Суспензиялы культура

Пән: Биология
Жұмыс түрі: Іс-тәжірибеден есеп беру
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 33 бет
Таңдаулыға:

Мазмұны

1 Дәрістер
2 Зертханалық жұмыстар
3 Өзіндіқ жұмыстар

1. Глоссарий – антигендер иммунды жүйеде антидененің пайда болуына
әкелетін заттарға спецификалық әсер туғаызатын ақуыз. Антидене –
иммунды жүйеде түзілетін ағзаға түскен бөгде патогендерді
агенттерді бекітетін ақуыз. Гаплоид, ядро, жасуша, ағза, бұл
хромосома жиынтығынан тұратын, толық жиынтықтың жартысын көрсетеді.
Ген – бір немесе бінеше полипептидті тіркесті белгілейтін немесе
РНК молекуласының немесе белгілі регуляторлы қызмет атқаратын
хромосоманың бір бөлшегі (ДНК молекуласы). Жасуша культурасы
асептикалық жағдайда арнайы жасанды қоректік ортада жануарлар
немесе өсімдіктердің белгілі бір тіндеріне жасушаларды өсіру.
Каллус – жасушаның ұйымдастырылғын пролиферациялық жолмен алынған
тін. Пролиферация – ол бір жасушадан көбею арқылы жаңа түзілістің
пайда болуы. Өсімдік- регенерант- культурада пайда болған, тамыры
мен дамыған асептикалық жолмен алыңған өсімдік яғни in vitro.
Тотипотенттік өзіне тән гентикалық ақпаратты көрсете алатын жасуша
құрамы дифференцировканы және ағзаның ары қарай дамуын
жалғастырады.
Суспензиялы культура – бұл белгілі бір жасушаларды немесе олардың
белгілі бір топтарын сұйық ортада аэрациясы мен араласуын қамтитын
аппараттар арқылы өсіру.
Протопласт – бұл қабықшасынан айырылған жалаңаш жасуша.
Фитогормондар - өсімдіктерде физиологиялық процестердің регуляциясына
қатысатын қосылыс. Дифференциация – бұл анализ жасушаларымен дочерни
жасушаларының немесе олардың өзара айырмашылығын көрсететін процестер
кешені.
Инокулюм жаңа ортаға қайта отырғызу үшін қолданылатын суспензиялы
культураның бір бөлігі. Компитенция индуцирленген әсерлерді қабылдайтын
және өзгенген дамуына спецификалық жағдайда әсер көрсете алатын
ктеткалардың қабілеті. Детерминация- жасушаға баайланысты арнайы тұқымдық
құрылысты реализацияға дайындайтын жағдай.

Дәріс №1
Жоспар
1. Клетка биотехнологиясының дамуы
2. Биотехнологияның үш бағыты, жекеленген клеткалар мен ұлпалардың
маңызы
1. Өсімдіктер әлемі тіршіліктің көзі болып есептеледі. 1,9млрд тонна
құрғақ затты аздап өсімдіктен алатыны белгілі. Өсімдікті көптеген салаларда
қолданады: ауылшаруашылығында, құрылыста, қағаз және энергетика
өндірісінде, шаруа қожалықтарында, химикаттарды, дәрілік заттарды,
биологиялық белсенді заттарды, заттардың химиялық байланыстарын алу үшін
арнайы қызығушылық танытады.
ХХ ғасырда химизация, механизация, мелярацияның қолдануда
ауылшаруашылық өнімдері жоғарылады, бірақ ол қоршаған ортаның ластануына,
ресурстардің төмендеуіне себепші болды. Сонымен қатар қосымша прогресстің
арқасында ауылшаруашылық өнімдерінің көрсеткіші өз шегінен асып кетті.
Сондықтан жаңа ізденістер мен жаңа әдістер керек болды.
Жаңа әдістердің ішінде ең перспективтісі- жасуша инженериясы болып
саналды. Жасушаның арнайы жаңа әдістерін қолдану арқылы құрылған оларды
эукриоттық ағзалардың жекелеген жасуша әдісі.
2.Жекеленген жасушалар мен ұлпалар биотехнологиясын 3 бағытта
қарастырады:
1. Жекелеген өсімдік жасушаларынан бағалы медициналық өнімдер,
парфюмериялар. косметикалар, бояулар және т.б. екіншілік
өнімдер: алколоидтар, стероидтар, гликоидтар, гормондар, эфирлі
майлар өндіреді.
2. Екіншілік өнімдерді қатты немесе сұйық каусты ұлпалардан алады.
Жасуша технологиясы арқасында диосгенинсияқты медициналық
препараттар алады, оны парфюмерияда қолданады. Осы тәсілдің
тиімділігі оның екіншілік синтезделген заттарының алынуына
біздің табиғата бағынбайтын өсімдіктерден алуға болады. Екінші
бағыты – отырғызатын материалдардың көбеюінде жекелкенген
тіндердің культурасын пайдалану болып саналады. Бұл әдіс
өсімдіктің микрокөбею клоналімен аталған. Бұнда бір
мерисистемадан бір жылда мыңдаған өсімдік алуға болады.
3. Селекциялық өсімдіктерде жекеленген жасушаларды пайдалану арқылы
жасалады. Бұнда тез өсетін өсімдіктерді табиғаттың қолайсыз
жағдайына: ыстық, суыққ, сусыздыққа төзе алатын өсімдіктерді алу
жатады.
ХІ ғасыр - өсімдік трониген ғасыры болып саналады. Бұл өсімдіктер
гербицидтерге, жәндіктерге, вирустарға төзімді. Бөтен геннің протопластарын
жеке генді инженерия әдісімен трансгенді өсімдікті алуда жақсы нәтиже
береді.

