жолы М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының ферменттердің құрылымы мен реттелуі лабораториясында алғаш рет ашылды.
Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің активтенуі белгілі бір сигналдық трансдукция механизімімен іске асады. Сигналды трансдукция механизімін зерттеу қзіргі кздегі биологияның ең өзекті мәселелерінің бірі. Трансдукция дегеніміз-сигналдың сигналға қатарымен берілуі. Трансдукцияның өзіндік ерекшеліктері бар. Трансдукция сигналды эстафета тәріздес өткізеді, басқаша айтқанда жоғары сигнал тек қана көршіге әсер етеді. Сигналды трансдукция механизімінде медиатордың ролі өте жоғары. Осы клеткадағы сигналды трансдукцияда маңызды рол атқаратындығы анықталынды. Медиатор екінші сатыдағы сигналды беретін зат. Себебі гормон тікелей өзі емес медиаторлар арқылы клеткаға әсер ете алады. Сол себептен цитокинин медиаторын зерттеу ғалымдардың қызығушылығын тудырады. Себебі осы цитокинин медиаторы клетка ішіндегі мембранамен байланысқан фементтерге әсері өте жоғары. Инозиттік сигналдың клеткадағы берілуінің малекулалық механизімі жақсы зерттелген, бірақ оның субклеткалық аспектілері толық зерттелмеген. Осылайша субклеткалы ранеллалардың инозитті сигналдық трансдукция процесіне қатысатыны әлі толық белгілі емес /1/.
М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтында cубклеткалық органелла-сферосома, липидтің тек бір түрі –фосфатидилинозиттен және глютаматдегидрогеназа деген бірғана ферменттен тұратыны белгілі болған /2/.
Бұл жұмыстың мақсаты: Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің биохимиялық қасиеттерін анықтау және оларға цитокинин медиаторының әcepi мен оның физиологиялық, биохимиялық қасиеттерін сипаттап, биотехнологияда қолдану жолдарын қарастыру.
Осы мақсатқа жету үшін алға қойылған міндеттер:
1. Цитокинин медиаторын бөліп алу;
2. Бөліп алынған цитокинин медиаторын глютамат айналымындағы негізгі ферментке - ГДГ-ға әсерін қарастыру;
3. ГДГ-ның белсенділігін анықтап, олардың клетка ішіндегі ролін зерттеу;
4. Клетка ішілік сигналдық трансдукцияның субклкткалық аспектілерін зерттеу;
Глутаматтың алмасуы түрлі белсенді ферменттердің қатысуымен жүретіні белгілі. Осы амин қышқылының алмасуының негізгі жолы ГДГ- мен глутаматтың ыдырау жолы М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының ферменттердің құрылымы мен реттелуі лабораториясында алғаш рет ашылды.
Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің активтенуі белгілі бір сигналдық трансдукция механизімімен іске асады. Сигналды трансдукция механизімін зерттеу қзіргі кздегі биологияның ең өзекті мәселелерінің бірі. Трансдукция дегеніміз-сигналдың сигналға қатарымен берілуі. Трансдукцияның өзіндік ерекшеліктері бар. Трансдукция сигналды эстафета тәріздес өткізеді, басқаша айтқанда жоғары сигнал тек қана көршіге әсер етеді. Сигналды трансдукция механизімінде медиатордың ролі өте жоғары. Осы клеткадағы сигналды трансдукцияда маңызды рол атқаратындығы анықталынды. Медиатор екінші сатыдағы сигналды беретін зат. Себебі гормон тікелей өзі емес медиаторлар арқылы клеткаға әсер ете алады. Сол себептен цитокинин медиаторын зерттеу ғалымдардың қызығушылығын тудырады. Себебі осы цитокинин медиаторы клетка ішіндегі мембранамен байланысқан фементтерге әсері өте жоғары. Инозиттік сигналдың клеткадағы берілуінің малекулалық механизімі жақсы зерттелген, бірақ оның субклеткалық аспектілері толық зерттелмеген. Осылайша субклеткалы ранеллалардың инозитті сигналдық трансдукция процесіне қатысатыны әлі толық белгілі емес /1/.
М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтында cубклеткалық органелла-сферосома, липидтің тек бір түрі –фосфатидилинозиттен және глютаматдегидрогеназа деген бірғана ферменттен тұратыны белгілі болған /2/.
Бұл жұмыстың мақсаты: Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің биохимиялық қасиеттерін анықтау және оларға цитокинин медиаторының әcepi мен оның физиологиялық, биохимиялық қасиеттерін сипаттап, биотехнологияда қолдану жолдарын қарастыру.
Осы мақсатқа жету үшін алға қойылған міндеттер:
1. Цитокинин медиаторын бөліп алу;
2. Бөліп алынған цитокинин медиаторын глютамат айналымындағы негізгі ферментке - ГДГ-ға әсерін қарастыру;
3. ГДГ-ның белсенділігін анықтап, олардың клетка ішіндегі ролін зерттеу;
4. Клетка ішілік сигналдық трансдукцияның субклкткалық аспектілерін зерттеу;
1. Бабаев Ж.А., Бутенко Р.Г., Строганов Б.П. //Физиол. раст.-1968, т.15-Вып.1. –с.93-102.
2. Клышев Л.К., Гильманов М.К., Валиханова Г.Ж., Кашиев Т.З. и др. «Регуляция метаболизма растений при засолении среды//Алматы. Изд. «Наука», КР. 1979, с.85-47.
3. Кулаев Ф.Б., Шамина З.Б., Строганов Б.П. //Физиол. раст. 1975. –т.22. –Вып.1. –с.131-136.
4. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев, -1990. –280 с.
5. Кретович В.Л.//Обмен азота в растениях.1972. с.14-21
6. Клышев А.К и другие//Регуляция метоболизма растений при засолений среды//Алматы. 1975. с.57-60
7. Клышев Л.К., Гильманов М.К., Валиханова Г.Ж., Кабишева Т.З. и др. Регуляция метоболизма растений при засолений среды //Алматы. Изд. «Наука» КР. 1979. с.35-47.
8. Вертомонов В.И. Рост и чистота природной среды //М.: Наука, 1986.
9. Школьник М.Л. Микроэлементы в жизни растений. - Л: Наука, 1974. с 83
10. Бертоке П., Раду Д. Стратегия защиты окружающей среды от загрязнителей //М.: Мир, 1980.
11. Александрова Л.Н. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. – Л.: Наука. 1980 - 281 с.
12. Ганин М.С. Эколого-биохимическая оценка Восточного Казахстана. –Алматы: Изд. КазГУ, 200, -10-55 с.
13. Шатилов В.Р. Глютоматдегирогенизисы //Итоги науки и техники. Серия биол. химии. М.: Ванижи, 1987, т. 24, с.4-014.
14. александрова Л.Н. органическое вещество почвы и процессы его трансформации. Л.: 1980. с.48-52.
15. Гальпова В.В., Титов А.Ф., Боева Н.П.//Влияние ионов кадмия и свинца на рост и содержание пылина и АБН в проростках огурца//Физ. Растений. 1999. т.46.№1. с.164-167.
16. Гильманов М.К., Досмагамбетова Ш.С., Дилбарканова Р. НАДФ специфическая гмотаматдегидрогеноза пшеницы //Физиологическая основы повышения устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений. Алма-Ата. Наука. 1988.
17. Гильманов М.К., Яковлева В.И., Кретович В.Л. Особенности глютаматдегидрогеназа растений. ДАН СССР. 1967, 175. с. 949-951.
18. Гильманов М.К., Колдасова А.С., Шалахметова Г.А, Цветкова Б.М., Колдасова Ш.С. Методы изучения ферментного комплекта [МДГ+ГОАТ] осуществляющего необративные расщепление глютамата зерна пшеницы //Алматы, 1999. Инст. мол. биол. и биохим. им. М.А.Айтхожина//с.93-98.
19. Римбаркопова Р., Гильманов М.К. Строение и функций растительной клетки. Алматы. Ғылым. 1997. с.164.
20. Мамонов Л.Н., Васильев Ю.К., Ахметова Д.Ж, Абишева Т.Н.//Изменение физиологических процессов у разных по солеустойчивости сортов пшеницы при засолении// Институт физиологии, генетики биоиженерий растений/ Н.Ц.Б. РК. Алматы. №5.1998.
21. Строгуко Б.Т. Солеустойчивость растений. Т.3. Москва., 1987. с.270-325.
22. Гильманов М.К., Досмагамбетова Ш.С., Дилбарканова Р. НАДФ специфическая гмотаматдегидрогеноза пшеницы //Физиологическая основы повышения устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений. Алма-Ата. Наука. 1988.
23. Гильманов М.К., Яковлева В.И., Кретович В.Л. Особенности глютаматдегидрогеназа растений. ДАН СССР. 1967, 175. с. 949-951.
24. Гильманов М.К., Колдасова А.С., Шалахметова Г.А, Цветкова Б.М., Колдасова Ш.С. Методы изучения ферментного комплекта [МДГ+ГОАТ] осуществляющего необративные расщепление глютамата зерна пшеницы //Алматы, 1999. Инст. мол. биол. и биохим. им. М.А.Айтхожина//с.93-98.
25. Римбаркопова Р., Гильманов М.К. Строение и функций растительной клетки. Алматы. Ғылым. 1997. с.164.
26. Bredonmeijer G. Latent glutomate de by dro genose in pllen of petina hybridn //Acta. Bot. Neere. 1971. v.70, p.110-131.
27. Sultanbaev B.E., Gilmanov M.C., Abramycheva M.R., Stolpakova v.v., Ginodman L.M., Muromtes G.S.//Plant. Sci.100. v.88. p.19-74.
28. Барсукова В.С., Гальцикова О.И. Влияние избытка кадмия на содержание макро и микроэлементов у контрактных по устойчивости сортов пшеницы //Физ. и биох. культ. раст.-2000. т.32.№1. с.47
29. Pov Vaia B.W., Reddy A.S.// Critical Reviews in plant. Sci. 1993-v.12-13. p.185-211.
30. Гильмнаов М.К., Ибрагимова С.А., Николенко Н.Г. Методы изучения сигнальной трансдукции в прорастающем зерне пшеницы // Инст. биолог. им. М.А.Айтхожина. Алматы. 1999. с. 107-117.
31. Marre E. // Plant phisiol. 1979. v.30. –p.273-278.
32. Srivastava G., Singh R.P. Role and regulation of L-glutamate dehydrogenase activity in higher plant // Phytochemistry. 1987, v.26, p.597-610.
33. Шатилов В.Р. Глютаматдегидрогеназы // Итоги науки и техники. Серия биол. химия. М.: ВИНИТИ, 1987, т.24, с.4-104.
34. Қалекенұлы Ж.Өсімдіктер физиологиясы Алматы, 2004 c241-248
35. Шатилов В.Р. Глутаматдегидрогеназы микроорганизмов и растений // Успехи биологической химии. 1982, т.23, с.185-209.
2. Клышев Л.К., Гильманов М.К., Валиханова Г.Ж., Кашиев Т.З. и др. «Регуляция метаболизма растений при засолении среды//Алматы. Изд. «Наука», КР. 1979, с.85-47.
3. Кулаев Ф.Б., Шамина З.Б., Строганов Б.П. //Физиол. раст. 1975. –т.22. –Вып.1. –с.131-136.
4. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Киев, -1990. –280 с.
5. Кретович В.Л.//Обмен азота в растениях.1972. с.14-21
6. Клышев А.К и другие//Регуляция метоболизма растений при засолений среды//Алматы. 1975. с.57-60
7. Клышев Л.К., Гильманов М.К., Валиханова Г.Ж., Кабишева Т.З. и др. Регуляция метоболизма растений при засолений среды //Алматы. Изд. «Наука» КР. 1979. с.35-47.
8. Вертомонов В.И. Рост и чистота природной среды //М.: Наука, 1986.
9. Школьник М.Л. Микроэлементы в жизни растений. - Л: Наука, 1974. с 83
10. Бертоке П., Раду Д. Стратегия защиты окружающей среды от загрязнителей //М.: Мир, 1980.
11. Александрова Л.Н. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. – Л.: Наука. 1980 - 281 с.
12. Ганин М.С. Эколого-биохимическая оценка Восточного Казахстана. –Алматы: Изд. КазГУ, 200, -10-55 с.
13. Шатилов В.Р. Глютоматдегирогенизисы //Итоги науки и техники. Серия биол. химии. М.: Ванижи, 1987, т. 24, с.4-014.
14. александрова Л.Н. органическое вещество почвы и процессы его трансформации. Л.: 1980. с.48-52.
15. Гальпова В.В., Титов А.Ф., Боева Н.П.//Влияние ионов кадмия и свинца на рост и содержание пылина и АБН в проростках огурца//Физ. Растений. 1999. т.46.№1. с.164-167.
16. Гильманов М.К., Досмагамбетова Ш.С., Дилбарканова Р. НАДФ специфическая гмотаматдегидрогеноза пшеницы //Физиологическая основы повышения устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений. Алма-Ата. Наука. 1988.
17. Гильманов М.К., Яковлева В.И., Кретович В.Л. Особенности глютаматдегидрогеназа растений. ДАН СССР. 1967, 175. с. 949-951.
