Полтитізбектік реакция тізбектері
Тақырыбы:
Биологиялық зерттеулерде политізбектік реакция әдісін қолдану
МАЗМҰНЫ
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 3
І Ғылыми әдебиеттерге шолу
1.1 Политізбектік реакция әдісінің ашылуы ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ...
1.2 ДНҚ-ң құрылысы мен құрамы ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
1.3 ПТР-диагностикасының тәжірибелік қолданылудың перспективалары ... ..
ІІ Зерттеу бөлімі
2.1 Политізбектік реакция әдісінің механизімдері ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ..
2.2 Биологиялық материалдың үлгісін дайындау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
2.3Полтитізбектік реакция тізбектері ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
2.4 ПТР-ді тәжірибелік денсаулық сақтауда қолдану ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
ІV Зерттеу нәтижелері
4.1 Медициналық тәжірибеде ПТР әдісің қолданылуының проблемалары ... .
4.2 Өсімдіктер ДНҚ-ғы бөтен ДНҚ-ң процентік көрсеткішін тест-жүйе арқылы анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Анықтамалар, белгілеулер мен қысқартулар
ДНҚ - дезоксирибонуклеин қышқылы
РНҚ - рибонуклеин қышқылы
ПТР - политізбекті реакция
дНТФ - дезоксинуклеозидифосфат
дНМФ - дезоксинуклеозидмонофосфат
дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат
дГТФ - дезоксигуанозинтрифосфат
дЦТФ - дезоксицитидиктрифосфат
дТТФ - дезокситимидинтрифосфат
Thermus aquaticus - грамтеріс таяқша тәрізді экстремальды термотұрақты бактерия.
ИФА - иммуноферменттік анализ
ГМО - генетикалық модификацияланған организім
Кіріспе
Соңғы он жылдықта молекулалық биологияның, медициналық генетиканың, биохимияның, биофизиканың, микробиологияның, иммунологияның, онкологияның, эпидемиологяның және т.б. ғылымдардың қарқынды дамуы адам, жануар, өсімдік, бактерия және вирус геномын зерттеуде диагностикалық практиканың молекулярлы-биологиялық әдістің белсенді нығайуына әкелді. Бұл әдіс ДНҚ-зерттеу деп аталады. [1]
ДНҚ-зерттеу әдісі әр түрлі ауруларды ерте және толық анықтауға мүмкіндік береді. Терапияда нәтижелі бақылау жасауға және қазіргі диференциалды диагностика жасауға мүмкіндік береді. Тұқым қуалайтын ауруларды анықтауда таптырмайтын әдіс әсіресе қан іздерінен, шәуеттен және саусақ мөрінен қылмысты адамдарды анықтауға мүмкіндік береді.
Қазіргі танда ДНҚ-диагностиканың екі бағыты бар олар: гибридизационды нуклеин қышқылдарының анализі және политізбектік реакция әдісін қолдану арқлы диагностика. Молекулалық биология әдісінің дамуы ХХ ғасырдың 50-і жылдары басталды. Ресімей бастама 1953 жылы ДНҚ-ң құрылысының ашылуымен байланысты болды. ДНҚ-гибридизация әдісі инфекциялы қоздырғыштарды анықтауда қиындау, ұзақ және қымбатқа түсті. Оның орнына политізбектік реакция әдісі келді (ПЦР).
Политізбекті реакция - ДНҚ-ң репликациясының жүруін айқын көрсететін ең негізгі әдістердің бірі болып табылады. ПЦР әдісінің ашылуымен спецификалық молекула ДНҚ-ң миллиондаған молекула арасындағы маңыздылығы анықталды. [2]
Политізбекті реакция әдісінің ашылуы молекулалық биология саласындағы соңғы онжылдықтағы негізгі жаңалық болып табылады. Ашылған жаңалық медицина саласындағы диагностиканы жаңа, жоғары сатыға көтерді. Политізбекті реакция әдісінің маңыздылығы - ДНҚ-ң участогын лабораториялық жағдайда температуралық цикл барысында пробиркада амплификациялау (бірнеше қайтара көшірмесін түсіру). ДНҚ-ң әрбір көшірмесін жасау барысында алдыңғы процесте синтезделген ақпарат қайта синтезделіп, ДНҚ полимеразамен қайта көшіріледі. Осы процесс барысында ДНҚ-дағы ақпарат түрленіп, күрделене түседі де синтез процесінің жүруі жеңілдей түседі.
Политізбекті реакция анализинің ашылуы соңғы жылдары медицина мен ғылым саласында көптеген жетістіктерге жетті. Алғашқы кезде ПТР әдісі институт қабырғасындағы лабораторияда қолданылып, қазіргі таңда көптеген мемлекеттерде практика жүзінде клиникалық ауруларды емдеуде кеңінен қолданылуда. Инфекциялық ауруларды диагностикалау (соның ішінде агенттен туа біткен); микроорганизмдерді генотиптеу, олардың вируленттігін анықтау; микрофлораның антибиотиктерге қарсы тұру қабілеттілігі; генодиагностика және генетикалық дактилоскопия; қанның препараттарына биологиялық бақылау жасауда - ПЦР анализі қолданылып келеді.
Қазіргі таңда Политізбекті реакцияны қажет етпейтін модификация саласы да бар. Соған қарамастан Политізбекті реакция анализі қарқындап дамып, нарықта өзінің соңғы үлгідегі тест, жасанды технологияларын ұсынып келеді. ТМД елдерінде жаңа әдіспен лабораториялық бақылаулар мен зерттеулер жүргізетін лабораториялар саны да артып келеді.
Дипломдық жұмыстың көкейкестілігі:
Дипломдық жұмыстың мақсаты: Биологиялық зерттеулерде политізбектік реакция әдісін қолдануды меңгеру.
Дипломдық жұмыстың міндеттері:
І Ғылыми әдебиеттерге шолу
0.1 Политізбектік реакция әдісінің ашылуы
Алғаш рет американдық биохимик Кэри Мюлис политізбекті реакция әдісін ашқан болатын. Оның негізгі мақсаты ДНҚ бөліктермен басқа ғалымдар жұмыс жасауы үшін қысқа ДНҚ үзіктерін бөліп алу керек болды. Молекулалық биология бағытында алға үлкен қадам жасады және 1993 жылы химия саласынан Нобел силығын алды.
ПТР-дің ашылуы туралы алғаш рет Cetus корпарациясының Кэри Мюлис 1985 жылы Science жураналына алғаш рет жариаланған.
1989 жылы термотұрақты ДНҚ-полимераза Taq ашылып, Science журналында жариаланып молекула жылы деп аталды. Hoffmann-La Roche Inc. және Cetus шешiмі бойынша ПТР-ді диагностикалық мақсаттарға қолдана бастады. 1990 жылы ғалым Cetus, D. Gelfand және S. Stoffel тазаланған Taq DNA-полимеразы анықтаған және де сот сараптамасында брініші ретосы әдісті қолданған. Cetus, H. Erlich и Kary Mullis биохимия саласында Неміс қоғамында наградаға лайықталған.
Политізбектік реакция - ДНҚ-ның табиғи репликациясын беретін және басқа да миллиондаған молекулалардың ішінен ДНҚ-ның жалғыз ерекше молекуласын анықтауға мүмкіндік беретін өте тамаша әдіс.
Политізбектік реакция әдісінің ашылуы соңғы он жылда молекулалы биология обылысында аты танымал жаңалықтардың бірі болды. Бұл әдіс медициналық диагностиканы сапалы жаңа деңгейге көтеруге мүмкіндік береді.
ДНҚ көшірмесін алу үшін реакциялық қосындыға кіретін ингредиенттердің праймерлері (ДНҚ-ның қысқа жасанды жолмен синтезделген молекулалары) және құрамының қолданылуының негізгі принціптері алғаш рет 1971 жылы Kleppe және авторлар бірлестігімен сипатталған. Бірақ ол уақытта ПТР-дің ДНҚ-ға кіретін үзінділер көшірмесінің санының (экспотенциялды) көрсеткіштік ұлғаюы реакциялық нәтиже ретіндегі негізгі қасиеті әлі көрсетілмеген-ді.
1983 жылы Cetus фирмасының жұмысшысы Kary Mullis политізбектік реакция ретінде кейіннен танымал болған әдісті ұсынады. Әдістің негізгі мәні қайталанбалы температуралық циклдер процесінде ДНК-нің белгілі бір учаскілерін пробиркада көпреттік көшіруде (амплификациясында) болып табылады. Амплификацияның әрбір циклінде бұрын синтезделген үзінділер ДНҚ-полимеразамен қайта көшіріледі. Осының арқасында ары қарай талдауды біраз жеңілдететін ДНҚ-нің ерекше фрагменттерінің санының көп есе ұлғаюы жүзеге асады.
Бұл жаңалықтың ашылуымен бірге кейбір технологиялыардың дамығандығын атап кету керек. Дәлірек айтсақ, ДНҚ-нің біртізбек үзінділерін автоматты түрде синтездеуге мүмкіндік беретін құралдардың пайда болуы. Дәл сол кезде гейзерлерде өмір сүретін ерекше микроағзалар анықталған. Олардың ферментативтік жүйесі және ДНҚ-полимеразасы ыстық қайнар көздерінің жоғарғы температураларын сақтайды және биологиялық белсенділігі 95° С-қа дейін сақталады, бұл температура көрсеткіш политізбектік реакцияны жүргізу үшін қажетті жағдай туғызады.
ПТР-дің ашылу нәтижесі әдістің тез арада тәжірибелік қолданылуына алып келді. 1985 жылы Saiki авторлар бірлестігімен бірге Р-глобинның геномды тізбектелуінің амплификациясы сипатталған мақаланы жариялады. Осы кезден бастап авторлар өздерінің жұмыстарында ПТР-дің қолданылуы туралы жазған мақалалар саны геометриялық прогресске біршама өсе бастады. Әдістің соншалықты танымалдылыққа ие болғандығы сондай, тіпті қазіргі уақытта молекулалы биология саласында оны қолданусыз жұмысты көз алдына елестету қиын болып отыр. Әсіресе политізбекті реакция әдісінің өршіген дамуына Адам геномы ұлтаралық бағдарлама арқасында жетті. Сондай-ақ, қазіргі заман сквинерлеудің лазерлік технологиясы (ДНҚ-ның нуклеотидті тізбектелуінің оқылуы) жасалды. Бұрын 250 жұп нуклеотид (ж.н) өлшемі бар ДНҚ-ның тізбектелуінің оқуылуы үшін бір апта уақыт қажет болса, қазіргі заман лазерлік сквенаторлар күніне 5000 жұп нуклеотидке дейінанықтауға мүмкіндік береді. Бұл өз кезегінде әртүрлі биологиялық қбъектілердің ДНҚ тізбектері құрайтын мәлеметтердің ақпараттық базасының өсуіне мүмкіндік береді. Бүгінгі таңда ПТР-дің әртүрлі модификациясы ұсынылуда, микроағзаларды анықтау үшін тест-жүйелерінің құрылуына, нүктелі мутацияны анықтауға мүмкіндік тудырып отыр, әдістің ондаған әртүрлі қолданылуы суреттелуде. [3-8]
1.2 ДНҚ-ң құрылысы мен құрамы
Нуклеин қышқылдары жасушаның ең маңызды бөлігі болып саналады. Нуклеин қышқылының молекуласын ХІХ ғасырдың аяғында 1868 жылы Щвейцария ғалымы Ф. Мишер ашқан болатын. Ал ДНҚ мен РНҚ-ң қызметтері, молекуласының құрылысы, кейінірек қана белгілі болды.
Қазіргі кездері нуклеин қышқылдарының тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі екеніне ешкім күмән келтірмейді, бірақ бұл тек 1950 жылы Х.Френкель-Конрат тәжірибелері нәтижесінде ғана үзілді-кесілді дәлелденген болатын. Ал, ХХ ғасырдың 20 жылдарында (1928 ж.) тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі ретінде ақуыз молекуласы саналып келген еді.
Тек ХХ ғасырдың 20 жылдары Т. Морган т.б. ғалымдардың еңбектері арқасында тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі хромосомалар екені белгілі болды. Тұқымқуалаушылықтың хромосмдық теориясы ашылған болатын. Сонымен бірге хромосомалар ақуыз және нуклеин қышқылынан (ДНҚ) тұратындығы анықталды. Ал, осы екі макромалекулалардың - ақуыз және нуклеин қышқылының (ДНҚ) қайсысы тұқым қуалаушылыққа жауапты деген мәселе ғалымдар арасында біршама пікірталас туғызған болатын. Ал, 1928 ж. Н.К. Кольцов ген қызметін ақуыз молекуласы атқаруы мүмкін деген болжам жасады және 1940 жылға дейін ғалыдардың көпшілігі осы пікірге келісіп келген. [30]
1928 жылы Ф. Гриффитс бактериялардың трансформациялау қабілетіне тәжірибе жасап, тұқым қуалаушылыққа ақуыз емес ДНҚ молекуласы жауапты болуы мүмкін деген болжам жасаған болатын.
Трансформация - дегеніміз бактериялардың бір штамының екінші бір штамының ДНҚ молекуласының бір бөлігін өзіне қосып алып, оның қасиетіне ие болуын айтамыз.
Ф.Гриффитс тышқандарғы вирулентті (патогенді) және вирулентті емес (патогенді емес) пневмококк штамдарын енгізіп, пневмококк штамдарының вируленттік қасиеті ДНҚ молекуласының фрагменттері арқылы деп болжамдаған.
1944 жылы О.Эйвери, К.Мак Леод және М.Мак Карти осы тәжірибені жаңа әдістемелік деңгейде қайталап Ф.Гриффитс болжамын растады.
1952 жылы Н.Циндер және Д.Ледерберг трансдукция құбылысын ашып (трансдукция бактериофагтардың бактерияның бір штамының ДНҚ фрагментін екінші штаммына көшіре алу қасиеті) ДНҚ молекуласының тұқым қуалаушылықтағы рөлі туралы тағы бір дәлелдемеге қол жеткізген болатын.