Дәріс №2
Тақырып: Клеткалық биотехнологияның теориялық негіздері
Жоспар
1. Тарихи ақпарат
2. Өсімдік жасушаларының тотипатенттігі
1. Тін, ағза, жасуша культурасы - термині толығымен өсімдікер
бөлігінің асептикалық өндірілуінде қолданылады:
• агарирленген ортадағы каллусты тіндерге
• жасушаның суспензиялы культурасына және сұйық ортадағы аздаған
агрегаттарға
• протопластар культурасында
• жекеленген ұрықтарда
• жекеленген ағзаларда (тамыр ұштары, өркендеуші меритемаларда)
1.1. Тарихи ақпарат өсімдіктер тіндерінің жекеленген жасушаларын
культивирлеу бұрын жасалған және бұл әдістің дамуының тарихи бірнеше
кезеңдері бар.
1 кезең (1892-1902) Х. Дерканд, Фехтинг, Ресимгер деген неміс
ғалымдарының атымен тығыз байланысты. Олар сахароза ерітіндісінде көптеген
өсімдіктер тіндерін культивирлеуге тырысқан.
Бақбақ пен теректің сабақтарының бөлшектерін зерттеуіне біріншілік
каус қолданылған. Оң нәтиже алмаған ғалымдар бірнеше ойлар мен
пікірлерайтқан, бірақ олар кейіннен расталды. Соған байланысты Хаберланд
арнайы культивирленген жағдайда өсімдіктер өзінің даму потенциалын
құрастыра алады деген болжам айтқан.
2 кезең (1902-1922) жануарлар тіндерін культивирлеу арнайы қоректік
орталарда жасалу негізделген. Бұл орталар табиғаты жағынан қан сарысуынан
және ұрықтық ерітіндіден құралған. Жасанды құрамында өсімдік экстрактылары
бар қоректік ортада жекеленген өсімдік тіндерін өсіру дұрыс нәтиже әкелген
жоқ, өйткені ол жасушаның және өсімдік тіндерінің өсу жылдамдығына қатысын
аз тигізді.
3 кезең (1922-1932) Ағылшын ғалымы Робинс және неміс ғалымы Котте
қатты қоректік орталарда культивирлеуге болатынын айтты, бірақ та белгілі
бір уақытта өсімдік тіндері өліп қалды.
4 кезең (1932-1940) француз ғалымы Р. Готри өсімдік тіндерінің жаңа
қоректік ортада периодтық отырғызу арқылы in vitro жағдайында ұзақ
культивирлеуді көрсетті.
5 кезең (1940-1960) 1955ж цитокин – фитогормон класының ашылуы табак
паренхимасының жасушалық бөлінуіне ықпал етті. Осы арқылы морфогенезді
индуцирленген каллустық тіндердің өсуін қамтамасыз етуге, эксплантты
жасушаларды қолданды.
6 кезең (1960-1975) Нотинген университетінің профессоры Э. Коккинг
ферментативтік әдісті ойлап шығарды. Оның әріптесі Пауэроль соматикалық
гибридтарды шығарды. Француз ғалымы Ж. Морель in vitro жағдайда культура
меристемасын қолдана отырып орхидеяның отырғызылған түрлерін алатын әдісті
ойлап тапты.
7 кезең (1975- қазіргі уақытқа дейін) in vitro техникасы тез дамуды
жалғастыруда, протопластардың электрслияния әдісі, мутагенез әдісі,
гаплоидты өсімдіктер алу әдісі, вектормен протопластардың жекеленуі арқылы
жасушаларды терең культивирлеу әдісі пайда болды. Генді инженерия әдісі
арқылы екі үйлі өсімдіктер үшін генді жеткізу әдісі ойлап шығарылды.
2. Өсімдіктің жекеленген бөліктерін культивирлеу әдісі - өсімдіктің
жасушасының маңызды құрамын тотипотенттілігін зерттеуде пайда болған.
Тотипотенттілік (лат. тотус- бүкіл, потенция –күш) – бұл жасушаның
генетикалқ ақпаратын ұйымдастырады. Онда бүкіл ағзаның өсуін және
дифференциациясын қамтамасыз етілетін жағдайлар туады. Тотипотенттілікке
жануарлар жұмырқаларының және өсімдіктердің жұмырқа жасушаларының ұрықтануы
тән.
Өсімдіктерде тотипотенттілікті табиғи жағдайда арнайы жасушалар
көрсете алады. Өсімдіктер тотипотенттілігі жараның жазылуында пайда болады.
Өсімдіктердің жаралы бетінде арнайы емес жасуша пролиферациясы себебінен
каустық пайда болады. Каллус жараның жазылуына әсер етеді.

Дәріс №3
Тақырып: Клеткалық биотехнологияның объектілері. In vitro – өсірілетін
клеткаларды биологиялық активті заттарды алу үшін пайдалану.
Жоспар
1. Каллусты культураны алу
2. Каллусты клеткалар қасиеті
3. Каллусты жасушаың генетикасы
4. Гормонға тәуелсіз өсімдіктер тіндері
1. Биологиялық активті заттарды шығаруда қатты фазалы ферментация және
терең суспензиялы культивирлеу арқылы алынған каллусты тіндер қолданады.
Каллусты культуралар – бұл дифференцирленген жасушалардан тұратын арнайы
емес пролиферлеуші тін. Клеткалар тіндерінің жекеленген бөліктерінде in
vitro, сонымен қатар жараланған өсімдіктер тіндерінде түзіледі.
Өсімдік жасушаларының каллусқа айналуы қоректік ортада
фитогормондардың болуына байланысты.
Әрбір жасушаның өсуі 3 фазадан өтеді:
1. бөліну
2. созылу
3. дифференцирлену
Қартаю мен бөліну болмау үшін және каллусты клеткалардың өлмеуі
үшін, эксплантта пайда болатын біріншілік каллусты, 4-6 аптадан кейін жаңа
қоректік ортаға отырғызады. Бұны пассирлеу операциясы деп атайды. Үнемі
пассирлегенде бөлінуге қабілеттілік 10 жылға сақталады. Каллусты
жасушаларды өсірген қисық S- тәрізді пішінге ие болады. Өсудің бұндай
сипаттамасын каллусты клетканың супензияда өсіруден байқауға болады.
