Гибридомалардан және иммундық жасұшалардан гибридтық жасұшаларды алу

Пән: Биология
Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

Жоспар

Кіріспе

Моноклоналды антиденелер

Гибридомды технологиямен танысу. Әдістің ұстанымы.
Моноклондарды алу. Тышқандардан жасанды ісік - гибридомалар - алу.
Гибридомалардан және иммундық жасұшалардан гибридтық жасұшаларды алу.
Моноклоналды антиденелерді алғанда ұйымдастырылатын жұмыстар және қолданылатын құрал-жабдықтар.
Сынауға жануарларды таңдау.
Моноклоналды антиденелерді алу биотехнологиясымен танысу:
ГАТ ортасымен қолданып гибридтық жасұшалар алу, реклондау - клондарды дамыту, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттен өткізу және оларды тазалау.

Пайдаланылған әдебиеттер

Биологиялық құрылымдарды зерттегенде, осы құрылыммен өзгеше қарым-қатынасқа кіретін реагенттерді іздеу - зерттеулердің негізі. Осындай қасиет әмбебабты реагентте - иммуноглобулиннің молекуласында бар. Иммуноглобулиндер антидене болып тек қана антигендермен қарым-қатынасқа кіреді. Бірақ көп құрылымдарға жағдай тұдырса, олар антигенге айналып комплементарлы антиденелер жаратылуға жағдай тұдырады (мысалы, күшті иммуногендермен коньюгатталғанда) . Сондықтан биологияның және медицинаның әр түрлі бөлімдерінде негізінде антиденелермен қолдану жатқан иммунологиялық әдістер кең таралған.

Әдістің тарихы. Зерттеушілердің мақсаты - өзгешелігі жоғары антиденелерді алу әдістерін табу. Бір белгілі жағдайда бактериалды полисахаридтермен иммунизация өткізсе - өзгешелігі жоғары антиденелердің жоғарыгомогенді аппаратын алуға болады. Осыдан басқа, плазмацитоманың (антидене жарату жасушадан жаратылған ісік) иммунды жануардың көк бауырының жасұшаларымен қосылуы мүмкін. Осылай гибридтік жасұшалар (гибридомалар) алынады. Гибридомалар ісік жасұшалардан шексіз көбею мүмкіншілігін, ал көк бауырдың жасұшаларынан - белгілі өзгешелігі бар антиденелер синтездеу мүмкіншілігін алған.

Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу әдісіне келесі методологиялық жұмыстар жол берген:

Миеломалар алу, оларды ағзадан бөлек өсіру;
Жасұшалардың соматикалық гибридизация әдісі.

Вирустерге қарсы тұратын иммуноглобулиндер поликлоналды гетерогенді антиденелер болады. Неге десек - олар әр түрлі клондардың В-лимфоциттерінің қоспасы.

Антигеннің молекуласының белсенді топтарының (бір неше аминқышқылдар) кешеңіне қарсы иммунды жасұшаларда (гибридомаларда) бір белгілі иммуноглобулин (моноспецификалы антидене) синтезделеді. Иммундық жасұшалардың ісік жасұшалармен гибридизациясы жасанды ісік - гибридома жаратады. Оны алу техникасы гибридомды технологияға жатады. Гибридомаларды жасұшалардың бір клонымен (моноклоналды антиденелер (МКА) ) секреттелетін гомогенді антиденелер шығарады.

Әдістің ұстанымы. Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасұшалардың қосылуынан кейін гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау.

Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті еңгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік тұды. Антигенді 3-5 рет 0, 5-5 мг мөлшерде еңгізеді. Бірінші инъекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0, 5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2-4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді.

Суспензияны 170 об/мин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп астында алынған суспензияның жасұшаларының өмірге кабілеттігін анықтайды. Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0, 1 пайыздық ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында бір тәүлік бұрын 24-ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік жасұшаларды салады. Қоректік жасұшалар ретінде тышқандардың немесе теңіз шошқалардың макрофагтарын алады.

Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75 пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 10 ⁸ көк бауырдың жасұшаларын және 10 ⁷ миеломды жасұшаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 об/мин центифугадан өткізеді; тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0, 5 мл 50 пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады; 10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин, амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді.

Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде ортаны ауыстырып отырады.

2 - 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасұшалары бар 96-ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында анықтайды. Дақылды суйықтықты жұма сайын радиоиммундық, иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан иммуноглобулиндерінің барын анықтайды.

Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі:

Антиген еңгізу.
Көк бауырдың жасұшаларын алу (108) .
Миеломды жасұшаларды алу (107) .
ПЭГ 4000 ортасында жасұшаларды қосу.
ГАТ ортасында гибридомаларды іріктеу.
Клондарды бөліп алу.
Дақылды суйықтықты антиденелер болуына тексеру.
Пассаждарда реклондау.
Дақылды суйықтықтан моноклоналды антиденелерді бөліп алу.
Клонды -70 градуста сақтау.
Асциттік ісік алу.

№ 1 сүрет. Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі

Тышқандардың ішіне бір неше рет көп уақыт минерал майларымен әсер етіп, олардың ағзаларында миелома тұдырып, жұмысқа жарамды миеломды жасұшаларды алады. Осы жасұшаларды әдейленген зертханаларда да алады.

Клондау жұмыстарын жалғастыру үшін ГАТ ортасына қоректік жасұшалар ретінде 500 мл ортаға 10 ⁸ көкбауыр жасұшаларын және 10 ⁶ перитонеалды жасұшаларды салады. Суспензияны 1 мл-ден 96-ұялы панельге құйып көмірқышқыл инкубаторда 37 градуста ұстайды. Әр бір үш тәүліктен кейін ортаны ауыстырып отырып, жасұшалардын өмірге жарамдығын тексереді. Дақылды суйықтықта секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп алынған гибридоманың клонын келесі микродақылдарда реклондайды. Дақылды суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелер болса, оларды эксперименттерде, дайындау үшін биотехнологиялық үдірістерде қолданады.

Жұмыстарды ұйымдастыру және қолданылатын құрал-жабдықтар.

Гибридомаларды алу жұмыстарын бөлек бөлмеде өткізеді. Келесі құрал-жабдықтар болу керек:

Ламинарлы бокс.
Бір белгілі мөлшерде ылғалды, температураны, көмірқышқыл газды ұстап тұратын инкубатор.
Центрифуга.
Микроскоптар.
+4 және -200 градус ұстайтын холодильник.
+37 және +560 градуста жұмыс істейтін су моншасы.

Осыдан басқа бөлек бөлмеде жасұшалар сақтау үшін -700 градусты тоңазытқыш және суйық азоты бар Дьюар ыдысы болу керек. Гибридомаларды алу үшін жасұшалардың дақылдарына арналған әдейленген пластикалы ыдыстарды дайындап қою керек. Олар: түбі тегіз 96-ұялы планшеталар, 24-ұялы планшеталар, көлемі 25, 75 см ² пластикалы ыдыстар, культивирлеуге арналған орталар, керекті реактивтер.

Экспериментке жануарды таңдау.

Иммунизацияға тышкандармен және егеу құйрықтылармен қолданады. Осы жануарлардың ағзаларында миеломды жасұшалар жақсы өседі. Басқа жануарлармен қолданбайды.

Рекомбинанттық ДНҚ технологиясының дамуы мен және МКА алу әдістерінің шығарылуы, сондай - ақ иммуноглобулиндердің құрылымы мен қызметтерінің бекітілгеннен кейін түрлі ауруларды емдеуге телімді антиденелерді қолдануға қызығушылық байқалады.

Осыдан 100 жыл бұрын дифтерия ауруымен ауырған балаларды адам дифтериясын тудыратын коринабактериялармен иммунделген жылқылардан алынған тазаланбаған қан сарысулардың көмегімен емдеу жүргізілді.

Бұл токсин қан ағымына еніп, бірінші инфекцияланған орындағы алшақталған мүшелерді жеңіп, емделмеген жағдайда летальды деңгейге жеткізуі мүмкін (45%) . Бірақ ауру адамға алғашқы күндері осы экзотоксинге телімді антиденелері бар жылқының анти қан сарысуын енгізсе, онда летальды шығуға жол бермейтін енжерлы иммунитет қалыптасады.

Бірақта бұл әдістің терапияда кең қолданылмауының себебі, қолданылатын антиденелермен байланысты:

2. Ауру ағзада жиі бөтен ақуыздарға өздерінің антиденелері өндіріледі;

3. Толық немесе бөлшектеп тазаланған анти қан сарысуларды қайталап енгізсек, ол пациенттің өліміне немесе анафилактиялық шокқа әкелуі мүмкін.