1950 жылы Х. Френкель-Конрат темекі өсімдігіне темекі мозайкасы вирусының врулентті және вирулентті емес штамдарының ақуыз және РНҚ молекулаларын жеке-жеке және бірге енгізіп, тәжірибе жасап, тұқымқуалаушылық ақпарат ақуыз молекуласында емес, нуклеин қышқылдарында болатындығын үзілді - кесілді дәлелдеген болатын.
Х.Френкель - Конрат тәжірибесінің мәні мынада: егер вирулентті вирус штамының тек ақуыз молекуласын өсімдікке енгізгенде ауру дамымаған, ал вируленті вирус штамының РНҚ молекуласын темекі өсімдігіне енгізгенде ауру дамыған еді. Сол сияқты, вирулентті вирус штамының ақуыз молекуласын және вирулентті емес РНҚ молекуласын бірге енгізгенде ауру дамымайды, ал вирулентті емес вирус штамының ақуыз молекуласын және вирулентті вирус штамының РНҚ-сын бірге енгізгенде ауру дамыған.
Нуклеин қышқылдарының екі түрі белгілі: ДНҚ және РНҚ.
Нуклеин қышқылдары - полимерлер, олардың мономерлері болып нуклеотидтер саналады. Нуклеоидтар өз кезегенде 3 бөліктен құралған.
Нуклеотидтер молекуласында азоттық негіздердің пуриндік - Аденин (А) не Гуанин (Г); немесе пиримидиндік - Цитозин (Ц), Тимин (Т) не Урацил (У) деген түрлері, қант ретінде - дезоксирибоза не рибоза, 1 фосфор қышқылының қалдығы (монофосфат) кездеседі.
Дезоксирибонуклеин қышқылының (ДНҚ) құрылысына келетін болса ол, ДНҚ (дезоксирибонуклеин қышқылы) нуклеотидтері-дезоксирибозадан, азоттық негіздерден, 1 фосфаттан (монофосфат) құрылған, оларды - д АМФ, д ГМФ, д ЦМФ, д ТМФ деп атайды.
ДНҚ молекуласы қосширатпалы болып келеді (Ф. Крик, Дж Уотстон). Оның алғашқы, екінші реттік, үшінші реттік құрылыстары белгілі).
ДНҚ молекуласының алқашқы құрылысы - бір жіпші нуклеотидтердің (А, Г, Ц, Т) бірізділікпен тізбектеліп орналасуы болып табылады. ДНҚ алғашқы құрылысы фосфодиэфирлік байланыс арқылы тұрақтанады, яғни бір жіпшедегі нуклеотидтер бір-бірімен фосфаттық топ және қаныттың гидроксил тобы арқылы байланысқан. [13-15]
ДНҚ молекуласының екінші реттік құрылысы оының екі жіпшесіндегі азоттық негіздердің бір-бірімен сутектік байланыс арқылы комплементарлы байланысуы (А-Т; Г-Ц) болып табылады. ДНҚ жіпшелері полярлы болады, яғни оның 5' және 3' ұштаы белгілі. ДНҚ молекуласының қосширатпасы (тізбектері) бір-біріне антипараллель орналасқан;
Қос ширатпаның бір оралымында 10 жұп нуклеотидтер кездеседі, ал оралымның ұзындығы 3,4 нм тең.
Сонымен қатар, А-Т арасында 2 сутектік байланыс болса, Г-Ц арасында 3 сутектік байланыс болады. Сондықтан-да Г-Ц байланысы, А-Т байланысына қарағанда әлдеқайда мықтылау болады.
ДНҚ молекуласының 3 реттік құрылысы ретінде оның ақуыздармен (гистондық ақуыздармен) байланысын айтуға болады.
Хромосома ақуыздарының 60-80 пайызын-негіздік және гидрофобтық аминқышқылдар (аргинин, лизин, валин, т.б.) көптеп кездесетін гистондық ақуыздар құрайды. Гистондық ақуыздар ДНҚ - мен негіздік радикалдар арқылы әрекеттеседі. Хромосомаларда ДНҚ молекуласы гистондық ақуыздармен байланысып нуклеогистон құрайды, ол хроматин жіпшесі ретінде белгілі. Хроматин жіпшесінің тірегін нуклеосома денешіктері құрайды. Ол 4 түрлі гистондық ақуыздардың - гистон Н2А, гистон Н2в, гистон3, гистон 4- (Н2а, Н2в, Н3, Н4) қос молекуласынан құралған.
Осындай әр бір денешікті ДНҚ молекуласы екі рет ширатылып оларды және оының ұзындығы 140 н.ж. тең. Нуклеосома денешіктірі бір-бірімен тығыз жабысып орналаспай біршаа алшақтау орналасқан нукеосома денешіктірінің аралығындағы ДНҚ учаскілерін линкерлік (жалғаушы) учаске деп атайды, ал әрбір линкерлік учаскемен гистондық ақуыздың 5-ші түрі - Н1 байланысқан.
Хроматин жіпшесінде ДНҚ өте көп, 600 000-ға жуық, нуклеосома денешіктерін түзеді. Ұзындығы 190 см, жететін ДНҚ молекуласының өлшемі жағынан микроскопиялық, бірнеше микрометірге -180 мкм. тең, 46 хромосомаларда тығыздалып, ширатылып орналасуына нуклеосома денешіктері мүмкіндік береді.
Жасуша ядросының барлық хромосомаларында орналасқан ДНҚ ұзындығы 190 см, тең, ал нуклеосома жіпшесінің ұзындығы ДНҚ ұзындығынан 6,2 есе кем.
Нуклеосома жіпшелері әрі қарай ширатылып хроматин жіпшелеріне айналады. Хроматин жіпшелерінің ұзындығы нуклеосома жіпшелерінің ұзындығынан 18 есе кем, ал ДНҚ молекуласының ұзындығынан 6,2х18=100 есе кем.
Хроматин жіпшелері митоз кезінде әрі қарай ширатылып, қатпарланып, тығыздалып митоздық хромосомаларды туғызады. Митоздық хромосомаларда хроматин жіпшелері хромосоманын ұзына бойына көптеген рет қатпарлар пайда етеді (кейбір деректер бойынша 100 ретке дейін), осының нәтижесінде барлық хромосомалардың ұзындығы (180 мкм) ДНҚ молекуласының ұзындығынан 100 000 есе кем болады.
Сонымен қатар нуклесомалар құрылымдық (хроматин тірегі), реттеуші қызметтерді де атқарады.
ДНҚ молекуласының бойында тұқым қуалаушылық ақпарат жазылған, ол негізінен (95%) ядрода, ал 5% цитоплазмада, митохондрияларда, хлоропластарда шоғырланған.
Рибонуклеин қышқылының (РНҚ) құрылысына келетін болсақ ол, РНҚ-да ДНҚ сияқты полимер-сызықты полинуклеотид, ал мономерлері болып рибонуклеотидтер саналады. РНҚ нуклеотидтерінде рибоза, 4 азоттық негіздер - А, Г, Ц, У, бір фосфор қышқылының қалдығы кездеседі, оларды рАМФ, рГМФ, рЦМФ рУМФ деп бейнелейді.
Нуклеотидтер 5', 3' - фосфодиэфирлік байланыс арқылы байланысқан.
РНҚ-ның, полинуклеотид тізбегі полярлы болып келеді, яғни оның 5' және 3' ұштары болады.
Сол сияқты, РНҚ молекуласының ДНҚ молекуласынан айырашылықтары да белгілі.
1) Ең негізгі айырмашылығы РНҚ молекуласы қосширапалы емес, қосшиыртпалы емес бір ширатпалы. Оның 3 себеі бар.
А) біріншіден, РНҚ молекуласындағы пентоза (қант) дезоксирибоза емес, қосымша гидроксил тобы бар, рибоза болып табылады. Ал, қосымша қосымша гидроксил тобы қосширатпалы құрылымының түзілуін тежейді.
Б) екіншіден, РНҚ молекуласында негізгі не мажорлық азоттық негіздерден тиминнің орнына урацил кездеседі (А, Г, Ц, У). Урацил тиминнен 5 метил тобының болмауымен ерекшеленеді. Осыған байланысты А-У арасында гиброфобтық әрекеттесу күші А-Т-ға қарағанда әжептеуір әлсіз болады. Ал, бұл тұрақты қосширатпалық құрылымның түзілуі мүмкіндігін төмендетеді.
В) РНҚ молекуласында (әсіресе т РНҚ-да) өзгерген, модификацияланған минорлық негіздердің және нуклеозидтердің мөлшері өте көп. Олардың ішінде - дигнодроуридин (урацилде 1 сутектік байланыс болмайды, яғни 3 сутектік байланыстың орнына 2 болады); псевдоуридин (урацил рибозамен ерекше байланысқан); диметиладенин және диметилгуанин (азоттық негіздерде екі қосымша метил тобы болады). Бұл негіздер комплементерлы әрекеттесуге қабілетсізү Осының бәрі қосширатпалы құрылымның пайда болуына кедергі келтіреді.
Сонымен, көпшілікке мәлім РНҚ молекуласының бір ширатпалы болуының орасан зор биологиялық маңызы бар, себебі РНҚ өзінің негізгі қызметтерін тек бір ширатпалы күйінде ғана орындай алады, бұл әсіресе а-РНҚ молекуласын тән: мысалы, қалайша қосшиартпалы а-РНҚ рибосомаларда трансляцияланар еді?
Сонымен қатар, РНҚ негізінен бір ширатпалы (тізбекті) болуымен бірге, кейде қосширатпалы ілмекшелер де пайда етеді (т-РНҚ).
Құрысылы, қызметтері жағынан түрліше болып келетін 3 түрлі РНҚ белгілі: а-РНҚ, т-РНҚ, р-РНҚ.
ДНҚ репликациясы. ДНҚ молекуласының ең маңызды қасиеттерінің бірі-оның өздігінен екі еселенуі (репликациялануы) болып саналады. ДНҚ репликациялануы салдарынан тұқым қуалаушылық ақпарат ұрпақтан-ұрпаққа өзгеріссіз, тепе-тең мөлшерде беріліп, ұрпақтардың жалғасуы қамтамасыз етіледі. ДНҚ репликациясы жасуша циклының S - синтетикалық кезеңінде жүзеге асады.
ДНҚ молекуласының репликациялану қасиеті 1953 жылы Дж. Уотсон және Ф. Криктің ДНҚ молекуласының құрылысының қос ширатпалы болатындығын анықтағаннан кейін белгілі болды.
Теория күйінде ДНҚ репликациясының 3 түрлі әдісі болжамдалған: 1) консервативті (тұрақты); 2) жартылай консервативті; 3) дисперсті.
Көптеген тәжірибелер нәтижесінде ДНҚ молекуласының репликациялануы жартылай консервативті жолмен жүретіндігін дәлелденді. Оны алғашқылардың бірі болып 1958 жылы М.Мезельсон және Ф.Сталь Е.соlі жасушасында байұаған.
Қазіргі таңда ДНҚ молекуласының сырт пішінінің 3 түрі белгілі: тұрақты сақиналы (бактериофагтарда); құбылмалы сақиналы (бактериофагтарда); сызықты (прокароттар және эукариоттарда). Осыған сәйкес ДНҚ молекуласының жартылай консерватвті репликациялануының 3 түрі белгілі: 1) тета репликация; 2) сигма репликация; 3) У-тәрізді репликция.
Кейбір прокариоттардың және басқа барлық эукариоттардың ДНҚ молекуласы сызықша тәрізді болып келеді және олардың репликациялануы белгілі бір нүктеден, репликативтік ісінудің пайда болуынан басталып, хромосоманың қарама-қарсы жағына қарай бағытталады. Эукариоттардың ірі хромосомаларында бір мезгілде жүздеген репликациялық ісінулер пайда болады және олар бір-бірімен қосылып У-тәрізді аралық құрылым пайда етеді. Мұны У-тәрізді жартылай консерватвті репликациялану деп атайды.
ДНҚ молекуласының негізгі бөлімінің бірнеше ерекшеліктері белгілі: а) ДНҚ молекуласының жаңа тізбегінің синтезделуіне қажет заттар- дезоксинуклеозидифосфат (дНТФ) болып табылады, ал ДНҚ құрамында дезоксинуклеозидмонофосфаттар (дНМФ) кездеседі. Сондықтанда ДНҚ тізбегіне жалғану алдында әрбір нуклеотидтен 2 фосфат қалдығы прифосфат күйінде бөлініп шығады да тез арада фосфаттарға дейін гидролизденеді.
Еркін дНТФ--дНИФ қалдығы +пирофосфат
дНТФ-ды құрылыс материалдары ретінде пайдаланудың энергетикалық себептері де бар. Нуклеотидтер арасындағы байланыстардың (фосфодиэфирлік) түзілуі үшін энергия қажет, ал энергия фосфаттараралық байланыстардың үзілуі нәтижесінде бөлінеді.
Б) ДНҚ репликациясы матрицалық (қалыптық) үдеріс яғни ДНҚ-ның жаңа тізбегі аналық ДНҚ молекуласының бір жішесі негізінде (матрица) комплементарлық ұстанымен (принциппен) синтезделінеді, яғни 4 нуклеотидтен (дАТФ, дГТФ, дТТФ) жаңа тізбекке тек аналық жіпшедегі нуклеотидке комплементарлы (А--Т; Г--Ц) нуклеотид қана қосылады.
В) ДНҚ синтезі (репликациясы) симметирялы болады, яғни матрица қызметін аналық ДНҚ молекуласының екі тізбегі де атқара береді. Сондықтан оны жартылай консервативті деп те атайды. Себебі, жаңадан синтезделген ДНҚ молекуласы жартылай жаңарған болады, яғни оның бір тізбегі ескі-аналық молекуладан алынған болса (матрица), екінші жаңадан синтезделген болады.
Г) ДНҚ синтезі (жаңа тізбектің не оның бір бөлімінің синтезделуі) белгілі бір бағытта жүреді, яғни 5' ұшынан 3' ұшына қарай жүреді.
Д) ДНҚ репликациясы басталу, жүруі үшін, міндетті түрде аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасы бір-бірімен ажырасуы қажет, тек осы жағдайда, яғни бір-бірінен ажырасқан аналық молекуланың жіпшелері матрица (қалып) қызметін атқара алады.
Репликация тетіктері немесе репликация үдерісі 15-20 ақуыздан тұратын күрделі ферменттік жүйенің қатынасуымен жүзеге асады.
