Гибридомалардан және иммундық жасұшалардан гибридтық жасұшаларды алу

Пән: Биология
Жұмыс түрі: Материал
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

Жоспар

Кіріспе
Моноклоналды антиденелер
1. Гибридомды технологиямен танысу. Әдістің ұстанымы.
2. Моноклондарды алу. Тышқандардан жасанды ісік – гибридомалар – алу.
3. Гибридомалардан және иммундық жасұшалардан гибридтық жасұшаларды алу.
4. Моноклоналды антиденелерді алғанда ұйымдастырылатын жұмыстар және
қолданылатын құрал-жабдықтар.
5. Сынауға жануарларды таңдау.
6. Моноклоналды антиденелерді алу биотехнологиясымен танысу:
7. ГАТ ортасымен қолданып гибридтық жасұшалар алу, реклондау - клондарды
дамыту, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттен өткізу және оларды
тазалау.

Пайдаланылған әдебиеттер

Биологиялық құрылымдарды зерттегенде, осы құрылыммен өзгеше қарым-
қатынасқа кіретін реагенттерді іздеу – зерттеулердің негізі. Осындай қасиет
әмбебабты реагентте – иммуноглобулиннің молекуласында бар.
Иммуноглобулиндер антидене болып тек қана антигендермен қарым-қатынасқа
кіреді. Бірақ көп құрылымдарға жағдай тұдырса, олар антигенге айналып
комплементарлы антиденелер жаратылуға жағдай тұдырады (мысалы, күшті
иммуногендермен коньюгатталғанда). Сондықтан биологияның және медицинаның
әр түрлі бөлімдерінде негізінде антиденелермен қолдану жатқан
иммунологиялық әдістер кең таралған.

Әдістің тарихы. Зерттеушілердің мақсаты – өзгешелігі жоғары
антиденелерді алу әдістерін табу. Бір белгілі жағдайда бактериалды
полисахаридтермен иммунизация өткізсе – өзгешелігі жоғары антиденелердің
жоғарыгомогенді аппаратын алуға болады. Осыдан басқа, плазмацитоманың
(антидене жарату жасушадан жаратылған ісік) иммунды жануардың көк бауырының
жасұшаларымен қосылуы мүмкін. Осылай гибридтік жасұшалар (гибридомалар)
алынады. Гибридомалар ісік жасұшалардан шексіз көбею мүмкіншілігін, ал көк
бауырдың жасұшаларынан – белгілі өзгешелігі бар антиденелер синтездеу
мүмкіншілігін алған.
Моноклоналды антиденелерді синтездейтін гибридомаларды алу әдісіне
келесі методологиялық жұмыстар жол берген:
1) Миеломалар алу, оларды ағзадан бөлек өсіру;
2) Жасұшалардың соматикалық гибридизация әдісі.
Вирустерге қарсы тұратын иммуноглобулиндер поликлоналды гетерогенді
антиденелер болады. Неге десек – олар әр түрлі клондардың В-лимфоциттерінің
қоспасы.
Антигеннің молекуласының белсенді топтарының (бір неше аминқышқылдар)
кешеңіне қарсы иммунды жасұшаларда (гибридомаларда) бір белгілі
иммуноглобулин (моноспецификалы антидене) синтезделеді. Иммундық
жасұшалардың ісік жасұшалармен гибридизациясы жасанды ісік – гибридома
жаратады. Оны алу техникасы гибридомды технологияға жатады. Гибридомаларды
жасұшалардың бір клонымен (моноклоналды антиденелер (МКА)) секреттелетін
гомогенді антиденелер шығарады.
Әдістің ұстанымы. Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың
сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасұшалардың қосылуынан кейін
гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі
бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды
жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында
асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден
тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау,
асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау.
Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың
қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті еңгізіп жануарлардың
ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың
генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана
екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік тұды. Антигенді 3-5 рет 0,5-5
мг мөлшерде еңгізеді. Бірінші инъекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0,5
мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2-4 күн өткеннен кейін
тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды:
көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық
пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды.
Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен
жеткізеді.
Суспензияны 170 обмин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп
астында алынған суспензияның жасұшаларының өмірге кабілеттігін анықтайды.
Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0,1 пайыздық
ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын
гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында
бір тәүлік бұрын 24-ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік
жасұшаларды салады. Қоректік жасұшалар ретінде тышқандардың немесе теңіз
шошқалардың макрофагтарын алады.
Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75
пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 108 көк бауырдың жасұшаларын және 107
миеломды жасұшаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла
ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 обмин центифугадан өткізеді;
тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0,5 мл 50
пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып
суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады;
10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин,
амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді.
Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды
көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде
ортаны ауыстырып отырады.
2 – 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасұшалары бар
96-ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында
анықтайды. Дақылды суйықтықты жұма сайын радиоиммундық,
иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан
иммуноглобулиндерінің барын анықтайды.

Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі:
1. Антиген еңгізу.
2. Көк бауырдың жасұшаларын алу (108).
3. Миеломды жасұшаларды алу (107).
4. ПЭГ 4000 ортасында жасұшаларды қосу.
5. ГАТ ортасында гибридомаларды іріктеу.
6. Клондарды бөліп алу.
7. Дақылды суйықтықты антиденелер болуына тексеру.
8. Пассаждарда реклондау.
9. Дақылды суйықтықтан моноклоналды антиденелерді бөліп алу.
10. Клонды -70 градуста сақтау.
11. Асциттік ісік алу.

№ 1 сүрет. Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу
кестесі
Тышқандардың ішіне бір неше рет көп уақыт минерал майларымен әсер етіп,
олардың ағзаларында миелома тұдырып, жұмысқа жарамды миеломды жасұшаларды
алады. Осы жасұшаларды әдейленген зертханаларда да алады.
Клондау жұмыстарын жалғастыру үшін ГАТ ортасына қоректік жасұшалар
ретінде 500 мл ортаға 108 көкбауыр жасұшаларын және 106 перитонеалды
жасұшаларды салады. Суспензияны 1 мл-ден 96-ұялы панельге құйып көмірқышқыл
инкубаторда 37 градуста ұстайды. Әр бір үш тәүліктен кейін ортаны ауыстырып
отырып, жасұшалардын өмірге жарамдығын тексереді. Дақылды суйықтықта
секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп
алынған гибридоманың клонын келесі микродақылдарда реклондайды. Дақылды
суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелер болса, оларды
эксперименттерде, иммунодиагностикумдарды дайындау үшін биотехнологиялық
үдірістерде қолданады.

Жұмыстарды ұйымдастыру және қолданылатын құрал-жабдықтар.
Гибридомаларды алу жұмыстарын бөлек бөлмеде өткізеді. Келесі құрал-
жабдықтар болу керек:
1. Ламинарлы бокс.
2. Бір белгілі мөлшерде ылғалды, температураны, көмірқышқыл газды ұстап
тұратын инкубатор.
3. Центрифуга.
4. Микроскоптар.
5. +4 және -200 градус ұстайтын холодильник.
6. +37 және +560 градуста жұмыс істейтін су моншасы.
Осыдан басқа бөлек бөлмеде жасұшалар сақтау үшін -700 градусты
тоңазытқыш және суйық азоты бар Дьюар ыдысы болу керек. Гибридомаларды алу
үшін жасұшалардың дақылдарына арналған әдейленген пластикалы ыдыстарды
дайындап қою керек. Олар: түбі тегіз 96-ұялы планшеталар, 24-ұялы
планшеталар, көлемі 25, 75 см2 пластикалы ыдыстар, культивирлеуге арналған
орталар, керекті реактивтер.

Экспериментке жануарды таңдау.
Иммунизацияға тышкандармен және ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.