2. Каллусты клекалардың ерекшеліктері. in vitro жағдайда өсірілген
каллусты клеткалар жай клеткаларға тән физиологиялық, химиялық қасиеттерін
сақтайды. Каллусты клеткалар 2-ші метаболиттік синтездік қасиетті сақтайды.
Суыққа төзімді өсімдік клеткаларынан алынған каллусты клеткаларда қатты
суыққа төзімділік, шынығуға бейімділік қасиеті байқалады.
Каллусты және пористі клеткаларға тән ортақ қасиет жоғарғы
температуға, осмотикалық белсенді заттарға, тұздалуға төзімділік.
Жай клеткалардан каллусты клеткалар жекеленген қасиеттерімен
ерекшелінеді. Оларда спецификалық белоктар пайда болады және
фотосинтезделген жапырақ клеткаларына тән белок мөлшері азаяды немесе
мүлдем жойылады. Каллусты клеткалар генетикалық гетерогенділігімен және
физиологиялық асинхрондылығымен ерекшелінеді.
Ағзаның бақылауынан шығу нәтижесінде каллусты клеткалардың өсуі
ұйымдастырылмаған, асинхронды және шексіз болады. Р. Готре 60 жыл бұрын
жаңа қоректік ортаға отырғызған сәбіз тінінің культурасы әлі күнге дейін
коллекцияда өсіп жатыр. Ашық грунтта өсіп жатқан өсімдікке қарағанда,
каллусты клеткалардың өсу циклы ұзақ.
Каллусты клеткалардың ерекшелігі, жас бойынша гетерогенді болуы:
клеткалар бір уақытта каллусты тіндерде кәрі және жас болады.
Каллусты клеткалар энергетикалық алмасуында елеулі өзгерістер
байқалады. Олар жай клеткалармен салыстырғанда ауаны аз тұтынады.
3. Каллусты клеткалардың генетикасы. каллусты тіндер клеткасы
генетикалық гетерогенді болады. Каллусты клеткалардың генетикалық
біртексіздігі алдымен әртүрлі тығыздықта байқалады, яғни каллусты клеткалар
хромосома санымен өзгешеленеді. Генетикалық стабильді in vitro болып
меристемалық тіндер саналады.
Каллусты және суспензиялы культураларда өсімдікке тән диплоидты
хромосома жиыны бар, клеткалар құрамында 3,4,5 және одан да көп хромосама
жиыны бар полиплоидты клеткалар кездеседі. Плоиплоидиямен қатар каллусты
клеткалар культурасында анеуплоидия (хромосома жиынының өсуі немесе
төмендеуі бінеше хромосомаға) кездеседі. каллусты клеткалар ұзақ
культивирлеген сайын плоидтылығымен көбірек ажыратылады.
Темекінің каллусты клеткаларын төрт жыл культивирлегенде диплоидты
клеткалар жойылып, барлық клеткалар полиплоидты немесе анеуплоидты болады.
Плоидтылықтың өзгеруінен басқа өсімдікткрдің тіндері мен
клеткаларын in vitro культивирлеу клеткаларда хромосомалық аббербацияның
пайда болуын шақырады. Ақырғысы культивирленетін тіндердің биологиялық
ерекшеліктеріне, сыртқы көрінісіне, зат алмасуына, өсу жылдамдығына әсер
етеді.
Каллусты клеткалардың генетикалық әртүрлілігі оларды клеткалық
селекциядажағымсыз факторларға төзімділікке, фитопатогендерге және жоғары
продуктивтілікке қолдануға мүмкін,дік береді.
4. Гормонға тәуелсіз өсімдік тіндері. Каллусты клеткалар қоректік
орталарда гормондардың мөлшеріне байланысты ғана бөлінеді. Бірақ та, ұзақ
культивирлеу нәтижесінде ортада гормонсыз өсу қабілетіне ие болуы мүмкін,
яғни ауксин мен цитокининге қатысы бойынша автономды болады. Бұндай
клеткаларды қалыптасқан деп атайды. Қалыптасқан клеткалар ісік клеткалары
сияқты, көп жағдайда қалыпты регенерацияға қабілетсіө және тек тератомдар
түзеді.
Барлық каллусты тіндерде, кейбір культураларда 4-ші апссаждан
абстап, регенерацияға қабілетілігі төмендейді, одан мүлдем жоғалады. Ескі
егілген культураларда өсімдік регенеранттар алынбайды. Химиялық ісіктермен
негізделеген қалыптасқан тіндерден басқа бактериямен, вируспен туындайтын
өсімдік тектес тіндермен және өсімдіктердің түраралық гибридтерден
туындайтын генетикалық ісіктер де бар.
Қалыптасқан тіндерде және ісіктерде өзіндік гормондардың
интенсивті синтезі жүреді, сондықтан олар қоректік орталарға енгізуді қажет
етпейді.
Қалыптасқан тіндерде гормонға тәуелділік гормондар ситезіне,
грмон молекулаларының құрылысуына қатысуына, ферментті белоктардың
синтезіне жауапты гендер белсенділігінің өзгерісі нәтижесінде туындайды.
Ісік тіндерінде гормондар синтезі осы процесске жауап беретін бактериалды
генді клеткаға ауысуына қатысты.

Дәріс №4
Тақырып: In vitro – өсірілетін клеткаларды организмге, ұлпаларға
және мүшелерге түрлі биологиялық активті қосылыстардың, дәрі-дәрмектердің,
токсиндердін, әр түрлі патогендердің әсерін зерттеу үшін модельді объект
ретінде пайдалану.
Жоспар
1. Жинақтағыш немесе кезеңдік культивирлеу
2. Үздіксіз культивирлеу
1. Сұйық ортада клеткаларды культивирлеу бірнеше әдіспен іске асады.