Эукариоттар хромосомаларында жоғарыда айтқанымыздай, бір мезгілде көптеген ферменттік кешендер қызмет етеді, яғни хромосомада ДНҚ репликациясының көптеген ферменттік кешендер қызмет етеді, яғнихромосомада ДНҚ репликацясының көптеген басталу (инициация) нүктелері болады және ДНҚ синтезі хромосоманың бас жағынан ұшына қарай баяу жүрей, көптеген жерлерінде бір мезгілде жүзеге асады. Бұл репликация ұзақтығынан едәуір қысқартады.
Репликацияның әр бір нүктесінде 2 ферменттік кешен жұмыс істейді; олар ДНҚ-ның инициация нүктесінен қараа-қарсы бағыттарға қарай жүреді.
ДНҚ молекуласының тізбектері бір-біріне антипаралель болғандықтан және ДНҚ синезі тек 5'--3' бағытында жүретіндіктен, репликативтік ашада аналық ДНҚ-ның бір тізбегі негізінде жаңа ДНҚ тізбегі үзіліссіз синтезделсе, екіншісі негізінде үзіліп-үзіліп синтезделеді. Біріншісін лидерлік тізбек, ал екіншісін артта қалушы (кешігуші) жіпше деп атайды.
Лидерлік тізбекке негізінде синтезделген өте ұзын, ұзындығы көршілес екі инициация нүктелерінің ұзындығының жартысына, яғни 1 600 000 нуклеотидке тең, тізбек синтезделсе, артта қалушы (кешігуші) тізбек негізінде қысқа 1500 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ фрагменттері синтезделеді. Оларды Оказаки ферменттері деп атайды.
ДНҚ синтезі басталуы үшін міндетті түрде 10-15 нуклеотидтерден тұратын РНҚ-ұйытқы-праймер қажет, себебі ДНҚ синтезін жүргізетін фермент ДНҚ-полимераза өз бетінше ДНҚ синтезін бастай алмайды.
ДНҚ молекуласындағы репликацияның басталу (инициация) нүктелері А-Т нуклеотидтер жұптарына бай бірізділікерге ие. Ерекше танып білуші ақуыз (А) әрбір осындай нуклеотидтер бірізділігіне (А-Т бай) ДНҚ - репликациялаушы кешенді байланыстарды да өзі әрі қарай, кешенмен бірге жылжымайды.
А-тандап білуші ақуыз; Г-геликаза; И-тополимераза; S-SSВ-ақуыз; П-праймаза АП-праймаза активаторы; α,β,δ,-ДНҚ полимеразалар; Р-РСNА-ақуыз; Н-нуклеаза; ДНҚ лигаза.
Ферменттік кешеннің ең алғашқы іске кірісетін ферменті - геликаза (Г). Ол аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасының ашылып, жіпшелердің бір-бірінен ажырауын қамтамасыз етеді.
Ширатпаның ашылып жазылуы әрі қарай үлкенді-кішілі түйіндердің (суперспирализация) пайда болуына алып келеді. Мұның себебі әрбір ДНҚ молекуласы өздерінің бірнеше учаскелерімен ядро матриксіне бекінген, ал бұл ширатпалары ашылған ДНҚ молекуласының еркін айналуынамүмкіндік бермейді, сондықтан да түйіндер пайда болады.
Бұл мәселе топоизомераза (И) ферментінің қатынасуы арқылы шешіледі.
Сонымен, геликаза, топоизомераза ферменттері аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасын жеке-жеке екі тізбекке ажыратады. Ажырасқан әрбір тізбекпен ерекше SSВ-ақуыздар байланысады, олардың қызметі бір-бірінен ажырасқан жіпшелерді керіп, күні бұрын жанасып, қос ширатпаның түзілуін болдырмау болып табылады. [17-26]
1.3 ПТР-диагностикасының тәжірибелік қолданылудың перспективалары
LabMedica International журналында берілген мәлеметтерге сүйенсек, 1995 жылдан бастап, ПТР-диагностикаға кеткен шығындардың ұлғаюы байқалады, бұл ПТР-дің тәжірибелі медицинада қолданылуының өсу көрсеткіші болып табылады. Американдық ғалымдар 1996 жылы ДНҚ-диагностикаға 181,6 миллион доллар қаражат кеткендігін атап көрсеткен, ал 2003 жылға қарай, маман иелерінің болжауы бойынша, қаражат шығыны 1400,0 миллион долларға өседі.
Аталған журналдардың берген мәлеметтері бойынша қазіргі таңда ПТР-диагностиканың бес негізгі бағыты тез дамуда:
1) Инфекциялық аурулардың диагностикасы;
2) Онкологиялық аурулардың диагностикасы;
3) Генетикалық аурулардың диагностикасы
4) Тұлғаның танылуы (идентификациясы);
5) Тамақта патогенездерді диагностикалау;
ДНҚ-диагностиканың нарықта дамуының басты бағыты инфекциялық аурулардың диагностикасы болып табылады. Осы салада қолданысы кең етек алған иммунды-ферменттік талдауға (ИФТ) қарағанда, ДНҚ-диагностика аурудың қоздырушысын дәлме-дәл анықтауға мүмкіндік береді. ПТР-дің сатыларының жетілдірілген сызбаларының көмегімен өте төмен концентрациясында патогенді микроағзаларды анықтауға болады.
Онкологиялық аурулардың ДНҚ-диагностикасы ісікті аурулармен байланысты гендер туралы мәлеметтердің үлкен емес, бірақ өте белсенді өспелі санымен шектеледі. Адам геномы проектісінің арнасында ғалымдар осы патологиямен байланысты мутацияларды зерттеуді жалғастыруда.
Онкологиялық сияқты, генетикалық аурулардың диагностикасы адам геномын ауқымды ғылыми зерттеулерді жүргізген соң ғана дамуы мүмкін. Медициналық бірлестік аурудың генетикалық негізін зерттеудің маңыздылығын, сондай-ақ диагностикасының мүмкіндігін және де аурудың симптомдарының пайда болуына дейінгі емдеу курсын бастау мүмкіндігін мойындайды.
Маман иелерінің баға беруі бойынша, құрамына соттық медицинаны, креминалистиканы, органдар мен ұлпаның трансплантациясын енгіздіретін тұлғаны тану (идентификация) ДНҚ-диагностикасының нарығында өте ірі және тез өспелі бағыттарының бірі. Бұл салада шығындардың жыл сайын өсімі 21,3%-дық көрсеткіштің белгіленуі көрсетілуде.
Тамақта патогендердің ДНҚ-диагностикасының нарығы өте қарапайымдылығымен белгілі. Қазіргі таңда өңдірілетін тамақ өңімдерінің микропты ластануының ДНҚ - диагностикасына өңімдердің ластануын тексеру үшін қолданылатын әдістердің ( культуральді әдістер және моноклональды антиденелерді қолданатын әдістер). Жалпы санынан 5%-дан төмен келіп отыр. Бірақ ДНҚ-диагностика әдістері, маман иелердің баға беруі бойынша тез, дәл және ақпаратты болып табылады, бұл бәлкім жақын болашақта осы салада ДНҚ-диагностикасының нарығында олардың екіншісінің жылдам өсуіне әкеледі. [37]
ІІ Зерттеу бөлімі
2.1 Политізбектік реакция әдісінің механизімдері
Политізбектік реакцияның жүргізілуі үшін келесі бірқатар компоненттерінің реакциялық қосындыларының болуы қажет.
Праймерлер - жасанды жолмен синтезделген олигонуклеотидтер, ережеге сай олардың өлшемдері 15-тен 30 жұп нуклеотидтері бар, ДНҚ-мишенінің сәйкес учаскілеріне пара-пар. Олар амплификацияның реакциясының өңімдерінің пайда болуында негізгі роль атқарады. Дұрыс таңдалған праймерлер тест-жүйенің ерекшелігін және сезімталдығын қамтамасыз етеді.
Tag-полимеразасы - термотұрақты фермент, ДНҚ-ның екінші тізбегінің 3'-ші соңын құрып бітіруді толықтыру принципіне сәйкес қамтамасыз етеді.
Дезоксинуклеотидүшфосфаттар қосындысы (дНТФ)-дезоксиаденинүшфосфат (дАТФ), дезоксигуанозинүшфосфат (дГТФ), дезкокцицитозинүшфосфат (дЦТФ) және дезкоситиминүшфосфат (дТТФ) - ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін Tag-полимеразасымен қолданылатын құрылыс материалы.
Буфер - белгілі бір концентрациясындағы катиондар мен аниондардың қосындысы, реакция, сондай-ақ рН-тің тұрақты маңызына қажетті жағдай туғызады.
Талданбалы үлгі - реакциялық қосындыға енгізуге дайын, ДНҚ негізін құрай алатын препарат, мысалы ДНҚ микроағзалары - кейінгі көпреттік көшіру үшін мишень ретінде қызмет етеді. Егер ДНҚ-мишені жоқ болса, амплификацияның ерекше өнімі пайда болмайды.
Айналымдық температуралық режим. Егер таңдалмалы үлгіде ДНҚ негізі болатын болса, онда амплификацияның реакциясы процесінде онымен бірге бірқатар белгілі температуралық айналымды қамтамасыз ететін жағдайлар жүреді. Амплификацияның әрбір айналымы үш сатыдан тұрады:
1. Денатурация. Бірінші сатыда үлгіде болатын ДНҚ-ның екінші тізбегін ажырату қажет. Бұл үшін реакциялық қосындыны 92-95° С-та қыздырады, нәтижесінде ДНҚ-ның екі тізбектік молекуласы бір тізбектік молекуланың түзілуіен ыдырайды.
2. Күйдіру. Екінші сатысында праймерлер бір тізбектік ДНҚ-мишеніне қосылады. Бұл процесс күйдіру деп аталады. (ағылшын сөзінен annealing)
Праймерлерді негізгі үзінділердішектете отырып, жинайды және олар ДНҚ-ның қарама-қарсы тізбектерін толықтырғыш болып келеді.
Күйдіру екі тізбектік ДНҚ молекулаларында аденинге қарсы әрдайым тимин, ал гуанинге қарсы - цитозин болатындығын білдіретін Чаргафтың комплементарлы ережесімен сәйкес жүзеге асады. Егер бұл жағдай бақыланбаса, праймерлердің күйдірілуі жүзеге аспайды.
3. Элонгация (синтездеу). Үшінші сатыда реакциялық қосындыдағы температураны Tag-полимераза жұмысының қажетті шегіне дейін жеткізеді және екінші тізбектің синтезделуі максимальды тиімділігімен ары қарай жалғасады.
Кейде, прайерлердің күю температурасының жақын мағынасы жағдайында және Tag-полимераза жұмысының қажетті шегінің температурасы кезінде күйдіру мен элонгацияны біріктіре отырып екі сатылы ПТР-ді қолдану мүмкін болады.
Амфлификацияның температуралық айналымы (30 және одан да көп рет) қайталанып отырады. Әр айналымда ДНҚ үзінділерінің синтезделген көшірлемер саны екі еселенеді.
Айналымдық процестің нәтижесі ДНҚ-ның ерекше үзіндісінің санының көрсеткіштік ұлғаюымен белгіленеді, оны А=М*(2п-п-1)~2п формуласымен сипаттауға болады. Мұндағы: А-амплификация реакциясының ерекше өңімдерінің (праймерлермен шектелген) саны; М- ДНҚ мишенінің бастама саны; п-амплификация айналымдарының саны;
Амплификацияның жеке айналымдар тиімділігінің шынайы мәні кейбір мәлеметтер бойынша 78-97%-ды құрайды. Реакция ингибиторларының үлгіде болуы жағдайында бұл мән біршама аз болуы мүмкін, сондықтан да амплификацияның ерекше өңімдерінің фактілі санын келсі формула жақсырақ сипаттайды:
А=М*(1+Е)п
Мұндағы, Е-реакция тиімділігінің мәні.
Амплификация процесі барысында соңғы тізбекте синтезделетіндігін, бірақ ұзын үзінділердің жиналуы тек амплификациялық прогрессияда келесі формула бойынша жүзеге асатындығын ескере кету қажет:
К=М*п
Мүндағы, амфлипикацияның ұзын өңімдерінің саны.
Қорта келе, соңдарында праймерлермен шектелген ерекше үзінділер алғаш рет екінші айналым аяғында пайда болып, геометриялық прогрессияда жиналып, амплификация өңімдері арасында басымдылық көрсете бастады.
Плато әсері. Амплификацияның ерекше өңімдерінің жиналуы процесі геометирялық прогрессия бойынша тек шектеулі процесі геометриялық прогрессия бойынша тек шектеулі уақытта ғана жүретіндігін ал одан кейін оның әсерлігі критикалық деңгейге дейін түсіп кететіндігіне ерекше көңіл бөлу қажет. Бұл процесс плато әсері деп аталатын механизіммен байланысты.
Амплификация реакциялыраның айналымдарының жағдайлары мен санына байланысты плато әсері сәтіне жетуіне: субстраттардың қолданылуы (дНТФ және прайерлер) реагенттердің (дНТФ және ферменттердің) тұрақтылығы; ингибиторларды, трифосфаттар мен ДНҚ-дуплекстердің саны; праймерлер дНТФ және полиераза үшін бәсекеге түсетін праймер димерлер емес жай өңімдер; амплификация өңімдерінің жоғары құрамдық көрсетуі барысында ерекше өнім концентрациясы мен толық емес денатурация ықпалын тигізеді. ДНҚ-мишенінің бастапқы құрамы қаншалықты аз болса, платоға реакциялар шығымды қауіпі соншалықты жоғары болады. Бұл сәт амплификацияның ерекше өңімдерінің саны оларды талдау үшін жеткілікті болғанда түсуі мүмкін. Жақсы дайындалған тест жүйелер бұл сәттің түсуіне жол бермейді. [26-31]
2.2 Биологиялық материалдың үлгісін дайындау
ПТР - талдау үш сатыдан тұрады.
