Бидай алейрон клеткаларында АР-эндонуклеазаларының белсенділігі
КІРІСПЕ 3
1 Әдебиетке шолу 4
1.1 Бидай алейрон клеткаларына жалпы сипаттама 4
1.2 Гиббериллин және абсциз қышқылдарына сипаттама 6
1.3 Оттегінің белсенді түрлері 8
1.4 ДНҚ репарациясына қатысатын ферменттер 13
2 Тәжірибелік бөлім 17
2.1 Материалдар мен зерттеу әдістері 17
2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу мен
инкубациялау шарттары 17
2.1.2 Ішек таяқшасы клеткасын өсіру жағдайлары 17
2.1.3 p. Bluescript.Alk A плазмидасын бөліп алу 19
2.1.4 ДНҚ репарация ферменттерін экстракциялау және белсінділігін анықтау 20
3 Зерттеу нәтижелері және оны талдау 21
ҚОРЫТЫНДЫ 28
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 29
1 Әдебиетке шолу 4
1.1 Бидай алейрон клеткаларына жалпы сипаттама 4
1.2 Гиббериллин және абсциз қышқылдарына сипаттама 6
1.3 Оттегінің белсенді түрлері 8
1.4 ДНҚ репарациясына қатысатын ферменттер 13
2 Тәжірибелік бөлім 17
2.1 Материалдар мен зерттеу әдістері 17
2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу мен
инкубациялау шарттары 17
2.1.2 Ішек таяқшасы клеткасын өсіру жағдайлары 17
2.1.3 p. Bluescript.Alk A плазмидасын бөліп алу 19
2.1.4 ДНҚ репарация ферменттерін экстракциялау және белсінділігін анықтау 20
3 Зерттеу нәтижелері және оны талдау 21
ҚОРЫТЫНДЫ 28
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 29
Алейрон ұлпасы, бидай дамуының өсiп-өну сатысында, синтетикалық және секреторлық қызмет атқаратын күрделi ұлпа. Яғни бидай дәнінің өсіп-өну барысында алейрон қабаттары бірқатар гидролитикалық ферменттерді синтездеп, оны крахмалды эндоспермге секрециялайды [1,2]. Онтогенездің соңғы сатысында алейрон клеткалары элиминацияланады. Алейрон қабаттарының бұл өлімі программаланған (апоптоз), яғни генетикалық детерминацияланған деген болжам бар [3,4,5].
Оттегiнiң белсендi түрлері (ОБТ) – супероксид (.О), сутектiң асқын тотығы (Н2О2), гидроксид радикалы (.ОН) өсімдіктер клеткаларының программаланған өлімі барысында маңызды роль атқаратындығы белгілі [6,7,8]. ОБТ клеткалық метаболизмнің өнімдері болып табылады, олардың ішкі клеткалық мөлшерін бірқатар антиоксидантты ферменттер (супероксиддисмутаза, аспартат пероксидаза, глутатионредуктаза, каталаза және т.б.) реттейді. Өсімдік клеткаларында ОБТ-нің митохондрияларда, хлоропласттарда, плазмалық мембраналарда, пероксисомаларда және апопластық кеңістіктерде синтезделетіні анықталған. Сонымен қатар, ОБТ қысқа толқынды сәулелердің (ультракүлгін және иондаушы сәулелер) және химиялық агенттердің әсерінен де пайда болуы мүмкін. ОБТ белоктар, липидтер, ДНҚ және т.б. сияқты клеткалық биомолекулалармен қарым-қатынасқа түсіп, оларды тотықтыру арқылы зақымдайды [9].
Клеткадағы бұндай процестер әсерінен болатын ДНҚ-ның зақымдалуы, ДНҚ-дағы генетикалық информацияны өзгертіп, клетканың тіршілігі үшін қауіп тудыруы мүмкін.
Сондықтан клеткада осындай зақымданулардан сақтайтын, тікелей зақымдалған негіздерді алмастыратын, DNР пулдарын тазартатын, мисмэтч, BER-, NER- және NIR-репарация секілді көптеген механизмдері дамыған. Осы ДНҚ репарациялау жүйелерінің ішінде маңызды қызметті ДНҚ-гликозилаза ферменті атқарады. Бұл фермент негіздер мен қант қалдығы арасындағы N-гликозидтік байланысты үзіп, зақымдалған негізді аластатады.
Осыған орай, бұл жұмыстың мақсаты ДНҚ репарациясының басты ферменттерінің бірі АР эндонуклеаза ферменттерiнiң белсендiлiгiне гиббереллин (ГҚ) және абсциз (АБҚ) қышқылдарының әсерiн зерттеу болып табылады.
Оттегiнiң белсендi түрлері (ОБТ) – супероксид (.О), сутектiң асқын тотығы (Н2О2), гидроксид радикалы (.ОН) өсімдіктер клеткаларының программаланған өлімі барысында маңызды роль атқаратындығы белгілі [6,7,8]. ОБТ клеткалық метаболизмнің өнімдері болып табылады, олардың ішкі клеткалық мөлшерін бірқатар антиоксидантты ферменттер (супероксиддисмутаза, аспартат пероксидаза, глутатионредуктаза, каталаза және т.б.) реттейді. Өсімдік клеткаларында ОБТ-нің митохондрияларда, хлоропласттарда, плазмалық мембраналарда, пероксисомаларда және апопластық кеңістіктерде синтезделетіні анықталған. Сонымен қатар, ОБТ қысқа толқынды сәулелердің (ультракүлгін және иондаушы сәулелер) және химиялық агенттердің әсерінен де пайда болуы мүмкін. ОБТ белоктар, липидтер, ДНҚ және т.б. сияқты клеткалық биомолекулалармен қарым-қатынасқа түсіп, оларды тотықтыру арқылы зақымдайды [9].
Клеткадағы бұндай процестер әсерінен болатын ДНҚ-ның зақымдалуы, ДНҚ-дағы генетикалық информацияны өзгертіп, клетканың тіршілігі үшін қауіп тудыруы мүмкін.
Сондықтан клеткада осындай зақымданулардан сақтайтын, тікелей зақымдалған негіздерді алмастыратын, DNР пулдарын тазартатын, мисмэтч, BER-, NER- және NIR-репарация секілді көптеген механизмдері дамыған. Осы ДНҚ репарациялау жүйелерінің ішінде маңызды қызметті ДНҚ-гликозилаза ферменті атқарады. Бұл фермент негіздер мен қант қалдығы арасындағы N-гликозидтік байланысты үзіп, зақымдалған негізді аластатады.
Осыған орай, бұл жұмыстың мақсаты ДНҚ репарациясының басты ферменттерінің бірі АР эндонуклеаза ферменттерiнiң белсендiлiгiне гиббереллин (ГҚ) және абсциз (АБҚ) қышқылдарының әсерiн зерттеу болып табылады.
1. Wyail S. E. and Carpila N. C. Trends Cell Biol. 3. - 1993. – P. 413-417.
2. Oixon R.A., Harrison M.J. and Lamb C.J. Annu. Rev. Phytopathol. 32. – 1994. – P. 479-501.
3. Bach M., Schnitzler J.P. and Seilz H.U. Plant Physiol. 103. – 1993. – P. 107-412.
4. Niirnberger Т., Nennstiel D., Jabs Т., Sacks W.R., Hahlbrock K. and Scheel D. Cell. 78. - 1994. – P. 449-460.
5. Fath A., Bethke P., Lonsdale J., Meza-Romero R., Jones R. Programmed cell death in cereal aleurone // Plant Molecular Biology. - 2000. - Vol. 44. - P. 255-256.
6. Фурсов О.В. Амилазы и их регуляция в зерне злаковых: Автореф. д-ры биол. наук: 03.00.04. – М, 1990.- С.41.
7. Bethke P.C., Hillmer S. and Jones R.L. Isolation of intact protein storage vacuoles from barley aleurone // Plant Physiol. - 1996. - Vol.110. - P.521-529.
8. Paul C., Bethke P.C., Robert Schuurink and. Jones R.L. Hormonal signalling in cereal aleuron // J. Exp. Bot. - 1997. - Vol.48, №. 312. - P. 1337-1356.
9. Heirmovaara-Dijkstra S., Heistek J.S., Wang M. Counteractive effects of ABA and GA on extracellular and intrasellular pH and Malate in barley aleurone // Plant. Phyysiol. - 1994. - Vol.106. - P. 359-365.
10. Козьминой Н.П., Любарский Л.Н. Пшеница и оценка ее качества. Изд. Колос. – М, 1968.- С.52-56.
11. Fujimura K., Kanoh M., Benaka T. Studies heterogecity of Taka-amylas A: Isolation of an amylase having one N-acetylglucosoamine residue as the sugar chain // J. Biochem. - 1982. - Vol. 92. - P. 265-270.
12. Jacobsen J.V., Knox R.B., Pyliotis N.A. The structure and composition of aleuron grains in the barley aleurone layer // Planta. - 1971. - Vol. 101. - P.189- 209.
13. Gilroy S., Jones R.L. Perception of gibberellin and abscisic acid at the external face of the plasma membrane of barley (Hordeum vulgare L.) aleurone protoplasts. Plant Physiol. - 1994. - Vol. 104. - Р. 1185–1192.
14. Bethke P.C., Hillmer S., Jones R.L. Isolation of intact protein storage vacuoles from barley aleurone // Plant Physiol. - 1996. - Vol.110. - P.521-529.
15. Bethke P.C., Jones R.L. Gibberellin signaling // Plant Biol. - 1998. - Vol. 1. - Р. 440–446.
16. Гильманов М.К., Сабитов А.Н., Саменов Н.А., Ибрагимова С.А., Мусабеков К. Изучение механизмов активации надф-гдг сферосом в семенах злаковых культур ионами Са2+, медиатором цитокинина и гиббереллином // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2006. - №3(29). С. 111-116.
17. Lovegrove A. and Hooley R. Gibberellin and abscisic acid signalling in aleurone // Trends in Plant Science. – 2000. – Vol. 5. – P. 102–110.
18. Wang M., Van Duijn, B. and Schram A.W. Abscisic acid induces a cytosolic calcium decrease in barley aleurone protoplasts. // FEBS Letters. – 1991. – Vol. 278. – P. 69–74.
19. Ritchie S. and Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated byphospholipase D activity //Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. – 1998a. – Vol. 95. – P. 2697–2702.
20. Verslues P.E., Zhu J.K. Before and beyond ABA: upstream sensing and internal signals that determine ABA accumulation and response under abiotic stress // Biochemical Society Transactions. - 2005. – Vol.33. P. 375–379.
21. Hahlbrock К Scheel, D, Logemann. E., Niirnberger. Т., Parniske. M.. Reinold, S.,Sacks W.'R. and Schmelzer, E. Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 92. – 1995. – P. 4150-4157.
22. Stavreva D.A., Gichner T. DNA damage induced by hydrogen peroxide in cultured tobacco cells is dependent on the cell growth stage, Mutat. Res.// Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. – 2002. – Vol. 514. - P. 147–152.
23. Jiang M., Zhang J. Effect of abscisic acid on active oxygen species, antioxidative defense system and oxidative damage in leaves of maize seedlings // Plant Cell Physiology. – 2001. – Vol, 42(11). – P. 1265-1273.
24. Elstner E.F. Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells. In: Pell EJ, Steffen KL, eds.Active oxygenjoxidalive stress and plant metabolism.Rockville, MD: American Society of Plant Physioloaists. - 1991. – P. 13-25.
25. Fridovich I. Superoxide dismutases // Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology. 58. - 1986. – P. 61-97.
26. Kanematsu S, Asada K. Ferric and manganic superoxide disinutases in Euglena gracilis // Archives of Biochemistry and Biophysics 195. - 1979. – P. 535-545.
27. Bannister WH, Bannister JV, Barra D, Bond J, Bossa F. Evolutionary aspects of superoxide dismutase: the copper/zinc enzyme, free Radical Research Communications. 12-13. - 1991. – P. 349-361.
28. Kliebcnstcin DJ, Monde R, Last RL. Superoxide dis¬mutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family with dis¬parate regulation and protein localization // Plant Physiology. 118. - 1998. – P. 637-650.
29. Tsang EWT, Bowler C, Herouart D, Van Camp W, Villarrocl R, Genetello C, Van Montagu M, Inze D. 1991. Differential regulation of superoxide dismutases in plants exposed to environmental stress. The Plant Cell 3, 783-792.
30. Marcus S, Mark D, Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disiase,1195-1210.
31. Foyer C.H., Descourvieres P. and Kunerl K.J. Plant Cell Environ. 17. – 1994. – P. 507-523.
32. Elstner E.F. Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells. In: Pell EJ, Steffen KL, eds.Active oxygenjoxidalive stress and plant metabolism.Rockville, MD: American Society of Plant Physioloaists. - 1991. – P. 13-25.
33. Salin M.L. Toxic oxygen species and protective systems of the chloroplast // Physiologia Plantarum 72. - 1988. – P. 681-689.
34. Takahashi M.A, Asada K. Superoxide anion permeability of phospholipid membranes and chloroplast thylakoids // Archives of Biochemistry and Biophysics. 226. - 1983. – P. 558-566.
35. Myouga F., Hosoda C., Umezawa T., Iizumi H., Kuromori T., Motohashi R., Shono Y., Nagata N., Ikeuchi M. and Shinozaki K. A Heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis //The Plant Cell. – 2008. – Vol. 20. – P. 148-3162.
36. Smith MW, Doolittle RF. A comparison of evolutionary rates of the two major kinds of superoxide dismutases // Journal of Molecular Evolution 34. - 1992. – P. 175-184.
37. Wood R.D. Nucleotide excision repair in mammalian cells // J. Biol. Chem. - 1997. – Vol. 272. – P. 23465–23468.
38. Laurent G, Saparbaev M, Laval J. Enzimology of the repair of free radicals-induced DNA damage // Oncogene. 21. – 2002. – P. 8905-8925.
39. Королев В.Г. Эксциционная репарация поврежденных оснований ДНК: ДНК-гликозилазы. Генетика. 2005. -№ 6 (41). –С. 725-735.
40. Василенко Н.Л., Невинский Г.А. Ферменты прямой, эксцизионной и коррекционной систем репарации высших и низших организмов и их биологическая роль. Молекулярная биология. 2003. -№ 6 (37). –С. 944-960.
Norbury C, Hickson I. Cellular responses to DNA damage. - 2001. – P. 367-401.
