Өсімдік клеткаларының in vitro жағдайында өзгергіштігі және оны селекцияда қолдану

Пән: Биология
Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

Өсімдік клеткаларының in vitro жағдайында өзгергіштігі және оны селекцияда қолдану

Жоспары:

1. Кіріспе

2. Клеткалық селекция

3. Төзімді клеткаларды сұрыптау

4. Төзімділік белгісінің тұрақтылығы

5. Индукцияланған мутагенез

6. Қорытынды

7. Пайдаланылған әдебиеттер

Кіріспе

Өсімдік клеткалары in vitro өсіргенде әр түрлі өзгерістерге ұшырайды. Ол генетикалық, морфологиялық, физиологиялық өзгерістер. Тіпті жеке бір клеткадан тараған оның ұрпағы да, яғни клетканың клоны, хромосомалық өзгергіштік салдарынан тез арада әркелкі болып кетеді.

Өсірген клеткаларда пайда болған өзгерістің кейбірі тұқым құлайды, кейбірі тұқым қуаламайды. Тұқым қуаламайтын өзгерістерді модификация деп атайды. Модификациялық өзгергіштік клеткалардың тіршілік жағдайына бейімделуіне көмектеседі. Тұқым қуалайтын, яғни генетикалық өзгерістердің практикада қолдануға маңызы зор. Генетикалық өзгерістердің негізінде жеке гендердің мутациялары, амплификация, делеция, ядродан тыс орналасқан гендердің өзгеруі, хромосомалар құрылымындағы ауытқулар жатады. Тұқым қуалайтын өзгерістердің негізінде генетикалық өзгерістермен қатар эпигенетикалық өзгерістерде жатады, басқа сөзбен айтқанда, жалпы геномда өзгеріс болмайды, тек организмнің дамуы кезінде гендердің экспрессиясы ғана өзгереді.

Клеткалардың өзгергіштігін әр түрлі мутагендермен әсер ету арқылы арттыруға болады. Өздігінен өтетін (спонтандық) және әдейі әсер ету арқылы қоздырылатын (эксперименттік) мутагенез, клеткалық технологияларда және селекциялық жұмыстарда пайдалану үшін қажетті генетикалық алғашқы материалды (клеткалық штаммдар, өсімдіктің жаңа генотиптері, т. б. ) шығаратын әдіс. Іn vitro өсетін клеткалардың тұрақсыздығы арқасында генетикалық өзгерген регенерат өсімдіктер шығады. Бұндай өсімдіктерді сомаклондық варианттар деп атайды.

Соңғы кезде өсімдіктердің жаңа формалары мен сорттарын шығару жолында сомаклондық варианттарға үлкен назар аударылуда. Сомаклондық варианттарды селективтік қоректік ортада клетка деңгейінде сұрыптап алу өте тиімді. Себебі клетка деңгейінде сұрыптау селекциялық жұмыстың көлемін қысқартып, оның тиімділігін арттырады. Өйткені in vitro өскен миллион клеткаларды талдаудан өткізу, миллион генотипі талдаумен тең. Бұндай жағдайда генетикалық өзгерістері селективтік ортаға сәйкес клеткалар ғана тіршілікке икемді келеді. Сондай сұрыпталып алынған клеткалар пайдалы қасиеттер тұқым қуалайтын клеткалық линияларға бастама бола алады. Ол клеткалық линиялардан регенерация процесі арқылы әр түрлі стресстік факторларға төзімді өсімдікті сынақтан өткізіп таңдап алуға мүмкіндік туады.

Клеткалық селекция

Іn vitro өсірілген клеткалардың арасынан нақтылы бір селективтік жағдайға сәйкес өзгеріске ұшырап, пайдалы қасиетке ие болған клеткаларды көбейтіп сұрыптап алуды клеткалық селекция дейді. Әрбір клеткадан өсімдік шыға алатын болғандықтан, клеткалық селекцияны қолданып өсімдіктердің жаңа формаларын тез алуға болады. Оларға бастама болған клетка белгілі бір төтенше факторға төзімді келсе, одан шыққан өсімдікте көбінесе сол қасиетті сақтай алады.

Клеткалық селекцияның артықшылығы мынада: жыл он екі ай маусымға тәуелсіздік және уақыт пен егіс көлемінің үнемделуі. Іn vitro өсетін клеткалық популяцияның әрбір клеткасын жеке организм деп теңесе, бір тәжірибенің өзінде-ақ миллионлаған дарақпен айналысуға болады. Ал дала жағдайында ең көп дегенде ғалым мындаған ғана өсімдіктермен жұмыс істей алады.

Молекулалық және хромосомалық деңгейлердегі өзгерістері мен организм деңгейінде белгілердің өзгергіштігі арасындағы байланыстар туралы мағлуматтардың жеткіліксіздігі клеткалық селекция жөніндегі зерттеулерге үлкен кедергі келтіреді, сондықтан бұл жұмыстар көбінесе эмпирикалық жолмен жүргізіледі.

Клеткалық селекцияның әдістері

Селекцияны қажетті бір бағытта өткізу үшін, яғни өсіп жатқан клеткалардың арасынан белгілі мутациялары бар жеке клеткаларды сұрыптау үшін оларды арнайы селективтік ортада өсіреді. Сондай жағдайда тек мутант клеткалар ғана өсе алады. Іn vitro жағдайында селекцияны амин қышқылдар аналогтарында, нуклеотидтер аналогтарына, патотоксиндерге, антибиотиктерге, гербицидтерге, тұздар мен ауыр металлдардың жоғары концентрацияларына, төмен рН көрсеткіштері мен басқа да түрлі-түрлі факторларға төзімді клеткалық линияларды сұрыптап алу үшін жүргізеді. Сондай-ақ гормондарға, витаминдерге, амин қышқылдарына прототрофтық немесе ауксотрофтық клеткаларды сұрыптайды, яғни сол заттар ортада болмағанда немесе болғанда ғана өсе алатын клеткалар іріктеліп алынады.

Егер де белгілі бір затқа төзімді клеткаларды сұрыптап алу керек болса, оларды сол зат қосылған ортаға егіп өсіреді. Ал енді нақтылы стресс факторға төзімді клеткаларды сұрыптап алу мақсаты болса, онда ішінде клеткалар өсіп жатқан ыдыстарды дәл сондай жағдай (төмен немесе жоғары температура, гипоксия, т. с. с. ) әсер ететін жерге орналастырады. Біраз мезгілден соң клеткалардың көбі бөліне алмай, өсе алмай құриды, тек мутация немесе эпигенетикалық өзгерістер арқасында сол факторға төзімділік көрсеткен клетклар ғана тірі қалады. Бұндай әдісті тура селекция деп атайды. Осындай тәсілді кейбір метаболиттерді (мысалы, амин қышқылын) көп мөлшерде түзіп өндіре алатын клеткаларды алу үшін қолданады. Амин қышқылының аналогін өзіне сіңірген жабайы клеткалар өледі, себебі полипептидтер дұрыс түзілмейді, белок синтезі бұзылады. Өйткені амин қышқылының орнына оның аналогі полипептидтің құрамына кіріп кетеді. Ал мутантар сол амин қышқылын басқа клеткалардан гөрі артық түзетіндіктен оларда белок синтезі дұрыс өтеді де, ондай клеткалар тірі қалады.

Кері немесе негативтік селекция . Бұл әдіс бойынша жабайы клеткалардың жедел бөлуіне жағдай жасалады. Сонан соң қоректік ортаға әдейілеп тимидиннің орнына ДНҚ құрамына енеді. Соның салдарынан ДНҚ синтезі бүлінеді де, жабайы клеткалар қысқа мерзім ішінде құрып кетеді («летальдік өсу» әдісі) . Ал мутант клеткалар бөліне алмайды, өспейді, бірақ тірі қалады. Басқаша айтқанда, өажетті өасиеттері бар клеткалар өспеу үшін ерекше жағдай туғызылады. Содан кейін тірі қалған мутант клеткаларды қолайлы қоректік ортаға көшіріп, көбейтіп өсіріп, тұрақты линияларды алады.