ПТР-дің орын алуына үлгілерді даярлау үшін қойылатын міндеттерге байланысты әртүрлі әдістемелер қолданылады. Олардың маңыздылығы биологиялық препараттан ДНҚ-ны алып тастауда және амплификация реакцияларының жүруі үшін жарамдылығы және тазалығы сақталған ДНҚ препараттарын алу үшін бөтен қосындылық құралады нейтралдау немесе мүлде жоюда болып табылады.
Кейде үлгіні 5-10 минут ішінде қайнатып алу жеткілікті болады, бірақ көпшілік жағдайда күрделі әдістердің орындалуын талап етеді.
Магнтитпен ұсынылған ДНҚ-ның таза препараттарын алу әдістемесе стандартты және классикалық болып үлгерген әдістеме деп есептеледі. Оның құрамына жасушаларды ферментативті протолизі, кейінгі спиртпен ДНҚ-ны депротеинизациялау және салқындатумен байланысты процестердің жүруі кіреді. Бірақ бұл әдіс өте күрделі болғандықтан, фенол және хлорофром сияқты заттардың агрессивті және қатты иістермен жұмыс істеуді білдіреді.
Қазіргі таңдағы өте танымал әдістердің бірі - Воот және авторлар бірлестігімен ұсынылған ДНҚ-ны белгілеу әдісі болып отыр. Бұл күшті хаотропты агенттің - гуанин тиоционатының (GuSCN) жасушаның лизисі үшін қолданылуда алып жүрушіде (шыны моншақтар, диатомды топырақ және сыны сүт және т.б.) ДНҚ-ның кейінгі сіңірілуіне негізделуде.
Жуылып шайылған соң үлгіде буфер көмегімен онай алынатын алып жүрушіде сіңірілген ДНҚ қалады. Әдіс қолдану ыңғайлы технологиялық және амплификацияға үлгіні даярлау үшін жарамды. Дегенмен де алып жүрушіде қайтымсыз сіңірілуі салдарынан, сондай-ақ жоғалып кетуі мүмкін. Әсіресе үлгіде ДНҚ-нің бірнеше санымен жұмыс істеу бар да бұл әдістің үлкен маңыздылығы көрініс табады. Сонымен қатар, тіпті GuSCN-нің іздің саны ПТР-ді жүргізі алады. Сондықтан да осы әдісті қолдану бар-да сорбитті дұрыс таңдау және технологиялық жаңалықтарды қолдануда жан-жақты қадағалау өте маңызды. Үлгімен жұмыс істеу бар да ертінділерді қосу және жою сатыларының көп болғандықтан жұмысқа тиянақтылық қажет етеді, себебі ДНҚ аэрозолмен пайда болған үлгілер арасында қиылысқан ластану жүзеге асуы мүмкін.
Үлгі дайындаудың басқа әдістер топтамасы Chilex типіндегі ион алмастырушыларды қолдануда негізделген, олардың ионы ыдыстардан өзгешілігі ДНҚ-ны емес, керсінше реакцияның жүруіне кедергі келтіретін құрамдық қосындыларды сіңіреді. Ережеге сай, бұл технологияның екі сатысы болады: үлгіні қайнату, оның нәтижесінде жасуша қабырғасы бұзылып, нуклеинді қышқылдар ертіндіге шығады және ион алмастырушыда құрамдық қосындыларды сіңіру. Әдіс орындалуы жағынан қарапайымдылығымен танымал. Көпшілік жағдайларда бұл әдіс клиникалық материалдармен жұмыс істеу үшін тиімді. Өкінішке орай, кейде ион алмастырушысымен жою мүмкін болмайтын құрамдық қосындылары бар үлгілер де кездесіп жатады. Сонымен қатар, кейбір микроағзалардың жасушалық қабырғалары жай қайнату арқылы бұзылмайды. Мұндай жағдайда үлгіні залалсыздандырудың қосымша сатыларын енгізу қажеттілігін тудырады.
Статистикалық мәлеметтердің алу үшін маңызды жаппай скрининг процесі бар да детергентерді немесе биологиялық материалдарды кейінгі нейтрализациялауымен бірге келетін сілтемемен залалсыздандыруды қолданатын қарапайым әдістердің қолданылуы жүзеге асады. Осыған орай, үлгі дайарлаудың осыған ұқсас әдістерінің клиникалық диагностика жасау үшін қолданылуы қате нәтижелерге алып келеді, оның салдары реакциялық қосындыда ДНҚ-ның сапасыз препаратын қолдану.
Қортындылай келсек, үлгі дайарлаудың әдістерін таңдауда алдын-ала болжамдалған анализдерді жүргізудің мақсаттарын түсініп барып ат салысу қажет. [7]
Амплификация. Ампрификация реакцияны жүргізу үшін реакциялық қосынды дайындап, оған ДНҚ-ның талданбалы үлгісін енгізу қажет. Бұл ретте праймерлерді күйдірудің ерекшеліктерін есепке алу маңызды. Оның мәні әртүрлі молекулалары болуында, оларға реакцияда пайдаланылатын праймерлер жеке, кейбір жағдайларда ауқымды гомологиялық қатысы бар. Осыған қарамастан, праймерлер праймер-димерлерді құрап отырып, бір-бірімен күйдіріле алады. Праймер-димердің екеуінде праймерлердің реакцияның (ерекше емес) жанама өнімдерін синтездеу үшін үлкен шығынға алып келеді және соның салдары ретінде жүйенің сезімталдығын біраз төмендетеді. Бұл электрофорезді жүргізу барысында реакция нәтижелерін есепке алудың мүмкіндігін шектейді немесе қиындата түседі.
ПТР-дің ыстық бастаманы қолдану арқылы жүзеге асырудың жолдары. Амплификация реакцияның жанама өңімдерінің пайда болу қауіпін азайту үшін ыстық бастама деген атауға ие болған (ағылшын тілінең hot start сөзінен) жолды қолданады. Оның мәні праймерлердің ерекше күйдірілуін қамтамасыз ететін жағдайларға пробиркада жету сәтіне дейін реакцияның жүруі басталуын болдырмау мүмкіндігінде.
Бұл негізінен, ГЦ-құрам мен өлшеміне байланысты праймерлер ерудің (ТШ) белгілі бір температурасы болатындығымен түсіндіріледі, мұндай температура барысында сутектік байланыстардың пайда болуы тұрақсыз. Егер жүйе температурасы асып кетсе, праймер ДНҚ тізбегінде тұра алмай, денатурленеді. Қажетті жағдайларды қадағалау барысында, яғни күйдіру температурасы, еру температурасына жақын болғанда праймер екітізбектік молекуланы құрайды, бұл процесс тек оның толықтырғыштық жағдай барысында жүзеге асады, осылайша, реакцияның ерекшелігін қамтамасыз етеді. Ыстық бастаманы жүзеге асырудың әртүрлі нұсқалары да бар:
А) реакциялық қосындыға пробирканы денатурация температурасына дейін қыздырғаннан кейін алғашқы айналым кезінде Taq-полимеразаны енгізеді;
Ә) реакциялық қосындының құрамдарын қабаттарға бөлу, мәселен, парафин немесе воскты бөліктерге (астыңғыда-праймерлер, үстіңгіде- Taq-полимераза және ДНҚ-мишені) бөледі, олар қабат материалдарының еру температурасына жету барысында араласып кетеді. (~45-85°С);
Б) Taq-полимеразада моноклональды антиденелерді қолдану. Моноклональды антиденелермен байлансты ферменттер моноклаональды антиденелер қайтымсыз денатурленгенде және Taq-полимеразаның белсенді орталық сатысынан кейін ғана белсенді болады.
Барлық сипатталған жағдайларда, егер жанама күйдіру температуралық айналымның жүруі басталғанға дейін жүзеге асса, элонгация жүрмейді, ал кешенді қыздыру барысында ДНҚ-праймерлері денетурленеді, сондықтан да жанама өнімдер пайда болмайды. Ары қарай пробиркада температура еру температурасынан төмен болуын қамтамасыз етеді.
Жабдықпен қамтамасыз етілуі. Амплификация реакцияның жүруінің маңызды факторы жабдықталуды қамтамасыз ету болып табылады. Амплификатордың сенімділігімен температураларды ұстау дәлдігіген басқа, құрал-жабдықты әдеттегі қадағалау кезіндегіге қарағанда, біршама аз уақыт аралығында пробирка ішінде реакциялық қосындының қажетті температураға жетуге мүмкіндік береттін маңызды қасиетін ескеру қажет. Осыған байланысты реакция уақыты қысқарады (1,5-2 есе); Taq-полмераза белсенділігінің сақтау уақыты ұзарады, бұл амплификация айналымдарының саны көбеюіне мүмкіндік береді, ал праймерлердің жанама күйіп кету қауіпін төмендетуге, сәйкесінше, реакцияның сезімталдығы мен ерекшелігін жоғарлатуға мүмкіндік тудырады. [40, 23]
Мұндай топтың құралдарына амплификаторлардың РСР-Systm 2400 немесе Model 9600 (Perkin-Elmer, АҚШ) Touch Doun (HyBaid, Ұлыбритания ), РСР 200 (МJResearch, АҚШ), Терцик (НПФ ДНҚ-Технология, Ресей) деген модельдерін жатқысуға болады. Белсенді қадағалауы бар құралдарды қолданған кезде ПТР-пробиркалардын типін ескерту қажет және дайындаушы фирмалардың ұсынымдарына сай қолдану қажет. Бұл температураның өзгеруінің жоғарғы жылдамдығы орнаған кезде амплификатор ұяшықтарының құрылымындағы кішігірім өзгешеліктер мен ПТР-пробирканың конус пішінді белсенді қадағалау басымдылығын жоққа шығарып, жылулық байланыстың нашарлауымен байланысты температуралық қателіктер кесірінен реакцияның сезімталдығын төмендете алатындығымен түсіндіріледі.
РНҚ молекуласының амплификациясы. ПТР үшін РНҚ-ы мишень ретінде қолдану мүмкіндігі бұл әдісті қолданудың аясын мағаналы қеңейте түсті. Мысалы, көптеген вирустардың (С гепатиті, инфлюэнца вирусы, пикорнавирустар және т.б.) геномдары дәл РНҚ-ның өзінде ұсынылады. Олардың өміршендік айналымдарына ДНҚ-ға ауысудың аралық фазасы болмайды. РНҚ-ны анықтауда бірінші ретте оны ДНҚ пішініне ауыстыру қажет. Бұл үшін ферменттік қайтымды транскриптаза да қолданылады, оларды әртүрлі екі вирустардан бөліп шығарады: Avian myeloblastosis virus және Moloney murinebeukemia virus. Бұл ферменттерді пайдалану кейбір қиындықтармен байланысты. Ең алдымен, олар термолабильді және сондықтан да 42°С-танжоғары емес температурада пайдаланыла алады. Себебі, осындай температурада РНҚ молекулалар екінші құрылымды оңай құрайды, ал реакция тиімділігі және әртүрлі баға беру бойынша шамамен 5%-ға тең.
Бұл кемшілікті Мn2+ барысында транскриптазалық белсенділігін көрсететін Thermus Thermophilus термофильді микроағзасынан алынған термотұрақты полимеразаны қайтымды транскриптаза ретінде қолдана отырып, жою жолдарын жүзеге асыруда. Бұл политізбекті, транскриптазалық белсенділікті көрсетуге қабілетті жалғыз танымал фермент.
Қайтымды транскрипцияның реакциясын жүргізу үшін реакциялық қосындыда ПТР-дегі сияқты праймерлер улы заттар ретінде болуы шарт және 4 дНТФ қосындысы құрылыс материалы ретінде болуы керек.
Қайтымды транскрипция реакциясы жүргеннен кейін пайда болған молекулалар ДНҚ-ға ПТР жүргізу үшін мишень ретінде қызмет атқарады.
Детекция. ПТР-дің нәтижелерін дұрыс бағалау үшін берілген әдіс сандық болып табылмайтындығын түсіну маңызды. ДНҚ-мишенінің бірліктік молекулаларының амплификация өнімдері теориялық түрде электрофорез көмегі 30-35 айналымнан кейін анықталады. Дегенмен де, тәжірибе жүзінде бұл процесс тек реакцияның өмірде сирек кездесетін үлгіге жақын жағдайларында жүргенде ғана орындалады. Әсіресе, амплификацияның әсерлілігіне үлкен ықпалды ДНҚ препаратының тазалық деңгейі тигізеді, яғни реакциялық қосындыда сол немесе басқадай ингибиторлардың болуы, кейбір кездері олардан құтылу өте қиынға соқтырады. Кейде олардың құрамдық болуының кесірінен ДНҚ-мишенінің тіпті он мыңдаған молекулаларын амплифицирлеу жүзеге аспай жатады. Сонымен, ДНҚ-мишенінің соңғы саны мен амплификация өнімдерінің соңғы санының арасында тікелей байланыс жиі болмайды.
Көлденең электрофорез әдісі. Амплификация нәтижелерін көзбен көру үшін әртүрлі әдістер қолданылады. Бүгінгі таңдағы ең көп таралған әдіс ол электрофорез әдісі болып отыр, бұл әдіс ДНҚ молекулаларының өлшемі бойынша бөлуде негізделген. Ол үшін ДНҚ-нің арнайы бояғышын қосу арқылы 1,5-1,2% құрамындағы агарозының электрофорездік буферде балқуынан кейін қатқан агорозды ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Биологиялық зерттеулерде политізбектік реакция әдісін қолдану
МАЗМҰНЫ
Кіріспе ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... 3
І Ғылыми әдебиеттерге шолу
1.1 Политізбектік реакция әдісінің ашылуы ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ...
1.2 ДНҚ-ң құрылысы мен құрамы ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
1.3 ПТР-диагностикасының тәжірибелік қолданылудың перспективалары ... ..
ІІ Зерттеу бөлімі
2.1 Политізбектік реакция әдісінің механизімдері ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ..
2.2 Биологиялық материалдың үлгісін дайындау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
2.3Полтитізбектік реакция тізбектері ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..
2.4 ПТР-ді тәжірибелік денсаулық сақтауда қолдану ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
ІV Зерттеу нәтижелері
4.1 Медициналық тәжірибеде ПТР әдісің қолданылуының проблемалары ... .