Қарапайым және көп таралғантүрі жинақтағыш немесе кезеңдік
культивирлеу болып табылады. Клеткалар тұрақты көлемде қоректік
роллерлі немесе тербеткіш типті құралдарда өседі. мұндай жүйелер газ
және метаболизмнің ұшқыш өнімдерінен басқа барлығы үшін жабық. Осы
кезде колбаларда көп мөлшерде көмір қышқыл газының біраз көлемі
жиналады. Өсу аяулағаннан кейін суспензия алғашқы тығыздыққа келеді,
өсіру циклы қайталанады.
Өсіру циклы – бұл жүйе инокулюмды жаңа ортаға келесі
субкультивирлеуе дейі енгізу. Жинақтағыш культуралар үшін көбінесе минутына
60-120 айналым жылдамдық жасайтын толық айналымды және жартылай айналымды
платформалы тербеткіштердегі әртүрлі мөлшердегі коникалық кеңмойынды
колбалар қолданылады. Өсімдік клеткалары микроорганизмдер сияқты
спецификалық ерекшеліктер қатарына қарамастан өсу заңдарына бағынады,
сондықтан микроорганизмдермен жұмыс істегенде қолданылатын технология және
аппаратуралар қолданылады. Микроорганизмдерді әдетте ферментер деп аталатын
аппараттарда культивирлейді. Жинақтағыш ферментерлерді 0,5-10л көлемді
лабораторлы ферментерлорда өсіруге болады. Тереңдік өсірумен салыстырғанда
тербеткіштердегі колбаларда тереңдік өсіру арқылы клеткаларды ферментерда
культивирлеуде олардың кострукцияларымен сәйкес жаңа мүмкіндіктер пайда
болады.
2. Ағынды режимде культураларды өсіру әдісі үздіксіз культивирлеу деп
аталады. Ағынды жүйені құру негізіндегі тәжірибелерде культураның
экспоненциалдық өсу фазасында жаңа қоректік орта бөлігін супензияға
қосу клеткалардың бөлінуін ұзақ қолдайды. Үздіксіз культивирлеу жабық
ағынды және ашық ағынды жүйелермен іске асады.
Жабық ағынды жүйеде суспензиялы культура жаңа қоректік ортамен
қамтамасыз етіледі, онда пайдаланылатын ортаның ағып келуі мен ағып шығу
көлемі баланстанған. Өсірудің жартылай ағынды режимінде суспензияның
белгілі бір көлемі уақыт өткен сайын таңдалынып алынады және қалған бөлігі
жаңа ортада ерітіледі. Үлкен биомасса алу үшін және биохимиялық зерттеу
үшін қолданылады.
Ашық ағынды жүйе жаңа қоректік ортаның ағып келуі мен клетка
суспензиясының тең көлемін жою арасындағы балансты қамтамасыз етеді. Клетка
бөлігін жүйеден жою жылдамдығы бөліну нәтижесінде, клетаның бөліну
жылдамдығына сәйкес келуі керек, ол клетканың өсуі және биосинтез арасында
тең жағдай туғызады.
Үздіксіз культивирлеу негізіне микроорганизмдерді культивирлеуде
құрылған турбидостат және хемостат принциптері кіруі мүмкін. Хемостатты
режимде үздіксіз культивирлеу ламитирлеуші өсу факторының әсерінен жүреді.
Турбидостат принципі сыртқы лимитирлеусіз үздіксіз культивирлеуді
көрсетеді, клетка популяциясының өсуі белгілі бір деңгейде клетканың
оптикалық тығыздығын реттеуде қолданылады. Бұл үшін төмен тығыздықты
клеткалы және жоғарғы өсу жылдамдықты суспензиялар келеді, яғни алғашқы өсу
фазасы популяциясы. Турбидостат тығыз культураға сезімтал фотоэлектрлік
элементпен толтырылған хемостатпен сипаттайды. Клетканың өсу популяциясы
берілген деңгейде автоматты түрде фотометрикалы ортаны беру регуляциясымен
қолданылады.

Дәріс №5
Тақырып: Клеткаларды культивирлеу
Жоспар
1. Әдіс тарихы
2. Клеткаларды культивирлеу
1. 20 ғасырдың бірінші 10 жылдығында жануарлардың клетка
тіндерін организмнен бөліп алуды және олардың өсуіне жағдай жасауды және in
vitro өндіруді мойындады. Мұндай процесстерге қол жеткізуге болатындығы
белгілі болғандықтан, жұмыcтың екінші этапы басталып, негізі болып өсіру
мүмкіндіктерінің демонстрациясы және мұндай клеткадағы инфекция агент-
вирустарының репродукциясы болып табылады. Тарихтың үшінші этапы вакцина
препараттарына қолдану үшін жануарлар клеткаларындағы үлкен вирус
материалының көлемін алу мүмкіндігін прктика жүзінде көрсетіле басталды,
және жойылуы: 1) клеткаға спецификалық экзогенді алынған гендерді енгізу
және олардың экспрессиясын алу және 2) клеткада бүтін популяцияның бір
клеткасын өсіру мүмкіндігі бекітілгенге дейін болды. Мұндай популяцияларды
қоршаған ортаға антидене бөлетін клеткалардан алғанда, барлық антидене
молекулалары тұнбаүстілік сұйықтықта бірдей болады. Бұл екі феноменнің
себебі мен барысы қазіргі уақытта қарқындылықпен зерттелуде және олар
өзімен берілген бағыттың 4-ші этап жұмыстарының басталуынаң алғышарты болып
саналады.
Культурада жануар клеткаларының өсу және бөліну қасиетін көрсету
үшін, әдістер қатарын меңгеру қажет етілді.
1. Экзогенді прокариоттардан және саңырауқұлақтардан таза клеткалар алу
әдістемесі.
2. Тіннен бөлініп алынғын немесе жекешеленген клеткалары бар ортаны
жасау әдістемесі ығыстырылмайды.
3. Динамикада клетканың дамуын бақылау әдістемесі.
4. Жануарлар клеткасын үздіксіз in vitro жағдайда культивирлеу және
оларды басқа биологиялық агенттерден бос ұстау әдістемесі.