2. Oixon R.A., Harrison M.J. and Lamb C.J. Annu. Rev. Phytopathol. 32. – 1994. – P. 479-501.
3. Bach M., Schnitzler J.P. and Seilz H.U. Plant Physiol. 103. – 1993. – P. 107-412.
4. Niirnberger Т., Nennstiel D., Jabs Т., Sacks W.R., Hahlbrock K. and Scheel D. Cell. 78. - 1994. – P. 449-460.
5. Fath A., Bethke P., Lonsdale J., Meza-Romero R., Jones R. Programmed cell death in cereal aleurone // Plant Molecular Biology. - 2000. - Vol. 44. - P. 255-256.
6. Фурсов О.В. Амилазы и их регуляция в зерне злаковых: Автореф. д-ры биол. наук: 03.00.04. – М, 1990.- С.41.
7. Bethke P.C., Hillmer S. and Jones R.L. Isolation of intact protein storage vacuoles from barley aleurone // Plant Physiol. - 1996. - Vol.110. - P.521-529.
8. Paul C., Bethke P.C., Robert Schuurink and. Jones R.L. Hormonal signalling in cereal aleuron // J. Exp. Bot. - 1997. - Vol.48, №. 312. - P. 1337-1356.
9. Heirmovaara-Dijkstra S., Heistek J.S., Wang M. Counteractive effects of ABA and GA on extracellular and intrasellular pH and Malate in barley aleurone // Plant. Phyysiol. - 1994. - Vol.106. - P. 359-365.
10. Козьминой Н.П., Любарский Л.Н. Пшеница и оценка ее качества. Изд. Колос. – М, 1968.- С.52-56.
11. Fujimura K., Kanoh M., Benaka T. Studies heterogecity of Taka-amylas A: Isolation of an amylase having one N-acetylglucosoamine residue as the sugar chain // J. Biochem. - 1982. - Vol. 92. - P. 265-270.
12. Jacobsen J.V., Knox R.B., Pyliotis N.A. The structure and composition of aleuron grains in the barley aleurone layer // Planta. - 1971. - Vol. 101. - P.189- 209.
13. Gilroy S., Jones R.L. Perception of gibberellin and abscisic acid at the external face of the plasma membrane of barley (Hordeum vulgare L.) aleurone protoplasts. Plant Physiol. - 1994. - Vol. 104. - Р. 1185–1192.
14. Bethke P.C., Hillmer S., Jones R.L. Isolation of intact protein storage vacuoles from barley aleurone // Plant Physiol. - 1996. - Vol.110. - P.521-529.
15. Bethke P.C., Jones R.L. Gibberellin signaling // Plant Biol. - 1998. - Vol. 1. - Р. 440–446.
16. Гильманов М.К., Сабитов А.Н., Саменов Н.А., Ибрагимова С.А., Мусабеков К. Изучение механизмов активации надф-гдг сферосом в семенах злаковых культур ионами Са2+, медиатором цитокинина и гиббереллином // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2006. - №3(29). С. 111-116.
17. Lovegrove A. and Hooley R. Gibberellin and abscisic acid signalling in aleurone // Trends in Plant Science. – 2000. – Vol. 5. – P. 102–110.
18. Wang M., Van Duijn, B. and Schram A.W. Abscisic acid induces a cytosolic calcium decrease in barley aleurone protoplasts. // FEBS Letters. – 1991. – Vol. 278. – P. 69–74.
19. Ritchie S. and Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated byphospholipase D activity //Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. – 1998a. – Vol. 95. – P. 2697–2702.
20. Verslues P.E., Zhu J.K. Before and beyond ABA: upstream sensing and internal signals that determine ABA accumulation and response under abiotic stress // Biochemical Society Transactions. - 2005. – Vol.33. P. 375–379.
21. Hahlbrock К Scheel, D, Logemann. E., Niirnberger. Т., Parniske. M.. Reinold, S.,Sacks W.'R. and Schmelzer, E. Proc. Nad. Acad. Sci. USA. 92. – 1995. – P. 4150-4157.
22. Stavreva D.A., Gichner T. DNA damage induced by hydrogen peroxide in cultured tobacco cells is dependent on the cell growth stage, Mutat. Res.// Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. – 2002. – Vol. 514. - P. 147–152.
23. Jiang M., Zhang J. Effect of abscisic acid on active oxygen species, antioxidative defense system and oxidative damage in leaves of maize seedlings // Plant Cell Physiology. – 2001. – Vol, 42(11). – P. 1265-1273.
24. Elstner E.F. Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells. In: Pell EJ, Steffen KL, eds.Active oxygenjoxidalive stress and plant metabolism.Rockville, MD: American Society of Plant Physioloaists. - 1991. – P. 13-25.
25. Fridovich I. Superoxide dismutases // Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology. 58. - 1986. – P. 61-97.
26. Kanematsu S, Asada K. Ferric and manganic superoxide disinutases in Euglena gracilis // Archives of Biochemistry and Biophysics 195. - 1979. – P. 535-545.
27. Bannister WH, Bannister JV, Barra D, Bond J, Bossa F. Evolutionary aspects of superoxide dismutase: the copper/zinc enzyme, free Radical Research Communications. 12-13. - 1991. – P. 349-361.
28. Kliebcnstcin DJ, Monde R, Last RL. Superoxide dis¬mutase in Arabidopsis: an eclectic enzyme family with dis¬parate regulation and protein localization // Plant Physiology. 118. - 1998. – P. 637-650.
29. Tsang EWT, Bowler C, Herouart D, Van Camp W, Villarrocl R, Genetello C, Van Montagu M, Inze D. 1991. Differential regulation of superoxide dismutases in plants exposed to environmental stress. The Plant Cell 3, 783-792.
30. Marcus S, Mark D, Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disiase,1195-1210.
31. Foyer C.H., Descourvieres P. and Kunerl K.J. Plant Cell Environ. 17. – 1994. – P. 507-523.
32. Elstner E.F. Mechanisms of oxygen activation in different compartments of plant cells. In: Pell EJ, Steffen KL, eds.Active oxygenjoxidalive stress and plant metabolism.Rockville, MD: American Society of Plant Physioloaists. - 1991. – P. 13-25.
33. Salin M.L. Toxic oxygen species and protective systems of the chloroplast // Physiologia Plantarum 72. - 1988. – P. 681-689.
34. Takahashi M.A, Asada K. Superoxide anion permeability of phospholipid membranes and chloroplast thylakoids // Archives of Biochemistry and Biophysics. 226. - 1983. – P. 558-566.
35. Myouga F., Hosoda C., Umezawa T., Iizumi H., Kuromori T., Motohashi R., Shono Y., Nagata N., Ikeuchi M. and Shinozaki K. A Heterocomplex of iron superoxide dismutases defends chloroplast nucleoids against oxidative stress and is essential for chloroplast development in Arabidopsis //The Plant Cell. – 2008. – Vol. 20. – P. 148-3162.
36. Smith MW, Doolittle RF. A comparison of evolutionary rates of the two major kinds of superoxide dismutases // Journal of Molecular Evolution 34. - 1992. – P. 175-184.
37. Wood R.D. Nucleotide excision repair in mammalian cells // J. Biol. Chem. - 1997. – Vol. 272. – P. 23465–23468.
38. Laurent G, Saparbaev M, Laval J. Enzimology of the repair of free radicals-induced DNA damage // Oncogene. 21. – 2002. – P. 8905-8925.
39. Королев В.Г. Эксциционная репарация поврежденных оснований ДНК: ДНК-гликозилазы. Генетика. 2005. -№ 6 (41). –С. 725-735.
40. Василенко Н.Л., Невинский Г.А. Ферменты прямой, эксцизионной и коррекционной систем репарации высших и низших организмов и их биологическая роль. Молекулярная биология. 2003. -№ 6 (37). –С. 944-960.
Norbury C, Hickson I. Cellular responses to DNA damage. - 2001. – P. 367-401.
ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫҢ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ
әл-фараби атындағы қазақ ұлттық университеті
Биология факультеті
Генетика және молекулалық биология кафедрасы
Бітіру жұмысы
Бидай алейрон клеткаларында АР-эндонуклеазаларының белсенділігі
Орындаушы 4 курс студенті _________________________
Ғылыми жетекшісі _________________________ Бисенбаев
А.Қ.
б.ғ.к., доцент ( қолы, күні)
Норма бақылаушы _________________________ Сатылған
И.А.
( қолы, күні)
Кафедра меңгерушісі
Айташева З.Г.
б.ғ.д.,профессор ( қолы, күні)
Алматы, 2010
МАЗМҰНЫ
КІРІСПЕ 3
1 Әдебиетке шолу 4
1.1 Бидай алейрон клеткаларына жалпы сипаттама 4
1.2 Гиббериллин және абсциз қышқылдарына сипаттама 6
1.3 Оттегінің белсенді түрлері
8
1.4 ДНҚ репарациясына қатысатын ферменттер 13
2 Тәжірибелік бөлім
17
2.1 Материалдар мен зерттеу әдістері
17
2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу мен
инкубациялау шарттары 17
2.1.2 Ішек таяқшасы клеткасын өсіру жағдайлары
17
2.1.3 p. Bluescript-Alk A плазмидасын бөліп алу
19
2.1.4 ДНҚ репарация ферменттерін экстракциялау және белсінділігін
анықтау
20
3 Зерттеу нәтижелері және оны талдау
21
ҚОРЫТЫНДЫ 28
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 29
КІРІСПЕ
Алейрон ұлпасы, бидай дамуының өсiп-өну сатысында, синтетикалық және
секреторлық қызмет атқаратын күрделi ұлпа. Яғни бидай дәнінің өсіп-өну
барысында алейрон қабаттары бірқатар гидролитикалық ферменттерді синтездеп,
оны крахмалды эндоспермге секрециялайды [1,2]. Онтогенездің соңғы сатысында
алейрон клеткалары элиминацияланады. Алейрон қабаттарының бұл өлімі
программаланған (апоптоз), яғни генетикалық детерминацияланған деген болжам
бар [3,4,5].
Оттегiнiң белсендi түрлері (ОБТ) – супероксид (.О), сутектiң асқын
тотығы (Н2О2), гидроксид радикалы (.ОН) өсімдіктер клеткаларының
программаланған өлімі барысында маңызды роль атқаратындығы белгілі [6,7,8].
ОБТ клеткалық метаболизмнің өнімдері болып табылады, олардың ішкі клеткалық
мөлшерін бірқатар антиоксидантты ферменттер (супероксиддисмутаза, аспартат
пероксидаза, глутатионредуктаза, каталаза және т.б.) реттейді. Өсімдік
клеткаларында ОБТ-нің митохондрияларда, хлоропласттарда, плазмалық
мембраналарда, пероксисомаларда және апопластық кеңістіктерде
синтезделетіні анықталған. Сонымен қатар, ОБТ қысқа толқынды сәулелердің
(ультракүлгін және иондаушы сәулелер) және химиялық агенттердің әсерінен де
пайда болуы мүмкін. ОБТ белоктар, липидтер, ДНҚ және т.б. сияқты клеткалық
биомолекулалармен қарым-қатынасқа түсіп, оларды тотықтыру арқылы зақымдайды
[9].
Клеткадағы бұндай процестер әсерінен болатын ДНҚ-ның зақымдалуы, ДНҚ-
дағы генетикалық информацияны өзгертіп, клетканың тіршілігі үшін қауіп
тудыруы мүмкін.
Сондықтан клеткада осындай зақымданулардан сақтайтын, тікелей
зақымдалған негіздерді алмастыратын, DNР пулдарын тазартатын, мисмэтч, BER-
, NER- және NIR-репарация секілді көптеген механизмдері дамыған. Осы ДНҚ
репарациялау жүйелерінің ішінде маңызды қызметті ДНҚ-гликозилаза ферменті
атқарады. Бұл фермент негіздер мен қант қалдығы арасындағы N-гликозидтік
байланысты үзіп, зақымдалған негізді аластатады.
Осыған орай, бұл жұмыстың мақсаты ДНҚ репарациясының басты
ферменттерінің бірі АР эндонуклеаза ферменттерiнiң белсендiлiгiне
гиббереллин (ГҚ) және абсциз (АБҚ) қышқылдарының әсерiн зерттеу болып
табылады.
1 Әдебиетке шолу
1.1 Бидай алейрон клеткаларына жалпы сипаттама
Астық тұқымдастардың алейрон қабаты біртекті жоғары дифференияланған
клеткалардың бір немесе бірнеше қабаттарынан тұратын ұлпа. Алейрон ұлпасы,
бидай дамуының өсiп-өну сатысында, синтетикалық және секреторлық қызмет
атқаратын күрделi ұлпа [1,2]. Онтогенездің келесi сатысында алейрон
клеткалары элеминацияланады. Алейрон қабатының онтогенетикалық
программаланған клеткалар өлiмi апоптотикалық сипатта жүзеге асады деген
болжам бар [3,4].
Алейрон қабатының клеткалары ұзынынан және көлденеңінен кесіндісінде
төртбұрышты немесе сәл созылған пішінде болады. Көптеген мәліметтер
бойынша, алейрондық қабаттың қалыңдығы шамамен 65-70 μ болады (1 сурет).
Алейрон қабатының клетка қабырғасы негізінен клетчаткадан тұрады [10].
Бидай дәнінің эндоспермі тозаң қапшығында, орталық клетканың аталық
жыныс клеткасымен ұрықтану нәтижесінде пайда болатын, триплоидты ұлпа.
Тозаңдану процесінен кейін шамамен 8-10 тәуліктен соң, дән эндоспермі
крахмалды эндоспермге және алейрон қабатына дифференциацияланады [7].
Алайда, ұрықтанған бір клеткадан пайда болатынына қарамастан, алейрон
ұлпасы мен крахмалды эндосперм клеткаларының өлуі әртүрлі уақытта жүзеге
асады. Крахмалды эндосперм клеткалары бидай дәнінің пісіп-жетілу барысында
өліп, дән қуысын белокты және крахмалды гранулалар түрінде толтырып тұрады
деген болжам бар. Ал алейрон клеткалары, дәннің пісіп-жетілу сатысында еш
өзгеріссіз сақталып, тек қана оның өніп-өсу сатысын, гидролитикалық
ферменттерді синтездеп, секрециялау арқылы индукциялағаннан кейін ғана
элиминацияланады [11].
Алейрон клеткаларының ультра құрылымы олардың қызметін көрсетеді.
Дәндегі алейронның көптеген көрсеткіштері оның ерекше және жан-жақты
тәжірибелік жүйе болуын қамтамассыз етеді. Астық тұқымдастарының алейрон
қабаты біртекті, жоғары дифференциалданған клеткалардың бір қабатынан
(сұлы, жүгері, қара бидай, бидай) немесе бірнеше қабатынан (күріш, арпа)
тұрады [12]. Пісіп-жетілген құрғақ алейрон клеткалары қалың
геммицеллюлозалық қабырғамен қоршалған және олар ешқандай да клеткалық
бөлінуге ұшырамайды. Алейрон қабаттарын жабысып қалған өлі крахмалды
эндоспермнен ажыратып алуға болады және ажыратып алынған алейрон ұлпасынан
ферменттердің көмегімен протопластардың біртекті популяциясын дайындауға да
болады [13].