4.2 Өсімдіктер ДНҚ-ғы бөтен ДНҚ-ң процентік көрсеткішін тест-жүйе арқылы анықтау ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
ҚОРЫТЫНДЫ ... ... ... ... ... ... .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ ... ... ... ... ... ... ... . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Анықтамалар, белгілеулер мен қысқартулар
ДНҚ - дезоксирибонуклеин қышқылы
РНҚ - рибонуклеин қышқылы
ПТР - политізбекті реакция
дНТФ - дезоксинуклеозидифосфат
дНМФ - дезоксинуклеозидмонофосфат
дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат
дГТФ - дезоксигуанозинтрифосфат
дЦТФ - дезоксицитидиктрифосфат
дТТФ - дезокситимидинтрифосфат
Thermus aquaticus - грамтеріс таяқша тәрізді экстремальды термотұрақты бактерия.
ИФА - иммуноферменттік анализ
ГМО - генетикалық модификацияланған организім
Кіріспе
Соңғы он жылдықта молекулалық биологияның, медициналық генетиканың, биохимияның, биофизиканың, микробиологияның, иммунологияның, онкологияның, эпидемиологяның және т.б. ғылымдардың қарқынды дамуы адам, жануар, өсімдік, бактерия және вирус геномын зерттеуде диагностикалық практиканың молекулярлы-биологиялық әдістің белсенді нығайуына әкелді. Бұл әдіс ДНҚ-зерттеу деп аталады. [1]
ДНҚ-зерттеу әдісі әр түрлі ауруларды ерте және толық анықтауға мүмкіндік береді. Терапияда нәтижелі бақылау жасауға және қазіргі диференциалды диагностика жасауға мүмкіндік береді. Тұқым қуалайтын ауруларды анықтауда таптырмайтын әдіс әсіресе қан іздерінен, шәуеттен және саусақ мөрінен қылмысты адамдарды анықтауға мүмкіндік береді.
Қазіргі танда ДНҚ-диагностиканың екі бағыты бар олар: гибридизационды нуклеин қышқылдарының анализі және политізбектік реакция әдісін қолдану арқлы диагностика. Молекулалық биология әдісінің дамуы ХХ ғасырдың 50-і жылдары басталды. Ресімей бастама 1953 жылы ДНҚ-ң құрылысының ашылуымен байланысты болды. ДНҚ-гибридизация әдісі инфекциялы қоздырғыштарды анықтауда қиындау, ұзақ және қымбатқа түсті. Оның орнына политізбектік реакция әдісі келді (ПЦР).
Политізбекті реакция - ДНҚ-ң репликациясының жүруін айқын көрсететін ең негізгі әдістердің бірі болып табылады. ПЦР әдісінің ашылуымен спецификалық молекула ДНҚ-ң миллиондаған молекула арасындағы маңыздылығы анықталды. [2]
Политізбекті реакция әдісінің ашылуы молекулалық биология саласындағы соңғы онжылдықтағы негізгі жаңалық болып табылады. Ашылған жаңалық медицина саласындағы диагностиканы жаңа, жоғары сатыға көтерді. Политізбекті реакция әдісінің маңыздылығы - ДНҚ-ң участогын лабораториялық жағдайда температуралық цикл барысында пробиркада амплификациялау (бірнеше қайтара көшірмесін түсіру). ДНҚ-ң әрбір көшірмесін жасау барысында алдыңғы процесте синтезделген ақпарат қайта синтезделіп, ДНҚ полимеразамен қайта көшіріледі. Осы процесс барысында ДНҚ-дағы ақпарат түрленіп, күрделене түседі де синтез процесінің жүруі жеңілдей түседі.
Политізбекті реакция анализинің ашылуы соңғы жылдары медицина мен ғылым саласында көптеген жетістіктерге жетті. Алғашқы кезде ПТР әдісі институт қабырғасындағы лабораторияда қолданылып, қазіргі таңда көптеген мемлекеттерде практика жүзінде клиникалық ауруларды емдеуде кеңінен қолданылуда. Инфекциялық ауруларды диагностикалау (соның ішінде агенттен туа біткен); микроорганизмдерді генотиптеу, олардың вируленттігін анықтау; микрофлораның антибиотиктерге қарсы тұру қабілеттілігі; генодиагностика және генетикалық дактилоскопия; қанның препараттарына биологиялық бақылау жасауда - ПЦР анализі қолданылып келеді.
Қазіргі таңда Политізбекті реакцияны қажет етпейтін модификация саласы да бар. Соған қарамастан Политізбекті реакция анализі қарқындап дамып, нарықта өзінің соңғы үлгідегі тест, жасанды технологияларын ұсынып келеді. ТМД елдерінде жаңа әдіспен лабораториялық бақылаулар мен зерттеулер жүргізетін лабораториялар саны да артып келеді.
Дипломдық жұмыстың көкейкестілігі:
Дипломдық жұмыстың мақсаты: Биологиялық зерттеулерде политізбектік реакция әдісін қолдануды меңгеру.
Дипломдық жұмыстың міндеттері:
І Ғылыми әдебиеттерге шолу
0.1 Политізбектік реакция әдісінің ашылуы
Алғаш рет американдық биохимик Кэри Мюлис политізбекті реакция әдісін ашқан болатын. Оның негізгі мақсаты ДНҚ бөліктермен басқа ғалымдар жұмыс жасауы үшін қысқа ДНҚ үзіктерін бөліп алу керек болды. Молекулалық биология бағытында алға үлкен қадам жасады және 1993 жылы химия саласынан Нобел силығын алды.
ПТР-дің ашылуы туралы алғаш рет Cetus корпарациясының Кэри Мюлис 1985 жылы Science жураналына алғаш рет жариаланған.
1989 жылы термотұрақты ДНҚ-полимераза Taq ашылып, Science журналында жариаланып молекула жылы деп аталды. Hoffmann-La Roche Inc. және Cetus шешiмі бойынша ПТР-ді диагностикалық мақсаттарға қолдана бастады. 1990 жылы ғалым Cetus, D. Gelfand және S. Stoffel тазаланған Taq DNA-полимеразы анықтаған және де сот сараптамасында брініші ретосы әдісті қолданған. Cetus, H. Erlich и Kary Mullis биохимия саласында Неміс қоғамында наградаға лайықталған.
Политізбектік реакция - ДНҚ-ның табиғи репликациясын беретін және басқа да миллиондаған молекулалардың ішінен ДНҚ-ның жалғыз ерекше молекуласын анықтауға мүмкіндік беретін өте тамаша әдіс.
Политізбектік реакция әдісінің ашылуы соңғы он жылда молекулалы биология обылысында аты танымал жаңалықтардың бірі болды. Бұл әдіс медициналық диагностиканы сапалы жаңа деңгейге көтеруге мүмкіндік береді.
ДНҚ көшірмесін алу үшін реакциялық қосындыға кіретін ингредиенттердің праймерлері (ДНҚ-ның қысқа жасанды жолмен синтезделген молекулалары) және құрамының қолданылуының негізгі принціптері алғаш рет 1971 жылы Kleppe және авторлар бірлестігімен сипатталған. Бірақ ол уақытта ПТР-дің ДНҚ-ға кіретін үзінділер көшірмесінің санының (экспотенциялды) көрсеткіштік ұлғаюы реакциялық нәтиже ретіндегі негізгі қасиеті әлі көрсетілмеген-ді.
1983 жылы Cetus фирмасының жұмысшысы Kary Mullis политізбектік реакция ретінде кейіннен танымал болған әдісті ұсынады. Әдістің негізгі мәні қайталанбалы температуралық циклдер процесінде ДНК-нің белгілі бір учаскілерін пробиркада көпреттік көшіруде (амплификациясында) болып табылады. Амплификацияның әрбір циклінде бұрын синтезделген үзінділер ДНҚ-полимеразамен қайта көшіріледі. Осының арқасында ары қарай талдауды біраз жеңілдететін ДНҚ-нің ерекше фрагменттерінің санының көп есе ұлғаюы жүзеге асады.
Бұл жаңалықтың ашылуымен бірге кейбір технологиялыардың дамығандығын атап кету керек. Дәлірек айтсақ, ДНҚ-нің біртізбек үзінділерін автоматты түрде синтездеуге мүмкіндік беретін құралдардың пайда болуы. Дәл сол кезде гейзерлерде өмір сүретін ерекше микроағзалар анықталған. Олардың ферментативтік жүйесі және ДНҚ-полимеразасы ыстық қайнар көздерінің жоғарғы температураларын сақтайды және биологиялық белсенділігі 95° С-қа дейін сақталады, бұл температура көрсеткіш политізбектік реакцияны жүргізу үшін қажетті жағдай туғызады.
ПТР-дің ашылу нәтижесі әдістің тез арада тәжірибелік қолданылуына алып келді. 1985 жылы Saiki авторлар бірлестігімен бірге Р-глобинның геномды тізбектелуінің амплификациясы сипатталған мақаланы жариялады. Осы кезден бастап авторлар өздерінің жұмыстарында ПТР-дің қолданылуы туралы жазған мақалалар саны геометриялық прогресске біршама өсе бастады. Әдістің соншалықты танымалдылыққа ие болғандығы сондай, тіпті қазіргі уақытта молекулалы биология саласында оны қолданусыз жұмысты көз алдына елестету қиын болып отыр. Әсіресе политізбекті реакция әдісінің өршіген дамуына Адам геномы ұлтаралық бағдарлама арқасында жетті. Сондай-ақ, қазіргі заман сквинерлеудің лазерлік технологиясы (ДНҚ-ның нуклеотидті тізбектелуінің оқылуы) жасалды. Бұрын 250 жұп нуклеотид (ж.н) өлшемі бар ДНҚ-ның тізбектелуінің оқуылуы үшін бір апта уақыт қажет болса, қазіргі заман лазерлік сквенаторлар күніне 5000 жұп нуклеотидке дейінанықтауға мүмкіндік береді. Бұл өз кезегінде әртүрлі биологиялық қбъектілердің ДНҚ тізбектері құрайтын мәлеметтердің ақпараттық базасының өсуіне мүмкіндік береді. Бүгінгі таңда ПТР-дің әртүрлі модификациясы ұсынылуда, микроағзаларды анықтау үшін тест-жүйелерінің құрылуына, нүктелі мутацияны анықтауға мүмкіндік тудырып отыр, әдістің ондаған әртүрлі қолданылуы суреттелуде. [3-8]
1.2 ДНҚ-ң құрылысы мен құрамы
Нуклеин қышқылдары жасушаның ең маңызды бөлігі болып саналады. Нуклеин қышқылының молекуласын ХІХ ғасырдың аяғында 1868 жылы Щвейцария ғалымы Ф. Мишер ашқан болатын. Ал ДНҚ мен РНҚ-ң қызметтері, молекуласының құрылысы, кейінірек қана белгілі болды.
Қазіргі кездері нуклеин қышқылдарының тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі екеніне ешкім күмән келтірмейді, бірақ бұл тек 1950 жылы Х.Френкель-Конрат тәжірибелері нәтижесінде ғана үзілді-кесілді дәлелденген болатын. Ал, ХХ ғасырдың 20 жылдарында (1928 ж.) тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі ретінде ақуыз молекуласы саналып келген еді.
Тек ХХ ғасырдың 20 жылдары Т. Морган т.б. ғалымдардың еңбектері арқасында тұқым қуалаушылықтың материалдық негізі хромосомалар екені белгілі болды. Тұқымқуалаушылықтың хромосмдық теориясы ашылған болатын. Сонымен бірге хромосомалар ақуыз және нуклеин қышқылынан (ДНҚ) тұратындығы анықталды. Ал, осы екі макромалекулалардың - ақуыз және нуклеин қышқылының (ДНҚ) қайсысы тұқым қуалаушылыққа жауапты деген мәселе ғалымдар арасында біршама пікірталас туғызған болатын. Ал, 1928 ж. Н.К. Кольцов ген қызметін ақуыз молекуласы атқаруы мүмкін деген болжам жасады және 1940 жылға дейін ғалыдардың көпшілігі осы пікірге келісіп келген. [30]
1928 жылы Ф. Гриффитс бактериялардың трансформациялау қабілетіне тәжірибе жасап, тұқым қуалаушылыққа ақуыз емес ДНҚ молекуласы жауапты болуы мүмкін деген болжам жасаған болатын.
Трансформация - дегеніміз бактериялардың бір штамының екінші бір штамының ДНҚ молекуласының бір бөлігін өзіне қосып алып, оның қасиетіне ие болуын айтамыз.
Ф.Гриффитс тышқандарғы вирулентті (патогенді) және вирулентті емес (патогенді емес) пневмококк штамдарын енгізіп, пневмококк штамдарының вируленттік қасиеті ДНҚ молекуласының фрагменттері арқылы деп болжамдаған.
1944 жылы О.Эйвери, К.Мак Леод және М.Мак Карти осы тәжірибені жаңа әдістемелік деңгейде қайталап Ф.Гриффитс болжамын растады.
1952 жылы Н.Циндер және Д.Ледерберг трансдукция құбылысын ашып (трансдукция бактериофагтардың бактерияның бір штамының ДНҚ фрагментін екінші штаммына көшіре алу қасиеті) ДНҚ молекуласының тұқым қуалаушылықтағы рөлі туралы тағы бір дәлелдемеге қол жеткізген болатын.
1950 жылы Х. Френкель-Конрат темекі өсімдігіне темекі мозайкасы вирусының врулентті және вирулентті емес штамдарының ақуыз және РНҚ молекулаларын жеке-жеке және бірге енгізіп, тәжірибе жасап, тұқымқуалаушылық ақпарат ақуыз молекуласында емес, нуклеин қышқылдарында болатындығын үзілді - кесілді дәлелдеген болатын.
Х.Френкель - Конрат тәжірибесінің мәні мынада: егер вирулентті вирус штамының тек ақуыз молекуласын өсімдікке енгізгенде ауру дамымаған, ал вируленті вирус штамының РНҚ молекуласын темекі өсімдігіне енгізгенде ауру дамыған еді. Сол сияқты, вирулентті вирус штамының ақуыз молекуласын және вирулентті емес РНҚ молекуласын бірге енгізгенде ауру дамымайды, ал вирулентті емес вирус штамының ақуыз молекуласын және вирулентті вирус штамының РНҚ-сын бірге енгізгенде ауру дамыған.