Осы әдістемелердің разработкасының ғылыми негізін, жануар және
өсімдік тектес тірі организмдердің құрылымдық элементі ретінде клетка
құрайды. Жануар тінінің клеткасын организмнен бөлу және одан кейін олардың
өсуіне жағдай жасау оларды in vitro өндіру идеясы Клод Бернардың
концепциясында пайда болды. Ол ішкі жағдайда қоршаған ортада өзгеріске
тәуелсіз, ішкі ортаның тұрақтылығын сақтауға қабілетті тек тірі организмдер
ғана емес деген пікірде болды. Организмнен тыс жануар клеткасы өзінің ішкі
жағдайларын сақтауға тырысады. Егер ішкі және сыртқы жағдайлар арасындағы
ерекшелік елеусіз болып, өсу мен клетканың бөлінуінің мүмкіншілігі артады.
Мұндай құбылыстың түсінігі қолдауға қабілетті және клетканың организмнен
тыс өсуін стимульдейтін орта құрылымын жасау болып табылады.
Одан кейінірек 1885 жылы У. Рукс организмнен тыс тірі организмдерді
сақтайһу мүмкіншілігін практика жүзінде көрсетті. Ол тауық эмбрионының
қабықшасын физиологиялық ерітіндіде тіршілікке қабілетті күйде сақтады.
Кейінірек 1897ж Леб жалғағыш тіндермен қан клеткаларын сарысу мен қант
плазмасы бар пробиркаларда тіршілкке қабілетті күйде сақтады. Льюнгрен
(1898ж) реиплантацияға қабілетін сақтаған қышқылды ортада адам терісінен
алынған экспланттарды тіршілікке қабілетті күйде ұстады. Қосымша
эксперименттерді Джолли (1903) саламандра лейкоциттері бпар ілмелі
тамшыларда клетканың бөлінуін бақылады., ал Биб және Эвинг (1906) бұл ит
тінінің лимфосаркомасын қайта отырғызу деп бекітті.
Ру және Росс Харрисон жұмысты жалғастыру барысында ілмелі тамшылар
әдістемесін жетілдірді. 1907 жылы камераның көмегімен бірнеше апта ішінде
нерв клеткаларының өсуін бақылай алды: ол бұл клеткалардың өсу жылдамдығы
25 минутта 20мкм болатынын бекітті.
1913ж Алексис Каррель эмбрион экстрактысымен байытылған қан
плазмасын қолданды. Бұл әдістеме үлкен жетістікті қамтамасыз етті. Рид
теңіз шошқасының сүйек миынан культура дайындап және белгілі химиялық
құрамдық ортада экспланты өсіруге талпынды. Левис (1911) және Рид (1908)
қолданған. Каррельдің жұмысы өлмейтін клеткаларды культивирлеу деген
атпен жариялағандықтан көпшіліктің үлкен назарын аудартты. 1912 жылдың 17
қаңтарының басы тауық эмбрионының жүрегінің клеткаларының инкубациясын алу
кезеңі болды. Клеткаларды қайтара егуді 34 жыл бойында Эблинг жалғастырды.
Каррель хирург болғандықтан және асептика жөнінде білгендіктен жануарлардың
клеткаларын in vitro культивирлеуге үлкен үлесін тигізді. Каррель өзінің
әріптестеріне клеткаларды қайтадан өткізу процесі кезінде жасалатын
бақылаулар туралы демонстрация жасады. Істелінген жұмыс барысында
культивирлеу ортасы рецептурасына бірқатар өзгертулер енгізді. Тирод
Ренгердің ерітіндісін модифицирледі және тауық сарысуымен эмбриональды
экстракты толтыруда фибрин коагулятын қолдана бастады. Бөлініп жатқан
жануарлар клеткаларын бақылау үшін 1928ж Канти кинофотомикрография тәсілін
шығарды. Осы кезеңде клеткалық жұмыс техникамына қосымша және түбірлі
өзгерістер болды. Ең бірінші жалғыз клетка культуралар клонын 1948 Эрли мен
оның әріптестері алды.

Дәріс №6
Тақырып: Жануарлар клеткаларын культивирлеу
Жоспар
1. Культураға клетканы енгізу
2. Клеткалардың шығуы
Экспериментальды жұмыстың мақсаты мен тапсырмаларына қатысты жануар
клеткаларының 2 бағытта культивирленуін шығаруға болады.
- клеткалар культурасы
- ағза мен тін культуралары (ағзалық культуралар)
Клеткалар культуралары құрылымдық мекемелерден алыстатылған
гистиотипикалық архитектураға тән қасиетін биохимиялық белгілерін жоғалтады
және олар арнайы жағдайлардың болмауы кезінде тепе-тең жағдайда көбінесе
жетпейді. Клеткалар культурада көбееді, олар клетканың үлкен массасын алуды
қамтамасыз етеді, одан оларды идентифицерлейді, идентикалық параллельдерде
бөледі және қажет болса сақтайды. Осымен байланысты кейбір зерттеулер
берілген тіннің құрылымдық біртұтастығын сақтайтын клеткалық жүйелерді
қолданады.
Клеткалар түрінің культураға кірген тізімі жетерліктей көп. Олар
адамның қосалқы тін элементі (фибробластар), скелет тіндері (сүйек және
сіңір), жүрек және тегіс бұлшықеттер, эпителий тіндері (бауыр, бүйрек
т.б.), нерв жүйесінің клеткалары, эндокринді клеткалар (бүйрек үсті,
гипофиз), меланоцит және әртүрлі ісік клеткалары. Клеткалар популяциясы
үнемі гомогенді болмайды және фиксирленген фенотипі бар. Культураға
енгізуге қандай ті алуға болады, ересек немесе эмбринальды, калыпты немесе
ісіктік? Эмбриональды тіннен алынған культуралардың тіршілікке
қабілеттілігімен және ересек тіндерге қарағанда белсенді өсу қабілетімен
сипатталады. Мұның себебі болып, мамандандырудың төменгі деңгейі қызмет
етеді. Ересек тіндерді пролиферативті қабілеті болып, олардың бөлінбейтін
маманданған клеткалардың көп болуы. Үлкен тіндердің біріншілік клетка
культураларын алу және олардың көбеюі қиын болғандықтан, мұндай
клеткалардың өмірі ұзақ емес. Ісіктен алынған культуралар үздіксіз ұзақ
уақыт пролиферленгенде қалыпты тіндер культуралар өміріне белгілі бір
уақыт береді. Ісік клеткалары культурасында пролиферацияға қабілеттілікті
сақтауда аздаған бөлікте дифференцировка болуы мүмкін.
Жаңа бөлінген культуралар пассирлеу мен субкуьтурлеубасталғанға
дейін біріншілік культура деген атқа ие болады. Біріншілік культуралар
клеткалары әдетте гетерогенді және төменгі пролиферациямен сипатталады.
пассерлеу культураның өмір сүруін ұзартып, клонирлеу мүмкіндігін зерттеу
және клетканың сақтау қасиетін қамтамасыз етеді. Бұдан неғұрлым біртекті
популяция пада болады, сонымен қатар специфирленген клеткалар жоғалады.
Бірнеше егуден кейін клеткалар линиялары өледі неме транформацияланады және
тұрақты клеткалар линияларына айналады. Өлмейтін қасиетке ісіктен алынған
клеткалар ие. Тұрақты клеткалар линиялар морфологиялық өзгерістерімен,
сарысуға тәуелділігінің төмендеуімен, эффектісінің жоғарлауымен субстратқа
тәуелділігінің төмендеуімен гетероплоидтылықтың жоғарлауымен
анеуплоидтықпен және ісіктектіліктің көбеюімен констатирленеді.

Дәріс №7
Тақырып: Соматикалық бұдандастыру
Жоспар
1. Іn vitro жағдайында культивирленетін клеткалар сипаттамасы
2. Трансформация
Бір типтегі клеткалар ұстап тұру үшін тіндердеәрекеттеседі және
бөліну жылдамдығын келіседі. Бұндай тектің әлеуметтік бақылауы бұзылу
реакциясында байқаланады. Ұқсастықты культуралардың дисоциирленген
клеткаларынан байқауға болады.
Адгезивті қатынастар клеткалар мембраналарын беткі рецепторларынан
комплекстердің түзілуін қамтамасыз етеді. Гликопотеиндердің көлденең
қозғалысының нәтижесінде мембранада гликопротеин комплексінің электронды
тығыз белгілер (бляшки) түзіледі. Бұндай белгілер аглютинерлі агенттер
немесе көрші клеткалар антиденесінің әрекетіне жауап ретінде түзіледі.
Адгезияда субстрат көпвалентті антидене ретінде әсер етеді. Ал көп түзілген
белгілерді адгезивті дақ деп атайды. Бұл дақтар адгезивт ақуыздарға бай
және гликопротеидті ұстап тұратын ситос скелет элементтері шығарады. Осы
қызметтердің көмегімен мембрананың күюі (разжижение) азаяды және
домаланудан алдын-ала сақтанады. Клетка түзілген адгезивті дақтар
шошақтарын (выступы) құрайды. Олардың көмегімен орын ауыстырады. Цитоплазма
шошақтары көрші мембраналармен қатынасында қозғалысты ингибирлейді. Осы
жағдайда клеткалар өздерінің псевдоподияларын басқа бағытқа ауыстырады.
Ондай клеткалар көпқабатты болған жағдайда жалған аяқтылардың белсенділігі
және клеткалардың қозғалысы тоқтайды. Қалыпты клеткалар бөлінуді тоқтатса,
бұл құбылыс тығыздыққа байланысты пролиферацияның тоқтауымен
түсіндіріледі.Егер мұндай моноқабат атбақшада клеткадан бос сызық пайда
болуы үшін инемен жараланса (поранить) клеткалар бұл сызықтың шетімен бос
орынға жылжи бастайды және бөліне бастайды. Клетка популяциясының тығыздығы
ортада өсу факторларының жоғарылауымен үлкееді, бұдан басқа егер
культуральды сұйықтық табақша бетімен клетка шеттерімен ағатын болса, онда
ортамен жуылған, басқа клеткалар үстімен өткен клеткалар, бос клеткалар
бөлімдері үстімен өткен, ортамен жуылған клеткаларға қарағанда баяу
бөлінеді. Клетка үстімен аққан ротада, кейбір қоректік заттар немесе өсу
факторлары болмайды.
Өсу факторы әдетте концентрациясы 10-10 М болатын ортада
болады. Өсу факторы бір фибробласта 105 рецепторлы өсу факторы болады,
олардың әрқайсысы оған өте жоғары типтілікке ие. Осылайша әрбір клеткаларды
150мкм диаметрлі сфера көлемінде өсу факторларының барлық молекулаларын
байланыстыру үшін рецепторлары жеткілікті.
Осыдан басқа клетка бетінің рецепторларымен байланысқан өсу
факторларының көп мөлшері эндоцитоз жолымен бұзыып, жойылады. Бұдан
көршілес клеткалар бір-бірімен өсу факторының азғана мөлшері үшін
бәсекелеседі. Бәсекелесудің бұндай түрі тіндегі клетка үшін де,
культивирленген клеткалар үшін де маңызды. Ол тығыздықтың кейбір деңгейінен
жоғарғы популяцияның өсуіне айналады.
Өсу факторы мен қоректік орта бәсекелестігі клетка культурасындағы
бөлу жылдамдығына әсер ететін жалғыз фактор емес. Субстрат бетіндегі олады
распластауымен, бос орындарға қозғалысының клеткалар формасы олардың бөліну
қабілетіне тағы да күшті әсер береді. Қатты бетке бекітілгенқалыпты
клеткаларды культивирлегенде, олар тіпті бөлінбейді. Сондықтан дөңгелек
пішінді иемденеді. Клетканың бөліну жиілігі олардың распластау дәрежесінің
үлкеюіне байланысты өседі. Қатты распластанған клеткалар көптеген өсу
факторының көп молекуласын ұстауы мүмкін және өзінің үлкен жоғарғы
қабатының арқасында көп мөлшерде қоректік ортаны қалғиды (поглощать).
Бірақ та субстрат аймағымен байланысқа түсе сала, клетка
распластай алмайтындай бұл аймақ өте кішкентай болса да суспензияда
пролиферацияға қабілетсіз клеткалар типі белсенді бөлінеді. Бұндай фокальды
байланыстар сыртқы клеткалық матрикстар молекуласымен клеткадан тыс актинді
филаминттер қосылысының орны болып табылады. Осы және басқа да байқаулар
клетканың бөлінуін бақылау қалайда цитоскелеттік ұйымдасумен байланысты
деген ойды туындатады. Механизм мен функция бұл ретте түсініксіз клетканың
байланысы оның бекітілуіне байланысты деп ойлауға болады, шындығында тіндер
клетка пролиферациясын, оның бүтіндігін сақтайды. Қатерлі ісік
клеткаларында өсуді басқарудың жоғарылауы әрқашан клетканың адгезивтіктің
азаюымен байланысты.
2. Культивирленген клеткалардың өсу ерекшелігінің өзгерісі
трансформация деп аталады. Трансформация қайтарылмайтын процесс, және тұқым
қуалаушылық ақпараттың спецификалық бөлігінде, өзінің иесінің
трансформирленген геномына қосылған неопластикалық фенотипті бақылайтын
генетикалық өзгерістері болады. Өсу ерекшеліктерінің өзгерісі,
трансформирленбеген клеткалар үшін жағымсыз жағдайда клеткаларды
полиферлейтін адаптивті ерекшеліктерінің бірі болып табылады. Осылайша
қалыпты клеткаларының өсуін шектейтін, трансформирленген клеткалар
популяцияның өте жоғары тығыздығында өседі және өсу факторларында олардың
төменгі қажеттілігімен байланысты. Трансформация кезіндегі өзгерістер
клеткалық мембрана арқылы қоректік заттар тасымалдауымен байланысты екені
дәлелденді, бұл, өз кезегінде геометрикалық өсу факторларына клеткаларды
аз тәуелді етеді.
Трансформирленген клеткалар сферикалық клондарды құра отырып,
суспензиялық клеткада өседі. Осылайша трансформирленген клеткалар аздаған
мөлшерде толерантты жануарларға алдын-ала енгізілген жағдайда қатерлі ісік
пайда болуы мүмкін. Осы себеппен трансформация кезінде қатерлі өзгерістеоге
теңеседі. Трансформация вирусты немесе спонтанды болуы мүмкін. Көптеген
клеткалармен орындалған зерттеулер вирустық трансформациямен негізделген.
Көп зерттеулер спонтанды тасымалданатын клеткалар ДНК енгізінде
жалғастырушылықты игереді. Бірақ бұнадй жұмыстар анологиялық болып саналады
және өзгерістер қалыпты генде нүктелі мутацияны шақырады.
Мысал болып адамның диплоидты клеткаларының линиялары қызмет етеді.
Трансформирленген клетканың өсуіне жоғары қабілеттілікті трансформация
береді.
Қартаю генетикалық факторларға байланысты, яғни әрбір түр сипатты
өмір жалғасын береді, бірақ популяция ішінде бұл көрсеткіш бойынша
вариабельділік фенотип әсерімен куә болады. Адамның диплоидты клеткалар
адаптирлегенде (линия W138) басынан бастап культивирленген клеткалар қартаю
феноменінберетіні көрінді және өмірдің өлшеулі уақытын берді.
(50±популяцияны екі еселеу). Өмір жасына байланысты өзгерістер
митотикааралық интервалдардың ұзаруын қоса қамтыды, (19±25%-31±41%сағ),
метаболизмнің, фермент деңгейінің және өнім экспрессиясының өзгеруі.
Клетканың пайда болуына байланысты өмір жалғасы аралығы культурадағы
клеткалардың екі еселену потенциалы арасындағы анық байланыс көрінбеген.
Өмір жалғасы бойынша шектелген клеткалық линиялар, мысалы
фибробластардың диплоидты клеткалар линиялары өндіріс мақсаты үшін идеалды
обьектілер болып санала алды. Олар клеткада қартаюдың нағыз өзгерісі
болғанша пайдаланылуы керек. Практикалық қатынаста бұл өндіріс мақсатында
оларды қолданғанда бұл клеткалардың өмір сүру периоды 12 мен 30 пассаж
аралығында аяқтлады (бірінші жағдайда – себетін материалды дайындау үшін).
Трансформирленген клеткалар шектелген өмір сүру жалғасын
иеленбейді, бұл биотехнологияда олардың мынадай артықшылығын айқындайды:
әртүрлі өнімдердің генерациясы үшін субстрат ретінде клетка популяциясына
неғұрлым жоғарға тығыздықпен, неғұрлым өсудің жоғары жылдамдылығымен
суспензияда өсу қабілеттілігімен араластырып пайдалану.

Дәріс №8
Тақырып: Микробиологиялық жүйелердің клеткалық биотехнологиясы.
Жоспар
1. Қоректік орта
2. Клетканың культивирлену шарты
Тіннен немесе ағзадан клеткаларды алып оларды культураға
орналастырған соң, культуральды орта клеткалары in vivo иеленетін барлық
сыртқы жағдайларды қамтамасыз етуі керек. Бұл клетканың өмір сүруін,
олардың пролиферациясын дифференцировкасын қамтамасыз етеді. Сыртқы
клеткалық орта клеткаларды қоректік және гормональды факторлармен, яғни өсу
үшін және клетканың өмір сүруі үшін барлық қажеттілікті қамтуы керек.
Адам және жануарлардың клетка культурасы сұйық (қоректік орта)
газообразды (газ концентрациясы) және қатты (субстрат беті) фазада,
нақтыланған талаптарды көрсетеді. Қоректік орта түсіндірілмеген биологиялық
түзілу компоненттері қосылатын, анықталған құрам ерітіндісін құрайды
(плазма қоспасы, қан сарысуы, тіндік экстракт және т.б.). Қоректік ортаның
негізін тұз ерітіндісі құрайды. бұл ерітіндіде минералдық компоненттер
культивирлеу процесінде ортаның тұрақты қышқыл сілтілі балансын қолдайтын
буферлік функцияны орындайтын ерітінді таңдалған. Ортаның pН тұрақтылығы
культивирлеу шартының негізгі талаптарының бірі болып саналады.
Қоректік ортаны дайындау үшін Эрл мен Хенкстің тұ ерітіндісі
қолданылады. Бұл ерітінділер фосфаттұзды буфер Дубленко мен Фугт сияқты
культураны пассирлеуде, клетка линияларын бөлуде, клетка культурасымен
басқа манипуляцияда өсіру және жуу үшін қолдалынады. Культивирлеудің басқа
маңызды шарты осмотикалық қысым болып табылады. Ол 1кг еріткіште
(осмолярлы) немесе 1 ерітіндіде (осмолярлы) ерітілген заттардың осмотикалық
белсенді бөлігінің (иондар мен ионсызданғдырылған молекулалар) мольдерінің
санымен анықталады. араластырылған су ерітіндісінде бұл шамалар жақын.
ерітіндінің осмолярлығы (осмолькг)=Smі *хі , мұндағы mі – ерітілген
заттардың 1-ші концентрациясы (молькг), хі – молекуласы диссоцирленген
бөліктер саны. Мысалы, Эрл ерітіндісі үшін осмолярлықтың есептік шамасы.
310,6 мосмолькг шындығында 283 клетка көбеюінен шығатын pН диапазоны мен
осмолярлығы жіңішке және клетка типіне байланысты варьирленеді. Мысалы:
W138 диплоидты фибробластарының клональды өсуі үшін pH=7,30+0,15 оптимальды
және осмолярлығы 285+40 мосмолькг, ал балапан эмбрионынан шығатын
фибробластар үшін 7,12+0,18 және 300+20 сәйкес болады. Көптеген ортада егер
көмір қышқыл газы бөлінсе HCO3=СО2+ОН. Көптеген ортада бикарбонатты буфер
қолданылады да, ОН концентрациясы көбееді. Ерітінділер бикарбонат буферінің
аздаған санын ұстауы мүмкін (Хенкс ерітіндісі), олар рН қолдау үшін тығыз
жабылған сосудтарға арналған. Басқаларынды (Эрла ерітіндісінде) биарбонат
көптеу, олар көтеріңкі парциальды СО2 қысыммен жүйеде қолданылады. Егер,
культура, рН қолдау қиын болған жағдайда СО2 инкубатоынан тыс жүргізілсе,
альтернативтік буферлік жүйе қажет. HEPES4- (2-оксиэтил)-пиперазин
этансульфондық қышқыл жақсы буфер болып табылады. HEPES суда жеңіл ериді,
еківалентті катионды байланыстырмайды, 0,05 моль концентрациясына дейін
цитотоксикалық емес 0,01 0,03М концентрациясында қолданылады.
Жануарлар клеткасы культурасын жүргізу үшін стандарттық орта. Игл
орталары МЕМ (minimal essetial medium) және ВМЕ (basal medium, Eagle). МЕМ
жиі қолданылады. Олар көмірсулар субстратының міндетін атқаратын минералды
заттар, Аминқышқылдары (13 ауыстырылмайтын), 6 суда ерітілген ерітінділер,
витаминдер, холин мен инозитті құрайды. МЕМ тек сарысумен ғана қолданылады,
өйткені онда тек қана биотин, В12 витамині, темір ионы және
микроэлементтер. Эрл ерітіндісінің негізі.
Дульбекко ДМЕ және ДМЕМ ортасы (Игл ерітіндісінің қосарланған
модификациясы). Клетка культивирленгенде әртүрлі типтер қолданылады, оның
ішінде трансформирленген клеткалар мен гибридтер бар). Марысусыз ортада
негіз болып табылады. Амин қышқылының қосарланған концентрациясын, глицин,
серин, пируват, темір құрайды. Бұл ортаны қолданғанда 10%-тік СО2
концентрациясымен инкубатор қажет.
Исков IMDM – Дульбекко ортасы модификациясы. алмастырылмайтын
амиқышқылдары, биотин, В12 витамині, натрий селениті қосылады. Ортаға HEPES
енгізілген және NaCl мен NaHCO3 концентрациясы азайтылған. Орта сарысусыз
лимфоциттер мен қанжасаушы клеткаларды культивирлеу үшін қолданылады.
МакКоя 2А және RPMI сериясы ортасы. МакКоя 5А 1958 жылы сарысу
қатысымен Уолкер 256 карцинсаркома клеткаларының клональды өсуін қолдау
үшін құрылған, одан кейін басқа алғашқы культуралар мен әртүрлі клеткалық
линиялар құрылды. Әдетте Ивката мен Грейс (RPMI) модификациясы өндіріледі,
сарысу қатысымен лейкоциттерді культивирлеу үшін арналған, гибрид
культивирлеуінде де жиі қолданылады. атмосферадағы культивирлеуде ауадағы
СО2 концентрациясы 5%.
199-ші орта 1950 жылы балапанның эмбрионынан жүрек фрагментін
культивирлеу үшін құрылды. Орта үшін азықтық ортаның кең кең спектрі мен
жоғарғы концентрациясы сипатталған. Қосымшасыз, алғашқы клеткаларды
қолдайтын, сарысумен тез көбейетін клеткалармен өсетін орта болып саналып,
қолданады (егер тасымалданбаса). клетканың оптимальды өсуі үшін ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.