Қоректік ортаға қосатын ингибитордың концентрациясы нақтылы клеткалар линиясының сезімталдығына байланысты. Сондықтан қоректік ортаға әрбір селективтік фактордың әр түрлі концентрациясы қосылған жеке-жеке ыдыстарға клеткаларды салып, олардың өсу қарқындығын анықтайды. Яғни концентрациялардың кеі диапазонын жасап, клеткалардың өсуін тоқтататын минимальдік және максимальдік концентрациясын табу керек. Клеткаларды өсіргенде қоректік ортаға кейбір амин қышқылдарының уландыратын концентрациясын немесе олардың аналогтарын қосып сұрыптау нәтижесінде сол амин қышқылдарын сол синтездейтін мутантар алынған. Ондай мутантар қажетті амин қышқылын асыра синтездейді, сондықтан оның аналогін өзіне онша сіңірмейді. Осылай алғашқы клеткалармен салыстырғанда триптофанды20-30 есе артық синтездейтін, және де 5-метилтриптофанға төзімді сәбіз бен темекі клеткаларының штаммдары іріктеліп алынады. Осы әдіспен картоптың, сәбіздің, күріштің, сасықмеңдуананың және басқа өсімдіктердің лизин, метионин, пролин, фенилаланин, глицинді асыра синтездейтін бірқатар клеткалық линиялар алынады.

Қоректік ортаға қосылған кейбір амин қышқылдарының жоғары концентрациясының улылығы мына екі себепке байланысты болуы мүмкін: 1) нақтылы амин қышқылының биосинтезі жүйесіндегі қандай да бір ферментінің активтілігі тежелуі салдарынан онымен биосинтез жолы ортақ басқа амин қышқылының түзілуі тоқтап қалады; 2) амин қышқылының концентрациясы қоректік ортада мол болғандықтан интрат немесе аммонийдің сіңірілуі (ассимиляциясы) тежеледі. Сонымен қатар, амин қышқылы аналогтары белоктардың құрамына кіріп, олардың атқаратын қызметін бұзады.

Ауыстырылмайтын кейбір амин қышқылдарын жоғары мөлшерде түзе алатын клеткалардан регенерат өсімдіктерді шығаруға болады. Сөйтіп, әдіс амин қышқылдарын, әсіресе ауыстырылмайтын амин қышқылдарын мол мөлшерде түзе алатын өсімдіктердін алудың тиімді жолы.

Сонымен, әр түрлі селективтік жүйелерді қолдану арқылы шаруашылыққа бағалы әралуан белгілер бойынша селекцияны жүргізуге болады. Атап айтқанда: ауруларға, гербицидтерге, түрлі стресс факторларына (топырақ тұздылығы, ауыр металдар, топырақ қышқылдығы, төмен және жоғары температура, т. с. с. ) төзімді сорттарды шығаруы мүмкіндік туады.

Клетка деңгейінде өткізілген селекция әдісімен собық, сабақ және жапырақ гельминтоспориозына төзімді жүгері линиялары, теңбіл ауруын қоздыратын вирусқа төзімді темекі өсімдіктері алынған. Осы әдіспен гербицидтерге, топырақ тұздылығына, өнеркәсіптік ластау әсеріне (ауыр металдар) төзімділігі жоғары бидай, апра, күріш, томат, қияр сорттары алынған. Мысалы, Жапонияда теңіз суымен (тұзды сумен) суаруға шыдайтын күріштің сорты шығарылған.

Қазақстанда Молекулалық биология мен биохимия институтында М. Қарабаев әріптестерімен бидайдың септориозға төзімділігін арттыру мақсатымен клеткалық селекция жүргізген. Септориоз деген бидай және басқа астық тұқымдастарының жұқпалы ауруы. Оны тұғызатын Septoria nodum деген саңырауқұлақ. Осы саңырауқұлақтың ең екі активті фитотоксиндерінің концентрацияларының тигізетін әсері, бидайдың бірнеше генотиптерінің сұйық ортада өсірілген клеткаларында зерттелді. Содан кейін арнайы схема бойынша клеткалық селекцияның эксперименттері орындалып, септориоз токсиніне төзімді бидайдың клеткалық линиясы алынды. Алынған клеткалардағы өзгерістердің клеткалық табиғаты, төзімділік белгісінің келесі клетка ұрпақтарында тұқым қуалау арқылы және селективтік қысым болмағанда да сақталуы арқылы дәлелденді. Сонымен қатар зерттеушілер көрсеткендей, ғарышта болып келген клеткалардың патотоксинге төзімділігі артқан. Клеткаларға токсимен ғарышта тікелей әсер ету нәтижесінде төзімділігі линияны шығару процесі едәуір тездетілген.

Ғарыщтағы клеткалық селекция, ол ғарыштың бірегей селективтік фактор ретінде мигрогравитация жаідайына зерттеу. Бұл зерттеулер «Мир» және Халықаралық ғарыштық станциларында Қазақстан ғарышкерлерінің ұшу сапарында орындалып, соның нәтижесінде картоптың өміс сүруге қабілетті клондары сұрыпталып алынады. Олардың өсімдіктер көбейтіліп Оңтүстік-Шығыс Қазақстанның егістігінде ыстық климаттық жағдайларында сыналды. Бұл өсімдіктердің тіршілік ету қабілеті және бейімделу жылдамдығы бақылаудағы өсімдіктерге қарағанда жоғары болған. 42 сомаклондық линиялардың арасынан егістікте сынаудың нәтижесінде сыртқы ортаның экстремалдық жағдайларына жақсы бейімделген және бағалы шаруашылық белгілері болған 5 сомаклондық линиясы сұрыпталып алынды. Ал 1998 Мемлекеттік сорт сынағына қазақтың алғашқы ғарышкерінің атымен аталған «Тоқтар» сорты тапсырылды. Қазіргі кезде Мемлекеттік сорт сынағынан картоптың «Орбита» деген тағы бір сорты өтіп жатыр. Бұл тәжірибелер болашақта биотехнологияның жаңа бағытының - космостық биотехнологияның дамуына жол ашар.

М. Айтқожин атындағы Молекулалық биология жіне биохимия Институтының биоинженерия лабараториясында (Ж. Т. Лесова, Ж. К. Жардемали, Г. Л. Лигай, т. б. ) бидайдың және картоптың сұйық ортада белсенді бөлініп өсетін клеткаларына әр түрлі стресс факторлары бойынша (фитопатогендердің токсиндері мен қоректік орта фильтраты, тұздану және құрғақшылық, мигрогравитация) клеткалық селекция жүргізіліп жатыр. Токсин түзуші фитопатогендердің ішінде фузариум саңырауқұлағы өсімдіктер үшін аса зиянды микроорганизм. Олар өсімдіктердің вегетативтік және репродуктивтік мүшелерінің өсуін тежейды.

Бидайдың суспензияда өсірілген клеткаларына NaCl тұзы әсер еткенде төзімді клеткаларда молекулалық массасы 35 және 38 кДа полипептидтер синтезделгені, ал құрғақшылық жағдайына (ПЭГ-ты қолдану арқылы) төзімді клеткаларында 27 кДа полипептидтің синтезделгені анықталды. Алынған бидайдың сомаклондық линиялары селекцияда қолдануда.

Қазақстандағы ауылшаруашылық өсімдіктердің деңгейін тежеушы фактор құрғақ аридтік климат пен Арал теңізі маңайында ауылшаруашылық маңызды жерлердің тұздануы мен далаға айналуы. Өсімдіктер физиологиясы, генетикасы және биоинженерия институтының биотехнология лабараториясында (Қ. Жамбакин, Б. Анапияев) тұз және осмостық стресс жағдайында жаздық арпаның гаплоидтық клеткаларын өсіріп, иондар балансының бұзылуын және цитологиялық, биохимиялық өзгерістерін анықтады. Тәжірибелік деректер тұздану кезінде әртүрлі генотиптер ушін клетканың иондық гомеостаз механизмдері бірдей екендігін дәлелдеді. Алынған нәтижелер қуаңшылық пен тұздануға төзімді астық тұқымдастардың бағытталған клеткалық селекциясының нәтижесін арттыру үшін маңызды болуы мүмкін.

Бірақ айта кету қажет, тұздарға, кейбір патоксиндерге төзімді клеткалардың клондарынан шыққан регенерат өсімдіктері сол төзімділік белгісін әрқашан сақтап қалмаған. Бұл жағдай төзімділік механизмдерінің жеке клетка мен тұтас өсімдіктер деңгейінде бірдей емес екенін дәлелдейді және де әрбір факторға төзімділікті бақылау жөнінде генетикалық зерттеулерді керек етеді. Алайда, клетка мен организм деңгейіндегі төзімділіктің ара қатынасы туралы білімнің жетіспеушілігіне қарамай, клеткалық селекция практикада қолдана бастады. Әр жолы селекция схемасы алдын ала дайындалуы қажет және клетка линияларындағы өзгерістердің генетикалық табиғаты дәлелденуі керек. Пайда болған өзгерістердің мутациялар салдарынан болмауы да мүмкін. Олар модификациялық өзгергіштің нәтижесінде пайда болса, онда тұқым қуаламайды. Бұл өте курделі жұмыс, себебі мктацияны дәлелдеу үшін мынандай белгілері болуы керек:

1) өзгерген клеткалар жиілігі өте төмен (1х $10^{- 6} - 10^{- 7}$ ) ;

2) мутагендерді қолдану арқылы оны едәуір арттыруға болады (1х $10^{- 4} - 10^{- 5}$ ) ;

3) өзгерген клеткалар ұзақ мерзім өсе алады;

4) жаңа белгі селективтік қысым болмаған жағдайда да сақталады;

5) өзгерген ген негізінде түзелетін зат табылады немесе жаңа пайда болған белгі анықталады.

Төзімді клеткаларды сұрыптау

Қажет белгісі бар клеткаларды суспензиядан, каллустан, протопластардан сұрыптап алуға болады. Суспензияны пайдаланғанның негізгі артықшылығы, стандарттық микробиологиялық әдістерді қолдану мүмкіншілігі. Өсімдік клеткалар селекциясының көптеген тәсілдері микроорганизмдер мен жануарлар сомалық клеткаларының генетикасынан алынған. Клеткалар топтары көлемінің кірігірімдігі және олардың бірсыпыра физиологиялық гомогендігі, бірден көптеген клеткаларға селективтік фактордың әсерін тигізуге мүмкіндік береді. Көлемі 1л, тіпті одан да аз ортада бірнеше миллион клеткаларды тексеруге болады. Кейде суспензиядағы клеткаларды агарланған ортаға көшіріп отырғзады. Бұндайда әрбір агардың үстінде өсіп шыққан клеткалар колониясы клон (жеке клетка ұрпағы) болу ықтималдығы зор.

Клеткалардың немесе протопластардың жақсы суспензиясын алуға мүмкіндік болмаған кезде, агарланған қою ортада өсетін клеткаларды селективтік фактор суда ерімейтін кезде де қолдануға болады. Бұл жағдайда ол зат органикалық еріткіште ерітіледі де, табақшадағы агардың үстіне тегіс жайылады немесе ерітілген ортаға қосылады. Каллус трансплантының клеткалары бұндай ортада тежеуші затпен бірыңғай әрекеттеседі: төменгі клеткаларға жоғарыдағы клеткаларға қарағанда сол заттың мөлшері артығырақ тиеді. Төзімді клеткалар жақсы өсуінің нәтижесінде біртіндеп көріне бастайды, оларды бөлшп алып, селективтік ортаға отырғызып, тұрақты линияларды шығарады. Төземді клеткалар линияларын протопластардан сұрыптаудың өз артықшылығы бар, себебі протопластарды суспензиядағы клеткалар мен каллустардан ғана емес, бүтін өсімдіктерден де алуға болады. Одан басқа, протопластарды клеткалық линия тек қана жалғыз жеке клеткадан шыққанына сенім мол болады.

Төзімділік белгісінің тұрақтылығы

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.