Нуклеин қышқылдарының екі түрі белгілі: ДНҚ және РНҚ.
Нуклеин қышқылдары - полимерлер, олардың мономерлері болып нуклеотидтер саналады. Нуклеоидтар өз кезегенде 3 бөліктен құралған.
Нуклеотидтер молекуласында азоттық негіздердің пуриндік - Аденин (А) не Гуанин (Г); немесе пиримидиндік - Цитозин (Ц), Тимин (Т) не Урацил (У) деген түрлері, қант ретінде - дезоксирибоза не рибоза, 1 фосфор қышқылының қалдығы (монофосфат) кездеседі.
Дезоксирибонуклеин қышқылының (ДНҚ) құрылысына келетін болса ол, ДНҚ (дезоксирибонуклеин қышқылы) нуклеотидтері-дезоксирибозадан, азоттық негіздерден, 1 фосфаттан (монофосфат) құрылған, оларды - д АМФ, д ГМФ, д ЦМФ, д ТМФ деп атайды.
ДНҚ молекуласы қосширатпалы болып келеді (Ф. Крик, Дж Уотстон). Оның алғашқы, екінші реттік, үшінші реттік құрылыстары белгілі).
ДНҚ молекуласының алқашқы құрылысы - бір жіпші нуклеотидтердің (А, Г, Ц, Т) бірізділікпен тізбектеліп орналасуы болып табылады. ДНҚ алғашқы құрылысы фосфодиэфирлік байланыс арқылы тұрақтанады, яғни бір жіпшедегі нуклеотидтер бір-бірімен фосфаттық топ және қаныттың гидроксил тобы арқылы байланысқан. [13-15]
ДНҚ молекуласының екінші реттік құрылысы оының екі жіпшесіндегі азоттық негіздердің бір-бірімен сутектік байланыс арқылы комплементарлы байланысуы (А-Т; Г-Ц) болып табылады. ДНҚ жіпшелері полярлы болады, яғни оның 5' және 3' ұштаы белгілі. ДНҚ молекуласының қосширатпасы (тізбектері) бір-біріне антипараллель орналасқан;
Қос ширатпаның бір оралымында 10 жұп нуклеотидтер кездеседі, ал оралымның ұзындығы 3,4 нм тең.
Сонымен қатар, А-Т арасында 2 сутектік байланыс болса, Г-Ц арасында 3 сутектік байланыс болады. Сондықтан-да Г-Ц байланысы, А-Т байланысына қарағанда әлдеқайда мықтылау болады.
ДНҚ молекуласының 3 реттік құрылысы ретінде оның ақуыздармен (гистондық ақуыздармен) байланысын айтуға болады.
Хромосома ақуыздарының 60-80 пайызын-негіздік және гидрофобтық аминқышқылдар (аргинин, лизин, валин, т.б.) көптеп кездесетін гистондық ақуыздар құрайды. Гистондық ақуыздар ДНҚ - мен негіздік радикалдар арқылы әрекеттеседі. Хромосомаларда ДНҚ молекуласы гистондық ақуыздармен байланысып нуклеогистон құрайды, ол хроматин жіпшесі ретінде белгілі. Хроматин жіпшесінің тірегін нуклеосома денешіктері құрайды. Ол 4 түрлі гистондық ақуыздардың - гистон Н2А, гистон Н2в, гистон3, гистон 4- (Н2а, Н2в, Н3, Н4) қос молекуласынан құралған.
Осындай әр бір денешікті ДНҚ молекуласы екі рет ширатылып оларды және оының ұзындығы 140 н.ж. тең. Нуклеосома денешіктірі бір-бірімен тығыз жабысып орналаспай біршаа алшақтау орналасқан нукеосома денешіктірінің аралығындағы ДНҚ учаскілерін линкерлік (жалғаушы) учаске деп атайды, ал әрбір линкерлік учаскемен гистондық ақуыздың 5-ші түрі - Н1 байланысқан.
Хроматин жіпшесінде ДНҚ өте көп, 600 000-ға жуық, нуклеосома денешіктерін түзеді. Ұзындығы 190 см, жететін ДНҚ молекуласының өлшемі жағынан микроскопиялық, бірнеше микрометірге -180 мкм. тең, 46 хромосомаларда тығыздалып, ширатылып орналасуына нуклеосома денешіктері мүмкіндік береді.
Жасуша ядросының барлық хромосомаларында орналасқан ДНҚ ұзындығы 190 см, тең, ал нуклеосома жіпшесінің ұзындығы ДНҚ ұзындығынан 6,2 есе кем.
Нуклеосома жіпшелері әрі қарай ширатылып хроматин жіпшелеріне айналады. Хроматин жіпшелерінің ұзындығы нуклеосома жіпшелерінің ұзындығынан 18 есе кем, ал ДНҚ молекуласының ұзындығынан 6,2х18=100 есе кем.
Хроматин жіпшелері митоз кезінде әрі қарай ширатылып, қатпарланып, тығыздалып митоздық хромосомаларды туғызады. Митоздық хромосомаларда хроматин жіпшелері хромосоманын ұзына бойына көптеген рет қатпарлар пайда етеді (кейбір деректер бойынша 100 ретке дейін), осының нәтижесінде барлық хромосомалардың ұзындығы (180 мкм) ДНҚ молекуласының ұзындығынан 100 000 есе кем болады.
Сонымен қатар нуклесомалар құрылымдық (хроматин тірегі), реттеуші қызметтерді де атқарады.
ДНҚ молекуласының бойында тұқым қуалаушылық ақпарат жазылған, ол негізінен (95%) ядрода, ал 5% цитоплазмада, митохондрияларда, хлоропластарда шоғырланған.
Рибонуклеин қышқылының (РНҚ) құрылысына келетін болсақ ол, РНҚ-да ДНҚ сияқты полимер-сызықты полинуклеотид, ал мономерлері болып рибонуклеотидтер саналады. РНҚ нуклеотидтерінде рибоза, 4 азоттық негіздер - А, Г, Ц, У, бір фосфор қышқылының қалдығы кездеседі, оларды рАМФ, рГМФ, рЦМФ рУМФ деп бейнелейді.
Нуклеотидтер 5', 3' - фосфодиэфирлік байланыс арқылы байланысқан.
РНҚ-ның, полинуклеотид тізбегі полярлы болып келеді, яғни оның 5' және 3' ұштары болады.
Сол сияқты, РНҚ молекуласының ДНҚ молекуласынан айырашылықтары да белгілі.
1) Ең негізгі айырмашылығы РНҚ молекуласы қосширапалы емес, қосшиыртпалы емес бір ширатпалы. Оның 3 себеі бар.
А) біріншіден, РНҚ молекуласындағы пентоза (қант) дезоксирибоза емес, қосымша гидроксил тобы бар, рибоза болып табылады. Ал, қосымша қосымша гидроксил тобы қосширатпалы құрылымының түзілуін тежейді.
Б) екіншіден, РНҚ молекуласында негізгі не мажорлық азоттық негіздерден тиминнің орнына урацил кездеседі (А, Г, Ц, У). Урацил тиминнен 5 метил тобының болмауымен ерекшеленеді. Осыған байланысты А-У арасында гиброфобтық әрекеттесу күші А-Т-ға қарағанда әжептеуір әлсіз болады. Ал, бұл тұрақты қосширатпалық құрылымның түзілуі мүмкіндігін төмендетеді.
В) РНҚ молекуласында (әсіресе т РНҚ-да) өзгерген, модификацияланған минорлық негіздердің және нуклеозидтердің мөлшері өте көп. Олардың ішінде - дигнодроуридин (урацилде 1 сутектік байланыс болмайды, яғни 3 сутектік байланыстың орнына 2 болады); псевдоуридин (урацил рибозамен ерекше байланысқан); диметиладенин және диметилгуанин (азоттық негіздерде екі қосымша метил тобы болады). Бұл негіздер комплементерлы әрекеттесуге қабілетсізү Осының бәрі қосширатпалы құрылымның пайда болуына кедергі келтіреді.
Сонымен, көпшілікке мәлім РНҚ молекуласының бір ширатпалы болуының орасан зор биологиялық маңызы бар, себебі РНҚ өзінің негізгі қызметтерін тек бір ширатпалы күйінде ғана орындай алады, бұл әсіресе а-РНҚ молекуласын тән: мысалы, қалайша қосшиартпалы а-РНҚ рибосомаларда трансляцияланар еді?
Сонымен қатар, РНҚ негізінен бір ширатпалы (тізбекті) болуымен бірге, кейде қосширатпалы ілмекшелер де пайда етеді (т-РНҚ).
Құрысылы, қызметтері жағынан түрліше болып келетін 3 түрлі РНҚ белгілі: а-РНҚ, т-РНҚ, р-РНҚ.
ДНҚ репликациясы. ДНҚ молекуласының ең маңызды қасиеттерінің бірі-оның өздігінен екі еселенуі (репликациялануы) болып саналады. ДНҚ репликациялануы салдарынан тұқым қуалаушылық ақпарат ұрпақтан-ұрпаққа өзгеріссіз, тепе-тең мөлшерде беріліп, ұрпақтардың жалғасуы қамтамасыз етіледі. ДНҚ репликациясы жасуша циклының S - синтетикалық кезеңінде жүзеге асады.
ДНҚ молекуласының репликациялану қасиеті 1953 жылы Дж. Уотсон және Ф. Криктің ДНҚ молекуласының құрылысының қос ширатпалы болатындығын анықтағаннан кейін белгілі болды.
Теория күйінде ДНҚ репликациясының 3 түрлі әдісі болжамдалған: 1) консервативті (тұрақты); 2) жартылай консервативті; 3) дисперсті.
Көптеген тәжірибелер нәтижесінде ДНҚ молекуласының репликациялануы жартылай консервативті жолмен жүретіндігін дәлелденді. Оны алғашқылардың бірі болып 1958 жылы М.Мезельсон және Ф.Сталь Е.соlі жасушасында байұаған.
Қазіргі таңда ДНҚ молекуласының сырт пішінінің 3 түрі белгілі: тұрақты сақиналы (бактериофагтарда); құбылмалы сақиналы (бактериофагтарда); сызықты (прокароттар және эукариоттарда). Осыған сәйкес ДНҚ молекуласының жартылай консерватвті репликациялануының 3 түрі белгілі: 1) тета репликация; 2) сигма репликация; 3) У-тәрізді репликция.
Кейбір прокариоттардың және басқа барлық эукариоттардың ДНҚ молекуласы сызықша тәрізді болып келеді және олардың репликациялануы белгілі бір нүктеден, репликативтік ісінудің пайда болуынан басталып, хромосоманың қарама-қарсы жағына қарай бағытталады. Эукариоттардың ірі хромосомаларында бір мезгілде жүздеген репликациялық ісінулер пайда болады және олар бір-бірімен қосылып У-тәрізді аралық құрылым пайда етеді. Мұны У-тәрізді жартылай консерватвті репликациялану деп атайды.
ДНҚ молекуласының негізгі бөлімінің бірнеше ерекшеліктері белгілі: а) ДНҚ молекуласының жаңа тізбегінің синтезделуіне қажет заттар- дезоксинуклеозидифосфат (дНТФ) болып табылады, ал ДНҚ құрамында дезоксинуклеозидмонофосфаттар (дНМФ) кездеседі. Сондықтанда ДНҚ тізбегіне жалғану алдында әрбір нуклеотидтен 2 фосфат қалдығы прифосфат күйінде бөлініп шығады да тез арада фосфаттарға дейін гидролизденеді.
Еркін дНТФ--дНИФ қалдығы +пирофосфат
дНТФ-ды құрылыс материалдары ретінде пайдаланудың энергетикалық себептері де бар. Нуклеотидтер арасындағы байланыстардың (фосфодиэфирлік) түзілуі үшін энергия қажет, ал энергия фосфаттараралық байланыстардың үзілуі нәтижесінде бөлінеді.
Б) ДНҚ репликациясы матрицалық (қалыптық) үдеріс яғни ДНҚ-ның жаңа тізбегі аналық ДНҚ молекуласының бір жішесі негізінде (матрица) комплементарлық ұстанымен (принциппен) синтезделінеді, яғни 4 нуклеотидтен (дАТФ, дГТФ, дТТФ) жаңа тізбекке тек аналық жіпшедегі нуклеотидке комплементарлы (А--Т; Г--Ц) нуклеотид қана қосылады.
В) ДНҚ синтезі (репликациясы) симметирялы болады, яғни матрица қызметін аналық ДНҚ молекуласының екі тізбегі де атқара береді. Сондықтан оны жартылай консервативті деп те атайды. Себебі, жаңадан синтезделген ДНҚ молекуласы жартылай жаңарған болады, яғни оның бір тізбегі ескі-аналық молекуладан алынған болса (матрица), екінші жаңадан синтезделген болады.
Г) ДНҚ синтезі (жаңа тізбектің не оның бір бөлімінің синтезделуі) белгілі бір бағытта жүреді, яғни 5' ұшынан 3' ұшына қарай жүреді.
Д) ДНҚ репликациясы басталу, жүруі үшін, міндетті түрде аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасы бір-бірімен ажырасуы қажет, тек осы жағдайда, яғни бір-бірінен ажырасқан аналық молекуланың жіпшелері матрица (қалып) қызметін атқара алады.
Репликация тетіктері немесе репликация үдерісі 15-20 ақуыздан тұратын күрделі ферменттік жүйенің қатынасуымен жүзеге асады.
Эукариоттар хромосомаларында жоғарыда айтқанымыздай, бір мезгілде көптеген ферменттік кешендер қызмет етеді, яғни хромосомада ДНҚ репликациясының көптеген ферменттік кешендер қызмет етеді, яғнихромосомада ДНҚ репликацясының көптеген басталу (инициация) нүктелері болады және ДНҚ синтезі хромосоманың бас жағынан ұшына қарай баяу жүрей, көптеген жерлерінде бір мезгілде жүзеге асады. Бұл репликация ұзақтығынан едәуір қысқартады.
Репликацияның әр бір нүктесінде 2 ферменттік кешен жұмыс істейді; олар ДНҚ-ның инициация нүктесінен қараа-қарсы бағыттарға қарай жүреді.
ДНҚ молекуласының тізбектері бір-біріне антипаралель болғандықтан және ДНҚ синезі тек 5'--3' бағытында жүретіндіктен, репликативтік ашада аналық ДНҚ-ның бір тізбегі негізінде жаңа ДНҚ тізбегі үзіліссіз синтезделсе, екіншісі негізінде үзіліп-үзіліп синтезделеді. Біріншісін лидерлік тізбек, ал екіншісін артта қалушы (кешігуші) жіпше деп атайды.
Лидерлік тізбекке негізінде синтезделген өте ұзын, ұзындығы көршілес екі инициация нүктелерінің ұзындығының жартысына, яғни 1 600 000 нуклеотидке тең, тізбек синтезделсе, артта қалушы (кешігуші) тізбек негізінде қысқа 1500 нуклеотидтерден тұратын ДНҚ фрагменттері синтезделеді. Оларды Оказаки ферменттері деп атайды.
ДНҚ синтезі басталуы үшін міндетті түрде 10-15 нуклеотидтерден тұратын РНҚ-ұйытқы-праймер қажет, себебі ДНҚ синтезін жүргізетін фермент ДНҚ-полимераза өз бетінше ДНҚ синтезін бастай алмайды.
ДНҚ молекуласындағы репликацияның басталу (инициация) нүктелері А-Т нуклеотидтер жұптарына бай бірізділікерге ие. Ерекше танып білуші ақуыз (А) әрбір осындай нуклеотидтер бірізділігіне (А-Т бай) ДНҚ - репликациялаушы кешенді байланыстарды да өзі әрі қарай, кешенмен бірге жылжымайды.
А-тандап білуші ақуыз; Г-геликаза; И-тополимераза; S-SSВ-ақуыз; П-праймаза АП-праймаза активаторы; α,β,δ,-ДНҚ полимеразалар; Р-РСNА-ақуыз; Н-нуклеаза; ДНҚ лигаза.
Ферменттік кешеннің ең алғашқы іске кірісетін ферменті - геликаза (Г). Ол аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасының ашылып, жіпшелердің бір-бірінен ажырауын қамтамасыз етеді.
Ширатпаның ашылып жазылуы әрі қарай үлкенді-кішілі түйіндердің (суперспирализация) пайда болуына алып келеді. Мұның себебі әрбір ДНҚ молекуласы өздерінің бірнеше учаскелерімен ядро матриксіне бекінген, ал бұл ширатпалары ашылған ДНҚ молекуласының еркін айналуынамүмкіндік бермейді, сондықтан да түйіндер пайда болады.
Бұл мәселе топоизомераза (И) ферментінің қатынасуы арқылы шешіледі.
Сонымен, геликаза, топоизомераза ферменттері аналық ДНҚ молекуласының қос ширатпасын жеке-жеке екі тізбекке ажыратады. Ажырасқан әрбір тізбекпен ерекше SSВ-ақуыздар байланысады, олардың қызметі бір-бірінен ажырасқан жіпшелерді керіп, күні бұрын жанасып, қос ширатпаның түзілуін болдырмау болып табылады. [17-26]
1.3 ПТР-диагностикасының тәжірибелік қолданылудың перспективалары
LabMedica International журналында берілген мәлеметтерге сүйенсек, 1995 жылдан бастап, ПТР-диагностикаға кеткен шығындардың ұлғаюы байқалады, бұл ПТР-дің тәжірибелі медицинада қолданылуының өсу көрсеткіші болып табылады. Американдық ғалымдар 1996 жылы ДНҚ-диагностикаға 181,6 миллион доллар қаражат кеткендігін атап көрсеткен, ал 2003 жылға қарай, маман иелерінің болжауы бойынша, қаражат шығыны 1400,0 миллион долларға өседі.
Аталған журналдардың берген мәлеметтері бойынша қазіргі таңда ПТР-диагностиканың бес негізгі бағыты тез дамуда:
1) Инфекциялық аурулардың диагностикасы;
2) Онкологиялық аурулардың диагностикасы;
3) Генетикалық аурулардың диагностикасы
4) Тұлғаның танылуы (идентификациясы);
5) Тамақта патогенездерді диагностикалау;
ДНҚ-диагностиканың нарықта дамуының басты бағыты инфекциялық аурулардың диагностикасы болып табылады. Осы салада қолданысы кең етек алған иммунды-ферменттік талдауға (ИФТ) қарағанда, ДНҚ-диагностика аурудың қоздырушысын дәлме-дәл анықтауға мүмкіндік береді. ПТР-дің сатыларының жетілдірілген сызбаларының көмегімен өте төмен концентрациясында патогенді микроағзаларды анықтауға болады.
Онкологиялық аурулардың ДНҚ-диагностикасы ісікті аурулармен байланысты гендер туралы мәлеметтердің үлкен емес, бірақ өте белсенді өспелі санымен шектеледі. Адам геномы проектісінің арнасында ғалымдар осы патологиямен байланысты мутацияларды зерттеуді жалғастыруда.
Онкологиялық сияқты, генетикалық аурулардың диагностикасы адам геномын ауқымды ғылыми зерттеулерді жүргізген соң ғана дамуы мүмкін. Медициналық бірлестік аурудың генетикалық негізін зерттеудің маңыздылығын, сондай-ақ диагностикасының мүмкіндігін және де аурудың симптомдарының пайда болуына дейінгі емдеу курсын бастау мүмкіндігін мойындайды.
Маман иелерінің баға беруі бойынша, құрамына соттық медицинаны, креминалистиканы, органдар мен ұлпаның трансплантациясын енгіздіретін тұлғаны тану (идентификация) ДНҚ-диагностикасының нарығында өте ірі және тез өспелі бағыттарының бірі. Бұл салада шығындардың жыл сайын өсімі 21,3%-дық көрсеткіштің белгіленуі көрсетілуде.
Тамақта патогендердің ДНҚ-диагностикасының нарығы өте қарапайымдылығымен белгілі. Қазіргі таңда өңдірілетін тамақ өңімдерінің микропты ластануының ДНҚ - диагностикасына өңімдердің ластануын тексеру үшін қолданылатын әдістердің ( культуральді әдістер және моноклональды антиденелерді қолданатын әдістер). Жалпы санынан 5%-дан төмен келіп отыр. Бірақ ДНҚ-диагностика әдістері, маман иелердің баға беруі бойынша тез, дәл және ақпаратты болып табылады, бұл бәлкім жақын болашақта осы салада ДНҚ-диагностикасының нарығында олардың екіншісінің жылдам өсуіне әкеледі. [37]
ІІ Зерттеу бөлімі
2.1 Политізбектік реакция әдісінің механизімдері
Политізбектік реакцияның жүргізілуі үшін келесі бірқатар компоненттерінің реакциялық қосындыларының болуы қажет.
Праймерлер - жасанды жолмен синтезделген олигонуклеотидтер, ережеге сай олардың өлшемдері 15-тен 30 жұп нуклеотидтері бар, ДНҚ-мишенінің сәйкес учаскілеріне пара-пар. Олар амплификацияның реакциясының өңімдерінің пайда болуында негізгі роль атқарады. Дұрыс таңдалған праймерлер тест-жүйенің ерекшелігін және сезімталдығын қамтамасыз етеді.
Tag-полимеразасы - термотұрақты фермент, ДНҚ-ның екінші тізбегінің 3'-ші соңын құрып бітіруді толықтыру принципіне сәйкес қамтамасыз етеді.
Дезоксинуклеотидүшфосфаттар қосындысы (дНТФ)-дезоксиаденинүшфосфат (дАТФ), дезоксигуанозинүшфосфат (дГТФ), дезкокцицитозинүшфосфат (дЦТФ) және дезкоситиминүшфосфат (дТТФ) - ДНҚ-ның екінші тізбегін синтездеу үшін Tag-полимеразасымен қолданылатын құрылыс материалы.
Буфер - белгілі бір концентрациясындағы катиондар мен аниондардың қосындысы, реакция, сондай-ақ рН-тің тұрақты маңызына қажетті жағдай туғызады.
Талданбалы үлгі - реакциялық қосындыға енгізуге дайын, ДНҚ негізін құрай алатын препарат, мысалы ДНҚ микроағзалары - кейінгі көпреттік көшіру үшін мишень ретінде қызмет етеді. Егер ДНҚ-мишені жоқ болса, амплификацияның ерекше өнімі пайда болмайды.
Айналымдық температуралық режим. Егер таңдалмалы үлгіде ДНҚ негізі болатын болса, онда амплификацияның реакциясы процесінде онымен бірге бірқатар белгілі температуралық айналымды қамтамасыз ететін жағдайлар жүреді. Амплификацияның әрбір айналымы үш сатыдан тұрады:
1. Денатурация. Бірінші сатыда үлгіде болатын ДНҚ-ның екінші тізбегін ажырату қажет. Бұл үшін реакциялық қосындыны 92-95° С-та қыздырады, нәтижесінде ДНҚ-ның екі тізбектік молекуласы бір тізбектік молекуланың түзілуіен ыдырайды.
2. Күйдіру. Екінші сатысында праймерлер бір тізбектік ДНҚ-мишеніне қосылады. Бұл процесс күйдіру деп аталады. (ағылшын сөзінен annealing)
Праймерлерді негізгі үзінділердішектете отырып, жинайды және олар ДНҚ-ның қарама-қарсы тізбектерін толықтырғыш болып келеді.
Күйдіру екі тізбектік ДНҚ молекулаларында аденинге қарсы әрдайым тимин, ал гуанинге қарсы - цитозин болатындығын білдіретін Чаргафтың комплементарлы ережесімен сәйкес жүзеге асады. Егер бұл жағдай бақыланбаса, праймерлердің күйдірілуі жүзеге аспайды.
3. Элонгация (синтездеу). Үшінші сатыда реакциялық қосындыдағы температураны Tag-полимераза жұмысының қажетті шегіне дейін жеткізеді және екінші тізбектің синтезделуі максимальды тиімділігімен ары қарай жалғасады.
Кейде, прайерлердің күю температурасының жақын мағынасы жағдайында және Tag-полимераза жұмысының қажетті шегінің температурасы кезінде күйдіру мен элонгацияны біріктіре отырып екі сатылы ПТР-ді қолдану мүмкін болады.
Амфлификацияның температуралық айналымы (30 және одан да көп рет) қайталанып отырады. Әр айналымда ДНҚ үзінділерінің синтезделген көшірлемер саны екі еселенеді.
Айналымдық процестің нәтижесі ДНҚ-ның ерекше үзіндісінің санының көрсеткіштік ұлғаюымен белгіленеді, оны А=М*(2п-п-1)~2п формуласымен сипаттауға болады. Мұндағы: А-амплификация реакциясының ерекше өңімдерінің (праймерлермен шектелген) саны; М- ДНҚ мишенінің бастама саны; п-амплификация айналымдарының саны;
Амплификацияның жеке айналымдар тиімділігінің шынайы мәні кейбір мәлеметтер бойынша 78-97%-ды құрайды. Реакция ингибиторларының үлгіде болуы жағдайында бұл мән біршама аз болуы мүмкін, сондықтан да амплификацияның ерекше өңімдерінің фактілі санын келсі формула жақсырақ сипаттайды:
А=М*(1+Е)п
Мұндағы, Е-реакция тиімділігінің мәні.
Амплификация процесі барысында соңғы тізбекте синтезделетіндігін, бірақ ұзын үзінділердің жиналуы тек амплификациялық прогрессияда келесі формула бойынша жүзеге асатындығын ескере кету қажет:
К=М*п
Мүндағы, амфлипикацияның ұзын өңімдерінің саны.
Қорта келе, соңдарында праймерлермен шектелген ерекше үзінділер алғаш рет екінші айналым аяғында пайда болып, геометриялық прогрессияда жиналып, амплификация өңімдері арасында басымдылық көрсете бастады.
Плато әсері. Амплификацияның ерекше өңімдерінің жиналуы процесі геометирялық прогрессия бойынша тек шектеулі процесі геометриялық прогрессия бойынша тек шектеулі уақытта ғана жүретіндігін ал одан кейін оның әсерлігі критикалық деңгейге дейін түсіп кететіндігіне ерекше көңіл бөлу қажет. Бұл процесс плато әсері деп аталатын механизіммен байланысты.
Амплификация реакциялыраның айналымдарының жағдайлары мен санына байланысты плато әсері сәтіне жетуіне: субстраттардың қолданылуы (дНТФ және прайерлер) реагенттердің (дНТФ және ферменттердің) тұрақтылығы; ингибиторларды, трифосфаттар мен ДНҚ-дуплекстердің саны; праймерлер дНТФ және полиераза үшін бәсекеге түсетін праймер димерлер емес жай өңімдер; амплификация өңімдерінің жоғары құрамдық көрсетуі барысында ерекше өнім концентрациясы мен толық емес денатурация ықпалын тигізеді. ДНҚ-мишенінің бастапқы құрамы қаншалықты аз болса, платоға реакциялар шығымды қауіпі соншалықты жоғары болады. Бұл сәт амплификацияның ерекше өңімдерінің саны оларды талдау үшін жеткілікті болғанда түсуі мүмкін. Жақсы дайындалған тест жүйелер бұл сәттің түсуіне жол бермейді. [26-31]
2.2 Биологиялық материалдың үлгісін дайындау
ПТР - талдау үш сатыдан тұрады.
ПТР-дің орын алуына үлгілерді даярлау үшін қойылатын міндеттерге байланысты әртүрлі әдістемелер қолданылады. Олардың маңыздылығы биологиялық препараттан ДНҚ-ны алып тастауда және амплификация реакцияларының жүруі үшін жарамдылығы және тазалығы сақталған ДНҚ препараттарын алу үшін бөтен қосындылық құралады нейтралдау немесе мүлде жоюда болып табылады.
Кейде үлгіні 5-10 минут ішінде қайнатып алу жеткілікті болады, бірақ көпшілік жағдайда күрделі әдістердің орындалуын талап етеді.
Магнтитпен ұсынылған ДНҚ-ның таза препараттарын алу әдістемесе стандартты және классикалық болып үлгерген әдістеме деп есептеледі. Оның құрамына жасушаларды ферментативті протолизі, кейінгі спиртпен ДНҚ-ны депротеинизациялау және салқындатумен байланысты процестердің жүруі кіреді. Бірақ бұл әдіс өте күрделі болғандықтан, фенол және хлорофром сияқты заттардың агрессивті және қатты иістермен жұмыс істеуді білдіреді.
Қазіргі таңдағы өте танымал әдістердің бірі - Воот және авторлар бірлестігімен ұсынылған ДНҚ-ны белгілеу әдісі болып отыр. Бұл күшті хаотропты агенттің - гуанин тиоционатының (GuSCN) жасушаның лизисі үшін қолданылуда алып жүрушіде (шыны моншақтар, диатомды топырақ және сыны сүт және т.б.) ДНҚ-ның кейінгі сіңірілуіне негізделуде.
Жуылып шайылған соң үлгіде буфер көмегімен онай алынатын алып жүрушіде сіңірілген ДНҚ қалады. Әдіс қолдану ыңғайлы технологиялық және амплификацияға үлгіні даярлау үшін жарамды. Дегенмен де алып жүрушіде қайтымсыз сіңірілуі салдарынан, сондай-ақ жоғалып кетуі мүмкін. Әсіресе үлгіде ДНҚ-нің бірнеше санымен жұмыс істеу бар да бұл әдістің үлкен маңыздылығы көрініс табады. Сонымен қатар, тіпті GuSCN-нің іздің саны ПТР-ді жүргізі алады. Сондықтан да осы әдісті қолдану бар-да сорбитті дұрыс таңдау және технологиялық жаңалықтарды қолдануда жан-жақты қадағалау өте маңызды. Үлгімен жұмыс істеу бар да ертінділерді қосу және жою сатыларының көп болғандықтан жұмысқа тиянақтылық қажет етеді, себебі ДНҚ аэрозолмен пайда болған үлгілер арасында қиылысқан ластану жүзеге асуы мүмкін.
Үлгі дайындаудың басқа әдістер топтамасы Chilex типіндегі ион алмастырушыларды қолдануда негізделген, олардың ионы ыдыстардан өзгешілігі ДНҚ-ны емес, керсінше реакцияның жүруіне кедергі келтіретін құрамдық қосындыларды сіңіреді. Ережеге сай, бұл технологияның екі сатысы болады: үлгіні қайнату, оның нәтижесінде жасуша қабырғасы бұзылып, нуклеинді қышқылдар ертіндіге шығады және ион алмастырушыда құрамдық қосындыларды сіңіру. Әдіс орындалуы жағынан қарапайымдылығымен танымал. Көпшілік жағдайларда бұл әдіс клиникалық материалдармен жұмыс істеу үшін тиімді. Өкінішке орай, кейде ион алмастырушысымен жою мүмкін болмайтын құрамдық қосындылары бар үлгілер де кездесіп жатады. Сонымен қатар, кейбір микроағзалардың жасушалық қабырғалары жай қайнату арқылы бұзылмайды. Мұндай жағдайда үлгіні залалсыздандырудың қосымша сатыларын енгізу қажеттілігін тудырады.
Статистикалық мәлеметтердің алу үшін маңызды жаппай скрининг процесі бар да детергентерді немесе биологиялық материалдарды кейінгі нейтрализациялауымен бірге келетін сілтемемен залалсыздандыруды қолданатын қарапайым әдістердің қолданылуы жүзеге асады. Осыған орай, үлгі дайарлаудың осыған ұқсас әдістерінің клиникалық диагностика жасау үшін қолданылуы қате нәтижелерге алып келеді, оның салдары реакциялық қосындыда ДНҚ-ның сапасыз препаратын қолдану.
Қортындылай келсек, үлгі дайарлаудың әдістерін таңдауда алдын-ала болжамдалған анализдерді жүргізудің мақсаттарын түсініп барып ат салысу қажет. [7]
Амплификация. Ампрификация реакцияны жүргізу үшін реакциялық қосынды дайындап, оған ДНҚ-ның талданбалы үлгісін енгізу қажет. Бұл ретте праймерлерді күйдірудің ерекшеліктерін есепке алу маңызды. Оның мәні әртүрлі молекулалары болуында, оларға реакцияда пайдаланылатын праймерлер жеке, кейбір жағдайларда ауқымды гомологиялық қатысы бар. Осыған қарамастан, праймерлер праймер-димерлерді құрап отырып, бір-бірімен күйдіріле алады. Праймер-димердің екеуінде праймерлердің реакцияның (ерекше емес) жанама өнімдерін синтездеу үшін үлкен шығынға алып келеді және соның салдары ретінде жүйенің сезімталдығын біраз төмендетеді. Бұл электрофорезді жүргізу барысында реакция нәтижелерін есепке алудың мүмкіндігін шектейді немесе қиындата түседі.
ПТР-дің ыстық бастаманы қолдану арқылы жүзеге асырудың жолдары. Амплификация реакцияның жанама өңімдерінің пайда болу қауіпін азайту үшін ыстық бастама деген атауға ие болған (ағылшын тілінең hot start сөзінен) жолды қолданады. Оның мәні праймерлердің ерекше күйдірілуін қамтамасыз ететін жағдайларға пробиркада жету сәтіне дейін реакцияның жүруі басталуын болдырмау мүмкіндігінде.
Бұл негізінен, ГЦ-құрам мен өлшеміне байланысты праймерлер ерудің (ТШ) белгілі бір температурасы болатындығымен түсіндіріледі, мұндай температура барысында сутектік байланыстардың пайда болуы тұрақсыз. Егер жүйе температурасы асып кетсе, праймер ДНҚ тізбегінде тұра алмай, денатурленеді. Қажетті жағдайларды қадағалау барысында, яғни күйдіру температурасы, еру температурасына жақын болғанда праймер екітізбектік молекуланы құрайды, бұл процесс тек оның толықтырғыштық жағдай барысында жүзеге асады, осылайша, реакцияның ерекшелігін қамтамасыз етеді. Ыстық бастаманы жүзеге асырудың әртүрлі нұсқалары да бар:
А) реакциялық қосындыға пробирканы денатурация температурасына дейін қыздырғаннан кейін алғашқы айналым кезінде Taq-полимеразаны енгізеді;
Ә) реакциялық қосындының құрамдарын қабаттарға бөлу, мәселен, парафин немесе воскты бөліктерге (астыңғыда-праймерлер, үстіңгіде- Taq-полимераза және ДНҚ-мишені) бөледі, олар қабат материалдарының еру температурасына жету барысында араласып кетеді. (~45-85°С);
Б) Taq-полимеразада моноклональды антиденелерді қолдану. Моноклональды антиденелермен байлансты ферменттер моноклаональды антиденелер қайтымсыз денатурленгенде және Taq-полимеразаның белсенді орталық сатысынан кейін ғана белсенді болады.
Барлық сипатталған жағдайларда, егер жанама күйдіру температуралық айналымның жүруі басталғанға дейін жүзеге асса, элонгация жүрмейді, ал кешенді қыздыру барысында ДНҚ-праймерлері денетурленеді, сондықтан да жанама өнімдер пайда болмайды. Ары қарай пробиркада температура еру температурасынан төмен болуын қамтамасыз етеді.
Жабдықпен қамтамасыз етілуі. Амплификация реакцияның жүруінің маңызды факторы жабдықталуды қамтамасыз ету болып табылады. Амплификатордың сенімділігімен температураларды ұстау дәлдігіген басқа, құрал-жабдықты әдеттегі қадағалау кезіндегіге қарағанда, біршама аз уақыт аралығында пробирка ішінде реакциялық қосындының қажетті температураға жетуге мүмкіндік береттін маңызды қасиетін ескеру қажет. Осыған байланысты реакция уақыты қысқарады (1,5-2 есе); Taq-полмераза белсенділігінің сақтау уақыты ұзарады, бұл амплификация айналымдарының саны көбеюіне мүмкіндік береді, ал праймерлердің жанама күйіп кету қауіпін төмендетуге, сәйкесінше, реакцияның сезімталдығы мен ерекшелігін жоғарлатуға мүмкіндік тудырады. [40, 23]
Мұндай топтың құралдарына амплификаторлардың РСР-Systm 2400 немесе Model 9600 (Perkin-Elmer, АҚШ) Touch Doun (HyBaid, Ұлыбритания ), РСР 200 (МJResearch, АҚШ), Терцик (НПФ ДНҚ-Технология, Ресей) деген модельдерін жатқысуға болады. Белсенді қадағалауы бар құралдарды қолданған кезде ПТР-пробиркалардын типін ескерту қажет және дайындаушы фирмалардың ұсынымдарына сай қолдану қажет. Бұл температураның өзгеруінің жоғарғы жылдамдығы орнаған кезде амплификатор ұяшықтарының құрылымындағы кішігірім өзгешеліктер мен ПТР-пробирканың конус пішінді белсенді қадағалау басымдылығын жоққа шығарып, жылулық байланыстың нашарлауымен байланысты температуралық қателіктер кесірінен реакцияның сезімталдығын төмендете алатындығымен түсіндіріледі.
РНҚ молекуласының амплификациясы. ПТР үшін РНҚ-ы мишень ретінде қолдану мүмкіндігі бұл әдісті қолданудың аясын мағаналы қеңейте түсті. Мысалы, көптеген вирустардың (С гепатиті, инфлюэнца вирусы, пикорнавирустар және т.б.) геномдары дәл РНҚ-ның өзінде ұсынылады. Олардың өміршендік айналымдарына ДНҚ-ға ауысудың аралық фазасы болмайды. РНҚ-ны анықтауда бірінші ретте оны ДНҚ пішініне ауыстыру қажет. Бұл үшін ферменттік қайтымды транскриптаза да қолданылады, оларды әртүрлі екі вирустардан бөліп шығарады: Avian myeloblastosis virus және Moloney murinebeukemia virus. Бұл ферменттерді пайдалану кейбір қиындықтармен байланысты. Ең алдымен, олар термолабильді және сондықтан да 42°С-танжоғары емес температурада пайдаланыла алады. Себебі, осындай температурада РНҚ молекулалар екінші құрылымды оңай құрайды, ал реакция тиімділігі және әртүрлі баға беру бойынша шамамен 5%-ға тең.
Бұл кемшілікті Мn2+ барысында транскриптазалық белсенділігін көрсететін Thermus Thermophilus термофильді микроағзасынан алынған термотұрақты полимеразаны қайтымды транскриптаза ретінде қолдана отырып, жою жолдарын жүзеге асыруда. Бұл политізбекті, транскриптазалық белсенділікті көрсетуге қабілетті жалғыз танымал фермент.
Қайтымды транскрипцияның реакциясын жүргізу үшін реакциялық қосындыда ПТР-дегі сияқты праймерлер улы заттар ретінде болуы шарт және 4 дНТФ қосындысы құрылыс материалы ретінде болуы керек.
Қайтымды транскрипция реакциясы жүргеннен кейін пайда болған молекулалар ДНҚ-ға ПТР жүргізу үшін мишень ретінде қызмет атқарады.
Детекция. ПТР-дің нәтижелерін дұрыс бағалау үшін берілген әдіс сандық болып табылмайтындығын түсіну маңызды. ДНҚ-мишенінің бірліктік молекулаларының амплификация өнімдері теориялық түрде электрофорез көмегі 30-35 айналымнан кейін анықталады. Дегенмен де, тәжірибе жүзінде бұл процесс тек реакцияның өмірде сирек кездесетін үлгіге жақын жағдайларында жүргенде ғана орындалады. Әсіресе, амплификацияның әсерлілігіне үлкен ықпалды ДНҚ препаратының тазалық деңгейі тигізеді, яғни реакциялық қосындыда сол немесе басқадай ингибиторлардың болуы, кейбір кездері олардан құтылу өте қиынға соқтырады. Кейде олардың құрамдық болуының кесірінен ДНҚ-мишенінің тіпті он мыңдаған молекулаларын амплифицирлеу жүзеге аспай жатады. Сонымен, ДНҚ-мишенінің соңғы саны мен амплификация өнімдерінің соңғы санының арасында тікелей байланыс жиі болмайды.
Көлденең электрофорез әдісі. Амплификация нәтижелерін көзбен көру үшін әртүрлі әдістер қолданылады. Бүгінгі таңдағы ең көп таралған әдіс ол электрофорез әдісі болып отыр, бұл әдіс ДНҚ молекулаларының өлшемі бойынша бөлуде негізделген. Ол үшін ДНҚ-нің арнайы бояғышын қосу арқылы 1,5-1,2% құрамындағы агарозының электрофорездік буферде балқуынан кейін қатқан агорозды ... жалғасы
Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.
Ұқсас жұмыстар
Пәндер
- Іс жүргізу
- Автоматтандыру, Техника
- Алғашқы әскери дайындық
- Астрономия
- Ауыл шаруашылығы
- Банк ісі
- Бизнесті бағалау
- Биология
- Бухгалтерлік іс
- Валеология
- Ветеринария
- География
- Геология, Геофизика, Геодезия
- Дін
- Ет, сүт, шарап өнімдері
- Жалпы тарих
- Жер кадастрі, Жылжымайтын мүлік
- Журналистика
- Информатика
- Кеден ісі
- Маркетинг
- Математика, Геометрия
- Медицина
- Мемлекеттік басқару
- Менеджмент
- Мұнай, Газ
- Мұрағат ісі
- Мәдениеттану
- ОБЖ (Основы безопасности жизнедеятельности)
- Педагогика
- Полиграфия
- Психология
- Салық
- Саясаттану
- Сақтандыру
- Сертификаттау, стандарттау
- Социология, Демография
- Спорт
- Статистика
- Тілтану, Филология
- Тарихи тұлғалар
- Тау-кен ісі
- Транспорт
- Туризм
- Физика
- Философия
- Халықаралық қатынастар
- Химия
- Экология, Қоршаған ортаны қорғау
- Экономика
- Экономикалық география
- Электротехника
- Қазақстан тарихы
- Қаржы
- Құрылыс
- Құқық, Криминалистика
- Әдебиет
- Өнер, музыка
- Өнеркәсіп, Өндіріс
Қазақ тілінде жазылған рефераттар, курстық жұмыстар, дипломдық жұмыстар бойынша біздің қор #1 болып табылады.
Ақпарат
Қосымша
Email: info@stud.kz