Ағзада таза моноспецификалық антиденелердің күнделікті деңгейін сақтап тұру үшін антиденелерді терапиялық құрал ретінде пайдалану гибридомалық технологияның дамуымен байланысты.

Қиылыспалы реакциялардың тәуелдігіне байланысты иммунды жауап пен анафилаксияны дамуына әкеледі, бірақ бұл мәселелер әлі шешімін тапқан жоқ. Сондықтан қазіргі кездегі міндет, ол адамдардың моноклоналды антиденелерін алу әдісін шығару барысында, олар төмендетілген иммуногендік және телімді иммунотерапиялық қасиеттеріне ие болуы тиіс.

Алғаш рет осы мақсатта ОКТЗ тышқанның моноклоналды антиденелері қолданылды, оларды адамда органнын көшіру барысында иммуносупрессор ретінде қолданды.

Пациенттерге телімді антиденелерді енгізу ұсынылды, олар белгілі бір типтегі антиденелермен байланысып, иммунды жауапты азайта отырып, отырғызылғын органға қарсы бағытталады. Тимуста дифференцирланатын, Т-жасушалы лимфоциттер органдардың қарсы тұруына жауап береді. СД3 деп атайтын Т-жасушалардың беткейінде орналасқан рецепторлармен ОКТЗ байланысады. Бұл толық иммунды жауаптың дамуы мен трансплантацияланған органының қарсы тұруын алдын - ала жобалайды.

Дәрілік заттарды немесе ферменттерді белгілі жасушалардың беткейлік ақуыздың арақатынасына телімді МКА мен немесе олардың Fv - фрагментерімен байланыстыруға болады, мысалы, ісік жасушасымен. Бұл кезде дәрілік заттар инертті формада болуы мүмкін. Егер осындай кешенді бірнеше рет енгізу жоспарланса, онда иммуноглобулиндердің компоненті антиденелерден немесе адамның антидене фрагментерінен тұруы керек; бұл ауру адамның қиылыспалы иммунды реакциясы мен сенсибилизациясының дамуын тоқтатады. Егер осы мақсатта кемірушілердің МКА қолданғанда, олардың құрылымы адамның антиденелерінің құрылымына жақын келуі керек. Ол үшін кемірушілердің антидене фрагментерін адамның антиденелерінің СDR-аймақтарына ұқсайтын аймағымен ауыстыру жеткілікті.

МКА адамдар мен жануарлардың организмінде дәрілік заттардың әсері мақсатты бағытта пайдалануда қолданылады. Оларды күткен эффект шығармағанда және дозаны көп болуынан кері әсердің пайда болуы кезінде ерекше қолданады.

Реклондау - клондарды дамыту.

Тірі қалған гибридомды жасұшаларды олар иммуноглобулиндер шығара бастағанша реклондайды. Іріктеп алған гибридтік жасұшаларды 1, 10, 100, 1000 жасұшалардан ұяларға салады. Моноклоналды антиденелер 12 күннен кейін жаратыла бастайды. Керекті клонды 20 мл ГАТ ортасына салады, сол пассажда сақтайды. 5 - 15 пассаж өткеннен кейін моноклоналды антиденелердің мөлшері ең көп болады. Клонның өмірге жарамдығы қоректік ортаның қоректік жасұшаларына байланысты.

Моноклоналды антиденелерді шығаратын клондарды 5 - 10, қай бір кезде 30 пассажға дейін апарып дамытуға болады. Кейіннен олар өмірге жарамды болады, бірақ ерекше иммуноглобулиндерді синтездемейді.

Антидене шығаратын клондардың көлемі антигендік препараттардың қасиетімен байланысты болып 2 - 20 пайыз құрайды. Клондар М- және G-класс иммуноглобулиндерді синтездейді.

Іріктеліп алған клонды сақтау керек. Іріктелген клондардың бір бөлегін -70 градус құрамында МДСИ, 20 пайыз қанның сары суы, 10 пайыз диметилсульфоксид бар ортада қатырады. Екінші бөлегін осы ортада суйық азотта сақтайды, клондың тағы бір бөлегін тышқандарда асцидтік ісік тұдыруға жібереді.

Іріктелген клонды асықпай, абайлап, кезеңмен қатырады. Жасұшаларды еріткенде жылдам 40 градуста су моншасында ерітеді.

Асцидтік ісікті алу.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.