Алейрон клеткаларының цитоплазмасына белоктар қорынан тұратын көптеген
вакуольдер тән, оларды көбінесе алейрондық түйіршіктер деп те атайды, олар
бүкіл клеткаларды алып жатады. Бұл органелла алейронның гормондар әсеріне
қайтаратын реакциясында негізгі қызмет атқарады.
1 сурет. Бидай дәнінің алейрон қабатының құрылысы
Протеиндердің қоры бар вакуольде гиббереллинмен өңделгеннен кейін
гидролизге ұшыраған протеиндерді секреторлық белоктардың түзілуіне қажетті
аминқышқылдармен қамтамасыз ету үшін қор ретінде сақтай бастайды [14].
Протеиндердің қоры бар вакуольдер, сондай-ақ, астық тұқымдастардың
дәндеріндегі минералдардың негізгі қоймасы болып табылады. Олардың
құрамынан минералдар фитин түрінде бөлініп алынған. Фитин К+, Mg2+, және
Ca2+ иондары мен фитинді қышқылынан (гексофосфат) түзілген кристалды,
ерімейтін комплекс болып табылады. Бұл кристалды қосынды, глобоид деп те
аталады. Рентгендік микроанализ нәтижелері бойынша дән құрамындағы РО43+,
К+, Mg2+ және Ca2+ иондарының шамамен 75% алейрон қабаттарында сақталады
[15]. Алейрон немесе протопластардың инкубациялық кезеңінде вакуольдер
көлемдері ұлғайып, бір-бірімен орталық үлкен бір вакуоль түзілгенше қосыла
бастайды. Инкубациялық ортада гиббереллин болған жағдайда клеткалар мен
протопластардағы алейрон қабаттарының вакуольдену процесі жылдамдай түседі.
Бейтарап майларды сақтайтын липидтік қосындылар немесе олеосомдар да
алейрон клеткаларының маңызды органеллалары болып табылады, олар клетканың
бүкіл кеңістігінің 30% алып жатқан үшглицеридтік негізден тұрады [16].
Алейрон қабатының құрамына белок (альбумин, глобулин және т.б.), майлар,
қант, клетчатка, күлдер (золы), суда еритін витаминдер, гемицеллюлозалар,
пентозалар кіреді. Алейрондық қабатта тиамин мен рибофлавин өте көп
мөлшерде болады. Олар флуоресцентті зерттеулер негізінде анықталған (2
сурет).
2 сурет. Бидай дәнінің алейрон қабатының құрамы
1.2 Гиббериллин және абсциз қышқылдарына сипаттама
Гиббереллиндер 1926 жылы Gibberella fujikuroi Sow саңырауқұлағында
табылған, күріш ауруын зерттеу кезінде атақты жапон ғалымы Е.Куросавамен
ашылған болатын. 1935 жылы жапон ғалымы Т.Ябута гиббереллинді осы
саңырауқұлақтардан кристалды түрде бөліп алып, оған өзіне тән атау береді.
Гиббереллиндер-бұл саңырауқұлақ гиббереллаларынан алынатын органикалық
қышқылдарға ұқсас заттар класы. Өсімдіктердің өнуінің стимуляторы болып
табылады және дәнектердің пісіп-жетілуі мен жапырақтардың дамуын
жылдамдатады. Гиббереллиндердің 27 түрі анықталды; олардың барлығы
тетрациклдік дитерпеноидтарға жатады және карбонатты қышқылдар болып
табылады. ГК9 гиббереллині гиббереллиндердің ең негізгі құрылымына
жатқызылады; ал қалған гиббереллиндер оның туындысы ретінде қарастырылады.
Гиббереллиндер тұрақты емес және ол ерітінді мен қышқылдық ортада тез
бұзылады. ГК9-дан көміртекте гидроқышқылдарының және екі байланыс : 233-
2350C пен молярлы массаның болуымен ерекшеленетін гиббереллоидты қышқыл
(ГК3) биологиялық белсенділікті қамтиды [17]. Гиббереллиндер өсімдіктер
өсімін жүйелейтін жүйенің компоненті болып табылады. Гиббереллиндерге
сәйкес, оны “жасыл жапырақтардың гормондары” деп атауға болады.
Гиббереллиндер негізінен фотосинтезделген ұлпаларда өңделеді, бірақ олардың
тамырларында да қалыптасуы мүмкін.
Гиббереллиндер ең алдымен жапырақтар бекітілетін түйіншіктер жақын
орналасқан интеркалярлы меристемаларға әсер етеді (Мысалы фотосинтездейтін
жапырақ неғұрлым көп болса, соғұрлым оның алаңы үлкен болады және олардың
арасындағы түйіншік ұзынырақ бола бастайды, үлкен жапырақ гиббереллинді көп
өндіреді және интеркалярлы меристемаға күшті сигнал береді).
Гиббереллиндер және дәндердің(зерна) өсіп-өнуі
Гиббереллиндермен пайда болатын ең басты нәтиженің бірі дәнектердің өніп-
өсуі кезіндегі қосымша қоректік заттардың мобилизациясы. Бұл процесс
арпада, бидайда жақсы зерттелген, сыра өндіріп шығаруда оның практикалық
мәні өте зор. Дәнді дақылдар ұрықтан, эндоспермнен және тұқым қабығынан
құралады. Қосымша қоректік заттар крахмал түрінде эндоспермде жинақталады.
Дәннің пісіп жетілуінде крахмалдық қабат тірі жасушалардан құрылмайды.
Эндоспермнің перифериясында тек қосымша ақуыздарға алейронды қабатқа бай
тірі жасушалардың жұқа қабаты ғана қалады. Дәннің тұқымы эндосперм
қалқаншасымен жабысады. Қалқанша өніп-өскен кезде, ол гиббереллиндерді
бөліп шығарады. Бұл дәннің оянғанын көрсетеді және оған қоректік заттардың
қажет екенін білдіреді. Гиббереллиндер эндоспермнің алейрондық қабатын
крахмалды дәндермен бірге зона арқылы диффундияцияланады. Алейрондық
қабаттың тірі жасушаларында крахмал- амилазды жоятын ферменттер үшін РНҚ
ұясы синтезделе бастайды [18].
Абсциз қышқылы
Абсциз қышқылы(AБҚ), абсцизин, дормин - өсімдіктердің гормоны.
Алғашқыда абсциз қышқыл үшін жапырақтардың түсуіндегі рөлі ұсынылды, бірақ
қазір мұндай рөл өсімдіктердің біршама түріне ғана арналады. Өсімдіктерде
стресс пен патогенге жауапты абсциз қышқылымен байланысты сигналдық жолдар
жазылған. АБҚ-ның биосинтезіне белсенді қатысатын өнімдер мен гендер
қарастырылды. АБҚ бірнеше патогендік саңырауқұлақтармен өсімдіктерге
қарағанда басқа жолмен синтезделеді. Жапырақтардың түсуінде абсциз
қышқылының рөлі көрсетілген. Қысқа дайындалу кезінде АБҚ өсімдіктердің
соңғы бүршіктерінде синтезделеді. Бұл оның баяулап өсуіне алып келеді. АБҚ
камбий қышқылының бөлінуіне алып келеді және бірінші-екінші реттілік өсуін
тоқтатады [19].
АБҚ сонымен қатар су потенциалын төмендетуге байланысты өсімдіктердің
тамырларында, стресстік жағдайлар кезінде қалыптасады. Кейін АБҚ жапыраққа
келіп түседі, онда осмотикалық потенциал жапырақ саңылауларындағы
жасушаларды өзгертеді және жапырақ саңылауларының жабылуына алып келеді.
Жапырақ саңылауларының жабылуы транспирациясын төмендетеді және жапырақтар
арқылы судың ағып кетуін тоқтатады [20].
1.3 Оттегінің белсенді түрлері
Өсімдіктер өздерінің тіршілік кезеңі барысында қоршаған ортаның әртүрлі
қолайсыз ықпалдарына қарсы тұруы тиіс. Осыған байланысты олардың бойында
өсімдік организмін биотикалық және абиотикалық қолайсыз жағдайлардан
қорғауға бағытталған кең ауқымды бағдарламалар пайда болып, дамыды.
Өсімдіктердің потогенді (ауру тудырғыш) бактериялармен , саңырауқұлақтармен
және вирустармен зақымдалуы олар үшін ең қауіпті жағдайлардың бірі болып
табылады [21].
Микроорганизмдерді өсімдіктерге ендіргеннен кейін олар патогендердің
көбеюін шектеу мен жою мақсатында бір немесе бірнеше қорғаныс механизмдерін
іске қосуы мүмкін. Клетка қабырғаларының қалыңдауы, фитоалексиндердің
түзілуі және антимикробиотикалық белоктардың жиналуы сияқты жалпы
қорғаныстық реакцияларды жүзеге асырады. Бұл реакциялардың уақыт пен
кеңістік бойынша реттелуі ие организм мен патоген арасындағы қарым-
қатынастың нәтижесін қамтамасыз етуде шешуші фактор болып табылады
(организм не микроорганизмнің ықпалына душар болып, беріледі, не оған қарсы
әрекет етеді). Көп жағдайда, бұл реакциялар зақымдалған ошақта бірнеше
клеткалардың өлімге ұшырауымен байланысты болады (гиперсезімталды жауап).
Қорғаныстық реакциялардың жүре бастауы үшін не организмге енген патоген
арқылы түзілген, не өсімдіктің клеткалық қабырғаларынан босап шыққан белгі
бергіш молекулалардың қабылдануы қажет. Мұндай молекулалар "элиситерлер"
(ағылш . elicit-қоздырып-шақыру, шығарып алу) деп аталады, олардың кейбі-
реулері олигосахаридтер, белоктар және пептидогликандар ретінде иденти-
фикацияланады [22]. Бұл элиситерлер ие организм-микроб түріндегі белгілі
бір өсімдік жүйесі үшін арнайы түрдегі молекулалар болуы мүмкін, немесе
арнайы емес сипаттағы молекулалар түріндегі, мысалы, өсімдіктердің
клеткалық қабырғаларының бөліктері немесе өсімдік организміне енген
патогеннің клеткалық бөлшектері ретінде болуы мүмкін.
Өсімдіктердің суспензия-культурасы ортасында қорғаныстық реакция-
ларды тудыру үшін элиситер молекулаларының қоспасы қолданылған жағдайда,
қорғаныс жауабының негізінен клетка қабырғасының бетінде жүзеге асатын,
жылдам жүруші процесстерден тұратын жаңа жақтары анықталады. Реакциялардың
ішінде мынадай түрлері идентификцияланады : оттегінің белсенді түрлерінің
(ОБТ) босатылуы (тотықтырушы қопарылыс) [21]; клеткадан тыс рН мәнінің,
мембрандық потенциалдардың, иондар қозғалысының өзгеріске ұшырауы;
белоктарды фосфарлау моделінің өзгеруі [22]; клеткалық қабырғаның белоктық
бөліктерінің тотыға иммобилизациялануы.
Клеткалардың көпшілігі ОБТ-рін өндіруге және бейтараптауға қабілетті
келеді. Қалыпты жағдайда ОБТ клеткада молекулалық оттегінің (О2) бір
электрондық тотықсыздануы нәтижесінде міндетті түрде түзіліп отыратын
қосымша өнім ретінде кездеседі. Сонымен қатар, клеткадағы ОБТ деңгейінің
мүмкіндігінше ең төмен болуын қамтамассыз ету үшін көптеген клеткаларда
арнайы қорғаныстық механизмдер болады.
Сүтқоректілерде ОБТ өндіру реакциясы жүретіні бізге 30 жылдан астам
уақыттан бері белгілі (фагоциттердегі респираторлық жарылу), өсімдіктерде
бұл құбылыс едәуір кеш анықталады [23]. Жуық арада жарияланған жұмыстардың
нәтижесі бойынша ОБТ тек организмдерге енген патогенге қарсы қорғаныс
құралы ретінде ғана қызмет атқарып қоймай, өсімдіктердің бұдан кейінгі
қорғаныстық реакцияларын, сонымен бірге, зақымдалған клеткалардың
гиперсезімталды жауабын белсендіруші сигнал болып табылады [24].
ОБТ молекулалық оттегінің белгілі бір ретпен тотықсыздануы барысында
түзелетін (1- cызба) : супероксид (О2*), сутегінің асқын тотығы (Н2О2),
және гидроксил радикалы (ОН*) өнімдері.
1 сызба. ОБТ молекулалық оттегінің белгілі бір ретпен тотықсыздану
барысында түзілетін өнімдер.
Бұл қосылыстар стреске ұшырамаған клеткалардың митохондриялары мен
хлоропластарындағы жүретін тотығу-тотықсыздану реакциялары нәтижесінде аз
мөлшерде түзіледі.
О2* түзілу үшін энергия аз мөлшерде жұмсалады. Тірі клеткалардағы
супероксидтің мөлшері оның протондалған түрі гидропероксил радикалдың
(О2Н*) мөлшерімен бірдей болады. Гидропероксил радикалы супероксидке
қарағанда анағұрлым гидрофобты келеді және мембраналардың липидті қабаттары
арқылы оңай енеді. рН-мәні физиологиялық болған жағдайда супероксид
клетканың макромолекулаларымен әлсіз түрде әрекеттеседі. рН мәні бейтарап
немесе әлсіз сілтілі болған жағдайда супероксид те, гидропероксил радикалы
да Н2О2 және О2 ыдырайды. Бұл реакция кенеттен жүруі мүмкін, сондай-ақ
супероксиддисмутазаның (СОД) қатысуыменде жүреді.
Н2О2 салыстырмалы түрде алғанда тұрақты ОБТ болып табылады. Н2О2
реакцияға түсу қабілеті жоғары емес. Ол электрлік тұрғыдан алғанда бейтарап
бола отырып, клеткалық мембраналар арқылы еніп, Н2О2 түзілген аймақтан
алшақ жатқан жерлерге жетуге қабілетті келеді. Өсімдік клеткаларында
жаңадан түзілген Н2О2 мынадай өзгерістерге ұшырауы мүмкін: 1) өздігінше
кенеттен немесе каталазаның қатысуымен су және оттегіге ыдырайды; 2)
әртүрлі пероксидазалар үшін субстрат ретінде болуы мүмкін, мысалы,
лигниннің түзілуін құрлымдық тұрғыдан тежейтін феноксил радикалдарының
түзілуі үшін субстрат болып келеді; 3) дегидроаскорбатредуктазамен және
глутатион-редуктазамен бірлесіп әсер ететін аскорбат пероксидаза көмегімен
зияндылығы жойылуы мүмкін. Белгі бір жағдайда,тотықсыздандырғыш болған
кезде, Н2О2 пероксидазалар арқылы Compound III түзілуін қамтамассыз ететін
реакциялардың ретті тізбегіне айналуы мүмкін.