18. Гильманов М.К., Колдасова А.С., Шалахметова Г.А, Цветкова Б.М., Колдасова Ш.С. Методы изучения ферментного комплекта [МДГ+ГОАТ] осуществляющего необративные расщепление глютамата зерна пшеницы //Алматы, 1999. Инст. мол. биол. и биохим. им. М.А.Айтхожина//с.93-98.
19. Римбаркопова Р., Гильманов М.К. Строение и функций растительной клетки. Алматы. Ғылым. 1997. с.164.
20. Мамонов Л.Н., Васильев Ю.К., Ахметова Д.Ж, Абишева Т.Н.//Изменение физиологических процессов у разных по солеустойчивости сортов пшеницы при засолении// Институт физиологии, генетики биоиженерий растений/ Н.Ц.Б. РК. Алматы. №5.1998.
21. Строгуко Б.Т. Солеустойчивость растений. Т.3. Москва., 1987. с.270-325.
22. Гильманов М.К., Досмагамбетова Ш.С., Дилбарканова Р. НАДФ специфическая гмотаматдегидрогеноза пшеницы //Физиологическая основы повышения устойчивости и продуктивности сельскохозяйственных растений. Алма-Ата. Наука. 1988.
23. Гильманов М.К., Яковлева В.И., Кретович В.Л. Особенности глютаматдегидрогеназа растений. ДАН СССР. 1967, 175. с. 949-951.
24. Гильманов М.К., Колдасова А.С., Шалахметова Г.А, Цветкова Б.М., Колдасова Ш.С. Методы изучения ферментного комплекта [МДГ+ГОАТ] осуществляющего необративные расщепление глютамата зерна пшеницы //Алматы, 1999. Инст. мол. биол. и биохим. им. М.А.Айтхожина//с.93-98.
25. Римбаркопова Р., Гильманов М.К. Строение и функций растительной клетки. Алматы. Ғылым. 1997. с.164.
26. Bredonmeijer G. Latent glutomate de by dro genose in pllen of petina hybridn //Acta. Bot. Neere. 1971. v.70, p.110-131.
27. Sultanbaev B.E., Gilmanov M.C., Abramycheva M.R., Stolpakova v.v., Ginodman L.M., Muromtes G.S.//Plant. Sci.100. v.88. p.19-74.
28. Барсукова В.С., Гальцикова О.И. Влияние избытка кадмия на содержание макро и микроэлементов у контрактных по устойчивости сортов пшеницы //Физ. и биох. культ. раст.-2000. т.32.№1. с.47
29. Pov Vaia B.W., Reddy A.S.// Critical Reviews in plant. Sci. 1993-v.12-13. p.185-211.
30. Гильмнаов М.К., Ибрагимова С.А., Николенко Н.Г. Методы изучения сигнальной трансдукции в прорастающем зерне пшеницы // Инст. биолог. им. М.А.Айтхожина. Алматы. 1999. с. 107-117.
31. Marre E. // Plant phisiol. 1979. v.30. –p.273-278.
32. Srivastava G., Singh R.P. Role and regulation of L-glutamate dehydrogenase activity in higher plant // Phytochemistry. 1987, v.26, p.597-610.
33. Шатилов В.Р. Глютаматдегидрогеназы // Итоги науки и техники. Серия биол. химия. М.: ВИНИТИ, 1987, т.24, с.4-104.
34. Қалекенұлы Ж.Өсімдіктер физиологиясы Алматы, 2004 c241-248
35. Шатилов В.Р. Глутаматдегидрогеназы микроорганизмов и растений // Успехи биологической химии. 1982, т.23, с.185-209.
әл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті
Биология факультеті
Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиология кафедрасы
БІТІРУ ЖҰМЫСЫ
ГЛЮТАМАТТЫҢ АЛМАСУЫНДАҒЫ НЕГІЗГІ БЕЛСЕНДІ ФЕРМЕНТКЕ ЦИТОКИНИН МЕДИАТОРЫНЫҢ
ӘСЕРІ
Орындаған: _________________________________Ал ашбаева Л.Ж.
(қолы, күні)
Ғылыми жетекшілері:
ҚР ҰҒА-ның академигі ________________________ Гильманов М.Қ.
(қолы, күні)
б.ғ.к., доцент_____________________________ _____Джокебаева С.Ә.
(қолы, күні)
Норма бақылаушы:
Акимбекова А.Б.
(қолы, күні)
Қорғауға жіберілді:
Кафедра меңгерушісі,
б.ғ.д., профессор _____________________________ Иващенко А.Т.
(қолы, күні)
Алматы, 2008
РЕФЕРАТ
Бітіру жұмысы: 32-беттен, 35-әдебиеттен, 1-кесте, 7-суреттен тұрады.
Бітіру жұмысы Алашбаева Лилия Жанабаевнаның М. А. Айтхожин атындағы
биохимия және молекулальқ биология институтыньң ферменттердің құрылымы мен
реттелу лабораториясы мен ҚазҰУ-дың биология факультетінің биотехнология,
биохимия және өсімдіктер физиологиясы кафедрасында өткізілді.
Өзектілігі: Глютамат айналымындағы негізгі белсенді фермент-ГДГ-ның
биохимиялық қасиеттерін анықтап, оларға цитокинин медиаторының әсерін
зерттеу және ферменттердің белсенділігін арттырып, ауылшаруашылығы
дақылдарының өнімділігін аттырады.
Негізгі сөздер: бидай дәні, ұрық бөлігі, алейрон қабаты, НАДФ-
глютаматдегидрогеназа, глутамат, цитокинин, цитокинин медиаторы
Алдына қойылған мақсаты: Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің
биохимиялық қасиеттерін анықтау және оларға цитокинин медиаторының әcepi
мен оның физиологиялық, биохимиялық қасиеттерін сипаттап, биотехнологияда
қолдану жолдарын қарастыру.
Зерттеу барысында: Жүргізілген зерттеу тәжірибелерімде бидай
дәндерінің үш түрлі сортын (Қазақстан-10, Арай, Дауыл) алдым. Себебі басқа
дәнді дақылдармен салыстырғанда, бұларда глутамин қышқылының айналымы
анығырақ жүреді, әрі глютаматдегидрогеназаның активтілігі жоғары. Бидай
дәнінен цитокинин медиаторын, сферасоманы бөліп алуды үйрендім. Бөліп
алынған цитокинин медиаторын глютамат айналымындағы негізгі ферменттерге
әсер ете отырып, оның белсенділігін, биохимиялық қасиеттерін анықтадым.
Қолданылған әдістер: Октил сефароза (CL-4B) гидрофобты хроматографиясы
жэне RP-18 колонкада жасалынатын жоғары кысымды кepi фазалы хроматография,
гомогенизациялау, центрифугалау.
МАЗМҰНЫ
Қысқартылған терминдер ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 4
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 5
1.Әдебиетке шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 6
1.1.Глютамат айналымы және оған қатысатын негізгі ферменттер ... ... ... ... 6
1.1.1 ГДГ-ның глютамат айналымындағы маңызы ... ... ... ... ... ... ... ... .. 10
1.1.2 МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігін, физико-химиялық 13
қасиеттерін және реттелін
зерттеу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... ...
1.2 Цитокининді байланыстырушы белоктар және 17
цитокинин медиаторы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ...
1.3 Өсімдік клеткаларындағы гормональды сигнальды трансдукцияның іске 18
асырылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
2.Тәжірибелік 21
бөлім ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ... ..
2.1. Зерттеу материалдар 21
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
...
2.2.Зерттеу әдістері 21
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... ... ...
3. Алынған нәтижелер және оларды 23
талдау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
3.1 НАДФ-ГДГ ферментінің активтілігін анықтайтын әдіс ... ... ... ... .. 25
Қорытынды ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 29
Пайдаланған әдебиеттер тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 30
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН ТЕРМИНДЕР
АТФ – аденозин трифосфат
ГДГ – глютаматдегидрогеназа
ДНҚ – дезоксирибонуклеин қышқылы
РНҚ – рибонуклеин қышқылы
МДГ – малатдегидрогеназа
[МДГ+ГОАТ] – малатдегидрогеназа глутаматоксалоацетатамино трансфераза
МСГ-1 – сигналды гормон медиаторы
ФК – ферменттік комплекс
НАД-ГДГ – никотинаминадениндинуклеотид – глютаматдегирогеназа
НАД(Ф)-ГДГ–никотинамидадениндинукле отидфосфат-глютаматдегидрогеназа
НАДН2 – тотықсызданған никотинамидадениндинуклеотид
ҚСҚ – қымыздық сірке қышқылы
Трис – 2 амино –2 (гидроксиметил) – 1,3-пропиондиол.
КІРІСПЕ
Әрбір өсімдіктің физиологиялық қалпы оларда жүретін биохимиялық
процесстердің қарқындылығымен сипатталады. Өсімдік клеткасының
метаболизмінде ең маңызды орын алатын – глутаматтың алмасу процестері. Осы
амин қышқылының алмасуы негізінен азоттың, көмірсулардың және энергетикалық
процестердің қиылысу нүктесі болып табылады. Сол себептен қандай да
болмасын стресс глутамат алмасуына зиян келтірсе, бүкіл өсімдіктің өсу және
даму процестері тежеледі.
Глутаматтың алмасуы түрлі белсенді ферменттердің қатысуымен жүретіні
белгілі. Осы амин қышқылының алмасуының негізгі жолы ГДГ- мен глутаматтың
ыдырау жолы М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия
институтының ферменттердің құрылымы мен реттелуі лабораториясында алғаш рет
ашылды.
Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің активтенуі белгілі бір
сигналдық трансдукция механизімімен іске асады. Сигналды трансдукция
механизімін зерттеу қзіргі кздегі биологияның ең өзекті мәселелерінің бірі.
Трансдукция дегеніміз-сигналдың сигналға қатарымен берілуі. Трансдукцияның
өзіндік ерекшеліктері бар. Трансдукция сигналды эстафета тәріздес өткізеді,
басқаша айтқанда жоғары сигнал тек қана көршіге әсер етеді. Сигналды
трансдукция механизімінде медиатордың ролі өте жоғары. Осы клеткадағы
сигналды трансдукцияда маңызды рол атқаратындығы анықталынды. Медиатор
екінші сатыдағы сигналды беретін зат. Себебі гормон тікелей өзі емес
медиаторлар арқылы клеткаға әсер ете алады. Сол себептен цитокинин
медиаторын зерттеу ғалымдардың қызығушылығын тудырады. Себебі осы цитокинин
медиаторы клетка ішіндегі мембранамен байланысқан фементтерге әсері өте
жоғары. Инозиттік сигналдың клеткадағы берілуінің малекулалық механизімі
жақсы зерттелген, бірақ оның субклеткалық аспектілері толық зерттелмеген.
Осылайша субклеткалы ранеллалардың инозитті сигналдық трансдукция процесіне
қатысатыны әлі толық белгілі емес 1.
М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтында
cубклеткалық органелла-сферосома, липидтің тек бір түрі
–фосфатидилинозиттен және глютаматдегидрогеназа деген бірғана ферменттен
тұратыны белгілі болған 2.
Бұл жұмыстың мақсаты: Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің
биохимиялық қасиеттерін анықтау және оларға цитокинин медиаторының әcepi
мен оның физиологиялық, биохимиялық қасиеттерін сипаттап, биотехнологияда
қолдану жолдарын қарастыру.
Осы мақсатқа жету үшін алға қойылған міндеттер:
1. Цитокинин медиаторын бөліп алу;
2. Бөліп алынған цитокинин медиаторын глютамат айналымындағы
негізгі ферментке - ГДГ-ға әсерін
қарастыру;
3. ГДГ-ның белсенділігін анықтап, олардың клетка ішіндегі ролін
зерттеу;
4. Клетка ішілік сигналдық трансдукцияның субклкткалық аспектілерін
зерттеу;
1. ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1. Глютамат айналымы және оған қатысатын негізгі ферменттер
Белоктар өздерінің көп түрлілігі және атқаратын қызметтерінің
маңыздылығына байланысты тірі организмдерде елеулі рол атқарады. Қалыптасып
келе жатқан өскіндерді кейін белок синтезі үшін қолданылатын азот айналымы
өнімдерімен қамтамассыз ету қорлық белоктардың гидролизі нәтижесінде пайда
болатын амин қышқылдары мен амидтердің кей жағдайда пептидтердің көмегімен
жүзеге асады. Қазіргі кезде астық тұқымдастардың проламиндер мен
глютелиндердің қорға жиналатындығына еш күмән келтірілмейді. Олар
эндосперімде жинақталған.
