Гендік инженерия жайлы ақпарат

Пән: Биология
Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

ҚР Білім және Ғылым Министрлігі

Семей қаласының Шәкәрім атындағы мемлекеттік университеті

СРО

Тақырыбы: «Гендік инженерия»

Орындаған: Тлебалды Күмісай

Тобы: БТ-307

Тексерген: Жылкыбаева С. Ж.

Семей - 2015

Жоспар:

Гендік инженерия және оның ашылуы;
Гендік инженерияда қолданылатын ферменттер;
Гендік инженерияның түрлі әдістері.

Гендік инженерия - генетикалық және биохимиялық әдістердің көмегімен түраралық кедергілері жоқ, тұқым қуалайтын қасиеттері өзгеше, табиғатта кездеспейтін жаңа гендер алу; молек. биологияның бір саласы. Гендік инженерия әр түрлі организмдер геномының бөлігінен рекомбинатты ДНҚ құрастырумен қатар, ол рекомбинатты молекулаларды басқа ағза геномына енгізіп, жұмыс істеуін (экспрессиясын) қамтамасыз етеді. Гендік инженериядағы тұңғыш тәжірибені 1972 ж. американ биохимигі Т. Берг (Нобель сыйл. лауреаты) іске асырды. Ол маймылдың онноген вирусы SV-40-тың толық геномын, бактериофаг - L геномының бір бөлігін және Е. Colі бактериясының галактоза генін біріктіру арқылы рекомбинантты (гибридті) ДНҚ алды. 1973 - 74 ж. Америка биохимиктері С. Коэн, Г. Бойер, т. б. түрлі ағзалардан бөліп алынған генді бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Бұл тәжірибе басқа организмдер гендерінің жаңа ағза ішінде жұмыс істей алатынын дәлелдеді. Жануарлар клеткаларымен жүргізілген тәжірибелерде бір клетканың ядросын екіншісімен алмастыруға, екі немесе бірнеше эмбриондарды қосып біріктіруге, оларды бірнеше бөлікке бөлшектеуге болатыны анықталды. Мыс., генотиптері әр түрлі тіндердің клеткаларын біріктіру арқылы тышқанның аллофенді особьтары (фенотипі әр түрлі дарабастар) алынды. Гендік инженерия-ның теориялық негізіне генетикалық кодтың әмбебаптылығы жатады. Бір ғана кодтың (триплиттің) әр түрлі ағзадағы белок молекулаларының құрамына енетін амин қышқылдарын бақылай алатындығына байланысты, ДНҚ молекуласының кез келген бөлігін басқа бөтен клеткаға апарып салу, яғни молек. деңгейде будандастырылу теориялық тұрғыдан алғанда мүмкін екені анықталды. Жануарлар, өсімдіктер және микроорганизмдер гендерінің қызметін қолдан басқаруға болатындығы дәлелденді. Ауыл шаруашылығында өсімдіктің атмосфералық азотты өзіне жинақтап алуы - үлкен мәселе. Осыған байланысты 1970 жылдары азотты фиксациялауға қабілеті жоқ пішен таяқшасына азотты жинақтай алатын, басқа бір бактерияның гені салынып, азотты жинақтау қасиетіне ие болды. Мед. саласында жаңа гендерді енгізу арқылы тұқым қуалайтын ауруларды емдеуге болады. Қазіргі кезде ауру адамдардан зат алмасудың 1000-нан аса әр түрлі тұқым қуалайтын өзгерістері табылған.

Гендік инженерияда қолданылатын ферменттер. Рестрикциялаушы эндонуклеазалар. ДНК-полимераза. Кері транскриптаза. Рестриктазалық эндонуклеаза- микроорганизмдерде кең таралған. Бактерияның бактериофагтарға төзімділігін арттырады. Белгілі бір сайттарды танып, таңбалап отырады. Дұрыс метилденбеген бактериофагтардың көбеюін шектейді. Қазір 1000-нан астамы табылған. Рестрикция сайтын-полиндром деп атайды. Полиндром 5` соңынан бастап санағанда басынан аяғына, аяғынан басына дейін оқығандабірдей оқылады. Таңдамалы аудан 4, 6, 8 жұп нуклеотидтерден тұрады. Осы таңбалы аудандармен байланысып, ДНҚ молекуласын үзеді. Бактериальды штамм рестрикциялық активтілікпен қатар ДНҚ-ны метилдеу қабілеті бар. Метилаза метил тобын аденин мен цитозин қалдықтарына рестрикциялық ферментпен байланысқан сайтта жалғайды. Сонда метилденген сайт рестрикция ферментіне төзімді болады. Рестриктазаның 3 түрі бар. Рестриктаза I кесу ерекшеліктері байланысқан жерден алыс кеседі. 1000 нуклеотид қашықтықтан. Рестриктаза II ке6су ерекшелігі таңдамалы ауданмен байланысқан жерінен, соның шеңберінде кеседі. Рестриктаза III кесу ерекшелігі таңдамалы ауданның 17-20 нуклеотид қашықтықта кеседі. Рестриктаза I және III екі активтілігі бар. Метилдеуші; АТФ- эндонуклеаза. АТФ-қа тәуелді болады. Ал, Рестриктаза II гендік инженерияда көп пайдаланылады. Себебі, екі блоктан тұрады: рестрикциялық эндонуклеаза мен метилаза. Оларға кофактор ретінде Mg2+ ионы қажет. Қазір 500-ге жуық түрі бар. ДНҚ-полимеразаны ең алғаш рет 1958 жылы Корнберг бөліп алған. Кері транскриптаза мРНҚ-дан ДНҚ-ның комплементарлы тізбегіне транскипциялануында пайдаланылады. Яғни, мРНҚ-дан ДНҚ-ны синтездейді. Гендік инженерияда қолданылатын ферменттер. ДНК-лигаза. Полинуклеотид киназа. Терминальді фосфотаза. Сілтілі фосфотаза. ДНҚ-лигаза 1967 жылы Мезельсон тапты. Ол ДНҚ фрагменттерін тігеді. Фосфодиэфирлі нуклеин қышқылдарының қостізбекті молекуласындағы байланыстың синтезін катализдейді. Лигазалар ДНҚ репарациясы мен репликациясына қажет. Гендік инженерияда ДНҚ-лигазаның екі түрі қолданылады. Оларды кофакторы және қызметіне қарай ажыратылады. Кофактор ретінде НАДН пайдаланылады Полинуклеотидкиназа ДНҚ молекуласының 5` соңын таңбалауға арналған. 32Р таңбалайды. Полинуклеотидкиназа ДНҚ молекуласының 5` соңын фосфорламаса, онда ДНҚ-лигаза өзінің жұмысын атқара алмайды (тіге алмайды) . Терминальды трансфераза 1962 жылы Боллум деген ғалым бұзаудың тимус безінен алған. Mg2+ ионы кофакторы, ал субстрат ретінде 3`-ОН соңы бар біртізбекті ДНҚ. ДНҚ-ның 3` соңына қосымша нуклеотидтерді қосуға көмектеседі. Кофактор ретінде Mg2+ ионын пайдаланса, онда ДНҚ молекуласының бір тізбегіне немесе жабысқақ соңды қос тізбегіне қосымша нуклеотидтерді жалғайды. Кофактор ретінде Со2+ ионын пайдаланса, ДНҚ молекуласының түзу соңды екі тізбегіне қосымша нуклеотидтерді жалғайды. Сілтілі фосфотаза ферменті ДНҚ молекуласының 5` соңындағы фосфорды жояды. Себебі, бөгде ДНҚ-ның плазмидаға ену эффективтігін арттырады. Поли-(А) -полимераза 1973 жылы Сиппел деген ғалым синтездеп алған. Ол 3` соңындағы РНҚ поли(А) молекуласының бір тізбекте жалғасуын катализдейді. мРНҚ 3` соңына поли-адениннің қосылуын қамтамасыз етеді. Рекомбинантты ДНҚ құрастыру әдістемелері. Рекомбинантты ДНҚ деп- ин витро жағдайында шығу көзі бойынша әр түрлі кез келген 2 немесе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны айтамыз. Рекомбинантты ДНҚ қарапайым құрамы: бөтен ДНҚ және вектор. Жабысқақ ұштар әдісі. Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ-ны құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де, вектор да 1 рестриктазалық эндонуклеазалық ферменттің көмегімен үзіледі, нәтижесінде ұштары бір біріне комплементарлы, яғни гибридтік ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінң көмегімен оңай бірігеді. Жабысқақ ұштыға гомополимерлі ұштар немесе конекторлық жатады. ДНҚ фрагментінің доғал ұштарына терминалдық трансфераза ферментінің көмегімен гомонуклеотидтер, мысалы, ДНҚ-ның 3’ -ұштарын поли (Т) немесе поли (Ц) , ал векторлық ДНҚ -ның 3’ ұштарына поли (А) немесе поли (Г) жалғанады. Гомополимерлі ұштардан құралған ДНҚ фрагменттерін 1 ортаға қосса, олар комплиментті жұп негіздерін түзеп оңай бир молекулаға бірігеді. Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі -доғал ұштарды жалғау. Оның негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Молекулалық векторлар. Бактериялық плазмидаларға жалпы түсініктеме. Плазмидалық векторларға қойылатын шарттар. рBR322 плазмидалық векторы. Вектор деп-бөтен генетикалық материалды клеткаға тасымалдауға қабілетті ДНҚ молекуласын айтады. Векторлар ген тасымалдағыштар. Векторларға қойылатын талаптар: 1. Вектор клетка ішіне өзімен бірге бөтен генді алып кірген соң, репликациялана алатын болуы керек, сонда ғана ол келесі ұрпақта тұқым қуалай алады, ол үшін векторға ДНҚ репликациясын бастайтын ерекше нуклеотидтер тізбегін енгізеді. 2. Құрамында рестриктазаларды танып, үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек, әйтпесе векторға ДНҚ фрагментін енгізу мүмкін емес. 3. Оның құрамында 1 немесе бірнеше таңбаланған гендері болуы керек, сол таңбалар бойынша қажет геннің қай клетка ішіне енгенін анықтайды. 4. Вектордың клетка ішіндегі көшірмелері жеткілікті мөлшерде болуы керек. Вектор ретінде мөлшері 15-20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар қолданылады. Плазмида дегеніміз-геномдық ДНҚ-ға тәуелсіз, репликациялануға қабілеті бар қос тізбекті сақиналы ДНҚ-ны айтамыз. Түрлері: R плазмидалар-антибиотиктерге төзімді гендері бар, F-плазмидалар-плазмиданы 1клеткадан, 2 ші клеткаға өтуін қамтамасыз ететін гендері бар, диградация-сирек кездеседі, криптикалық-қызметі белгісіз. 6, бактериофагының геномының құрылысы. Бактериофаг геномы негізіндегі векторлар. бактериофагының литикалық және лизогениялық даму жолдары. Вектор ретінде бактериялармен қатар вирустар да қолданылады. Олардан вектор алу әдістемесі лямбда (λ) фагында жете зерттелген. Лямбда фагтың ДНҚ-сы қос тізбекті және формасы түзу, оның геномы 48, 5 мың н. ж. тұрады. Фаг ДНҚ-сының 12 н. ж. құралған комплементарлы жабысқақ ұштары бар. Олар, фаг клеткаға енгеннен кейін бір-бірімен бірігіп, ДНҚ сақиналы формаға ауысады. Сақиналы ДНҚ репликациялық форма болып саналады. Лямбда фагтың ДНҚ молекуласында 60-тай ген бар. Фагтың геномында лизистік даму мен ұрпағын көбейту үшін қажет гендері (маңызды) жоқ екі учаскесі бар. Бірінші учаске фаг геномының орталық бөлігінде (маңызды емес гендер) орналасқан, оның ұзындығы 22, 0 мың н. ж. тең, екінші учаске P менQ гендері арасында орналасқан, ұзындығы 3, 0 мың н. ж. тең. Міне, осы бөліктерді бөтен ДНҚ молекуласымен ауыстыруға болады. Лямбда фагтың вектор ретінде кең таралуы осы қасиеті мен ерекшелігіне байланысты, бұдан басқа оның орташа фаг екендігі бұрыннан белгілі. Сонымен фагтың басына 25. 0 мың н. ж. құралған бөтен ДНҚ-ны енгізуге болады. Фагтың қалыпты геномы 48, 5 мың н. ж. құралғанымен, оның басына 38, 0 мын, н. ж. кем емес және 53, 0 мың н. ж. артық емес ДНҚ жинала алады, фагтың белокты капсиды ДНҚ-ның осындай мөлшерлерін қоршай алады. Лизистік дамуға қажет ген 29, 0 мың н. ж. тең болғанымен, вектордың қалыпты тіршілік етуіне қажет фаг геномының мөлшері 38, 0 мың н. ж. кем болмауы керек. Ғалымдар қазіргі кезде лямбда фагтың негізінде аталған шектеулер мен фаг қасиеттерін ескеріп, түрлі рестриктазалардың көмегі бірқатар векторлық молекулалар құрастырды: харон - λфаг, λgt - фаг, ЕМВ1З, λFIХ, λZАР және т. б. 7, Космидті векторлардың конструкцисы. М13 бактериофагы негізіндегі векторлар. Космидті векторлар олар табиғатта болмайды. Олар плазмидтер мен - λ фагы комбинатсиясы нәтежесінде жасанды түрде құрайды. Ұзынырақ гендерді және оған қоса реттеуші бөліктерді бөліп алып зерттеу үшін космидалар қолданылады. Космиидаларда фаг геномынын арнайы COS бөлігі бар. Сонын арқасында - λфаг бас жағы белокқа орана алады. Яғни буып туйінеді. E. coli дк репликация жасай алады себебі Ori ауданы бар колемі мың н. ж Вектор ретінде бактериофагты қолданғанда генді бактерияға енгізу және соңғыны қоректік ортада өсіру жоғарыдағыдай плазмидалық вектор қолданғандағыдай өтеді. Фаг ДНҚ-сы (енбеген клеткалар агарда көбейіп, көмескі тегіс «газон» түзейді. Ал, фаг ДНҚ-ы бар бактериялар түскен орындарда мөлдір дөңгелек ойыстар түзіледі, оларды негативтік шоғыр деп атайды. Негативтік шоғырдың түзілуі клеткада фаг ДНҚ-ның репликациялануына және жетілген фагтардың пайда болуына байланысты. Бұдан кейін фагтар басқа клеткаларға еніп, оларлы ыдыратады, нәтижесінде әрбір ойын бір ғана ДНҚ-сы клеткаға енген ДНҚ-ның копиясы бар фаг ұрпақтарынан тұрады. М13 фагы клетканы лизиске әкелмегендіктен негативтік шоғыр түзбейді. Бірақ олар көбейген орындарда бактериялық клетканың бөлінуі бәсеңдейді, сондықтан жалпы көмескі газонда мөлдірлеу ойыстар пайда болады. Соңғы газонда қажет рДНҚ молекулалары енген бактериофагтардың көбеюі өтеді. Қазіргі кезде ген инженериясында ген клонын көбейтудің екі әдісі кең қолданылуда: геномның жеке фрагментін (кДНҚ-ны қажет геннің иРНҚ молекуласынан кері транскрптаза ферменті көмегімен алу) және барлық геном клонын көбейту. Кейінгі уақытта жалғыз тізбекті ДНҚ -сы бар фаг - М1З негізінде де жақсы векторлар алынды. Жетілген М1З фагының жалғыз ДНҚ молекуласының ұзындығы 6, 5 мың н. ж. тең. Клеткаға енгеннен кейін қос тізбекті репликациялық формаға айналып, өзінің 100-200 көшірмесін синтездейді. Ары қарай асимметриялы синтез жүреді: жетілген фагтың құрамына кіретін жалғыз тізбекті ДНҚ ғана синтезделеді. М1З фагы клетканы лизиске душар еткізбейді, бірақ оның бөлінуін бәсеңдетеді. Осының нәтижесінде жетілген фагтар клеткадан ортаға үздіксіз бөлініп тұрады. М1З фагының вектор ретінде негізгі артықшылығы жалғыз тізбекті векторлық ДНҚ-ны ыңғайлы жеке күйде тасымалдай алу қабілетіне байланысты. Мұндай ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарының Сэнгер әдісімен тез анықталуы генетикалық эксперименттерді жеңілдетеді. Тағы да, қазір пайдаланылатын барлық векторларға қарағанда, оларды бөлу және көшірмелерін алу оңайға соғады. Жоғарыда баяндалғандардан фаг негізінде алынған векторлардың бірнеше артықшылықтарын байқауға болады. Бірақ, олардың сыйымдылығы шектелген, сондықтан рекомбинантты ДНҚ-ны молекулалық массасы бойынша іріктеу керек. Мұндай кемшілік космид деп аталатын векторлық молекулаларда кездеспейді. 8, Экспрессиялаушы векторлар. Белоктардың секрециялануын қамтамасыз етеін векторлар. Бинарлы векторлар. 9, Трансформацияланған клеткалар скринингі. маркерлік гендер: селективті маркерлік гендер және репортерлік гендер. Рекомбинантты ДНҚ-ны фенотиптік сұрыптау әдісінің бір мысалын жоғарыда рВR322 плазмидасын вектор ретінде таңбалауынан байқауға болады: қажет гені бар рДНҚ тек ампицилинді ортада ғана өсе алады, ал векторға енбеген ДНҚ-ның басқа үзінділер мұндай ортада жойылып кетеді. Плазмидалық векторды β - галактозидаза ферментінің гені арқылы таңбалап, қажет бактериялық клонды фенотипі бойынша іріктеуге болады. Бұл ферменттің дисахарид лактозаны және оның аналогтарын ажырататынын білеміз. Аналог ретінде 5-бром -4-хлор -3-индолил - р - галактозид қосылысын алуға болады, оны генетиктер Х-гал деп атайды. β- галактозидаза одан ашық көгілдір түсті бояу - бромхлориндолды ажыратады. Плазмидаға β - галактозидазаның генін енгізіп, рДНҚ құрастыруға болады. Осы ферменттің гені жоқ Е. Соlі немесе басқа бактерияларға аталған ген бар векторды енгізіп, олар өсіп жатқан ортаға Х-гал қосса, онда ген бойынша рекомбинантты клеткалар көгілдір түсті, ал бастапқы клеткалар түссіз шоғырлар түзейді. Енді, тәжірибеде β- галактозидаза генінің арасын арнайы рестриктазаның көмегімен үзіп, орнына қажет ДНҚ үзіндісін жалғайды, мұның нәтижесінде β - галактозидаза гені активтілігін жоғалтады. Осындай рекомбинантты ДНҚ-мен трансформацияланған клеткалар қатты ортада түссіз шоғырлар түзейді, оларды бастапқы векторы бар клеткалардан (көгілдір) оңай ажыратуға болады. маркерлік гендер: селективті маркерлік гендер және репортерлік гендер. Антибетикке тұрақтылықты қамтамасыз ететін гендерді маркерлік гендер деп атаймыз. селективті маркерлік гендер-Олар амписсидинге тұрақтылықтыты қамтамыз етеді. репортерлік гендер-Организмге қауіпсіз белок тузілуін қамтамасыз етеді. 10, Бөгде генді айқындау әдістері. ДНҚ тізбегінің нуклеотидтік ретін анықтау әдістері. ПЦР. Қажет генді барлық бактериялар массасынан алу үшін оларды қатты қоректік ортаға егеді, мұнда бактерияның әрбір жеке клеткасы жеке ұрпақ береді яғни бактериялық шоғыр түзіледі. Енді гендер жинағын яғни әр түрлі клондар арасынан бізге қажет генді табу қерек. Бұл процесс скрининг деп аталады. Гендер жинағы аз болған сайын одан қажет генді табу оңай. Комплементарлы ДНҚ клонын көбейту әдісі гендер жинағы мөлшерін азайтуға әкеледі, дегенмен мұның өзінде де қажет генді табу үшін арнайы әдістер қолданылады. Кең тараған әдістің бірі шоғырларды гибридизациялау деп аталады. Ол үшін Петри шынысындағы негативтік шоғырларға (рДНҚ-сы бар бактериялар) нитроцеллюлозалы сүзгіні беттестіреді, бұның нәтижесінде ДНҚ молекулалары сүзгіге жабысады. Сүзгінің газонга сәйкес орны үлкен дәлдікпен мұқият белгіленуі қажет, мысалы, сүзгі мен оның астындағы газоны бар агарды бірнеше жерден инемен шаншиды. Бұдан кейін сүзгіні тез арада 0, 5 М NаОН-пен өңдейді, онан соң бейтараптайды. Бұның нәтижесінде қос тізбекті ДНҚ молекулалары денатурацияланып жеке тізбектерге ажырап, интроцеллюлозамен байланысады. ДНҚ молекуласын нитроцеллюлозалы сүзгіде берік бекіту үшін оларды 80°С температурада қыздырады. Сүңгі алынғаннан кейін рекомбинантты векторды талдауға кіріседі. Гендер жинағын бүкіл геномдық немесе комалементарлық ДНҚ

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.