Гидроксил радикалы бұл жұмыста аталған ОБТ ішінде реакцияға түсу
қабілеті ең жоғары болып келетін түрін құрайды. Ол Н2О2 мен О2* өзара
әрекеттесуі нәтижесінде пайда болуы мүмкін. Қалыпты клеткаларда бұл
реакция баяу жүреді және ОН* көп мөлшерде өндірілуі үшін тиімсіз болып
табылады [25]. Бірақ, Fe2+ немесе Cu+ сияқты транзиттік металлдардың
тотығуынан (Фентон реакциясы) және бұл тотыққан иондардың супероксидтің
қатысуымен тотықсызданған түрлеріне дейін регенерациялануынан тұратын
реакциялар циклы барысында ОН* айтарлықтай көп мөлшерде түзіледі. ОН*
радикалдық тізбекті реакцияларды бастауға қабілетті болғандықтан, ол
клеткалық макромолекулалардың қайтымсыз өзгерістерге (модификацияға)
ұшырауына және органеллалардың зақымдалуына жауапты болып келетін негізгі
ОБТ ретінде саналады [26]. ОН* бос күйінде болуы шамамен 0,000000002 сек
тең болғандықтан оны көзбен көру және оның патоген-өсімдік қарым-
қатынасындағы рөлін анықтау сәтсіз аяқталды. N-ацетилхит-олигосахаридті
элиситермен өңделген күріштің (Oryza sativa) суспензиялық культура
клеткаларына жақында ғана жүргізілген тәжірибелер нәтижесінде, бұл
модельдік жүйеде ОН* түзілетіні анықталды [25].
Өсімдік клеткаларының көптеген жануар жүйелерінен ерекшелігі ,
олар ОБТ негізінен алғанда Н2О2 түрі үнемі ,айтарлықтай көп мөлшерде
өндіруге қабілетті келеді, бұл процесс әдетте клетканың экстрацеллюларлық
компарт-ментімен байланысты болады және ол гормондар жарық сәулесі,
механикалық зақымданулар сияқты әртүрлі фактолар арқылы реттеледі. Н2О2
лигнификация процесіне ұшырайтын клеткаларда кездеседі, мысалы, трахеялық
(түтікше) элементтерден және флоэма талшықтарынан көруге болады, ал тез
ұзарушы клеткалардың клеткалық қабырғаларында әдетте болмайды; механикалық
стреске шалдығып зақымдалған клеткаларда Н2О2 қарқынды түрде өндіріледі.
Сырттан түрткі болған факторларға жауап ретінде ОБТ көп мөлшерде,
жылдам өндірілуі тотықтырушы қопарылыс болып табылады [23,27,28]. ОБТ
өндірілу жайында алғашқы мәліметтер 1983 жылы пайда болды, бұл мәліметтер
бойынша картоп түйіндеріне (Solanum tuberosum) өзімен сәйкес келмейтін
Phytophthora infestans тұқымын өндіріп өсірген (инокуляциялаған) жағдайда
картоп түйіндері супероксид түзе бастайды [27]. Бұл реакция сондай-ақ
потогенді микроорганизмдермен зақымдалған өсімдіктерде және элиситерлік
препараттармен, қоздырғыштың бөліктерімен өңделіп немесе механикалық
стреске ұшыратылып өсірілген клеткаларда да байқалады. Көптеген мәліметтер
бойынша, тотықтырушы қопарылысқа қатысатын негізгі ОБТ - Н2О2 болып
табылады, О2* қатысуы да мүмкін. Н2О2 мен О2* түзілуі химиялық тұрғыдан
алғанда ұқсас келеді, сондықтан тотықтырушы қопарылыстағы СОД (NN-
диэтилдитиокарбамат) ингибиторының әсерінен бұзылатындықтан, Н2О2 СОД
қатысуымен О2*-нен түзіледі деген болжам бар [25].
ОБТ өнімдерінің кенеттен жоғарлауы әдетте жылдам түрде өтеді, сондай-
ақ, әр-түрлі зиянды факторларды пайдаланған жағдайда зерттеліп жатқан түрлі
жүйелерде өзгеше болады. Суспензиялық-культура клеткаларында реакция
әдетте, ортаға элиситерлерді қосқаннан кейін 1-2 минут өткен соң басталып,
бірнеше минуттан кейін ең жоғарғы шегіне жетеді де элиситер-леудің
басталғанына 30-60 минут болғанда аяқталады [27, 28]. Тотықтырушы
қопарылысты зерттеу үшін өсімдіктің бөліктерін пайдаланған кезде реакция
айтарлықтай кеш байқалды: элиситерлеуден кейін 8-12 сағатта басталып
[29,30], 2-4 сағаттан соң ОБТ түзілуінің айқын белгілері көрінді [31]. Мұны
салат-латук өсімдігіне тән келмейтін Pseudomonas syringеae тұқымын
инокуляциялағаннан кейін 5 сағат өткен соң салат-латук өсімдігі in-vivo
жағдайында Н2О2 өндіретіндігінің анықталғандығы растай түседі [27]. Басқа
мәліметтердің хабарлауынша, қиярдың (Cucumis sativus) кутикуласын алып
тастап, гипокотиль аймағын не салицил қышқылымен(СҚ) не 2,6-
дихлороизоникотин қышқылымен(ИНҚ) өңдеу арқылы қиярдың гипоко-тилінде
жылдам жүретін реакцияны тудыруға болады, салицил қышқылы мен 2,6-
дихлороизоникотин қышқылы тіршілік ету барысында пайда болатын жүйелі
төзімділіктің индукторлары болып табылады [32]. Мұндай гипокотильдерде Н2О2
өндірілуі элиситерлеуден кейін 20 минут өткеннен соң аяқталады, бұл
суспензиялық культура клеткаларында байқалатын өзгеріске ұқсас келеді.
Гипокотильдерді алдын-ала өңдеудің әсері циклогексимидті немесе
пуромицинді қосқан жағдайда толық тежеледі, яғни бұл процесте белоктың
түзілуі қатар жүріп отыруы қажет [28]. Гипокотильдерді олиго-1,4-Д-
галактуронидтермен өңдеген жағдайда да нақ осындай өзгеріс байқалады [33].
Осыған ұқсас басқа да зерттеу жұмыстарының нәтижесі бойынша соя өсімдігінде
қорғаныс реакцияларын тудыруға қажетті болып табылатын, "элиситерлеуге
ықпал етуші факторлар" болады. Суспензиялық культура клеткаларында
араластыру нәтижесінде олар механикалық түрткіге үнемі ұшырап
отыратындықтан, "алдын-ала өңдеуден туатын жер" бұл жүйелерге онсыз да тән
қасиет болуы мүмкін. Суспензиялық культура клеткаларын алдын-ала салицил
қышқылымен өңдеген жағдайда тотықтырушы қопарылыстың ұзақтығы өзгермейтіні,
ал ОБТ түзілуі күшейе түсетіні назар аударарлық. Әртүрлі өсімдіктер
жүйесінде әртүрлі элиситерлердің тотық-тырушы қопарылыс тудыру қабілетіне
қарай отырып, өсімдік жүйелерін салыстырған кезде ОБТ өндірілуінің
қарқындылығында және көріну уақы-тында айтарлықтай айырмашылық байқалады.
Соя өсімдігінің суспензиялық культура клеткаларында олиго-1,4-Д-
галактуронид ықпалынан туған тотықтырушы қопарылыс Verticillum dahliae
құрамынан алынған таза емес элиситерлермен өңдеуден туатын тотықтырушы
қопарылысқа өте ұқсас болып шықты. Аталған элиситердің белоктық бөлігі емес
көмірсутектік бөлігі. Н2О2 өндірілуін тудыруға жауап беретіні анықталды
[34]. Темекі (Nicotiana tabacum) клеткаларында өзгеше құбылыс байқалады,
бұл өсімдіктерде Phytoptora parasitica құрамынан алынған таза емес күйдегі
элиситер әсеріне тотықтырушы қопарылыс пайда болмайды, ал криптогеин
(темекі үшін патогенді емес Phytoptora parasitica культуралық ортасынан
алынған белок) ол өсімдіктерде ОБТ генерациясын тиімді түрде индукциялайды
[27].Барлық тұқымдас өсімдіктердің суспензиялық культура клеткаларына
әртүрлі төрт элиситердің әсер етуі сыннан өткізілді. Уақытқа байланысты
көрсеткіштері жуық шамамен алғанда бірдей болғанына қарамастан,
реакциялардың қарқындылығында үлкен айырмашылықтар байқалады.Colletotrichum
lindemuthianum клеткалық қабырғасынан алынған тазаланбаған күйдегі
элиситерлі препарат тотықтырушы қопарылысты ең күшті индукциялайды. Бұл
элиситерлерді бидайдың ұрықтық агглютинімен өңдеген жағдайда, оның
белсенділігі төрт есе төмендеді, бұл жағдай индукция процессінде N-ацетил-
глюкозогендік қалдықтардың маңызды екенін білдіреді. Бірақ элиситерлеу үшін
хотинді немесе хитозанды олигомерлерді қолданған жағдайда тотықтырушы
қопарылыстың қарқындылығы тек 10 % -ға жетті, және тазаланбаған күйдегі
элиситердің әсерінен туатын тотықтырушы қопарылыстың қарқындылығынан төмен
болып шықты, яғни мұндай реакцияларды индукциялауға қажет болып табылатын
басқада компаненттер бар [35].
Барлық жағдайларда егер, сырттан келіп отыратын тотықсыздандырғыш
болмаса ОБТ өндірілуі байқалмайды. Сәбіз протопластына тотықсыздандырғыш
қоспай, оны Pythium aphanidermatum културасынан алынған элиситермен өңдеген
жағдайда тотықтырушы қопарылыс байқалмайды, бірақ иондардың қозғалысы және
4-гидробензой қышқылының түзілуі сияқты элиситер әсерінен туатын басқа
реакциялар байқалады [36].
1.4 ДНҚ репарациясына қатысатын ферменттер
ДНҚ репарациясы - тірі организмнің ДНҚ-ғы өзгерістерін қалпына
келтіру қабілеті болып табылады [37]. Әртүрлі мутагендік факторлар оның
ішінде ОБТ әсерінен болатын ДНҚ-ның зақымдалуы, ДНҚ-дағы генетикалық
информацияны өзгертіп, клетканың тіршілігі үшін қауіп тудыруы мүмкін.
Сондықтан клеткада осындай зақымданулардан сақтайтын, тікелей зақымдалған
репарация негіздерді алмастыратын,DNР пулдарын тазартатын, мисмэтч
репарация және де BER-негіздерді кесетін репарация, NER-нуклеотидтерді
кесетін репарация және NIR-нуклеотидтерді кескілейтін (разрезающий)
репарация секілді, көптеген репарация механизмдері дамыған. Осы механизмдер
ішінде негіздерді кесіп алып тастайтын репарация (BER)көптеген тотыға
зақымдалған ДНҚ-ды қалпына келтіре алады. Алайда басқа да репарация
жолдары да бұл зақымдануларды репарациялауда эффективті болып табылады.
BER жолы. Зақымдалған негіз ДНҚ-гликозилаза көмегімен кесіліп,
нәтижесінде апуриндік-апиримидиндік сайт пайда болып, АР-сайт апуриндік-
апиримидиндік эндонуклеазалар арқылы ыдыратылып, тізбек бөлек нуклеотидтер
тармағы мен ұзын аудандар тармағына ыдырайды.
ДНҚ-гликозилаза аномальді негізді танып, сол негізбен қантты
байланыстыратын N-гликозидтік көпірдің үзілуін катализдейді. Нәтижесінде АР
сайт пайда болғаннан кейін BER жолының басқа да ферменттеріне жұмыс
атқаруға мүмкіншілік туады. АР эндонуклеазалар мен фосфодиэстеразалар 3'-
гидроксил және 5'-фосфат соңдарынан тұратын бір нуклеотидтік бос аралықтың
пайда болуын катализдеп, ДНҚ-полимеразаның сол аралықты толтыруына жол
ашады. Соңында ДНҚ-лигаза қалған зақымдануларды жөндей алады.
BER- репарациясының екі жолы белгілі: 1 short - patch репарация және
2 long-patch репарация. Short - patch pепарацияда β-ДНҚ-полимеразаға
тәуелді түрде бір ғана зақымдалған негізді алып тастай алса, long- patch
репарация алты және одан да көп негіздердің алмасуын алып тастай алады
[38].
ДНҚ-гликозилаза. ДНҚ-ны зақымдайтын ОБТ-нің көпшілігі BER-ферменттері
үшін субстрат болып табылады.BER-жолының негізгі ферменттері. ДНҚ-
гликозилазалар дизоксирибоза мен зақымдалған негіз арасындағы N-гликозидтік
байланысты үзіу арқылы ДНҚ-дағы зақымданулар мен дұрыс жұптаспаған
негіздерді алып тастап, АР-сайт түзеді.
ДНҚ-гликозилазаның екі түрі белгілі. Олар монофункциональді және
бифункциональді ДНҚ-гликозидазалар. Монофун,кциональді ДНҚ-гликозидазалар N-
гликозидтік байланысты үзіп, өзгерген негіздерді кесіп, соңғы өнім ретінде
АР-сайт түзеді. АР-сайтты АР-эндонуклеаза өңдейді. Бифункциональді ДНҚ-
гликозидазалар N-гликозидтік байланысты үзіп, өзгеріске ұшыраған негізді
алып тастаумен қатар 3'фосфодиэфирлі байланысты үзіп β-элиминациялаушы
механизм арқылы АР-сайт түзіп, -3'-фосфат және 3'-фосфогликолат
соңды біртізбектік үзіліске әкеледі. Нәтижесінде АР-сайттан кейінгі негіз
АР-эндонуклиаза арқылы ыдырап ДНК полимеразаға бос аралықты толтыруға
мүмкіндік береді. [40]
FPG-белок. ДНҚ-гликозилазалар ішінде жақсы зерттелгені E.Coli-дің FPG
белогі. FPG белогі 269амин қышқылынан тұратын 302.2 кДа глобулярлі
мономер.Ол in vitro жағдайында өзгеріске ұшыраған пуриндерді, әсіресе 2,6-
диамино-4-гидрокси-5N-метилформамид опиримидин мен 7,8-дигидро-8-оксогуанин
қалдықтарын, сонымен қоса пиримидиннің тотыққан өнімдерін, мысалыға, 5-
гидроксицитозин, 5,6-дигидротимин, 5-гидроксиурацил, тимин гликольді кесе
алады. FPG - АР-лиазалық белсенділігі бар бифункционалды ДНҚ-гликозидаза.
Ол ДНҚ-ны β-σ элиминация механизмі арқылы АР сайттарға кесе алады. Сонымен
қоса дезоксирибозаның 5'-соңындағы фосфатты кесе алатын белсенділікке ие.
in vivo жағдайында FPG GC→TA спонтандық трансверсиясын болдырмайтын
антимутаторлық эффектіге ие. Ол Mut Y белогімен бірлесе әсер етеді. fpg mut
y мутант СС104 экстремальді мутаторлық фенотип көрсетеді. Қызығы
бактериалардың fpg генінің адам клеткасындағы экспрессиясы γ-сәулелердің
мутагенділігін төмендетеді. Алайда клетканың тіршілігі үшін ешқандай эффект
көрсетпейді [40].
Fpg – ң СООН соңында міндетті түрде (Суs – X2 – Cys – X16 – Cys – X2 –
Cys – X2 – COOH) цинк – саусақ мотив болады. Fpg – ң бұл активті ауданы
аминдік соңының алғашқы 73 амин қышқылы қалдықтарының шегінде орналасқан
[41].
Жақында Fpg - ң белогының үш деңгейлік құрылысын шешуде үлкен
жетістікке қол жеткізілді. Сугахара мен оның әріптестері жоғары термофильді
Thermus thermofhilus бактериясының НВ8 (НВ8 – Fpg) Fpg –ге гомологты
белогының үш деңгейлік кристалдық құрылысын анықтады. Бұл Fpg
белогының молекуласы өзара серпімді стержень арқылы байланысқан екі түрлі
ауданнан тұратынын көрсетті. Ізінше Костайнг пен оның әріптестері
Lactococcus Lactis Fpg мен 1,3 пропандиол (Pr) АР сайт арасындағы
ковалентсіз комплекстің құрылысын анықтады. Олар Fpg лизинге қарсы
цитозинді танып, ДНК – дан Pr ығыстырып, ДНҚ - ң 60-градусқа майысуына
әкелетінін көрсеткен. Сонымен НВ8 – Fpg дің құрылысына сай Е. Соli – дің
Fpg-і bilobal белок екені анықталды. Онда ДНҚ-ы байлайтын теріс зарядталған
ауқымды терең аймағы бар екені анықталды.
(Радиотөзімділігі жоғары Deinococcus radiodurans бактериясынан 2 Fpg
белогы бөлініп алды. Екеуі де Ғару мен 8 – ОХОG қалдығын кесіп, В – лиазді
белсенділік көрсетеді. Сонымен қоса біреуі тимин гликольді кесе алады.)
Fpg белогының S. Cerevicae ашытқысындағы 8-оксогуанин – ДНК
гликозиказа (УОGG1) гомологы анықталды. Алайда олардың Аминқышқылдық
тізбектерін салыстырғанда ешқандай байқалатындай ұқсастық табылмаған.
Дегенмен олар ұқсас функция атқарады. Fpg белогының сонымен қатар
сүтқоректілерде де (мысалы адамда HOOG1) гомологы табылған.
АР эндонуклеаза. АР эндонуклеаза АР сайттардың цитотоксикалық және
мутагендік потенциялын тежейді. АР сайттар – ДНҚ-да ОБТ әсерінен спонтанды
дезпуринделу, дезпириминделу әсерінен немесе ДНҚ гликозилазамен өзгерген
негіздерді алып тастағаннан кейін екінші реттік зақымдалудан пайда болады.
АР сайт дұрыс коделенбейтін қасиетке ие. Себебі репликация барысында АР
сайтқа қарсы көбінесе А қойылады. Бұл жағдай кейіннен А rule яғни А
ережесі деп аталады.
Ферменттердің АР сайтты тану құбылысы алғашқыда Верлидің жұмыстарында
суреттелген. ДНҚ-ны АР сайт аудандарында 2 түрлі фермент танып кеседі. Олар
зақымдануларды гидролитикалық механизмен өңдейтін экзонуклеаза ІІІ (Xth)
және эндонуклеаза ІV (Nfo). Ар эндонуклеазалық белсенділікпен қатар
фосфодиэстеразалық белсенділікке ие. Осы белсенділік арқылы ол
оксиданттармен индуцирленіп үзілген тізбектің 3 соңындағы фосфогликалат
тәрізді қанттардың фрагменттелген қалдықтарын алып тастайды. АР
эндонуклеазалар 3'- соңындағы топтарды АР-лиаза көмегімен В – элеминациялау
арқылы да алып тастай алады.
Nfo белок (эндонуклеаза ІV). АР эндонуклеазалық белсенділіктің 5%ғана
көрсететін ЕОТА – ға төзімді АР эндонуклеаза. Ол тотықтырушы стреспен
индуцирленіп, SOX RS системаның бақылауында болады. E.Coli-де эндонуклеаза
ІV – ті коделейтін ген Nfo жан – жақты сипатталған. Nfo белогы 30кДа
мономер. Ол бірнеше белсенділікке ие. Бұл 3' белсенділіктер соңдарын
тазалауы репарацияның ДНҚ синтезіне дайындығы ретінде ұсынылған. E.Coli-дің
Nfo мутанттары bleomycia мен Т-бутилгидропероксид секілді тотықтырушы
агенттердің летальды эффектілеріне өте сезімтал болып келеді. Сонымен қоса
бұл мутация Xth Nfo мутанты У радияцияға да сезімталдық көрсетеді. Nfo-ң
жоғары қабілеттілігі оның деңгейлік құрылымының ашылуымен белгілі болды.
Nfo ЈВ- белок. Бұл құрылым ДНК тәрізді үлкен молекулаға бекінуге арнайы
маманданған Nfo белок өзінің бүйір тізбегін ДНҚ-ң шамалы рутинасына
инсерциялау арқылы АР сайтты тани алады және көптеген қалыпты ДНҚ негіздері
ішінен АР сайт пен оған қарама – қарсы нуклеотидті ығыстырып, ДНҚ-ны 90º
майыстырады [39].
АР- эндонуклеаза Аре1, Аре2 Адамдағы басты эндонуклеаза (НАР-
1Аре1АреХ) E.Coli-дің Xth белогына гомологты. Ол АР эндонуклеаза және Fos
– Jun, Jun-Jun, Аре1 белок және NF – каппа В, Муb және ATFCREB
тұқымдасының өкілдері секілді ДНҚ- мен байланысқан домендердің тотығу –
тотықсыздануының регуляторы ретінде идентификацияланған.
Аре1 р53 активтендіретін 35,5 кДа ядролық белок. Тышқандардың
гомозиготты Арех генінің бағытталған бұзылыстары олардың эмбриондарының
летальды жағдайына әкеледі. Ал гетерозиготты тышқандардың фенотипінде
жабайы типпен салыстырғанда ОБТ әсерінен болатын айтарлықтай өзгерістер
байқалмайды. Аре1 қосарлы рөліне байланысты эмбриондардың летальды жағдайы
я ВЕR-дің деффектісімен, я кейбір транскрипциялық факторлардың
деффектісімен байланысты. Аре1 E.Coli үшін экзонуклеаза ІІІ ал S.
Cerevicae үшін Арп1 алмастыра алады. Ол АР эндонуклеазалық белсенділікпен
қатар 3' – 5' экзонуклеазалық, фосфодиэстеразалық, 3' фосфотазалық және НRN-
азалық белсенділік көрсете алады. Алайда бұл белсенділіктер АР
эндонуклеазалық белсенділікке қарағанда 3-4 есе әлсіз болып келеді. Чоу мен
Ченг Аре1-дің 3' – мисмэтч экзонуклеазалық белсенділігінің болуына
байланысты, оны корректураны оқи алатын фермент ретінде де қарастыруға
болады деген.
Аре1 ВЕR-де орталық рольді ойнайды. Ол “short -patch” және “long -
patch” репарацияға да қатысады. Ол сонымен қоса ВЕR-дің маңызды регуляторы
бола алады. Аре1 in vivo жағдайында ВЕR-дің ең маңызды ферменті ДНҚ
полимераза β мен әрекеттесіп β полимеразаны ДНҚ АР сайтына енуіне жол ашып,
оның dRP – азалық белсенділігін күшейтеді. Аре1 сонымен қатар ВЕR-дің басқа
да ферменттерімен XRCC1, PCNA, және FEN1 мен байланыса алады, және де р21-
дің ВЕR –гі ингибиторлық эффектісін компенсациялап, long – patch ВЕR-ді
стимулдей әрі бағыттай алады. Аре1 ДНҚ гликозилазаны да стимулдей алады.
Осыған орай ВЕR белок пен белоктың өзара әсерлесулері арқылы стимулденіп,
бағытталады, және де мұнда Аре1 маңызды роль атқарады деп айтуға болады.
Екінші АР эндонуклеаза Аре2 сүтқоректілерде анықталған. Ол S.
Cerevicae-нің Арn2 белогына гомологты. Аре2 белогын коделейтін аре2 ген Х
хромосомада орналасқан. Аре2 57,3 кДа белок. Ол көбінесе ядрода сонымен
қоса митохондрияда да кездеседі. Аре2 PCNA-мен колокализденіп онымен in
vitro жағдайында да әрекеттесе алады. Бұл Аре2-нің ядролық және
митохондриялық ВЕR-ге қатысатынын, ал ядродағы ролі PCNA-ға тәуелді екенін
көрсетеді [41].
2 Тәжірибелік бөлім
2.1 Материалдар мен зерттеу әдістері
Зерттеулерде Қазақстан 4 сортты гексоплоидты бидайдың (Triticum
aestivum) деэмбриональды дәндерінен жекеленген алейрон ұлпалары қолданылды.
Сонымен қатар келесі фитогармондар׃ гиббереллин қышқылы, абсциз қышқылы
пайдаланылды.
2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу мен
инкубациялау шарттары
Тәжірибелерде деэмбриональды дәндердің жекеленген алейрон ұлпаларын
пайдаландық [1]. Эндогенді гиббереллиндердің алейрон клеткаларына әсерін
тежеу үшін, бидай дәндерінің ұрық бөліктері алынып тасталынды. Алынған
ұрықсыз бидай бөліктерін 10 минут 1%-натрий гипохлориды ерітіндісінде
зиянсыздандырып, оларды стерильді суда бірнеше рет жудық. Содан соң, 100 г
стерильді құм бар Петри табақшаларын дайындап, оларды 20-25 мл ионсыздалған
сумен ылғалдап, 150-200 деэмбриональды дәндерді орналастырып,
инкубацияладық. Ұрықсыз дәндердің алғашқы инкубациясын үш күн мерзімде,
шайқағышта (220 айнмин), 25° С температурада, қараңғылық жағдайда
жүргіздік. Инкубация уақыты аяқталған соң дән жартыларын шығарып, 20 мл
суда құмнан тазарттық. Алейрон қабаттарын бөліп ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
әл-фараби атындағы қазақ ұлттық университеті
Биология факультеті
Генетика және молекулалық биология кафедрасы
Бітіру жұмысы
Бидай алейрон клеткаларында АР-эндонуклеазаларының белсенділігі
Орындаушы 4 курс студенті _________________________
Ғылыми жетекшісі _________________________ Бисенбаев
А.Қ.
б.ғ.к., доцент ( қолы, күні)
Норма бақылаушы _________________________ Сатылған
И.А.
( қолы, күні)
Кафедра меңгерушісі
Айташева З.Г.
б.ғ.д.,профессор ( қолы, күні)
Алматы, 2010
МАЗМҰНЫ
КІРІСПЕ 3
1 Әдебиетке шолу 4
1.1 Бидай алейрон клеткаларына жалпы сипаттама 4
1.2 Гиббериллин және абсциз қышқылдарына сипаттама 6
1.3 Оттегінің белсенді түрлері
8
1.4 ДНҚ репарациясына қатысатын ферменттер 13
2 Тәжірибелік бөлім
17
2.1 Материалдар мен зерттеу әдістері
17
2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу мен
инкубациялау шарттары 17
2.1.2 Ішек таяқшасы клеткасын өсіру жағдайлары
17
2.1.3 p. Bluescript-Alk A плазмидасын бөліп алу
19
2.1.4 ДНҚ репарация ферменттерін экстракциялау және белсінділігін
анықтау
20
3 Зерттеу нәтижелері және оны талдау
21
ҚОРЫТЫНДЫ 28
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 29
КІРІСПЕ
Алейрон ұлпасы, бидай дамуының өсiп-өну сатысында, синтетикалық және
секреторлық қызмет атқаратын күрделi ұлпа. Яғни бидай дәнінің өсіп-өну
барысында алейрон қабаттары бірқатар гидролитикалық ферменттерді синтездеп,
оны крахмалды эндоспермге секрециялайды [1,2]. Онтогенездің соңғы сатысында
алейрон клеткалары элиминацияланады. Алейрон қабаттарының бұл өлімі
программаланған (апоптоз), яғни генетикалық детерминацияланған деген болжам
бар [3,4,5].
Оттегiнiң белсендi түрлері (ОБТ) – супероксид (.О), сутектiң асқын
тотығы (Н2О2), гидроксид радикалы (.ОН) өсімдіктер клеткаларының
программаланған өлімі барысында маңызды роль атқаратындығы белгілі [6,7,8].
ОБТ клеткалық метаболизмнің өнімдері болып табылады, олардың ішкі клеткалық
мөлшерін бірқатар антиоксидантты ферменттер (супероксиддисмутаза, аспартат
пероксидаза, глутатионредуктаза, каталаза және т.б.) реттейді. Өсімдік
клеткаларында ОБТ-нің митохондрияларда, хлоропласттарда, плазмалық
мембраналарда, пероксисомаларда және апопластық кеңістіктерде
синтезделетіні анықталған. Сонымен қатар, ОБТ қысқа толқынды сәулелердің
(ультракүлгін және иондаушы сәулелер) және химиялық агенттердің әсерінен де
пайда болуы мүмкін. ОБТ белоктар, липидтер, ДНҚ және т.б. сияқты клеткалық
биомолекулалармен қарым-қатынасқа түсіп, оларды тотықтыру арқылы зақымдайды
[9].
Клеткадағы бұндай процестер әсерінен болатын ДНҚ-ның зақымдалуы, ДНҚ-
дағы генетикалық информацияны өзгертіп, клетканың тіршілігі үшін қауіп
тудыруы мүмкін.