Барлық белоктардың түріне тән ерекшелік – олардың құрамында глютамин
қышқылының қалдығының біраз мөлшерінің болуы. Астық тұқымдастардың
дәніндегі проламиндерде глютамин қышқылының мөлшері орташа есеппен 100г
белоктың ішінде тарыда 13,7г, ал бидайда 43,3г дейінгі аралықта болады, ал
амега проламиндер фракцияларында белоктың құрғақ салмағына есптегенде 53,2%-
ін глютамин қышқылы құрайды. Бидайдың глютениндегі оның мөлшері 37%-ке жуық
болады. Қорлық белоктың құрамындағы, әсіресе бидайдағы глиадинде глютамин
қышқылы қалдықтарының көпшілігі амидтенген. Үпілмәліктен алынған альбумин
фракциясының құрамында глютамин қышқылының мөлшері жоғары (30 моль %- ке
дейін) болған. Ол пісіп жетілу кезінде жинақталып, өскін өсуі кезінде тез
жұмсалған. Соның негізінде ол бірінші тез мобилденетін белок резервісі
болып табылады деген қорытынды жасалған. Тұқымдардағы қорлық белоктарда
глютамин қышқылдарының мөлшерінің жоғары болуы немен байланысты болады
деген сұрақ туады? Бұның ең дұрыс шындыққа жақын жауабы, осы амин қышқылы
тұқымының енуі кезіндегі метоболиттік процестердің тез жүруіне ерекше
маңызды роль атқаратындығында деп түсіндіріледі.
Бидай дәнінде глутамин мөлшерінің көп екені белгілі, себебі бидайдың қор
ретінде жиналатын белоктарының құрамында глутамин және оның туындысы -
пролиннің жалпы мөлшері 60%-дан астам болса, басқа амин қышқылдары 35-38%-
ын ғана құрайды 3. Өсімдіктердің метаблизімінде ең маңызды рол атқаратын
глютамат алмасу процесі. Глютамат өсімдіктерде барлық амин қышқылдарының
арасында ең маңызды және орталық амин қышқылы екендігі жалпыға мәлім 4.
Сондықтан жоғары сатыдағы өсімдіктердегі глютамат айналымының негізгі
жолдарын үлкен қызығушылық тудырды. М.Ә.Айтхожин атындағы молекулалық
биология және биохимия институтының ферменттердің құрылымы және реттелуі
лабораториясында ондаған жылдар бойы осы айналымындағы амин қышқылдарының,
яғни, глютамат айналымының ферменттік механизімін зерттеу үстінде. Бұнда
минералдық азоттың сіңіру реакциясын атқаратын НАДФ спецификалық ГДГ
анықталғаннан бастап жоғары сатыдағы қсімдіктердегі гютаматтың ыдырауының
жалғыз ғана жолы белгілі болатын. Ол глютаматдегидрогеназа (ГДГ) арқылы
глютаматты тотықтыру жолы. Метоболиттік процес күшейген кезде бұл амид
глютамин қышқылына айналады, ол айналымында маңызды роль атқарады. Глютамат
өсімдік өсуі үшін өте қажетті НАДН және 2-оксоглютарат субстраттарының
негізгі көзі ретінде қызмет етеді. Глютамин қышқылымен тотығып дезаминденуі
глтаматдегидрогеназа ферментінің қатысуымен жүзеге асады, нәтижесінде
оксоглютарат түзіледі. Метоболизімнің осы сатысында клетканың азотпен қуат
алмасуының негізгі жолдарын туғызады. Яғни, глутамат алмасуының сапалы
деректерін негізге ала отырып, өсімдіктердің әртүрлі стресс жағдайларына
төзімділігіне биохимиялық баға беруге болады 5. Осы бағытта Гильманов
М.К. басқаруымен глютаматтың қайтымсыз ыдырау нәтижесінде маңызды
метоболиттер – L-кетоглутарат, аспартат, НАДН түзілетін реакцияны жүзеге
асыратын МДГ-ГОАТ комплексті ферментті зерттеуде. Бұл фермен ттік комплекс
мынадай реакциялар реттілігін жүзеге асырады. Бірінші атқаратын реакциясы
малатдегидрогеназа арқылы алма қышқылы кофермент НАД қатысуымен қымыздық
сірке қышқылына дейін тотығады және осы кезде НАД коферменті НАДН-қа дейін
тотықсызданады. Содан кейін глютаматоксалоацетаттрансферза қатысуымен
оксалоацетат глютаматпен трансаминизациялық реакцияға түседі. Осы реакция
нәтижесінде глютамат 2-оксалоглютаратқа, ал оксалоацетат аспартатқа
айналады. өсімдіктердің өнуі мен өсуі процестерінде тұздың әсерінен туатын
өзгерістердің болуын осы ферменттік комплекс арқылы сипаттауға болады,
яғни, комплексті ферменттің активтілігімен өсімдіктердің өмір сүруге
қабілеттілігі, әртүрлі факторларға төтеп беруі, тіпті иондық қызметтерінің
арасында байланыстық болуы мүмкін 6.
Глютамин азоттың минералдық формаларымен қатар, өсімдіктерде азоттың
тасымалданушы формасы болып табылады және де пісіп келе жатқан тұқымдарға
келіп түсетін осы элементтің негізгі бөлігін құрайды. Сонымен қатар
өсімдіктің өсуінде де органикалық азоттың тасымалдануында оның елеулі оль
атқаруы мүмкін. Бидайдың жапырақтарына радиоктивті С глютаматты ендірген,
мынадай маин қышқылдары, органикалық қышқылдар СО және қант фосфаттары
сияқты радиоактивті құраған. Глютамат және глютамин фототыныс алу кезінде
түзілетін аммонидің реассимиляциясына жауап беретін ГОГАТ цикілге тікелей
қосылатын екі қосылыс.
Сонымен, глютамин және глютамин қышқылы арқылы азоттың әртүрлі
өсімдіктерге тән өзіндік бағыттағы көмірсу алмасуын қарқынды өндіретін
көміртегі ізашарлармен түйісуі жүреді. Тек осы амин қышқылдарының алмасуы
арқылы көмірсу және азот алмасуы арасында өзара қарым қатынас болады.
Сонымен қатар глютамин қышқылы және глютаминнің қатысуымен жүретін
реакциялар амин қышқылдарының синтезі мен катаболизімін трансаминдік
реакциялармен үйлестіру жолымен бір жерде шоғырландыруға мүмкіндік береді.
Нәтижесінде протеингенді амин қышқылдарының әрбіреуінде дегидрогеназалары
болатындығындай эффект береді.
Әртүрлі амин қышқылдарынан транс аминазалар көмегімен жинақталған амин
топтары соңында L-глтамин қышқылының а-топтарына айналады, ал ол
глютаматдегидрогеназа ферментінің әсерінен тотыға дезаминденеді. Бұл
ферменттің бидай дәнінен анықталуына 50 жылдан астам уақыт өтті.
Глютаматдегидрогеназа 2-оксоглютар және глютамин қышқылдарының өзара бір
біріне айналуын катализдейді, сол кезде аммони неорганикалық азот және а-
аминдік азоттың өзара бір - бірімен айналуы қатар жүреді.
Глютаматдегидрогеназа жануарларда, өсімдіктерде және микроорганизмдерде ең
көп тараған ферменттердің бірі болып саналады. Қазіргі кезде бұл ферменттің
кездеспейтін организм жоқ дерлік.
Көптеген зерттеулер арқылы ферменттің активтілігі митохондрия
бөлшектерінің фракцияларымен байланысты ғана емес, көбінесе сол жерде
жинақталатындығы көрсетілген. Бұршақтың өскіндеріндегі митахондрияларында
ГДГ-ның клеткадағы 70%-ке дейінгі барлық активтілігі анықталған. ГДГ
аспартаттрансаминаза және малатдегидрогеназа секілді, митахондриялардың
мембраналарында емес, матриксте шоғырланатындығы анықталды.
Митахондрияға тән өзіндік қасиеті, ол глютаматтың тотығуы парацесіне
активті түрде қатысады. Соның нәтижесінде, ондағы ГДГ тек аминденуші
бағытта ғана емес, сонымен қатар дезаминденуші бағытта да активті болады
және ГДГ-ның осы қызметтерін зерттеу жаңаша ерекше қызыметтерін тудырады.
Осы мақсатпен бұршақтың өскіндерінің гипокотильдеріндегі митахондрияларында
зерттеулер жүргізілді. Митахондрияда болған немесе жаңадан түзілетін
әртүрлі субстраттар, сонымен бірге Кребс цикылының қышқылдары да
концентрцияларына байланысты аминденуші немесе дезаминденуші бағыттарында
ГДГ активтілігін аса реттегіш болып табылады. Кребс цикылының субстраттары
( цитрат, изоцитрат, фумарат, сукцинат) төменгі концентрацияда дезаминдену
активтілігін, ал жоғарғы концентрацияда 2-оксоглютараттың а-амтиндену
тежеген. Амин қышқылдары және амидтер ( аспартат, аспарагин, глютамин,
аланин ) глютаматтың дезаминденуін тежеген, аминденуіне еш әсер етпеген.
Митахондриядағы НАДН төменгі концентрацияда ГДГның дезаминденуші
активтілігін тежеген.
Дэй және басқада авторлар сояның жапырағы мен тұқым жарнағындағы
митахондрияларындағы глютаматтың тотығуын зерттеген. Тұқым жарнағындағының
пайда болған кезінен бастап (4-5 тәуілік) және 24-күндік кезіне дейін тұқым
жарнақтары мен жапырақтарындағы ГДГ ның тотықтырғыш активтілігін
тазартылған митахондриялардан анықтаған. Глютаматтың тотығуы реакциясын О
тұтынуына байланысты болған. Сояның тұқым жарнақтарының оқшауланған
митахондрияларында глтаматтың тотыға дезаминденуі реакциясында ГДГ-ның
активтілігінің динамикасы өзгеше болды: тұқымды сепкеннен кейінгі 2-ші
күнінде активтілігі жоғары, 7-ші күнге дейін максимумға жеткен, содан кейін
тұқым жарнағының қаратюы кезінде бір төмендеп, бір өсіп отырған. Авторлар
митахондриялардағыглютаматтың тотығуы өскіндерінің өсуі кезеңінде қорлық
қосылыстардың мобилизациялануына және амин қышқылдарының метоболизәмәне
әсер етеді деген болжау айтқан. Жапырақтар мен қартайып келе жатқан тұқым
жарнақтарының митахондрияларында басқа субстраттардың тез тотығуымен
салыстырғанда (малат), глютаматтың тотығу жылдамдығы онша емес екендігі
көрсетілген.
Қазіргі кезде өсімдік клеткасындағы гютаматдегидрогеназаның
изоферменттері бар екендігі, сонымен қатар олардың аммонидің әсеріне жауап
ретінде іріктеліп индукциялануы жайлы материалдар жинақталған. Бірақта бұл
изоферменттердің клетка ішінде таралуы жайлы арнаулы зерттеулер әлі күнге
дейін аз, сондықтан клетка құрылымдары мен цитазольдағы ГДГ-ның қызыметтері
мен қасиеттерін түсіндіріп, талдау жасау қиынға соғады.
Алайда өсімдіктердің түрлік спецификалығын ескере отырып, бұл сұрақты
шешу аса қажет. Себебі әртүрлі өсімдіктердегі ферменттердің
локализациялануы мен қасиеттерінің өз ерекшеліктері болады. Мысалы балық
отында (ряска) ГДГ бір изоферментпен, ал бұршақта жеті изоферментпен
болатындығы көрсетілген. Бір қатар көрсеткіштерге байланысты ферменттер
ұқсас болып келген: бірдей молекулалық (23000) массасы 58500 болатын төрт
бірдей суббірліктер, ұқсас амин қышқылдар құрамы және активтіліктілігін
анықтау үшін Са ионының міндетті түрде болуы қажет.
Бидай дәнінің өсу кезі мен пісіп жетілу кезіндегі тура реакцияның
(глютаматтың тотыға дезаминденуі) және кері реакцияның (2-оксаглютараттың
тотықсыздана дезаминденуі) ара қатынасы зерттелген. Эндоспермде ферменттің,
оң екі бағытта катализдейтін реакцияларының активтілігі сумен бөрттіріп
қойған алғашқы күндерінде ең жоғарғы, екінші күні екі есе төмендеген, одан
кейін төмендеуін жалғастырғаны анықталды.бидай өне бастаған кезде тура және
кері реакциялардың ара қатынасы эндоспермде, сонымен қатар қабығында 1:2 ал
өскіндерде 1:1 тең ол кейін глютамин қышқылының синтезделуі жағына қарай
өзгереді (өскіндері 1:12). Пісіп жетіле бастаған кезде, гүлденгеннен кейін
ГДГның тура және кері реакцияларының жылдамдығының өсуі дәннің 68% -ден 58%
-ке дейінгі ылғалдылығында, яғни сүт пісіп жетілу кезеңінде максимумға
жеткендігі байқалған. Глютамин қышқылының глютаматдегидрогеназаның
қатысуымен алмасуының негізгі процестері оның жинақталатын жерінде, яғни
бидай дәнінің эндоспермінде жүретіндігі байқалған
Бидай өсімдігінің тамырынан алынған ГДГ-ның гомогенді препораттарындағы
тотыға дезаминденуі және 2-оксаглутараттың тотықсыздана аминденуі
реакциялардың жылдамдығының қатынасы 1:14 құрған кезде, ал бидайдың
тазартылмаған экстракттарындағы глютаматтың тотыға дезаминденуі
реакцияларының жоғары діңгейде жүретіндігі ерекше еөңіл аудартады. Мүмкін
тазарту процесі кезінде ГДГ-дан жоғары глютаматты ыдырату активтілігі бар
басқа фермент бәліп шығаруы мүмкін және ол шынымен де біздің
зерттеулерімізде анықталған.
Tsukamoto және Welander бұрынғы жұмыстарында алғаш рет бидайда глютамат
тотықтыратын ферменттің бар екендігі көрсетілген, мысал ретінде Welander
электрофорез кезінде гелде активтілікті айқындау үшін НАД қажет етпейтін
фермент аймағын анықтаған. Өкінішке орай бұл тәжірибе басқа зерттеушілер
жағынандұрыс көңіл аударылмауына байланысты ары қарай тәжірибе қойылы,
дамытылмай қалды.
Зерттеулер жасау негізінде, біз глютаматтың қайтымсыз ыдырауны жүзеге
асыратын ферменттің жаңа түрін анықтадық. Жаңадан ашылған ферменттің түрі
жақсы зертелген глютаматдегидрогеназадан физико химиялық жағынан
ерекшеленеді. Сол арқылы өсімдік органиімінде әсер ету механизімін ашуға
мүмкіндік берді.
МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің өсімдіктің метоболиттік процестеріне
атқаратын үлкен ролін ескере отырып, өсімдіктердің тұзға төзімділігін осы
ферменттің активтілігінің өзгеруімен анықтауға болатындығы дәлелденді 7.
1.1.1. ГДГ-ның глютамат айналымындағы маңызы.
М.Ә.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының
ферменттердің құрылымы және реттелуі лабораториясында глютаматтың айналымы
және оның айналымына қатысатын негізгі белсенді ферменттер жөнінде ондаған
жылдар бойы зерттеу жұмыстарын жүргізу үстінде бұл лабораторияның ең үлкен
жетісіктерінің бірі болып жоғарғы сатыдағы өсімдіктерде минералды азоттың
сіңірілу реакциясын атқаратын НАДФ спецификалық ГДГ–ны алғаш рет бидай
дәніне тәжірибе жүргізу нәтижесінде спецификалық субклеткалық құрлымда,
шамамен 1мкм мөлшерлі және 1,07-1,1 гсм3 жылжымалы тығыздықты –сферасомада
анықталды. Сферасома тек бір ғана белоктан – ГДГ-дан, және бір ғана
липидтен- фосфотидилинозидтен тұратыны анықталынды 8. Бидай дәніндегі
глютаматдегидрогеназа кофермент ретінде тек НАД-ты ғана спецификалығын
таныта алады. Бұл ГДГ аммони иондарына күшті сезімтал фосфорланған фермент
түріне жататыны бекітілді. ГДГ өнімінің қалыптасу кезеңіндегі
бейорганикалық азоттың қақпаға түсу қызметін атқарады. НАДФ-ГДГ активтенуі
цитокининнің бақылауымен жүреді 8. Бірақта бидай дәнінің ұрықсыз бөлігіне
әсер еткенде НАДФ-ГДГ-ның активтілігі байқалмаған. Осыған орай цитокининді
ұрықтық бөлімге әсер еткенімізде НАДФ-ГДГ активтенген, яғни,цитокинин
ұрықтық бөлімінде екіншілік гормон- цитокинин медиаторды түзген, ол алейрон
қабатындағы НАДФ-ГДГ-ны активтейді 9.
Өсімдіктерде аммонидің ассимиляциянуының негізгі жолы
глютаматдегидрогеназа ферментінің қатысуымен а-кетоглутар қышқылының
тотықсызданып аминденуінен, глютамин қышқылының пайда болу реакциялары
болып есептелінеді 10.
Реакцияның бірінші сатысында субстраттың байланысуынан имин қышқылы
пайда болып, екінші сатысында оның тотықсыздануынан НАДФН-тың қатысуымен,
глутамин қышқылы түзіледі.
Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) барлық өсімдіктердің жапырақтарымен
тамырларында болатын фермент. Ол негізінен митахондрияларда, цитоплазма
матриксінде, хлоропластарда да кездеседі.
1974 жылы Р.Ли және Б.Мифли аммонидің ассимиляциялануының екі реакция
арқылы жүзеге асатын негізгі жолы ашты. Ол реакцияның біреуі
глютаминсинтетаза (ГС), екіншісі глютаматсинтетаза (ГТС) ферменттерімен
катализденеді 11.
Сонымен клеткаларда глютамин қышқылымен қатар аминді глутамин де пайда
болады. Глютаминсинтетаза глютамин қышқылы аммиакты қабылдап алып глютамин
амидті синтезделінетін реакцияны катализдейді.
Бұл реакцияның жүруіне АТФ қажет. Глютаматсинтетаза болса глютаминнің
амид тобын а-кетоглутар қышқылына ауыстырып, ферредоксиннің қатысуымен,
глутамин қышқылының екі молекуласы пайда болатын реакцияны катализдейді.
Өсімдікке енген аммиак а-кетоглутар қышқылынан басқа да органикалық
қышқылдарға байланысып, тиісті ферменттердің қатысуымен алғашқы амин
қышқылдардан түзіледі. Олардың қатарына қымыздық, сірке, пирожүзім,
глиоксил және т.б. қышқылдар жатады. Олардың тотықсызданып аминдену
(трансаминдену) нәтижесінде, тиісінше аспарагин, серин, глицин амин
қышқылдары синтезделінеді.
Глютамин қышқылының амин тобының трансаминдену арқылы басқа қышқылдарға
ауыса алатындығы А.Е.Браунштейн жіне М.Г.Крицман зерттеулері нәтижесінде
анықталды. Бұл реакцияны катализдейтін ферменттер аминотрансферазалар деп
аталады. Мысалы ретінде глутамин қышқылының пайда болуын келтіруге болады
12.
Өсімдіктер аммонимен өте қамтамассыз етілгенде олардың ұлпаларында
глутамин және аспарагин сияқты амидтер жиналады 13.
Жаңа ферменттік әдістәің ашылуы суқоймаларының антропогендік ластануының
экологиялық маниторингі бола алады. Одан басқа бұл әдіс клиникалық
биохимияда организімнің патологиялық күйін анықтау үшін-бауыр және бүйрек
ауруларын, қандағы және зәрдегі аммиак деңгейін анықтау арқылы қолданылады
14. Лабораториямен аз зерттелген өсімдік клеткаларының органелласы
сферасоманы ашуға қол жеткізді.
Қолданылған фермент номенклатурасы бойынша окси-ферментке арнайылығына
қарай глютаматдегидрогеназаның үш түрі бар:
1. НАД- қа арнайы ГДГ (1.4.1.2.);
2. НАД-қа да, НАДФ-қа да активтілігін бірдей көрсететіy
ГДГ(1.4.1.3.);
3. НАДФ- қа арнайы ГДГ.
Жоғары сатыдағы өсімдіктерде глютаматдегидрогеназаның бірінші және
екінші формалары табылған 15.
Сривастава, Зигн өздерінің еңбектерінде глютаматдегидрогеназаның
активтілік орталығында ерекше байланысқан SH тобы бар екенін, 6 немесе 4
суббөліктен тұратыны, молекулалық салмағы 280-нен 270 кДа-ға дейін
болатынын және метал иондарына ассоцирленетіні көрсетілген. ГДГ-ның кейбір
изоферменттері қоршаған орта күйіне және минеральды қоректенуіне қарай
индуцирленеді. ГДГ-ның активтілік деңгейі көптеген факторларға тәуелді:
жасқа, жарыққа, қараңқылық режимге, бейорганикалық және органикалық азотқа,
көмірсудың энергетикалық күйіне, өсу реттеліміне және басқа да факторларға.
Фермент қараңғылықта ашығу, жоғарғы температура, тұздануда, суға стрестік
жағдай, қоршаған ортаның ластануында және тағы басқа стрестік жағдайларға
шалдыққан кезде азоттың сіңірілуіне өте қажет. Жоғарғы сатыдағы
өсімдіктердегі ГДГ-ға жүргізілген барлық зерттеулер біздің көзқарасымыз
бойынша НАД ГДГ-ны зерттеуге негізделген 16.
Әсіресе неміс ғалымы Полих горох тамырындағы осы ферментті ұзақ жылдар
бойы бар күшін салып зерттеді. Полих алғаш рет гомогендіферментті алып,
оған сипаттама берді. НАДФ ГДГ ның электрофоретикалық формалары болып
саналады. Нуклеатидтер тізбегі осы ферменттердің ретелімі болып
табылатынның айты 17. Шатиловтың басқарылуымен жүретін зерттеу тобы ГДГ-
ны зерттеуге үлкен күш жұмсады. Бұлармен ГДГ реакциясының катализінің
механизімі бөлім-бөлімімен зерттелінді. Ферментке каталитикалық түрлі
агенттердің әсері, ГДГ-ң активті орталығындағы амин қышқылдардың қалдығының
ролі, ГДГ-ң синтезделіну механзімі зерттелінді. Иондар мен супстраттың
ажырататын арнайылығы бойынша әсер етеді 18.
1.1.2. Өсімдіктердің МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігін, физико-
химиялық қасиеттерін және реттелуін зерттеу
Глютамат өсімдіктерде барлық амин қышқылдарының арасында ең маңызды
амин қышқылы болып табылады. Глютамин қышқылының азот айналымындағы маңызды
және орталық амин қышқылы екендігі жалпыға мәлім. Сондықтан жоғары сатыдағы
өсімдіктердегі глютамат айналымының негізгі жолдарын зерттеу үлкен ғылыми
қызығушылық тудырыды. Осы кезге дейін жоғары сатыдағы глютаматтың
ыдырауының жалғыз ғана жолы белгілі болатын. Осы глютаматдегидрогеназа
(ГДГ) арқылы глютаматты тотықтыру жолы. Осы ГДГ арқылы жүрген реакциясының
нәтижесінде аммиак бөлінеді. Бөлінген аммиак клетка менбраналарына зақым
келтіреді. Осыған орай өсімдіктерде глютаматты ыдытататын басқа зиансыз
жолы бар – жоқ сұрақты туғызады. Яғни глютаматты ыдырататын осындай зиянсыз
жолды Қазақстандық ғалымдар тапқан 19.
Ол М.Ә.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының
ферменттердің құрылымы және реттелуі лабораториясында глютаматты ыдырататын
малатдегидрогеназа және глютаматоксалоацетаттрансфераза ферменттерінен
құралған жаңа ферменттік комплекс бидай өсімдігінен табылған. Ол МДГ-ГОАТ
жолы. Бұл ферменттік комплекс мынадай реакциялар реттілігін жүзеге асырады.
Бірінші атқаратын реакциясы малатдегидрогеназасы арқылы алма қышқылы
кофермент НАД қатысуымен қымыздық сірке қышқылына дейін тотығады және осы
кезде НАД коферменті НАДН-қа дейін тотықсызданады. Содан кейін
глютаматоксалоацетаттрансфераза қысылуымен оксалоацетат глютаматпен
трансаминизациялық реакцияға түседі. Осы реакция нәтижесінде глютамат 2-
оксоглютаратқа, ал оксалоацетат аспартатқа айналады 20. Қорыта айтқанда,
МДГ-ГОАТ реакциясының нәтижелерінде глютаматпен малат НАД арқылы
оксоглютарат, аспартат және НАДН-қа айналады. Ферменттік комплексті
зерттегенде глютамат катаболизмінің 95%-ке жуығы ферметтік комплекс арқылы
жүретіндігі анықталды. Ал ГДГ тек қана 5% глютамат катаболизмін атқарады.
Сондықтан МДГ-ГОАТ глютамат ыдырауының негізгі жолдарын атқаратыны
дәлелденді. Бірақ, бұл ферменттік комплекс тек бидай дәнінде анықталған
21. Сол себептен жаңа ферменттік комплекстік қасиеттерін басқа
өсімдіктерде зерттеудің маңыздылығы сөссіз. Осыған байланысты ғылыми
зерттеу жұмысымыздың мақсаты эвалюциялық әр сатыда тұрған өсімдіктерде МДГ-
ГОАТ активтілігін анықтау және оның қасиеттерін, реттеуін зерттеу болды.
Осы мақсатқа жету үшін мынандай міндеттемелер қойылды:
1. Әр тұқымдас өсімдіктерде МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
активтілігін анықтау.
2. Ферменттік комплексті тазартып, қасиеттерін зерттеу.
3. МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің реттелуін зерттеу.
Осы міндеттемелерді шешу үшін қазіргі заманға сай мынадай әдістерді
қолдандық: гель-хроматографиясы, ДЕ-52 ион алмасу хроматографиясы,
спектрофотометриялық әдіс арқылы МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
активтілігін және протейн мәлшерін анықтадық.
Осы жұмысты атқарғанда келесі нәтижелерге жеттік:
Эвалюцияда әр тұрған әсімдіктерді МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
эвалюцияныңсоңғы сатыларында пайда болатындығы дәлелденді 22. Мысалы,
өсімдіктердің ең төменгі сатыда тұрған балдырлар, саңырауқұлақтар, қыналар,
мүктер, қырықбуындылар, папротниктер, плаундар біз МДГ-ГОАТ активтілігін
таба алмадық. Жалаңаш тұқымды өсімдіктердің өкілдерінде – шырша, қарағай,
арша және туяда МДГ-ГОАТ-тің активтілігі байқалмады. Жер бетіндегі ең
алғашқы гүлді өсімдіктердің бірі болып табылатын-лалагүлдерде, сонымен
қатар құрамындада МДГ-ГОАТ активтілігі жоқ екендігін байқадық 23.
Эволюцияда әр сатыда тұрған өсімдіктерді МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
активтілігін зерттегенде осы комплекстің эволюциясының соңғы сатыларында
пайда болатындығы дәлелденді. Мысалы әсімдіктерден ең төменгі сатыда
тұратын балдырлар; саңырауқұлақтар; қыналар; мүктер және т.б. Біз МДГ-ГОАТ
таба алмадық. Жер бетіндегі ең алғашқы гүлді өсімдіктердің бірі болып
табылатын-лалагүлдерде де МДГ-ГОАТ активтілігі табылмаған. Тек қана
раушангүлділер тұқымдасының өкілдерінен табылған. Ал әрі қарай эволюция
бойынша өсімдіктер сатылары жоғарылай бере, МДГ-ГОАТ активтілігі де
жоғарылай береді. Ең жоғары МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігі
асқабақ тұқымдастары мен астық тұқымдастарында табылды.
Сонымен осы алынған мәліметтер бойынша ферменттік комплекс тек кейінен
пайда болғаны және эвалюйиялық тұрғыдан жас өсімдіктердің тұқымдарына тән
екендігі анықталды 24.
Екінші міндеттемені орындағанда біз ДЕАЕ-52 ион алмасу
хромотографиясын және сефароза 6В гель-хроматографиясын қолданып МДГ-ГОАТ-
ты тазарттық. Тазартылған ферменттік комплекстің кейбір физико-химиялық
қасиеттерін зерттедік 25.
Молекулалық массасын анықтау үшін сефакрил S300 колонкасы арқылы гель-
хроматография әдісін жүргіздік. Ферменттік комплекстің молекулалық массасы
110 кДа-тең болды. Ферменттік компекстің РН оптимумы 7,7 МДГ-ГОАТ
ферменттік комплексінің температура оптимумы 45 26.
Тазартылған МДГ-ГОАТ қасиеттерін зерттегенде біз оның реттелуін де
зерттедік. Алғаш рет аспартаттың МДГ-ГОАТ ферменттік комплекс реакциясының
өнімі болып табылады және сол МДГ-ГОАТ –қа теріс реттегіш болып келеді.
Аспартаттың теріс реттегіш болуының үлкен физиологиялық мағынасы бар. Ол
артық аспартат түзуіне апарады бұл клетканың үнемділік принципіне жатады.
Себебі клетка ешқашан заттарды өз қажеттілігінен артық түзілдірмейді.
Сонымен алғаш рет МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің эволюциялық тұрғыдан
кейін пайда болған өсімдіктерге тән екендігі анықталынды. Тазартылып
алынған ферменттік комплекстің молекулалық массасы ;рн оптимумы және
температура оптимумы зерттелініп анықталынды.
Көптеген зерттеушілердің жұмыстары өсімдіктің иондық стресс факторларын
зерттеуге арналған. Иондық стресс жағдайында көп аммиак түзіледі де ол
өсімдіктің улануына әкеледі. Осы жағдайға қарай көптеген өсімдіктің
линияларынан жоғары ферменттік комплекс активтілігі байқалса, өсімдіктің
иондық стреске төзімділігі жоғары болады. Себебі глютамат ыдырағанда аммиак
түзілмейді және төзімсіз сорттарынан иондық стрестің әсерін байқау үшін
[МДГ-ГОАТ] активтілігін зерттеуге тура кеді 27.
Глютамат азот деңгейі көптеген факторларға байланысты: өсімдіктің
жасына, жарықты, қараңғы режимдерге, бейорганикалық және органикалық
азотқа, көмірсулар көзіне, энергетикалық, және басқада факторларға тәуелді
болады.
Байқауымызша ферменттің өсімдіктердің азотты сіңіруінде стресс
жағдайында қажеттілігі артады, мысалы: қоршаған ортаның ластануы т.б.
стресті жағдайларда фермент маңызды. Астық дақылдары және
бұршақтұқымдастардың ГДГ-сын терең әрі жан-жақты етіп зерттеген Гильманов
М.К. және оның шәкіріттері 27.
Жоғары сатыдағы өсімдіктердің глютаматдегидрогеназасы жөнінде
көптеген зерттеулер жүргізілгенмен, өте көп нәрсе түсініксіз болып отыр.
Біріншіден глютаматдегидрогеназаның басқа түрлерінің болуы туралы сұрақ
туады. Бұл бағытта қызықты жұмыстарды голланд зерттеуші Bredemeіjer (1977
ж) жүргізген. Оның еңбегінде глютаматдегидрогеназаның латентті формаларының
бидай тозаңқабында бар екендігі анықталған, бірақ бұл
глютаматдегидрогеназаның түрі бөлініп сипатталған жоқ. Белгісіз себептерге
байланысты Bredemeіjer бұл зерттеуін одан әрі дамытқан жоқ.
Қазіргі кезде жоғары сатыдағы өсімдіктердің глютаматдегидрогеназасы
бойынша көп мәліметтер бар. Онда олардың қасиеттері және таралуы
сипатталған. Біз осы фермент туралы негізгі мәліметтерді келтіре отырып,
оның реттелу аспектісіне аса назар аударамыз. Әдеби мәліметтер бойынша
барлық зерттеушілер негізнен НАД(Ф)-ГДГ-ны зерттеген. Әсіресе осы ферментті
мақсатты түрде неміс ғалымы Палих бұршақ тамырынан зерттеген. Ол алғаш рет
гомогенді фермент алды. Оның айтуынша НАД(Ф)-ГДГ-ның электрофоретикалық
формалары конформер және изофермент емес. Оның көрсетуінше бірқатар
нуклеотидтер осы ферменттердің регуляторлары болып табылады. Сонымен қатар
Шатилов жетекшілігімен глютаматдегидрогеназаның зерттелуіне үлкен үлес
қосты. Олар ферменттің каталитикалық қасиетімен амин қышқылды қалдықтардың
активті орталықтарындағы ролін ашты. Глютаматдегидрогеназаның синтезінің
механизмдері зерттелген, олар ион және субстрат әсеріне өзіндік
мамандануына байланысты ерекшеленеді.
Гильманов М.К және оның шәкірттері (1975,1978, 1984, 1989). Олар ГДГ-
реакцияларының катализдік механизмін толық зерттеп, әртүрлі агенттердің
каталитикалық қасиеттеріне әсерін, ГДГ-ның активті орталықтарындағы
аминқышқылдар қалдықтарының ролін анықтаған. Ион және субстраттар әсерінен
глютаматдегидрогеназаның синтезінде өзіндік спецификалығы көп ерекшеленетін
механизмдер зерттелінген.
L-оксоглютарат қышқылы энергетика және жоғарғы сатыдағы өсімдіктердегі
оксоқышқылдардың алмасуында маңызды орын алады және де Кребс циклінің
негізгі қатысушы компоненті болып табылады 28.
Глютаматдегидрогеназа зат алмасуда негізгі орын алады және азот пен
энергия алмасуын байланыстырушы звено болып табылады.
Қазіргі кезде жоғары сатыдағы өсімдіктердегі глютаматдегидрогеназаның
негізгі физика-химиялық қасиеттерін зерттеу белсенді жүргізілуде.
Глютаматдегидрогеназа жоғары сатыдағы өсімдіктерде барлық уақытта НАД және
НАДН2 кофермент ретінде мамандалады. Сонымен қатар жоғары сатыдағы
өсімідктердегі глютаматдегидрогеназа НАДН2 мен бірге белгілі бір
белсенділікті көрсетеді. Оны ең бірінші болып Яковлева қатарластарымен
бірге көрсеткен. Көптеген авторлардың мәліметтері бойынша ферменттің осы
кофермент пен активтілігі НАДН2 бірге көрсететін белсенділігінен 10 есе
төмен. Сондай-ақ кейбір зертеушілер НАД(Ф)Н2 мен глютаматдегидрогеназаның
активтілігі жоғары екенін вики өсімдігінің хлоропластарынан көрсетеді. Kіrk
глютамат алмасуының сапалық деректерін негізге ала отырып, өсімдіктердің
әртүрлі стресс жағдайларына төзімділігіне биохимиялық тұрғыда баға берген.
Қазіргі күні де глютаматтың ыдырау жолдары онша жақсы зерттелмеген.
Тыныс алу процесінде көп ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Биология факультеті
Биотехнология, биохимия, өсімдіктер физиология кафедрасы
БІТІРУ ЖҰМЫСЫ
ГЛЮТАМАТТЫҢ АЛМАСУЫНДАҒЫ НЕГІЗГІ БЕЛСЕНДІ ФЕРМЕНТКЕ ЦИТОКИНИН МЕДИАТОРЫНЫҢ
ӘСЕРІ
Орындаған: _________________________________Ал ашбаева Л.Ж.
(қолы, күні)
Ғылыми жетекшілері:
ҚР ҰҒА-ның академигі ________________________ Гильманов М.Қ.
(қолы, күні)
б.ғ.к., доцент_____________________________ _____Джокебаева С.Ә.
(қолы, күні)
Норма бақылаушы:
Акимбекова А.Б.
(қолы, күні)
Қорғауға жіберілді:
Кафедра меңгерушісі,
б.ғ.д., профессор _____________________________ Иващенко А.Т.
(қолы, күні)
Алматы, 2008
РЕФЕРАТ
Бітіру жұмысы: 32-беттен, 35-әдебиеттен, 1-кесте, 7-суреттен тұрады.
Бітіру жұмысы Алашбаева Лилия Жанабаевнаның М. А. Айтхожин атындағы
биохимия және молекулальқ биология институтыньң ферменттердің құрылымы мен
реттелу лабораториясы мен ҚазҰУ-дың биология факультетінің биотехнология,
биохимия және өсімдіктер физиологиясы кафедрасында өткізілді.
Өзектілігі: Глютамат айналымындағы негізгі белсенді фермент-ГДГ-ның
биохимиялық қасиеттерін анықтап, оларға цитокинин медиаторының әсерін
зерттеу және ферменттердің белсенділігін арттырып, ауылшаруашылығы
дақылдарының өнімділігін аттырады.
Негізгі сөздер: бидай дәні, ұрық бөлігі, алейрон қабаты, НАДФ-
глютаматдегидрогеназа, глутамат, цитокинин, цитокинин медиаторы
Алдына қойылған мақсаты: Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің
биохимиялық қасиеттерін анықтау және оларға цитокинин медиаторының әcepi
мен оның физиологиялық, биохимиялық қасиеттерін сипаттап, биотехнологияда
қолдану жолдарын қарастыру.
Зерттеу барысында: Жүргізілген зерттеу тәжірибелерімде бидай
дәндерінің үш түрлі сортын (Қазақстан-10, Арай, Дауыл) алдым. Себебі басқа
дәнді дақылдармен салыстырғанда, бұларда глутамин қышқылының айналымы
анығырақ жүреді, әрі глютаматдегидрогеназаның активтілігі жоғары. Бидай
дәнінен цитокинин медиаторын, сферасоманы бөліп алуды үйрендім. Бөліп
алынған цитокинин медиаторын глютамат айналымындағы негізгі ферменттерге
әсер ете отырып, оның белсенділігін, биохимиялық қасиеттерін анықтадым.
Қолданылған әдістер: Октил сефароза (CL-4B) гидрофобты хроматографиясы
жэне RP-18 колонкада жасалынатын жоғары кысымды кepi фазалы хроматография,
гомогенизациялау, центрифугалау.
МАЗМҰНЫ
Қысқартылған терминдер ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 4
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 5
1.Әдебиетке шолу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 6
1.1.Глютамат айналымы және оған қатысатын негізгі ферменттер ... ... ... ... 6
1.1.1 ГДГ-ның глютамат айналымындағы маңызы ... ... ... ... ... ... ... ... .. 10
1.1.2 МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігін, физико-химиялық 13
қасиеттерін және реттелін
зерттеу ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... ...
1.2 Цитокининді байланыстырушы белоктар және 17
цитокинин медиаторы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ...
1.3 Өсімдік клеткаларындағы гормональды сигнальды трансдукцияның іске 18
асырылуы ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .
2.Тәжірибелік 21
бөлім ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... ... ... ... ... ... ..
2.1. Зерттеу материалдар 21
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
...
2.2.Зерттеу әдістері 21
... ... ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
... ... ...
3. Алынған нәтижелер және оларды 23
талдау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
3.1 НАДФ-ГДГ ферментінің активтілігін анықтайтын әдіс ... ... ... ... .. 25
Қорытынды ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . 29
Пайдаланған әдебиеттер тізімі ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. 30
ҚЫСҚАРТЫЛҒАН ТЕРМИНДЕР
АТФ – аденозин трифосфат
ГДГ – глютаматдегидрогеназа
ДНҚ – дезоксирибонуклеин қышқылы
РНҚ – рибонуклеин қышқылы
МДГ – малатдегидрогеназа
[МДГ+ГОАТ] – малатдегидрогеназа глутаматоксалоацетатамино трансфераза
МСГ-1 – сигналды гормон медиаторы
ФК – ферменттік комплекс
НАД-ГДГ – никотинаминадениндинуклеотид – глютаматдегирогеназа
НАД(Ф)-ГДГ–никотинамидадениндинукле отидфосфат-глютаматдегидрогеназа
НАДН2 – тотықсызданған никотинамидадениндинуклеотид
ҚСҚ – қымыздық сірке қышқылы
Трис – 2 амино –2 (гидроксиметил) – 1,3-пропиондиол.
КІРІСПЕ
Әрбір өсімдіктің физиологиялық қалпы оларда жүретін биохимиялық
процесстердің қарқындылығымен сипатталады. Өсімдік клеткасының
метаболизмінде ең маңызды орын алатын – глутаматтың алмасу процестері. Осы
амин қышқылының алмасуы негізінен азоттың, көмірсулардың және энергетикалық
процестердің қиылысу нүктесі болып табылады. Сол себептен қандай да
болмасын стресс глутамат алмасуына зиян келтірсе, бүкіл өсімдіктің өсу және
даму процестері тежеледі.
Глутаматтың алмасуы түрлі белсенді ферменттердің қатысуымен жүретіні
белгілі. Осы амин қышқылының алмасуының негізгі жолы ГДГ- мен глутаматтың
ыдырау жолы М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия
институтының ферменттердің құрылымы мен реттелуі лабораториясында алғаш рет
ашылды.
Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің активтенуі белгілі бір
сигналдық трансдукция механизімімен іске асады. Сигналды трансдукция
механизімін зерттеу қзіргі кздегі биологияның ең өзекті мәселелерінің бірі.
Трансдукция дегеніміз-сигналдың сигналға қатарымен берілуі. Трансдукцияның
өзіндік ерекшеліктері бар. Трансдукция сигналды эстафета тәріздес өткізеді,
басқаша айтқанда жоғары сигнал тек қана көршіге әсер етеді. Сигналды
трансдукция механизімінде медиатордың ролі өте жоғары. Осы клеткадағы
сигналды трансдукцияда маңызды рол атқаратындығы анықталынды. Медиатор
екінші сатыдағы сигналды беретін зат. Себебі гормон тікелей өзі емес
медиаторлар арқылы клеткаға әсер ете алады. Сол себептен цитокинин
медиаторын зерттеу ғалымдардың қызығушылығын тудырады. Себебі осы цитокинин
медиаторы клетка ішіндегі мембранамен байланысқан фементтерге әсері өте
жоғары. Инозиттік сигналдың клеткадағы берілуінің малекулалық механизімі
жақсы зерттелген, бірақ оның субклеткалық аспектілері толық зерттелмеген.
Осылайша субклеткалы ранеллалардың инозитті сигналдық трансдукция процесіне
қатысатыны әлі толық белгілі емес 1.
М.А.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтында
cубклеткалық органелла-сферосома, липидтің тек бір түрі
–фосфатидилинозиттен және глютаматдегидрогеназа деген бірғана ферменттен
тұратыны белгілі болған 2.
Бұл жұмыстың мақсаты: Глютамат айналымындағы негізгі ферменттердің
биохимиялық қасиеттерін анықтау және оларға цитокинин медиаторының әcepi
мен оның физиологиялық, биохимиялық қасиеттерін сипаттап, биотехнологияда
қолдану жолдарын қарастыру.
Осы мақсатқа жету үшін алға қойылған міндеттер:
1. Цитокинин медиаторын бөліп алу;
2. Бөліп алынған цитокинин медиаторын глютамат айналымындағы
негізгі ферментке - ГДГ-ға әсерін
қарастыру;
3. ГДГ-ның белсенділігін анықтап, олардың клетка ішіндегі ролін
зерттеу;
4. Клетка ішілік сигналдық трансдукцияның субклкткалық аспектілерін
зерттеу;
1. ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ
1.1. Глютамат айналымы және оған қатысатын негізгі ферменттер
Белоктар өздерінің көп түрлілігі және атқаратын қызметтерінің
маңыздылығына байланысты тірі организмдерде елеулі рол атқарады. Қалыптасып
келе жатқан өскіндерді кейін белок синтезі үшін қолданылатын азот айналымы
өнімдерімен қамтамассыз ету қорлық белоктардың гидролизі нәтижесінде пайда
болатын амин қышқылдары мен амидтердің кей жағдайда пептидтердің көмегімен
жүзеге асады. Қазіргі кезде астық тұқымдастардың проламиндер мен
глютелиндердің қорға жиналатындығына еш күмән келтірілмейді. Олар
эндосперімде жинақталған.
Барлық белоктардың түріне тән ерекшелік – олардың құрамында глютамин
қышқылының қалдығының біраз мөлшерінің болуы. Астық тұқымдастардың
дәніндегі проламиндерде глютамин қышқылының мөлшері орташа есеппен 100г
белоктың ішінде тарыда 13,7г, ал бидайда 43,3г дейінгі аралықта болады, ал
амега проламиндер фракцияларында белоктың құрғақ салмағына есптегенде 53,2%-
ін глютамин қышқылы құрайды. Бидайдың глютениндегі оның мөлшері 37%-ке жуық
болады. Қорлық белоктың құрамындағы, әсіресе бидайдағы глиадинде глютамин
қышқылы қалдықтарының көпшілігі амидтенген. Үпілмәліктен алынған альбумин
фракциясының құрамында глютамин қышқылының мөлшері жоғары (30 моль %- ке
дейін) болған. Ол пісіп жетілу кезінде жинақталып, өскін өсуі кезінде тез
жұмсалған. Соның негізінде ол бірінші тез мобилденетін белок резервісі
болып табылады деген қорытынды жасалған. Тұқымдардағы қорлық белоктарда
глютамин қышқылдарының мөлшерінің жоғары болуы немен байланысты болады
деген сұрақ туады? Бұның ең дұрыс шындыққа жақын жауабы, осы амин қышқылы
тұқымының енуі кезіндегі метоболиттік процестердің тез жүруіне ерекше
маңызды роль атқаратындығында деп түсіндіріледі.
Бидай дәнінде глутамин мөлшерінің көп екені белгілі, себебі бидайдың қор
ретінде жиналатын белоктарының құрамында глутамин және оның туындысы -
пролиннің жалпы мөлшері 60%-дан астам болса, басқа амин қышқылдары 35-38%-
ын ғана құрайды 3. Өсімдіктердің метаблизімінде ең маңызды рол атқаратын
глютамат алмасу процесі. Глютамат өсімдіктерде барлық амин қышқылдарының
арасында ең маңызды және орталық амин қышқылы екендігі жалпыға мәлім 4.
Сондықтан жоғары сатыдағы өсімдіктердегі глютамат айналымының негізгі
жолдарын үлкен қызығушылық тудырды. М.Ә.Айтхожин атындағы молекулалық
биология және биохимия институтының ферменттердің құрылымы және реттелуі
лабораториясында ондаған жылдар бойы осы айналымындағы амин қышқылдарының,
яғни, глютамат айналымының ферменттік механизімін зерттеу үстінде. Бұнда
минералдық азоттың сіңіру реакциясын атқаратын НАДФ спецификалық ГДГ
анықталғаннан бастап жоғары сатыдағы қсімдіктердегі гютаматтың ыдырауының
жалғыз ғана жолы белгілі болатын. Ол глютаматдегидрогеназа (ГДГ) арқылы
глютаматты тотықтыру жолы. Метоболиттік процес күшейген кезде бұл амид
глютамин қышқылына айналады, ол айналымында маңызды роль атқарады. Глютамат
өсімдік өсуі үшін өте қажетті НАДН және 2-оксоглютарат субстраттарының
негізгі көзі ретінде қызмет етеді. Глютамин қышқылымен тотығып дезаминденуі
глтаматдегидрогеназа ферментінің қатысуымен жүзеге асады, нәтижесінде
оксоглютарат түзіледі. Метоболизімнің осы сатысында клетканың азотпен қуат
алмасуының негізгі жолдарын туғызады. Яғни, глутамат алмасуының сапалы
деректерін негізге ала отырып, өсімдіктердің әртүрлі стресс жағдайларына
төзімділігіне биохимиялық баға беруге болады 5. Осы бағытта Гильманов
М.К. басқаруымен глютаматтың қайтымсыз ыдырау нәтижесінде маңызды
метоболиттер – L-кетоглутарат, аспартат, НАДН түзілетін реакцияны жүзеге
асыратын МДГ-ГОАТ комплексті ферментті зерттеуде. Бұл фермен ттік комплекс
мынадай реакциялар реттілігін жүзеге асырады. Бірінші атқаратын реакциясы
малатдегидрогеназа арқылы алма қышқылы кофермент НАД қатысуымен қымыздық
сірке қышқылына дейін тотығады және осы кезде НАД коферменті НАДН-қа дейін
тотықсызданады. Содан кейін глютаматоксалоацетаттрансферза қатысуымен
оксалоацетат глютаматпен трансаминизациялық реакцияға түседі. Осы реакция
нәтижесінде глютамат 2-оксалоглютаратқа, ал оксалоацетат аспартатқа
айналады. өсімдіктердің өнуі мен өсуі процестерінде тұздың әсерінен туатын
өзгерістердің болуын осы ферменттік комплекс арқылы сипаттауға болады,
яғни, комплексті ферменттің активтілігімен өсімдіктердің өмір сүруге
қабілеттілігі, әртүрлі факторларға төтеп беруі, тіпті иондық қызметтерінің
арасында байланыстық болуы мүмкін 6.
Глютамин азоттың минералдық формаларымен қатар, өсімдіктерде азоттың
тасымалданушы формасы болып табылады және де пісіп келе жатқан тұқымдарға
келіп түсетін осы элементтің негізгі бөлігін құрайды. Сонымен қатар
өсімдіктің өсуінде де органикалық азоттың тасымалдануында оның елеулі оль
атқаруы мүмкін. Бидайдың жапырақтарына радиоктивті С глютаматты ендірген,
мынадай маин қышқылдары, органикалық қышқылдар СО және қант фосфаттары
сияқты радиоактивті құраған. Глютамат және глютамин фототыныс алу кезінде
түзілетін аммонидің реассимиляциясына жауап беретін ГОГАТ цикілге тікелей
қосылатын екі қосылыс.
Сонымен, глютамин және глютамин қышқылы арқылы азоттың әртүрлі
өсімдіктерге тән өзіндік бағыттағы көмірсу алмасуын қарқынды өндіретін
көміртегі ізашарлармен түйісуі жүреді. Тек осы амин қышқылдарының алмасуы
арқылы көмірсу және азот алмасуы арасында өзара қарым қатынас болады.
Сонымен қатар глютамин қышқылы және глютаминнің қатысуымен жүретін
реакциялар амин қышқылдарының синтезі мен катаболизімін трансаминдік
реакциялармен үйлестіру жолымен бір жерде шоғырландыруға мүмкіндік береді.
Нәтижесінде протеингенді амин қышқылдарының әрбіреуінде дегидрогеназалары
болатындығындай эффект береді.
Әртүрлі амин қышқылдарынан транс аминазалар көмегімен жинақталған амин
топтары соңында L-глтамин қышқылының а-топтарына айналады, ал ол
глютаматдегидрогеназа ферментінің әсерінен тотыға дезаминденеді. Бұл
ферменттің бидай дәнінен анықталуына 50 жылдан астам уақыт өтті.
Глютаматдегидрогеназа 2-оксоглютар және глютамин қышқылдарының өзара бір
біріне айналуын катализдейді, сол кезде аммони неорганикалық азот және а-
аминдік азоттың өзара бір - бірімен айналуы қатар жүреді.
Глютаматдегидрогеназа жануарларда, өсімдіктерде және микроорганизмдерде ең
көп тараған ферменттердің бірі болып саналады. Қазіргі кезде бұл ферменттің
кездеспейтін организм жоқ дерлік.
Көптеген зерттеулер арқылы ферменттің активтілігі митохондрия
бөлшектерінің фракцияларымен байланысты ғана емес, көбінесе сол жерде
жинақталатындығы көрсетілген. Бұршақтың өскіндеріндегі митахондрияларында
ГДГ-ның клеткадағы 70%-ке дейінгі барлық активтілігі анықталған. ГДГ
аспартаттрансаминаза және малатдегидрогеназа секілді, митахондриялардың
мембраналарында емес, матриксте шоғырланатындығы анықталды.
Митахондрияға тән өзіндік қасиеті, ол глютаматтың тотығуы парацесіне
активті түрде қатысады. Соның нәтижесінде, ондағы ГДГ тек аминденуші
бағытта ғана емес, сонымен қатар дезаминденуші бағытта да активті болады
және ГДГ-ның осы қызметтерін зерттеу жаңаша ерекше қызыметтерін тудырады.
Осы мақсатпен бұршақтың өскіндерінің гипокотильдеріндегі митахондрияларында
зерттеулер жүргізілді. Митахондрияда болған немесе жаңадан түзілетін
әртүрлі субстраттар, сонымен бірге Кребс цикылының қышқылдары да
концентрцияларына байланысты аминденуші немесе дезаминденуші бағыттарында
ГДГ активтілігін аса реттегіш болып табылады. Кребс цикылының субстраттары
( цитрат, изоцитрат, фумарат, сукцинат) төменгі концентрацияда дезаминдену
активтілігін, ал жоғарғы концентрацияда 2-оксоглютараттың а-амтиндену
тежеген. Амин қышқылдары және амидтер ( аспартат, аспарагин, глютамин,
аланин ) глютаматтың дезаминденуін тежеген, аминденуіне еш әсер етпеген.
Митахондриядағы НАДН төменгі концентрацияда ГДГның дезаминденуші
активтілігін тежеген.
Дэй және басқада авторлар сояның жапырағы мен тұқым жарнағындағы
митахондрияларындағы глютаматтың тотығуын зерттеген. Тұқым жарнағындағының
пайда болған кезінен бастап (4-5 тәуілік) және 24-күндік кезіне дейін тұқым
жарнақтары мен жапырақтарындағы ГДГ ның тотықтырғыш активтілігін
тазартылған митахондриялардан анықтаған. Глютаматтың тотығуы реакциясын О
тұтынуына байланысты болған. Сояның тұқым жарнақтарының оқшауланған
митахондрияларында глтаматтың тотыға дезаминденуі реакциясында ГДГ-ның
активтілігінің динамикасы өзгеше болды: тұқымды сепкеннен кейінгі 2-ші
күнінде активтілігі жоғары, 7-ші күнге дейін максимумға жеткен, содан кейін
тұқым жарнағының қаратюы кезінде бір төмендеп, бір өсіп отырған. Авторлар
митахондриялардағыглютаматтың тотығуы өскіндерінің өсуі кезеңінде қорлық
қосылыстардың мобилизациялануына және амин қышқылдарының метоболизәмәне
әсер етеді деген болжау айтқан. Жапырақтар мен қартайып келе жатқан тұқым
жарнақтарының митахондрияларында басқа субстраттардың тез тотығуымен
салыстырғанда (малат), глютаматтың тотығу жылдамдығы онша емес екендігі
көрсетілген.
Қазіргі кезде өсімдік клеткасындағы гютаматдегидрогеназаның
изоферменттері бар екендігі, сонымен қатар олардың аммонидің әсеріне жауап
ретінде іріктеліп индукциялануы жайлы материалдар жинақталған. Бірақта бұл
изоферменттердің клетка ішінде таралуы жайлы арнаулы зерттеулер әлі күнге
дейін аз, сондықтан клетка құрылымдары мен цитазольдағы ГДГ-ның қызыметтері
мен қасиеттерін түсіндіріп, талдау жасау қиынға соғады.
Алайда өсімдіктердің түрлік спецификалығын ескере отырып, бұл сұрақты
шешу аса қажет. Себебі әртүрлі өсімдіктердегі ферменттердің
локализациялануы мен қасиеттерінің өз ерекшеліктері болады. Мысалы балық
отында (ряска) ГДГ бір изоферментпен, ал бұршақта жеті изоферментпен
болатындығы көрсетілген. Бір қатар көрсеткіштерге байланысты ферменттер
ұқсас болып келген: бірдей молекулалық (23000) массасы 58500 болатын төрт
бірдей суббірліктер, ұқсас амин қышқылдар құрамы және активтіліктілігін
анықтау үшін Са ионының міндетті түрде болуы қажет.
Бидай дәнінің өсу кезі мен пісіп жетілу кезіндегі тура реакцияның
(глютаматтың тотыға дезаминденуі) және кері реакцияның (2-оксаглютараттың
тотықсыздана дезаминденуі) ара қатынасы зерттелген. Эндоспермде ферменттің,
оң екі бағытта катализдейтін реакцияларының активтілігі сумен бөрттіріп
қойған алғашқы күндерінде ең жоғарғы, екінші күні екі есе төмендеген, одан
кейін төмендеуін жалғастырғаны анықталды.бидай өне бастаған кезде тура және
кері реакциялардың ара қатынасы эндоспермде, сонымен қатар қабығында 1:2 ал
өскіндерде 1:1 тең ол кейін глютамин қышқылының синтезделуі жағына қарай
өзгереді (өскіндері 1:12). Пісіп жетіле бастаған кезде, гүлденгеннен кейін
ГДГның тура және кері реакцияларының жылдамдығының өсуі дәннің 68% -ден 58%
-ке дейінгі ылғалдылығында, яғни сүт пісіп жетілу кезеңінде максимумға
жеткендігі байқалған. Глютамин қышқылының глютаматдегидрогеназаның
қатысуымен алмасуының негізгі процестері оның жинақталатын жерінде, яғни
бидай дәнінің эндоспермінде жүретіндігі байқалған
Бидай өсімдігінің тамырынан алынған ГДГ-ның гомогенді препораттарындағы
тотыға дезаминденуі және 2-оксаглутараттың тотықсыздана аминденуі
реакциялардың жылдамдығының қатынасы 1:14 құрған кезде, ал бидайдың
тазартылмаған экстракттарындағы глютаматтың тотыға дезаминденуі
реакцияларының жоғары діңгейде жүретіндігі ерекше еөңіл аудартады. Мүмкін
тазарту процесі кезінде ГДГ-дан жоғары глютаматты ыдырату активтілігі бар
басқа фермент бәліп шығаруы мүмкін және ол шынымен де біздің
зерттеулерімізде анықталған.
Tsukamoto және Welander бұрынғы жұмыстарында алғаш рет бидайда глютамат
тотықтыратын ферменттің бар екендігі көрсетілген, мысал ретінде Welander
электрофорез кезінде гелде активтілікті айқындау үшін НАД қажет етпейтін
фермент аймағын анықтаған. Өкінішке орай бұл тәжірибе басқа зерттеушілер
жағынандұрыс көңіл аударылмауына байланысты ары қарай тәжірибе қойылы,
дамытылмай қалды.
Зерттеулер жасау негізінде, біз глютаматтың қайтымсыз ыдырауны жүзеге
асыратын ферменттің жаңа түрін анықтадық. Жаңадан ашылған ферменттің түрі
жақсы зертелген глютаматдегидрогеназадан физико химиялық жағынан
ерекшеленеді. Сол арқылы өсімдік органиімінде әсер ету механизімін ашуға
мүмкіндік берді.
МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің өсімдіктің метоболиттік процестеріне
атқаратын үлкен ролін ескере отырып, өсімдіктердің тұзға төзімділігін осы
ферменттің активтілігінің өзгеруімен анықтауға болатындығы дәлелденді 7.
1.1.1. ГДГ-ның глютамат айналымындағы маңызы.
М.Ә.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының
ферменттердің құрылымы және реттелуі лабораториясында глютаматтың айналымы
және оның айналымына қатысатын негізгі белсенді ферменттер жөнінде ондаған
жылдар бойы зерттеу жұмыстарын жүргізу үстінде бұл лабораторияның ең үлкен
жетісіктерінің бірі болып жоғарғы сатыдағы өсімдіктерде минералды азоттың
сіңірілу реакциясын атқаратын НАДФ спецификалық ГДГ–ны алғаш рет бидай
дәніне тәжірибе жүргізу нәтижесінде спецификалық субклеткалық құрлымда,
шамамен 1мкм мөлшерлі және 1,07-1,1 гсм3 жылжымалы тығыздықты –сферасомада
анықталды. Сферасома тек бір ғана белоктан – ГДГ-дан, және бір ғана
липидтен- фосфотидилинозидтен тұратыны анықталынды 8. Бидай дәніндегі
глютаматдегидрогеназа кофермент ретінде тек НАД-ты ғана спецификалығын
таныта алады. Бұл ГДГ аммони иондарына күшті сезімтал фосфорланған фермент
түріне жататыны бекітілді. ГДГ өнімінің қалыптасу кезеңіндегі
бейорганикалық азоттың қақпаға түсу қызметін атқарады. НАДФ-ГДГ активтенуі
цитокининнің бақылауымен жүреді 8. Бірақта бидай дәнінің ұрықсыз бөлігіне
әсер еткенде НАДФ-ГДГ-ның активтілігі байқалмаған. Осыған орай цитокининді
ұрықтық бөлімге әсер еткенімізде НАДФ-ГДГ активтенген, яғни,цитокинин
ұрықтық бөлімінде екіншілік гормон- цитокинин медиаторды түзген, ол алейрон
қабатындағы НАДФ-ГДГ-ны активтейді 9.
Өсімдіктерде аммонидің ассимиляциянуының негізгі жолы
глютаматдегидрогеназа ферментінің қатысуымен а-кетоглутар қышқылының
тотықсызданып аминденуінен, глютамин қышқылының пайда болу реакциялары
болып есептелінеді 10.
Реакцияның бірінші сатысында субстраттың байланысуынан имин қышқылы
пайда болып, екінші сатысында оның тотықсыздануынан НАДФН-тың қатысуымен,
глутамин қышқылы түзіледі.
Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) барлық өсімдіктердің жапырақтарымен
тамырларында болатын фермент. Ол негізінен митахондрияларда, цитоплазма
матриксінде, хлоропластарда да кездеседі.
1974 жылы Р.Ли және Б.Мифли аммонидің ассимиляциялануының екі реакция
арқылы жүзеге асатын негізгі жолы ашты. Ол реакцияның біреуі
глютаминсинтетаза (ГС), екіншісі глютаматсинтетаза (ГТС) ферменттерімен
катализденеді 11.
Сонымен клеткаларда глютамин қышқылымен қатар аминді глутамин де пайда
болады. Глютаминсинтетаза глютамин қышқылы аммиакты қабылдап алып глютамин
амидті синтезделінетін реакцияны катализдейді.
Бұл реакцияның жүруіне АТФ қажет. Глютаматсинтетаза болса глютаминнің
амид тобын а-кетоглутар қышқылына ауыстырып, ферредоксиннің қатысуымен,
глутамин қышқылының екі молекуласы пайда болатын реакцияны катализдейді.
Өсімдікке енген аммиак а-кетоглутар қышқылынан басқа да органикалық
қышқылдарға байланысып, тиісті ферменттердің қатысуымен алғашқы амин
қышқылдардан түзіледі. Олардың қатарына қымыздық, сірке, пирожүзім,
глиоксил және т.б. қышқылдар жатады. Олардың тотықсызданып аминдену
(трансаминдену) нәтижесінде, тиісінше аспарагин, серин, глицин амин
қышқылдары синтезделінеді.
Глютамин қышқылының амин тобының трансаминдену арқылы басқа қышқылдарға
ауыса алатындығы А.Е.Браунштейн жіне М.Г.Крицман зерттеулері нәтижесінде
анықталды. Бұл реакцияны катализдейтін ферменттер аминотрансферазалар деп
аталады. Мысалы ретінде глутамин қышқылының пайда болуын келтіруге болады
12.
Өсімдіктер аммонимен өте қамтамассыз етілгенде олардың ұлпаларында
глутамин және аспарагин сияқты амидтер жиналады 13.
Жаңа ферменттік әдістәің ашылуы суқоймаларының антропогендік ластануының
экологиялық маниторингі бола алады. Одан басқа бұл әдіс клиникалық
биохимияда организімнің патологиялық күйін анықтау үшін-бауыр және бүйрек
ауруларын, қандағы және зәрдегі аммиак деңгейін анықтау арқылы қолданылады
14. Лабораториямен аз зерттелген өсімдік клеткаларының органелласы
сферасоманы ашуға қол жеткізді.
Қолданылған фермент номенклатурасы бойынша окси-ферментке арнайылығына
қарай глютаматдегидрогеназаның үш түрі бар:
1. НАД- қа арнайы ГДГ (1.4.1.2.);
2. НАД-қа да, НАДФ-қа да активтілігін бірдей көрсететіy
ГДГ(1.4.1.3.);
3. НАДФ- қа арнайы ГДГ.
Жоғары сатыдағы өсімдіктерде глютаматдегидрогеназаның бірінші және
екінші формалары табылған 15.
Сривастава, Зигн өздерінің еңбектерінде глютаматдегидрогеназаның
активтілік орталығында ерекше байланысқан SH тобы бар екенін, 6 немесе 4
суббөліктен тұратыны, молекулалық салмағы 280-нен 270 кДа-ға дейін
болатынын және метал иондарына ассоцирленетіні көрсетілген. ГДГ-ның кейбір
изоферменттері қоршаған орта күйіне және минеральды қоректенуіне қарай
индуцирленеді. ГДГ-ның активтілік деңгейі көптеген факторларға тәуелді:
жасқа, жарыққа, қараңқылық режимге, бейорганикалық және органикалық азотқа,
көмірсудың энергетикалық күйіне, өсу реттеліміне және басқа да факторларға.
Фермент қараңғылықта ашығу, жоғарғы температура, тұздануда, суға стрестік
жағдай, қоршаған ортаның ластануында және тағы басқа стрестік жағдайларға
шалдыққан кезде азоттың сіңірілуіне өте қажет. Жоғарғы сатыдағы
өсімдіктердегі ГДГ-ға жүргізілген барлық зерттеулер біздің көзқарасымыз
бойынша НАД ГДГ-ны зерттеуге негізделген 16.
Әсіресе неміс ғалымы Полих горох тамырындағы осы ферментті ұзақ жылдар
бойы бар күшін салып зерттеді. Полих алғаш рет гомогендіферментті алып,
оған сипаттама берді. НАДФ ГДГ ның электрофоретикалық формалары болып
саналады. Нуклеатидтер тізбегі осы ферменттердің ретелімі болып
табылатынның айты 17. Шатиловтың басқарылуымен жүретін зерттеу тобы ГДГ-
ны зерттеуге үлкен күш жұмсады. Бұлармен ГДГ реакциясының катализінің
механизімі бөлім-бөлімімен зерттелінді. Ферментке каталитикалық түрлі
агенттердің әсері, ГДГ-ң активті орталығындағы амин қышқылдардың қалдығының
ролі, ГДГ-ң синтезделіну механзімі зерттелінді. Иондар мен супстраттың
ажырататын арнайылығы бойынша әсер етеді 18.
1.1.2. Өсімдіктердің МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігін, физико-
химиялық қасиеттерін және реттелуін зерттеу
Глютамат өсімдіктерде барлық амин қышқылдарының арасында ең маңызды
амин қышқылы болып табылады. Глютамин қышқылының азот айналымындағы маңызды
және орталық амин қышқылы екендігі жалпыға мәлім. Сондықтан жоғары сатыдағы
өсімдіктердегі глютамат айналымының негізгі жолдарын зерттеу үлкен ғылыми
қызығушылық тудырыды. Осы кезге дейін жоғары сатыдағы глютаматтың
ыдырауының жалғыз ғана жолы белгілі болатын. Осы глютаматдегидрогеназа
(ГДГ) арқылы глютаматты тотықтыру жолы. Осы ГДГ арқылы жүрген реакциясының
нәтижесінде аммиак бөлінеді. Бөлінген аммиак клетка менбраналарына зақым
келтіреді. Осыған орай өсімдіктерде глютаматты ыдытататын басқа зиансыз
жолы бар – жоқ сұрақты туғызады. Яғни глютаматты ыдырататын осындай зиянсыз
жолды Қазақстандық ғалымдар тапқан 19.
Ол М.Ә.Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының
ферменттердің құрылымы және реттелуі лабораториясында глютаматты ыдырататын
малатдегидрогеназа және глютаматоксалоацетаттрансфераза ферменттерінен
құралған жаңа ферменттік комплекс бидай өсімдігінен табылған. Ол МДГ-ГОАТ
жолы. Бұл ферменттік комплекс мынадай реакциялар реттілігін жүзеге асырады.
Бірінші атқаратын реакциясы малатдегидрогеназасы арқылы алма қышқылы
кофермент НАД қатысуымен қымыздық сірке қышқылына дейін тотығады және осы
кезде НАД коферменті НАДН-қа дейін тотықсызданады. Содан кейін
глютаматоксалоацетаттрансфераза қысылуымен оксалоацетат глютаматпен
трансаминизациялық реакцияға түседі. Осы реакция нәтижесінде глютамат 2-
оксоглютаратқа, ал оксалоацетат аспартатқа айналады 20. Қорыта айтқанда,
МДГ-ГОАТ реакциясының нәтижелерінде глютаматпен малат НАД арқылы
оксоглютарат, аспартат және НАДН-қа айналады. Ферменттік комплексті
зерттегенде глютамат катаболизмінің 95%-ке жуығы ферметтік комплекс арқылы
жүретіндігі анықталды. Ал ГДГ тек қана 5% глютамат катаболизмін атқарады.
Сондықтан МДГ-ГОАТ глютамат ыдырауының негізгі жолдарын атқаратыны
дәлелденді. Бірақ, бұл ферменттік комплекс тек бидай дәнінде анықталған
21. Сол себептен жаңа ферменттік комплекстік қасиеттерін басқа
өсімдіктерде зерттеудің маңыздылығы сөссіз. Осыған байланысты ғылыми
зерттеу жұмысымыздың мақсаты эвалюциялық әр сатыда тұрған өсімдіктерде МДГ-
ГОАТ активтілігін анықтау және оның қасиеттерін, реттеуін зерттеу болды.
Осы мақсатқа жету үшін мынандай міндеттемелер қойылды:
1. Әр тұқымдас өсімдіктерде МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
активтілігін анықтау.
2. Ферменттік комплексті тазартып, қасиеттерін зерттеу.
3. МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің реттелуін зерттеу.
Осы міндеттемелерді шешу үшін қазіргі заманға сай мынадай әдістерді
қолдандық: гель-хроматографиясы, ДЕ-52 ион алмасу хроматографиясы,
спектрофотометриялық әдіс арқылы МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
активтілігін және протейн мәлшерін анықтадық.
Осы жұмысты атқарғанда келесі нәтижелерге жеттік:
Эвалюцияда әр тұрған әсімдіктерді МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
эвалюцияныңсоңғы сатыларында пайда болатындығы дәлелденді 22. Мысалы,
өсімдіктердің ең төменгі сатыда тұрған балдырлар, саңырауқұлақтар, қыналар,
мүктер, қырықбуындылар, папротниктер, плаундар біз МДГ-ГОАТ активтілігін
таба алмадық. Жалаңаш тұқымды өсімдіктердің өкілдерінде – шырша, қарағай,
арша және туяда МДГ-ГОАТ-тің активтілігі байқалмады. Жер бетіндегі ең
алғашқы гүлді өсімдіктердің бірі болып табылатын-лалагүлдерде, сонымен
қатар құрамындада МДГ-ГОАТ активтілігі жоқ екендігін байқадық 23.
Эволюцияда әр сатыда тұрған өсімдіктерді МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің
активтілігін зерттегенде осы комплекстің эволюциясының соңғы сатыларында
пайда болатындығы дәлелденді. Мысалы әсімдіктерден ең төменгі сатыда
тұратын балдырлар; саңырауқұлақтар; қыналар; мүктер және т.б. Біз МДГ-ГОАТ
таба алмадық. Жер бетіндегі ең алғашқы гүлді өсімдіктердің бірі болып
табылатын-лалагүлдерде де МДГ-ГОАТ активтілігі табылмаған. Тек қана
раушангүлділер тұқымдасының өкілдерінен табылған. Ал әрі қарай эволюция
бойынша өсімдіктер сатылары жоғарылай бере, МДГ-ГОАТ активтілігі де
жоғарылай береді. Ең жоғары МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің активтілігі
асқабақ тұқымдастары мен астық тұқымдастарында табылды.
Сонымен осы алынған мәліметтер бойынша ферменттік комплекс тек кейінен
пайда болғаны және эвалюйиялық тұрғыдан жас өсімдіктердің тұқымдарына тән
екендігі анықталды 24.
Екінші міндеттемені орындағанда біз ДЕАЕ-52 ион алмасу
хромотографиясын және сефароза 6В гель-хроматографиясын қолданып МДГ-ГОАТ-
ты тазарттық. Тазартылған ферменттік комплекстің кейбір физико-химиялық
қасиеттерін зерттедік 25.
Молекулалық массасын анықтау үшін сефакрил S300 колонкасы арқылы гель-
хроматография әдісін жүргіздік. Ферменттік комплекстің молекулалық массасы
110 кДа-тең болды. Ферменттік компекстің РН оптимумы 7,7 МДГ-ГОАТ
ферменттік комплексінің температура оптимумы 45 26.
Тазартылған МДГ-ГОАТ қасиеттерін зерттегенде біз оның реттелуін де
зерттедік. Алғаш рет аспартаттың МДГ-ГОАТ ферменттік комплекс реакциясының
өнімі болып табылады және сол МДГ-ГОАТ –қа теріс реттегіш болып келеді.
Аспартаттың теріс реттегіш болуының үлкен физиологиялық мағынасы бар. Ол
артық аспартат түзуіне апарады бұл клетканың үнемділік принципіне жатады.
Себебі клетка ешқашан заттарды өз қажеттілігінен артық түзілдірмейді.
Сонымен алғаш рет МДГ-ГОАТ ферменттік комплексінің эволюциялық тұрғыдан
кейін пайда болған өсімдіктерге тән екендігі анықталынды. Тазартылып
алынған ферменттік комплекстің молекулалық массасы ;рн оптимумы және
температура оптимумы зерттелініп анықталынды.
Көптеген зерттеушілердің жұмыстары өсімдіктің иондық стресс факторларын
зерттеуге арналған. Иондық стресс жағдайында көп аммиак түзіледі де ол
өсімдіктің улануына әкеледі. Осы жағдайға қарай көптеген өсімдіктің
линияларынан жоғары ферменттік комплекс активтілігі байқалса, өсімдіктің
иондық стреске төзімділігі жоғары болады. Себебі глютамат ыдырағанда аммиак
түзілмейді және төзімсіз сорттарынан иондық стрестің әсерін байқау үшін
[МДГ-ГОАТ] активтілігін зерттеуге тура кеді 27.
Глютамат азот деңгейі көптеген факторларға байланысты: өсімдіктің
жасына, жарықты, қараңғы режимдерге, бейорганикалық және органикалық
азотқа, көмірсулар көзіне, энергетикалық, және басқада факторларға тәуелді
болады.
Байқауымызша ферменттің өсімдіктердің азотты сіңіруінде стресс
жағдайында қажеттілігі артады, мысалы: қоршаған ортаның ластануы т.б.
стресті жағдайларда фермент маңызды. Астық дақылдары және
бұршақтұқымдастардың ГДГ-сын терең әрі жан-жақты етіп зерттеген Гильманов
М.К. және оның шәкіріттері 27.
Жоғары сатыдағы өсімдіктердің глютаматдегидрогеназасы жөнінде
көптеген зерттеулер жүргізілгенмен, өте көп нәрсе түсініксіз болып отыр.
Біріншіден глютаматдегидрогеназаның басқа түрлерінің болуы туралы сұрақ
туады. Бұл бағытта қызықты жұмыстарды голланд зерттеуші Bredemeіjer (1977
ж) жүргізген. Оның еңбегінде глютаматдегидрогеназаның латентті формаларының
бидай тозаңқабында бар екендігі анықталған, бірақ бұл
глютаматдегидрогеназаның түрі бөлініп сипатталған жоқ. Белгісіз себептерге
байланысты Bredemeіjer бұл зерттеуін одан әрі дамытқан жоқ.
Қазіргі кезде жоғары сатыдағы өсімдіктердің глютаматдегидрогеназасы
бойынша көп мәліметтер бар. Онда олардың қасиеттері және таралуы
сипатталған. Біз осы фермент туралы негізгі мәліметтерді келтіре отырып,
оның реттелу аспектісіне аса назар аударамыз. Әдеби мәліметтер бойынша
барлық зерттеушілер негізнен НАД(Ф)-ГДГ-ны зерттеген. Әсіресе осы ферментті
мақсатты түрде неміс ғалымы Палих бұршақ тамырынан зерттеген. Ол алғаш рет
гомогенді фермент алды. Оның айтуынша НАД(Ф)-ГДГ-ның электрофоретикалық
формалары конформер және изофермент емес. Оның көрсетуінше бірқатар
нуклеотидтер осы ферменттердің регуляторлары болып табылады. Сонымен қатар
Шатилов жетекшілігімен глютаматдегидрогеназаның зерттелуіне үлкен үлес
қосты. Олар ферменттің каталитикалық қасиетімен амин қышқылды қалдықтардың
активті орталықтарындағы ролін ашты. Глютаматдегидрогеназаның синтезінің
механизмдері зерттелген, олар ион және субстрат әсеріне өзіндік
мамандануына байланысты ерекшеленеді.
Гильманов М.К және оның шәкірттері (1975,1978, 1984, 1989). Олар ГДГ-
реакцияларының катализдік механизмін толық зерттеп, әртүрлі агенттердің
каталитикалық қасиеттеріне әсерін, ГДГ-ның активті орталықтарындағы
аминқышқылдар қалдықтарының ролін анықтаған. Ион және субстраттар әсерінен
глютаматдегидрогеназаның синтезінде өзіндік спецификалығы көп ерекшеленетін
механизмдер зерттелінген.
L-оксоглютарат қышқылы энергетика және жоғарғы сатыдағы өсімдіктердегі
оксоқышқылдардың алмасуында маңызды орын алады және де Кребс циклінің
негізгі қатысушы компоненті болып табылады 28.
Глютаматдегидрогеназа зат алмасуда негізгі орын алады және азот пен
энергия алмасуын байланыстырушы звено болып табылады.
Қазіргі кезде жоғары сатыдағы өсімдіктердегі глютаматдегидрогеназаның
негізгі физика-химиялық қасиеттерін зерттеу белсенді жүргізілуде.
Глютаматдегидрогеназа жоғары сатыдағы өсімдіктерде барлық уақытта НАД және
НАДН2 кофермент ретінде мамандалады. Сонымен қатар жоғары сатыдағы
өсімідктердегі глютаматдегидрогеназа НАДН2 мен бірге белгілі бір
белсенділікті көрсетеді. Оны ең бірінші болып Яковлева қатарластарымен
бірге көрсеткен. Көптеген авторлардың мәліметтері бойынша ферменттің осы
кофермент пен активтілігі НАДН2 бірге көрсететін белсенділігінен 10 есе
төмен. Сондай-ақ кейбір зертеушілер НАД(Ф)Н2 мен глютаматдегидрогеназаның
активтілігі жоғары екенін вики өсімдігінің хлоропластарынан көрсетеді. Kіrk
глютамат алмасуының сапалық деректерін негізге ала отырып, өсімдіктердің
әртүрлі стресс жағдайларына төзімділігіне биохимиялық тұрғыда баға берген.
Қазіргі күні де глютаматтың ыдырау жолдары онша жақсы зерттелмеген.
Тыныс алу процесінде көп ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz