Молекулалық биологияда қолданатын әдістер

Пән: Биология
Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 4 бет
Таңдаулыға:

Молекулалық биологияда қолданатын әдістер

Молекулалық биология қолданатын әдістер тізімі

Микроскопия

Микроскопия әдісінің тарихы XVII ғасырдан басталады. 1611 жылы Й. Кеплер жарық микроскопын жасау принципін ұсынды, ал алғаш рет 1638 жылы А. Левенгук жарық микроскопы көмегімен бірклеткалы бактерияларды бақылады. Дәл осы шешуші қабілеті 0, 4-0, 7 мкм-ге дейін болатын жарық микрокопы М. Шлейден мен Т. Шваннға 1838 жылы жасуша теориясын ашуға мүмкіндік берді. Микроскопияның дамуында итерфернциялы, фазалы-контрастты, электронды микроскоптардың ашылуы маңызды кезеңдер болды.

Электрондық микроскопия

Электрондық микроскопия, әдетте 20 А (2 нм) өлшемдегі объекттерді көруге мүмкіндік береді және жаңа электронды микроскоптар 0, 1 нм өлшемдегі обектілерді көре алды, бұлар вирустардың құрылысын, клетка ішілік органеллаларды, белок-нуклеинді комплекстерді және бөлек белок молекулаларын зерттеуге мүмкіндік берді.

Осы әдістің бір нұсқасы ретінде - крио-электронды микроскопия- қазіргі таңда рибосоманың құрылымын зерттеуде кең қолданыс тапқан.

Көрнекті және мәліметті көбірек жеткізетін, клетка құрылылымының нақтырақ көлемді суреттерін алуға сканерлейтін электронды микроскоптар мүмкіндік береді.

Ренгеностркутуралық анализ

Рентгеноқұрылымдық анализ - рентен сәулелерінің дифракциясына негізделген (сәуле ұзындығы 10-16 м жуық электромагниттік сәулелену) ; молекуладаға атомдардың үш өлшемдік орналасуын анықтауға көмектеседі.

Бұл әдісті Англияда Г. Брэгг және Л. Брэгг жасап шығарған және оның көмегімен белоктың, ДНҚ және РНҚ-ң құрылымы туралы негізгі ақпарат алынды.

Бұл тәсіл молекулалардың құрамындағы атомдардың кеңістіктегі орналасуын анықтауға, олардың ара қашықтықтарын өлшеуге мүмкіндік береді. Биологиялық маңызды молекулаларды, әсіресе ақуыз немесе нуклеин қышқылдарының молекулаларына құрылымдық талдау жасау көптеген қиындықтармен жүреді, себебі олардың құрамындағы атомдардың саны өте көп. Аталған молекулалардың сырт пішінін анықтаудың биологиялық функцияларды білу үшін маңызы өте зор.

Рентгенқұрылымдық талдау әдісінде зерттелетін объектіге (гемоглобиннің, ДНҚ-ң кристалдары) рентген сәулелері бағытталып, пайда болған дифракциялық бейнесі фотоппленкаға тіркеледі. Бұл әдістің көмегімен ақуыз, ДНҚ, РНҚ молекулаларының құрылымы жөнінде мәліметтер алынды.

Радиоактивті изотоптау

Радиоактивті изотоптар - нуклеин қышқылдарын, белоктарды, көмірсуларды және тірі клетканың басқа да молекулаларын зерттеу үшін қолданылады. Радиоизотоптар тұрақсыз келеді және кенеттен ыдырауға бейім; бұл кезде не зарядталған бөлшектер - электрондар бөлініп шығады, не гамма-сәулелену жүреді.

Радиоактивті молекулалар түрлі клеткаішілік процесстерді зерттеу кезінде қолданылады: молекулалардың клеткаішілік локализациясын анықтағанда, олардың клеткадағы қызметі және оның жеке компартменттері туралы, макромолекулалардың жеке аумақтарындағы химиялық өзгерістерді және т. б.

Клеткадағы кез-келген молекуланы белглеуге болады. Оларға бір немесе бірнеше радиоактивті атомдар енгізеді. Тұрақсыз радиоактивті атомдар ыдырай отырып сәуле шығарады. Бұл зерттелін отырған молекудалардың тағдырың бақылауға мүмкіндік береді.

Клетка биологиясында радиоактивті изотоптардың пайдаланылуының мысалы - 1-ден метаболиттік жолдардың анализі және 2- клеткада жеке молекулалардың шоғарлануын радиоавтография жолымен анықтау болады.

Ультрацинтрифугалау

Ультрацентрифугалау (седиментациялық анализ) - 1926 жылы Т. Сведберг аналитикалық ультрацентрифуганы ойлап тапқаннан кейін кең қолданысқа ие болды. Оның көмегімен Сведберг алғашқы болып гемоглобиннің молекулалық массасын анықтады. Осы әдісте седиментация (шөгу) жылдамдығы бөлінуші компоненттердің пішіндері және мөлшерлерімен сипатталады.

ХХ ғ. 40-50 жылдары А. Клод және Ж. Барше клеткалардың органеллаларын бөлу үшін дифференциалды центрифугалау әдісін ойлап тапты. Оның көмегімен де Дюв 1953 жылы бірінші рет лизосомаларды бөліп алды, одан соң пероксисомаларды да алды.

әдістерінің түрлі нұсқаларын клеткаішілік компоненттерді және макромолекулаларды бөліп алу үшін молекулалық-биологиялық зерттеулерде кең қолданады.

Қазіргі уақытта түрлі молекулалардың нақтырақ фракциялануы және тазалануы үшін физико-химиялық әдістердің көптеген түрі қолданылады:

Хроматография

Хроматография - орыс ғалымы М. С. Цветов ойлап тапқан әдіс, ол 1906 жылы өсімдік жапырақтарының боялған сығындысын (экстракт) фракциялаған болатын.

Қазіргі уақытта хроматографияның көптеген нұсқалары бар. Осы аталған нұсқаларда түрлі матрикстерді (тасушылар) қолданады; олар, өз кезегінде, белоктарды заряд бойынша (ионалмасушы хроматография), молекулалар мөлшері бойынша (гель-хроматография немесе гель-фильтрация) немесе белгілі химиялық заттармен спецификалық байланыса алатын қасиеттері бойынша бөлуге жол ашады.

Ионды хроматография

Хроматографияның бұл түрі талданатын ерітіндідегі иондарды адсорбенттің құрамына кіретін иондарға қайтымды алмастыруға негізделген. Өз иондарын жылжымалы фаза иондарына алмастыра алатын мұндай сорбенттерді иониттер немесе ион алмастырғыштар деп атайды, олар өздерінің арналуына сәйкес катиониттерге және аниониттерге бөлінеді. Талданатын ерітінді иондарының алмастыру қабілеті әр түрлі болуына байланысты хроматограммалар түзілуі жүзеге асады. Ион алмастыру хроматографиясы ұстанымы әр түрлі ерітінділердің тең және көп компонентті талдауын жасауға мүмкіндік беретін иондық хроматографтардың үлкен ассортиментінде тәжірибе жүзінде іске асты.

Электрофорез

Электрофорез -бұл әдіс белгілі бір зарядқа ие белоктардың электр өрісінде өз зарядына, мөлшері мен формасына сәйкес орын ауыстыра алу қабілетіне негізделген. Электрофорезді сулы (буферлі) ерітіндіде жүргізуге болады, алайда оны көбінесе саңылаулы (полимерлі) тасушыда жүргізуге де болады: крахмалды, агарлы немесе полиакриламидті гельде, целлюлозалы немесе нитроцеллюлозалы пластиналарда, т. б. Целлюлозалы пластиналарда электрофорездің қарапайым әдісін 1956 жылы В. Ингрэм гемоглобинді фракциялағанда қолданған.

Изоэлектрофокустау

Изоэлектрофокустау атауына ие болған әдісті ХХ ғ. 70-жылдарының басында Швецияда ойлап тапқан. Элеткрофорез әдісінен айырмашылығы - белоктарды рН градиентінде бөледі; бұл градиентті арнайы реагенттердің көмегімен (амфолиндер) іске асырады. Изоэлектрофокустау процессінде белоктар электр өрісінде тек молекулалар зарядымен сәйкес қозғалады және олар молекулалары электронейтралды болатын рН градиентінің нүктелерінде тоқтайды.

Клетка өсінділері (культуралары) әдісі.

Кейбір ұлпаларды жеке-жеке клеткаларға бөлгеннен кейін, жекеленген клеткалар өз тіршіліктерін жалғастырады, тіпті көбею қасиетін жоғалтпайды. Эмбрион немесе кейбір жеке клеткалар қолайлы ортада ағзадан тыс өсіп, көбейе алатындығын алғаш рет американ эмбрилогы Р. Гаррисон (1879-1959) дәлелдеген. Клетканы культуралау техникасын әрі қарай дамытқан француз биологы А. Каррель (1873-1959) болды.

Бұл әдістің ең қарапайым тәсілі келесідей: қоректік ортаға толы камераға тірі ұлпаның кесегі салынады. Біраз уақыт өткеннен кейін ұлпа кесегінің шетіндегі клеткалар бөлініп өсе бастайды. Өзге жағдайда ұлпаның кесілген кішкентай кесегі трипсин ферменті немесе хелатон версен ферменті ерітінділерімен сәл өңделеді, бұл клеткалардың толық бытырап кетуіне әкеп соғады. Содан соң клеткаларды шайып қоректік ортаға салады, онда клеткалар тұнбаға түседі де, шыныға жабысып көбейе бастайды, алдымен олар колониялар түзеді, соңынан клеткалық қабат түзеді.

Моноклональды антиденелер

Антиденелер - белгілі бір биологиялық макромолекуларды шоғырландырудың қолайлы және сезімтал әдісі болып табылады. Омыртқалы жаңуарлардың денесінде миллиондаған әр түрлі антиденелер түзіледі. Олардың әрқайсысында белгілі бір молекулалар тобын танитын байланысу бөліктері болады. Гибрид әдісінің көмегімен моноклональды антиденелер алуға болады. Клеткадағы кез-келген макромолекулаға қарсы моноклональды антиденелерді алуға болады.

Рекомбинанттық ДНҚ технологиясы клетканы зерттеуде төңкеріс жасады. Қазіргі кезде реструктуралаушы нуклеазаларды пайдалана отырып, клетка ДНҚ-сінің кез-келген бөлігін кесіп алуға, клондауға және осы генетикалық материалды шексіз мөлшерде алуға, содан соң оның кезектесуін күніне бірден жүздеген нуклеотидке дейін анықтауға болады. Осы әдіспен эукариоттардың көптеген