Сондықтан клеткада осындай зақымданулардан сақтайтын, тікелей
зақымдалған негіздерді алмастыратын, DNР пулдарын тазартатын, мисмэтч, BER-
, NER- және NIR-репарация секілді көптеген механизмдері дамыған. Осы ДНҚ
репарациялау жүйелерінің ішінде маңызды қызметті ДНҚ-гликозилаза ферменті
атқарады. Бұл фермент негіздер мен қант қалдығы арасындағы N-гликозидтік
байланысты үзіп, зақымдалған негізді аластатады.
Осыған орай, бұл жұмыстың мақсаты ДНҚ репарациясының басты
ферменттерінің бірі АР эндонуклеаза ферменттерiнiң белсендiлiгiне
гиббереллин (ГҚ) және абсциз (АБҚ) қышқылдарының әсерiн зерттеу болып
табылады.
1 Әдебиетке шолу
1.1 Бидай алейрон клеткаларына жалпы сипаттама
Астық тұқымдастардың алейрон қабаты біртекті жоғары дифференияланған
клеткалардың бір немесе бірнеше қабаттарынан тұратын ұлпа. Алейрон ұлпасы,
бидай дамуының өсiп-өну сатысында, синтетикалық және секреторлық қызмет
атқаратын күрделi ұлпа [1,2]. Онтогенездің келесi сатысында алейрон
клеткалары элеминацияланады. Алейрон қабатының онтогенетикалық
программаланған клеткалар өлiмi апоптотикалық сипатта жүзеге асады деген
болжам бар [3,4].
Алейрон қабатының клеткалары ұзынынан және көлденеңінен кесіндісінде
төртбұрышты немесе сәл созылған пішінде болады. Көптеген мәліметтер
бойынша, алейрондық қабаттың қалыңдығы шамамен 65-70 μ болады (1 сурет).
Алейрон қабатының клетка қабырғасы негізінен клетчаткадан тұрады [10].
Бидай дәнінің эндоспермі тозаң қапшығында, орталық клетканың аталық
жыныс клеткасымен ұрықтану нәтижесінде пайда болатын, триплоидты ұлпа.
Тозаңдану процесінен кейін шамамен 8-10 тәуліктен соң, дән эндоспермі
крахмалды эндоспермге және алейрон қабатына дифференциацияланады [7].
Алайда, ұрықтанған бір клеткадан пайда болатынына қарамастан, алейрон
ұлпасы мен крахмалды эндосперм клеткаларының өлуі әртүрлі уақытта жүзеге
асады. Крахмалды эндосперм клеткалары бидай дәнінің пісіп-жетілу барысында
өліп, дән қуысын белокты және крахмалды гранулалар түрінде толтырып тұрады
деген болжам бар. Ал алейрон клеткалары, дәннің пісіп-жетілу сатысында еш
өзгеріссіз сақталып, тек қана оның өніп-өсу сатысын, гидролитикалық
ферменттерді синтездеп, секрециялау арқылы индукциялағаннан кейін ғана
элиминацияланады [11].
Алейрон клеткаларының ультра құрылымы олардың қызметін көрсетеді.
Дәндегі алейронның көптеген көрсеткіштері оның ерекше және жан-жақты
тәжірибелік жүйе болуын қамтамассыз етеді. Астық тұқымдастарының алейрон
қабаты біртекті, жоғары дифференциалданған клеткалардың бір қабатынан
(сұлы, жүгері, қара бидай, бидай) немесе бірнеше қабатынан (күріш, арпа)
тұрады [12]. Пісіп-жетілген құрғақ алейрон клеткалары қалың
геммицеллюлозалық қабырғамен қоршалған және олар ешқандай да клеткалық
бөлінуге ұшырамайды. Алейрон қабаттарын жабысып қалған өлі крахмалды
эндоспермнен ажыратып алуға болады және ажыратып алынған алейрон ұлпасынан
ферменттердің көмегімен протопластардың біртекті популяциясын дайындауға да
болады [13].
Алейрон клеткаларының цитоплазмасына белоктар қорынан тұратын көптеген
вакуольдер тән, оларды көбінесе алейрондық түйіршіктер деп те атайды, олар
бүкіл клеткаларды алып жатады. Бұл органелла алейронның гормондар әсеріне
қайтаратын реакциясында негізгі қызмет атқарады.
1 сурет. Бидай дәнінің алейрон қабатының құрылысы
Протеиндердің қоры бар вакуольде гиббереллинмен өңделгеннен кейін
гидролизге ұшыраған протеиндерді секреторлық белоктардың түзілуіне қажетті
аминқышқылдармен қамтамасыз ету үшін қор ретінде сақтай бастайды [14].
Протеиндердің қоры бар вакуольдер, сондай-ақ, астық тұқымдастардың
дәндеріндегі минералдардың негізгі қоймасы болып табылады. Олардың
құрамынан минералдар фитин түрінде бөлініп алынған. Фитин К+, Mg2+, және
Ca2+ иондары мен фитинді қышқылынан (гексофосфат) түзілген кристалды,
ерімейтін комплекс болып табылады. Бұл кристалды қосынды, глобоид деп те
аталады. Рентгендік микроанализ нәтижелері бойынша дән құрамындағы РО43+,
К+, Mg2+ және Ca2+ иондарының шамамен 75% алейрон қабаттарында сақталады
[15]. Алейрон немесе протопластардың инкубациялық кезеңінде вакуольдер
көлемдері ұлғайып, бір-бірімен орталық үлкен бір вакуоль түзілгенше қосыла
бастайды. Инкубациялық ортада гиббереллин болған жағдайда клеткалар мен
протопластардағы алейрон қабаттарының вакуольдену процесі жылдамдай түседі.
Бейтарап майларды сақтайтын липидтік қосындылар немесе олеосомдар да
алейрон клеткаларының маңызды органеллалары болып табылады, олар клетканың
бүкіл кеңістігінің 30% алып жатқан үшглицеридтік негізден тұрады [16].
Алейрон қабатының құрамына белок (альбумин, глобулин және т.б.), майлар,
қант, клетчатка, күлдер (золы), суда еритін витаминдер, гемицеллюлозалар,
пентозалар кіреді. Алейрондық қабатта тиамин мен рибофлавин өте көп
мөлшерде болады. Олар флуоресцентті зерттеулер негізінде анықталған (2
сурет).
2 сурет. Бидай дәнінің алейрон қабатының құрамы
1.2 Гиббериллин және абсциз қышқылдарына сипаттама
Гиббереллиндер 1926 жылы Gibberella fujikuroi Sow саңырауқұлағында
табылған, күріш ауруын зерттеу кезінде атақты жапон ғалымы Е.Куросавамен
ашылған болатын. 1935 жылы жапон ғалымы Т.Ябута гиббереллинді осы
саңырауқұлақтардан кристалды түрде бөліп алып, оған өзіне тән атау береді.
Гиббереллиндер-бұл саңырауқұлақ гиббереллаларынан алынатын органикалық
қышқылдарға ұқсас заттар класы. Өсімдіктердің өнуінің стимуляторы болып
табылады және дәнектердің пісіп-жетілуі мен жапырақтардың дамуын
жылдамдатады. Гиббереллиндердің 27 түрі анықталды; олардың барлығы
тетрациклдік дитерпеноидтарға жатады және карбонатты қышқылдар болып
табылады. ГК9 гиббереллині гиббереллиндердің ең негізгі құрылымына
жатқызылады; ал қалған гиббереллиндер оның туындысы ретінде қарастырылады.
Гиббереллиндер тұрақты емес және ол ерітінді мен қышқылдық ортада тез
бұзылады. ГК9-дан көміртекте гидроқышқылдарының және екі байланыс : 233-
2350C пен молярлы массаның болуымен ерекшеленетін гиббереллоидты қышқыл
(ГК3) биологиялық белсенділікті қамтиды [17]. Гиббереллиндер өсімдіктер
өсімін жүйелейтін жүйенің компоненті болып табылады. Гиббереллиндерге
сәйкес, оны “жасыл жапырақтардың гормондары” деп атауға болады.
Гиббереллиндер негізінен фотосинтезделген ұлпаларда өңделеді, бірақ олардың
тамырларында да қалыптасуы мүмкін.
Гиббереллиндер ең алдымен жапырақтар бекітілетін түйіншіктер жақын
орналасқан интеркалярлы меристемаларға әсер етеді (Мысалы фотосинтездейтін
жапырақ неғұрлым көп болса, соғұрлым оның алаңы үлкен болады және олардың
арасындағы түйіншік ұзынырақ бола бастайды, үлкен жапырақ гиббереллинді көп
өндіреді және интеркалярлы меристемаға күшті сигнал береді).
Гиббереллиндер және дәндердің(зерна) өсіп-өнуі
Гиббереллиндермен пайда болатын ең басты нәтиженің бірі дәнектердің өніп-
өсуі кезіндегі қосымша қоректік заттардың мобилизациясы. Бұл процесс
арпада, бидайда жақсы зерттелген, сыра өндіріп шығаруда оның практикалық
мәні өте зор. Дәнді дақылдар ұрықтан, эндоспермнен және тұқым қабығынан
құралады. Қосымша қоректік заттар крахмал түрінде эндоспермде жинақталады.
Дәннің пісіп жетілуінде крахмалдық қабат тірі жасушалардан құрылмайды.
Эндоспермнің перифериясында тек қосымша ақуыздарға алейронды қабатқа бай
тірі жасушалардың жұқа қабаты ғана қалады. Дәннің тұқымы эндосперм
қалқаншасымен жабысады. Қалқанша өніп-өскен кезде, ол гиббереллиндерді
бөліп шығарады. Бұл дәннің оянғанын көрсетеді және оған қоректік заттардың
қажет екенін білдіреді. Гиббереллиндер эндоспермнің алейрондық қабатын
крахмалды дәндермен бірге зона арқылы диффундияцияланады. Алейрондық
қабаттың тірі жасушаларында крахмал- амилазды жоятын ферменттер үшін РНҚ
ұясы синтезделе бастайды [18].
Абсциз қышқылы
Абсциз қышқылы(AБҚ), абсцизин, дормин - өсімдіктердің гормоны.
Алғашқыда абсциз қышқыл үшін жапырақтардың түсуіндегі рөлі ұсынылды, бірақ
қазір мұндай рөл өсімдіктердің біршама түріне ғана арналады. Өсімдіктерде
стресс пен патогенге жауапты абсциз қышқылымен байланысты сигналдық жолдар
жазылған. АБҚ-ның биосинтезіне белсенді қатысатын өнімдер мен гендер
қарастырылды. АБҚ бірнеше патогендік саңырауқұлақтармен өсімдіктерге
қарағанда басқа жолмен синтезделеді. Жапырақтардың түсуінде абсциз
қышқылының рөлі көрсетілген. Қысқа дайындалу кезінде АБҚ өсімдіктердің
соңғы бүршіктерінде синтезделеді. Бұл оның баяулап өсуіне алып келеді. АБҚ
камбий қышқылының бөлінуіне алып келеді және бірінші-екінші реттілік өсуін
тоқтатады [19].
АБҚ сонымен қатар су потенциалын төмендетуге байланысты өсімдіктердің
тамырларында, стресстік жағдайлар кезінде қалыптасады. Кейін АБҚ жапыраққа
келіп түседі, онда осмотикалық потенциал жапырақ саңылауларындағы
жасушаларды өзгертеді және жапырақ саңылауларының жабылуына алып келеді.
Жапырақ саңылауларының жабылуы транспирациясын төмендетеді және жапырақтар
арқылы судың ағып кетуін тоқтатады [20].
1.3 Оттегінің белсенді түрлері
Өсімдіктер өздерінің тіршілік кезеңі барысында қоршаған ортаның әртүрлі
қолайсыз ықпалдарына қарсы тұруы тиіс. Осыған байланысты олардың бойында
өсімдік организмін биотикалық және абиотикалық қолайсыз жағдайлардан
қорғауға бағытталған кең ауқымды бағдарламалар пайда болып, дамыды.
Өсімдіктердің потогенді (ауру тудырғыш) бактериялармен , саңырауқұлақтармен
және вирустармен зақымдалуы олар үшін ең қауіпті жағдайлардың бірі болып
табылады [21].
Микроорганизмдерді өсімдіктерге ендіргеннен кейін олар патогендердің
көбеюін шектеу мен жою мақсатында бір немесе бірнеше қорғаныс механизмдерін
іске қосуы мүмкін. Клетка қабырғаларының қалыңдауы, фитоалексиндердің
түзілуі және антимикробиотикалық белоктардың жиналуы сияқты жалпы
қорғаныстық реакцияларды жүзеге асырады. Бұл реакциялардың уақыт пен
кеңістік бойынша реттелуі ие организм мен патоген арасындағы қарым-
қатынастың нәтижесін қамтамасыз етуде шешуші фактор болып табылады
(организм не микроорганизмнің ықпалына душар болып, беріледі, не оған қарсы
әрекет етеді). Көп жағдайда, бұл реакциялар зақымдалған ошақта бірнеше
клеткалардың өлімге ұшырауымен байланысты болады (гиперсезімталды жауап).
Қорғаныстық реакциялардың жүре бастауы үшін не организмге енген патоген
арқылы түзілген, не өсімдіктің клеткалық қабырғаларынан босап шыққан белгі
бергіш молекулалардың қабылдануы қажет. Мұндай молекулалар "элиситерлер"
(ағылш . elicit-қоздырып-шақыру, шығарып алу) деп аталады, олардың кейбі-
реулері олигосахаридтер, белоктар және пептидогликандар ретінде иденти-
фикацияланады [22]. Бұл элиситерлер ие организм-микроб түріндегі белгілі
бір өсімдік жүйесі үшін арнайы түрдегі молекулалар болуы мүмкін, немесе
арнайы емес сипаттағы молекулалар түріндегі, мысалы, өсімдіктердің
клеткалық қабырғаларының бөліктері немесе өсімдік организміне енген
патогеннің клеткалық бөлшектері ретінде болуы мүмкін.
Өсімдіктердің суспензия-культурасы ортасында қорғаныстық реакция-
ларды тудыру үшін элиситер молекулаларының қоспасы қолданылған жағдайда,
қорғаныс жауабының негізінен клетка қабырғасының бетінде жүзеге асатын,
жылдам жүруші процесстерден тұратын жаңа жақтары анықталады. Реакциялардың
ішінде мынадай түрлері идентификцияланады : оттегінің белсенді түрлерінің
(ОБТ) босатылуы (тотықтырушы қопарылыс) [21]; клеткадан тыс рН мәнінің,
мембрандық потенциалдардың, иондар қозғалысының өзгеріске ұшырауы;
белоктарды фосфарлау моделінің өзгеруі [22]; клеткалық қабырғаның белоктық
бөліктерінің тотыға иммобилизациялануы.
Клеткалардың көпшілігі ОБТ-рін өндіруге және бейтараптауға қабілетті
келеді. Қалыпты жағдайда ОБТ клеткада молекулалық оттегінің (О2) бір
электрондық тотықсыздануы нәтижесінде міндетті түрде түзіліп отыратын
қосымша өнім ретінде кездеседі. Сонымен қатар, клеткадағы ОБТ деңгейінің
мүмкіндігінше ең төмен болуын қамтамассыз ету үшін көптеген клеткаларда
арнайы қорғаныстық механизмдер болады.
Сүтқоректілерде ОБТ өндіру реакциясы жүретіні бізге 30 жылдан астам
уақыттан бері белгілі (фагоциттердегі респираторлық жарылу), өсімдіктерде
бұл құбылыс едәуір кеш анықталады [23]. Жуық арада жарияланған жұмыстардың
нәтижесі бойынша ОБТ тек организмдерге енген патогенге қарсы қорғаныс
құралы ретінде ғана қызмет атқарып қоймай, өсімдіктердің бұдан кейінгі
қорғаныстық реакцияларын, сонымен бірге, зақымдалған клеткалардың
гиперсезімталды жауабын белсендіруші сигнал болып табылады [24].
ОБТ молекулалық оттегінің белгілі бір ретпен тотықсыздануы барысында
түзелетін (1- cызба) : супероксид (О2*), сутегінің асқын тотығы (Н2О2),
және гидроксил радикалы (ОН*) өнімдері.
1 сызба. ОБТ молекулалық оттегінің белгілі бір ретпен тотықсыздану
барысында түзілетін өнімдер.
Бұл қосылыстар стреске ұшырамаған клеткалардың митохондриялары мен
хлоропластарындағы жүретін тотығу-тотықсыздану реакциялары нәтижесінде аз
мөлшерде түзіледі.
О2* түзілу үшін энергия аз мөлшерде жұмсалады. Тірі клеткалардағы
супероксидтің мөлшері оның протондалған түрі гидропероксил радикалдың
(О2Н*) мөлшерімен бірдей болады. Гидропероксил радикалы супероксидке
қарағанда анағұрлым гидрофобты келеді және мембраналардың липидті қабаттары
арқылы оңай енеді. рН-мәні физиологиялық болған жағдайда супероксид
клетканың макромолекулаларымен әлсіз түрде әрекеттеседі. рН мәні бейтарап
немесе әлсіз сілтілі болған жағдайда супероксид те, гидропероксил радикалы
да Н2О2 және О2 ыдырайды. Бұл реакция кенеттен жүруі мүмкін, сондай-ақ
супероксиддисмутазаның (СОД) қатысуыменде жүреді.
Н2О2 салыстырмалы түрде алғанда тұрақты ОБТ болып табылады. Н2О2
реакцияға түсу қабілеті жоғары емес. Ол электрлік тұрғыдан алғанда бейтарап
бола отырып, клеткалық мембраналар арқылы еніп, Н2О2 түзілген аймақтан
алшақ жатқан жерлерге жетуге қабілетті келеді. Өсімдік клеткаларында
жаңадан түзілген Н2О2 мынадай өзгерістерге ұшырауы мүмкін: 1) өздігінше
кенеттен немесе каталазаның қатысуымен су және оттегіге ыдырайды; 2)
әртүрлі пероксидазалар үшін субстрат ретінде болуы мүмкін, мысалы,
лигниннің түзілуін құрлымдық тұрғыдан тежейтін феноксил радикалдарының
түзілуі үшін субстрат болып келеді; 3) дегидроаскорбатредуктазамен және
глутатион-редуктазамен бірлесіп әсер ететін аскорбат пероксидаза көмегімен
зияндылығы жойылуы мүмкін. Белгі бір жағдайда,тотықсыздандырғыш болған
кезде, Н2О2 пероксидазалар арқылы Compound III түзілуін қамтамассыз ететін
реакциялардың ретті тізбегіне айналуы мүмкін.
Гидроксил радикалы бұл жұмыста аталған ОБТ ішінде реакцияға түсу
қабілеті ең жоғары болып келетін түрін құрайды. Ол Н2О2 мен О2* өзара
әрекеттесуі нәтижесінде пайда болуы мүмкін. Қалыпты клеткаларда бұл
реакция баяу жүреді және ОН* көп мөлшерде өндірілуі үшін тиімсіз болып
табылады [25]. Бірақ, Fe2+ немесе Cu+ сияқты транзиттік металлдардың
тотығуынан (Фентон реакциясы) және бұл тотыққан иондардың супероксидтің
қатысуымен тотықсызданған түрлеріне дейін регенерациялануынан тұратын
реакциялар циклы барысында ОН* айтарлықтай көп мөлшерде түзіледі. ОН*
радикалдық тізбекті реакцияларды бастауға қабілетті болғандықтан, ол
клеткалық макромолекулалардың қайтымсыз өзгерістерге (модификацияға)
ұшырауына және органеллалардың зақымдалуына жауапты болып келетін негізгі
ОБТ ретінде саналады [26]. ОН* бос күйінде болуы шамамен 0,000000002 сек
тең болғандықтан оны көзбен көру және оның патоген-өсімдік қарым-
қатынасындағы рөлін анықтау сәтсіз аяқталды. N-ацетилхит-олигосахаридті
элиситермен өңделген күріштің (Oryza sativa) суспензиялық культура
клеткаларына жақында ғана жүргізілген тәжірибелер нәтижесінде, бұл
модельдік жүйеде ОН* түзілетіні анықталды [25].
Өсімдік клеткаларының көптеген жануар жүйелерінен ерекшелігі ,
олар ОБТ негізінен алғанда Н2О2 түрі үнемі ,айтарлықтай көп мөлшерде
өндіруге қабілетті келеді, бұл процесс әдетте клетканың экстрацеллюларлық
компарт-ментімен байланысты болады және ол гормондар жарық сәулесі,
механикалық зақымданулар сияқты әртүрлі фактолар арқылы реттеледі. Н2О2
лигнификация процесіне ұшырайтын клеткаларда кездеседі, мысалы, трахеялық
(түтікше) элементтерден және флоэма талшықтарынан көруге болады, ал тез
ұзарушы клеткалардың клеткалық қабырғаларында әдетте болмайды; механикалық
стреске шалдығып зақымдалған клеткаларда Н2О2 қарқынды түрде өндіріледі.
Сырттан түрткі болған факторларға жауап ретінде ОБТ көп мөлшерде,
жылдам өндірілуі тотықтырушы қопарылыс болып табылады [23,27,28]. ОБТ
өндірілу жайында алғашқы мәліметтер 1983 жылы пайда болды, бұл мәліметтер
бойынша картоп түйіндеріне (Solanum tuberosum) өзімен сәйкес келмейтін
Phytophthora infestans тұқымын өндіріп өсірген (инокуляциялаған) жағдайда
картоп түйіндері супероксид түзе бастайды [27]. Бұл реакция сондай-ақ
потогенді микроорганизмдермен зақымдалған өсімдіктерде және элиситерлік
препараттармен, қоздырғыштың бөліктерімен өңделіп немесе механикалық
стреске ұшыратылып өсірілген клеткаларда да байқалады. Көптеген мәліметтер
бойынша, тотықтырушы қопарылысқа қатысатын негізгі ОБТ - Н2О2 болып
табылады, О2* қатысуы да мүмкін. Н2О2 мен О2* түзілуі химиялық тұрғыдан
алғанда ұқсас келеді, сондықтан тотықтырушы қопарылыстағы СОД (NN-
диэтилдитиокарбамат) ингибиторының әсерінен бұзылатындықтан, Н2О2 СОД
қатысуымен О2*-нен түзіледі деген болжам бар [25].
ОБТ өнімдерінің кенеттен жоғарлауы әдетте жылдам түрде өтеді, сондай-
ақ, әр-түрлі зиянды факторларды пайдаланған жағдайда зерттеліп жатқан түрлі
жүйелерде өзгеше болады. Суспензиялық-культура клеткаларында реакция
әдетте, ортаға элиситерлерді қосқаннан кейін 1-2 минут өткен соң басталып,
бірнеше минуттан кейін ең жоғарғы шегіне жетеді де элиситер-леудің
басталғанына 30-60 минут болғанда аяқталады [27, 28]. Тотықтырушы
қопарылысты зерттеу үшін өсімдіктің бөліктерін пайдаланған кезде реакция
айтарлықтай кеш байқалды: элиситерлеуден кейін 8-12 сағатта басталып
[29,30], 2-4 сағаттан соң ОБТ түзілуінің айқын белгілері көрінді [31]. Мұны
салат-латук өсімдігіне тән келмейтін Pseudomonas syringеae тұқымын
инокуляциялағаннан кейін 5 сағат өткен соң салат-латук өсімдігі in-vivo
жағдайында Н2О2 өндіретіндігінің анықталғандығы растай түседі [27]. Басқа
мәліметтердің хабарлауынша, қиярдың (Cucumis sativus) кутикуласын алып
тастап, гипокотиль аймағын не салицил қышқылымен(СҚ) не 2,6-
дихлороизоникотин қышқылымен(ИНҚ) өңдеу арқылы қиярдың гипоко-тилінде
жылдам жүретін реакцияны тудыруға болады, салицил қышқылы мен 2,6-
дихлороизоникотин қышқылы тіршілік ету барысында пайда болатын жүйелі
төзімділіктің индукторлары болып табылады [32]. Мұндай гипокотильдерде Н2О2
өндірілуі элиситерлеуден кейін 20 минут өткеннен соң аяқталады, бұл
суспензиялық культура клеткаларында байқалатын өзгеріске ұқсас келеді.
Гипокотильдерді алдын-ала өңдеудің әсері циклогексимидті немесе
пуромицинді қосқан жағдайда толық тежеледі, яғни бұл процесте белоктың
түзілуі қатар жүріп отыруы қажет [28]. Гипокотильдерді олиго-1,4-Д-
галактуронидтермен өңдеген жағдайда да нақ осындай өзгеріс байқалады [33].
Осыған ұқсас басқа да зерттеу жұмыстарының нәтижесі бойынша соя өсімдігінде
қорғаныс реакцияларын тудыруға қажетті болып табылатын, "элиситерлеуге
ықпал етуші факторлар" болады. Суспензиялық культура клеткаларында
араластыру нәтижесінде олар механикалық түрткіге үнемі ұшырап
отыратындықтан, "алдын-ала өңдеуден туатын жер" бұл жүйелерге онсыз да тән
қасиет болуы мүмкін. Суспензиялық культура клеткаларын алдын-ала салицил
қышқылымен өңдеген жағдайда тотықтырушы қопарылыстың ұзақтығы өзгермейтіні,
ал ОБТ түзілуі күшейе түсетіні назар аударарлық. Әртүрлі өсімдіктер
жүйесінде әртүрлі элиситерлердің тотық-тырушы қопарылыс тудыру қабілетіне
қарай отырып, өсімдік жүйелерін салыстырған кезде ОБТ өндірілуінің
қарқындылығында және көріну уақы-тында айтарлықтай айырмашылық байқалады.
Соя өсімдігінің суспензиялық культура клеткаларында олиго-1,4-Д-
галактуронид ықпалынан туған тотықтырушы қопарылыс Verticillum dahliae
құрамынан алынған таза емес элиситерлермен өңдеуден туатын тотықтырушы
қопарылысқа өте ұқсас болып шықты. Аталған элиситердің белоктық бөлігі емес
көмірсутектік бөлігі. Н2О2 өндірілуін тудыруға жауап беретіні анықталды
[34]. Темекі (Nicotiana tabacum) клеткаларында өзгеше құбылыс байқалады,
бұл өсімдіктерде Phytoptora parasitica құрамынан алынған таза емес күйдегі
элиситер әсеріне тотықтырушы қопарылыс пайда болмайды, ал криптогеин
(темекі үшін патогенді емес Phytoptora parasitica культуралық ортасынан
алынған белок) ол өсімдіктерде ОБТ генерациясын тиімді түрде индукциялайды
[27].Барлық тұқымдас өсімдіктердің суспензиялық культура клеткаларына
әртүрлі төрт элиситердің әсер етуі сыннан өткізілді. Уақытқа байланысты
көрсеткіштері жуық шамамен алғанда бірдей болғанына қарамастан,
реакциялардың қарқындылығында үлкен айырмашылықтар байқалады.Colletotrichum
lindemuthianum клеткалық қабырғасынан алынған тазаланбаған күйдегі
элиситерлі препарат тотықтырушы қопарылысты ең күшті индукциялайды. Бұл
элиситерлерді бидайдың ұрықтық агглютинімен өңдеген жағдайда, оның
белсенділігі төрт есе төмендеді, бұл жағдай индукция процессінде N-ацетил-
глюкозогендік қалдықтардың маңызды екенін білдіреді. Бірақ элиситерлеу үшін
хотинді немесе хитозанды олигомерлерді қолданған жағдайда тотықтырушы
қопарылыстың қарқындылығы тек 10 % -ға жетті, және тазаланбаған күйдегі
элиситердің әсерінен туатын тотықтырушы қопарылыстың қарқындылығынан төмен
болып шықты, яғни мұндай реакцияларды индукциялауға қажет болып табылатын
басқада компаненттер бар [35].
Барлық жағдайларда егер, сырттан келіп отыратын тотықсыздандырғыш
болмаса ОБТ өндірілуі байқалмайды. Сәбіз протопластына тотықсыздандырғыш
қоспай, оны Pythium aphanidermatum културасынан алынған элиситермен өңдеген
жағдайда тотықтырушы қопарылыс байқалмайды, бірақ иондардың қозғалысы және
4-гидробензой қышқылының түзілуі сияқты элиситер әсерінен туатын басқа
реакциялар байқалады [36].
1.4 ДНҚ репарациясына қатысатын ферменттер
ДНҚ репарациясы - тірі организмнің ДНҚ-ғы өзгерістерін қалпына
келтіру қабілеті болып табылады [37]. Әртүрлі мутагендік факторлар оның
ішінде ОБТ әсерінен болатын ДНҚ-ның зақымдалуы, ДНҚ-дағы генетикалық
информацияны өзгертіп, клетканың тіршілігі үшін қауіп тудыруы мүмкін.
Сондықтан клеткада осындай зақымданулардан сақтайтын, тікелей зақымдалған
репарация негіздерді алмастыратын,DNР пулдарын тазартатын, мисмэтч
репарация және де BER-негіздерді кесетін репарация, NER-нуклеотидтерді
кесетін репарация және NIR-нуклеотидтерді кескілейтін (разрезающий)
репарация секілді, көптеген репарация механизмдері дамыған. Осы механизмдер
ішінде негіздерді кесіп алып тастайтын репарация (BER)көптеген тотыға
зақымдалған ДНҚ-ды қалпына келтіре алады. Алайда басқа да репарация
жолдары да бұл зақымдануларды репарациялауда эффективті болып табылады.
BER жолы. Зақымдалған негіз ДНҚ-гликозилаза көмегімен кесіліп,
нәтижесінде апуриндік-апиримидиндік сайт пайда болып, АР-сайт апуриндік-
апиримидиндік эндонуклеазалар арқылы ыдыратылып, тізбек бөлек нуклеотидтер
тармағы мен ұзын аудандар тармағына ыдырайды.
ДНҚ-гликозилаза аномальді негізді танып, сол негізбен қантты
байланыстыратын N-гликозидтік көпірдің үзілуін катализдейді. Нәтижесінде АР
сайт пайда болғаннан кейін BER жолының басқа да ферменттеріне жұмыс
атқаруға мүмкіншілік туады. АР эндонуклеазалар мен фосфодиэстеразалар 3'-
гидроксил және 5'-фосфат соңдарынан тұратын бір нуклеотидтік бос аралықтың
пайда болуын катализдеп, ДНҚ-полимеразаның сол аралықты толтыруына жол
ашады. Соңында ДНҚ-лигаза қалған зақымдануларды жөндей алады.
BER- репарациясының екі жолы белгілі: 1 short - patch репарация және
2 long-patch репарация. Short - patch pепарацияда β-ДНҚ-полимеразаға
тәуелді түрде бір ғана зақымдалған негізді алып тастай алса, long- patch
репарация алты және одан да көп негіздердің алмасуын алып тастай алады
[38].
ДНҚ-гликозилаза. ДНҚ-ны зақымдайтын ОБТ-нің көпшілігі BER-ферменттері
үшін субстрат болып табылады.BER-жолының негізгі ферменттері. ДНҚ-
гликозилазалар дизоксирибоза мен зақымдалған негіз арасындағы N-гликозидтік
байланысты үзіу арқылы ДНҚ-дағы зақымданулар мен дұрыс жұптаспаған
негіздерді алып тастап, АР-сайт түзеді.
ДНҚ-гликозилазаның екі түрі белгілі. Олар монофункциональді және
бифункциональді ДНҚ-гликозидазалар. Монофун,кциональді ДНҚ-гликозидазалар N-
гликозидтік байланысты үзіп, өзгерген негіздерді кесіп, соңғы өнім ретінде
АР-сайт түзеді. АР-сайтты АР-эндонуклеаза өңдейді. Бифункциональді ДНҚ-
гликозидазалар N-гликозидтік байланысты үзіп, өзгеріске ұшыраған негізді
алып тастаумен қатар 3'фосфодиэфирлі байланысты үзіп β-элиминациялаушы
механизм арқылы АР-сайт түзіп, -3'-фосфат және 3'-фосфогликолат
соңды біртізбектік үзіліске әкеледі. Нәтижесінде АР-сайттан кейінгі негіз
АР-эндонуклиаза арқылы ыдырап ДНК полимеразаға бос аралықты толтыруға
мүмкіндік береді. [40]
FPG-белок. ДНҚ-гликозилазалар ішінде жақсы зерттелгені E.Coli-дің FPG
белогі. FPG белогі 269амин қышқылынан тұратын 302.2 кДа глобулярлі
мономер.Ол in vitro жағдайында өзгеріске ұшыраған пуриндерді, әсіресе 2,6-
диамино-4-гидрокси-5N-метилформамид опиримидин мен 7,8-дигидро-8-оксогуанин
қалдықтарын, сонымен қоса пиримидиннің тотыққан өнімдерін, мысалыға, 5-
гидроксицитозин, 5,6-дигидротимин, 5-гидроксиурацил, тимин гликольді кесе
алады. FPG - АР-лиазалық белсенділігі бар бифункционалды ДНҚ-гликозидаза.
Ол ДНҚ-ны β-σ элиминация механизмі арқылы АР сайттарға кесе алады. Сонымен
қоса дезоксирибозаның 5'-соңындағы фосфатты кесе алатын белсенділікке ие.
in vivo жағдайында FPG GC→TA спонтандық трансверсиясын болдырмайтын
антимутаторлық эффектіге ие. Ол Mut Y белогімен бірлесе әсер етеді. fpg mut
y мутант СС104 экстремальді мутаторлық фенотип көрсетеді. Қызығы
бактериалардың fpg генінің адам клеткасындағы экспрессиясы γ-сәулелердің
мутагенділігін төмендетеді. Алайда клетканың тіршілігі үшін ешқандай эффект
көрсетпейді [40].
Fpg – ң СООН соңында міндетті түрде (Суs – X2 – Cys – X16 – Cys – X2 –
Cys – X2 – COOH) цинк – саусақ мотив болады. Fpg – ң бұл активті ауданы
аминдік соңының алғашқы 73 амин қышқылы қалдықтарының шегінде орналасқан
[41].
Жақында Fpg - ң белогының үш деңгейлік құрылысын шешуде үлкен
жетістікке қол жеткізілді. Сугахара мен оның әріптестері жоғары термофильді
Thermus thermofhilus бактериясының НВ8 (НВ8 – Fpg) Fpg –ге гомологты
белогының үш деңгейлік кристалдық құрылысын анықтады. Бұл Fpg
белогының молекуласы өзара серпімді стержень арқылы байланысқан екі түрлі
ауданнан тұратынын көрсетті. Ізінше Костайнг пен оның әріптестері
Lactococcus Lactis Fpg мен 1,3 пропандиол (Pr) АР сайт арасындағы
ковалентсіз комплекстің құрылысын анықтады. Олар Fpg лизинге қарсы
цитозинді танып, ДНК – дан Pr ығыстырып, ДНҚ - ң 60-градусқа майысуына
әкелетінін көрсеткен. Сонымен НВ8 – Fpg дің құрылысына сай Е. Соli – дің
Fpg-і bilobal белок екені анықталды. Онда ДНҚ-ы байлайтын теріс зарядталған
ауқымды терең аймағы бар екені анықталды.
(Радиотөзімділігі жоғары Deinococcus radiodurans бактериясынан 2 Fpg
белогы бөлініп алды. Екеуі де Ғару мен 8 – ОХОG қалдығын кесіп, В – лиазді
белсенділік көрсетеді. Сонымен қоса біреуі тимин гликольді кесе алады.)
Fpg белогының S. Cerevicae ашытқысындағы 8-оксогуанин – ДНК
гликозиказа (УОGG1) гомологы анықталды. Алайда олардың Аминқышқылдық
тізбектерін салыстырғанда ешқандай байқалатындай ұқсастық табылмаған.
Дегенмен олар ұқсас функция атқарады. Fpg белогының сонымен қатар
сүтқоректілерде де (мысалы адамда HOOG1) гомологы табылған.
АР эндонуклеаза. АР эндонуклеаза АР сайттардың цитотоксикалық және
мутагендік потенциялын тежейді. АР сайттар – ДНҚ-да ОБТ әсерінен спонтанды
дезпуринделу, дезпириминделу әсерінен немесе ДНҚ гликозилазамен өзгерген
негіздерді алып тастағаннан кейін екінші реттік зақымдалудан пайда болады.
АР сайт дұрыс коделенбейтін қасиетке ие. Себебі репликация барысында АР
сайтқа қарсы көбінесе А қойылады. Бұл жағдай кейіннен А rule яғни А
ережесі деп аталады.
Ферменттердің АР сайтты тану құбылысы алғашқыда Верлидің жұмыстарында
суреттелген. ДНҚ-ны АР сайт аудандарында 2 түрлі фермент танып кеседі. Олар
зақымдануларды гидролитикалық механизмен өңдейтін экзонуклеаза ІІІ (Xth)
және эндонуклеаза ІV (Nfo). Ар эндонуклеазалық белсенділікпен қатар
фосфодиэстеразалық белсенділікке ие. Осы белсенділік арқылы ол
оксиданттармен индуцирленіп үзілген тізбектің 3 соңындағы фосфогликалат
тәрізді қанттардың фрагменттелген қалдықтарын алып тастайды. АР
эндонуклеазалар 3'- соңындағы топтарды АР-лиаза көмегімен В – элеминациялау
арқылы да алып тастай алады.
Nfo белок (эндонуклеаза ІV). АР эндонуклеазалық белсенділіктің 5%ғана
көрсететін ЕОТА – ға төзімді АР эндонуклеаза. Ол тотықтырушы стреспен
индуцирленіп, SOX RS системаның бақылауында болады. E.Coli-де эндонуклеаза
ІV – ті коделейтін ген Nfo жан – жақты сипатталған. Nfo белогы 30кДа
мономер. Ол бірнеше белсенділікке ие. Бұл 3' белсенділіктер соңдарын
тазалауы репарацияның ДНҚ синтезіне дайындығы ретінде ұсынылған. E.Coli-дің
Nfo мутанттары bleomycia мен Т-бутилгидропероксид секілді тотықтырушы
агенттердің летальды эффектілеріне өте сезімтал болып келеді. Сонымен қоса
бұл мутация Xth Nfo мутанты У радияцияға да сезімталдық көрсетеді. Nfo-ң
жоғары қабілеттілігі оның деңгейлік құрылымының ашылуымен белгілі болды.
Nfo ЈВ- белок. Бұл құрылым ДНК тәрізді үлкен молекулаға бекінуге арнайы
маманданған Nfo белок өзінің бүйір тізбегін ДНҚ-ң шамалы рутинасына
инсерциялау арқылы АР сайтты тани алады және көптеген қалыпты ДНҚ негіздері
ішінен АР сайт пен оған қарама – қарсы нуклеотидті ығыстырып, ДНҚ-ны 90º
майыстырады [39].
АР- эндонуклеаза Аре1, Аре2 Адамдағы басты эндонуклеаза (НАР-
1Аре1АреХ) E.Coli-дің Xth белогына гомологты. Ол АР эндонуклеаза және Fos
– Jun, Jun-Jun, Аре1 белок және NF – каппа В, Муb және ATFCREB
тұқымдасының өкілдері секілді ДНҚ- мен байланысқан домендердің тотығу –
тотықсыздануының регуляторы ретінде идентификацияланған.
Аре1 р53 активтендіретін 35,5 кДа ядролық белок. Тышқандардың
гомозиготты Арех генінің бағытталған бұзылыстары олардың эмбриондарының
летальды жағдайына әкеледі. Ал гетерозиготты тышқандардың фенотипінде
жабайы типпен салыстырғанда ОБТ әсерінен болатын айтарлықтай өзгерістер
байқалмайды. Аре1 қосарлы рөліне байланысты эмбриондардың летальды жағдайы
я ВЕR-дің деффектісімен, я кейбір транскрипциялық факторлардың
деффектісімен байланысты. Аре1 E.Coli үшін экзонуклеаза ІІІ ал S.
Cerevicae үшін Арп1 алмастыра алады. Ол АР эндонуклеазалық белсенділікпен
қатар 3' – 5' экзонуклеазалық, фосфодиэстеразалық, 3' фосфотазалық және НRN-
азалық белсенділік көрсете алады. Алайда бұл белсенділіктер АР
эндонуклеазалық белсенділікке қарағанда 3-4 есе әлсіз болып келеді. Чоу мен
Ченг Аре1-дің 3' – мисмэтч экзонуклеазалық белсенділігінің болуына
байланысты, оны корректураны оқи алатын фермент ретінде де қарастыруға
болады деген.
Аре1 ВЕR-де орталық рольді ойнайды. Ол “short -patch” және “long -
patch” репарацияға да қатысады. Ол сонымен қоса ВЕR-дің маңызды регуляторы
бола алады. Аре1 in vivo жағдайында ВЕR-дің ең маңызды ферменті ДНҚ
полимераза β мен әрекеттесіп β полимеразаны ДНҚ АР сайтына енуіне жол ашып,
оның dRP – азалық белсенділігін күшейтеді. Аре1 сонымен қатар ВЕR-дің басқа
да ферменттерімен XRCC1, PCNA, және FEN1 мен байланыса алады, және де р21-
дің ВЕR –гі ингибиторлық эффектісін компенсациялап, long – patch ВЕR-ді
стимулдей әрі бағыттай алады. Аре1 ДНҚ гликозилазаны да стимулдей алады.
Осыған орай ВЕR белок пен белоктың өзара әсерлесулері арқылы стимулденіп,
бағытталады, және де мұнда Аре1 маңызды роль атқарады деп айтуға болады.
Екінші АР эндонуклеаза Аре2 сүтқоректілерде анықталған. Ол S.
Cerevicae-нің Арn2 белогына гомологты. Аре2 белогын коделейтін аре2 ген Х
хромосомада орналасқан. Аре2 57,3 кДа белок. Ол көбінесе ядрода сонымен
қоса митохондрияда да кездеседі. Аре2 PCNA-мен колокализденіп онымен in
vitro жағдайында да әрекеттесе алады. Бұл Аре2-нің ядролық және
митохондриялық ВЕR-ге қатысатынын, ал ядродағы ролі PCNA-ға тәуелді екенін
көрсетеді [41].
2 Тәжірибелік бөлім
2.1 Материалдар мен зерттеу әдістері
Зерттеулерде Қазақстан 4 сортты гексоплоидты бидайдың (Triticum
aestivum) деэмбриональды дәндерінен жекеленген алейрон ұлпалары қолданылды.
Сонымен қатар келесі фитогармондар׃ гиббереллин қышқылы, абсциз қышқылы
пайдаланылды.
2.1.1 Бидай дәнінің жекелеген алейрон ұлпасын бөліп алу мен
инкубациялау шарттары
Тәжірибелерде деэмбриональды дәндердің жекеленген алейрон ұлпаларын
пайдаландық [1]. Эндогенді гиббереллиндердің алейрон клеткаларына әсерін
тежеу үшін, бидай дәндерінің ұрық бөліктері алынып тасталынды. Алынған
ұрықсыз бидай бөліктерін 10 минут 1%-натрий гипохлориды ерітіндісінде
зиянсыздандырып, оларды стерильді суда бірнеше рет жудық. Содан соң, 100 г
стерильді құм бар Петри табақшаларын дайындап, оларды 20-25 мл ионсыздалған
сумен ылғалдап, 150-200 деэмбриональды дәндерді орналастырып,
инкубацияладық. Ұрықсыз дәндердің алғашқы инкубациясын үш күн мерзімде,
шайқағышта (220 айнмин), 25° С температурада, қараңғылық жағдайда
жүргіздік. Инкубация уақыты аяқталған соң дән жартыларын шығарып, 20 мл
суда құмнан тазарттық. Алейрон қабаттарын бөліп ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz