ДНҚ вакциналарын алу технологиясы

Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 25 бет
Таңдаулыға:

Мазмұны

Кіріспе

1 ДНҚ вакциналарын алу технологиясы
1.1 Вакциналар туралы жалпы түсінік
1.2 Вакциналар классификациясы
1.3 Рекомбинантты ДНК технологиясы негізіндегі жаңа буынды вакциналар

2 ДНҚ вакциналарын алудың негізгі бағыттары
2.1 Модификацияланған организмдерді алу технологиясының мазмұны
2.2 Рекомбинантты ДНҚ технологиясының механизмі

3 Микроорганизмдердің биотехнологиясы саласындағы ДНҚ вакциналарын алу технологиясының маңызы

Қорытынды
Пайдаланылған әдебиеттер

3

5
5
5

9

11

11
13

21

32
34

Кіріспе

Заманауи вакциналогияның негізі иммунитеттің жасушалық және молекулярлық механизмінің дамуын меңгеру болып табылады. Болашақтың вакциналарына мыналар жатады: генді инженериялық вакциналар, пептидті синтетикалық вакциналар, ДНҚ вакциналары, жаңа комплексті вакциналар, топтық және жеке вациналар , және т.б.
Организмге енгізілген вакцинаға иммунды жауаптың күшін болжау өте қиын. Иммунды жауап барлық антигендерге түзіледі, бірақ ол бір вакцинаға жақсы әсер беруі мүмкін, ал екінші вакцинаға әсері төмен болып иммунды жауап дұрыс түзілмейді. Міне сондықтан да иммунды жауапты алдан ала болжау қиындыққа соғады.
Рекомбинантты вакциналар. Генді инженериялық вакциналарды шығару тірі аттенуирленген вирус, бактерия, ашытқы немесе эукариот жасушалардың геномына вакцинаға бағытталған протективті антиген қоздырғышының кодталуын түзетін ген қойылады. Вакцина ретінде in vitro культивтрлеуде түзілген модификацияланған микроорганизмдер немесе протективті антигендер қолданылады.
Дайын антигеннен дайындалатын гепатитке қарсы В вакцинасы рекомбинанты вакцинаға мысал бола алады. Рекомбинанты өнімнің құрылымы табиғи антигендермен бірдей бола бермейді. Бұндай өнімнің иммуногендігі төмендетілуі мүмкін.
Бактериялық рекомбинанты вакциналарды шығару технологиясы жоғарыдағылармен ұқсас. Негізгі кезеңі токсикалық емес формадағы иммуногенді кодталатын антигендердің гендерін клондау болып табылады.
Қазіргі уақытта дифтерин, синектік таяқша токсині, сібір таяқшасының гендері клондалуда. Бактериялық вектордың тасығыштары ретінде БЦЖ, Vibrio cholerae, E. coli, Salmonella typhimurium қолданылады. Мысалы, E. сoli негізінде көптеген энтеральдық вакциналар шығарылды.
Гендік инженериялық вакциналардың мысалы ретінде көп компонентті диареялық инфекцияға қарсы вакцинаны келтіруге болады. Болашақта түрлі медиаторлы иммунды жауапты бақылайтын векторларды қолдану ұсынылып отыр.
Синтетикалық пептидті вакциналар. 1974 жылы алғаш рет М.Села жасанды жолмен пептидті алуды, яғни жұмыртқа лизоциміне антиденелердің түзілуін сипаттады. Белгілі бір жағдайларда синтетикалық пептидтердің иммуногендін құрылымы табиғи антигендермен бірдей болуы мүмкін. Жақсы иммунды жауапты тудыру үшін кем дегенде синтетикалық антигеннің құрамында сегіз амин қышқыл қалдығы болу керек, ал детерминантты антигеннің құрамына үш немесе төрт амин қышқылдары кіру мүмкін. Мұндай детерминанттың ең аз салмағы шамамен 4000 Д құрайды.
Биотехнолог ғалымдар келесідей жасанды антигендерді алды:
:: α - амин қышқылдарынан тұратын , линиялық полимерлер;
:: амин қышқылдары мен пептидті конъюгаттар, гомополимерлер;
:: полисахаридтер табиғи антигендермен ұқсас.
Курстық жұмыстың мақсаты - ДНҚ вакциналарын алу технологиясын анықтау. Осыған байланысты келесідей міндеттерді алдыма қойдым:
oo вакциналар туралы жалпы түсінік беру;
oo вакциналар классификациясын ажырату;
oo рекомбинантты ДНК технологиясы негізіндегі жаңа буынды вакциналар жасау технологисын тереңірек талдау;
oo модификацияланған организмдерді алу технологиясының мазмұнына тоқталу;
oo рекомбинантты ДНҚ технологиясының механизмін қарастыру;
oo микроорганизмдердің биотехнологиясы саласындағы ДНҚ вакциналарын алу технологиясының маңызын түсіндіру.

1 ДНҚ вакциналарын алу технологиясы
1.1 Вакциналар туралы жалпы түсінік

Вакциналар (Vaccines) - егілген адамдар мен жануарлар ағзасында белсенді иммунитет тудыруға арналған препараттар, яғни биологиялық препараттар болып табылып, ағзаға енгізгенде белгілі бір ауруға қарсы қорғаныстық иммунитетті индукциялайды. Әрбір вакцинаның негізгі әсерінің бастамасы иммуноген болады, яғни ауру қоздырушысының компоненттеріне ұқсас химиялық құрылымдарға ие болатын және иммунитет пайда болуына жауапты корпускулярлы немесе еріген субстанция.
Адамзат тіршілігінде соғыстар, экологиялық апаттар мен әлеуметтік-экономикалық дағдарыстар инфекцияның белсенуіне, көп жағдайда эпидемия мен пандемияға ұшыратады. Инфекционды ауруларды ликвидация мен төмендету шараларының негізгісінің бірі - вакцинопрофилактика болып табылады.
Вакциналар компоненттері. Вакциналар негізін қорғаныштық антигендер құрайды, яғни арнайы иммунды жауап дамуын қамтамасыз ететін бактериальды жасуша немесе вирустың кішігірім бөлшегінен тұрады. Қорғаныштық антигендер ақуыздар, гликопротеидтер, липополисахаридті ақуыздар бола алады. Олар микропты жасушалармен байланысты (көкжөтел таяқшасы, стрептококтар және т.б.), және олармен секрециялануы (бактериальды токсиндер) мүмкін, ал вирустарда вирионның суперкапсидінің беткейлік қабаттарында басым орналасады. Негізгі әрекеттесуші бастамамен қатар, вакцина құрамына басқа да компоненттер - сорбент, консервант, толтырғыш, стабилизатор, арнайы емес қоспалар ене алады [2].

1.2 Вакциналар классификациясы

Тірі вакциналар құрамында әлсізденген тірі микроорганизм (вирус, бактерия) болады, оның вируленттігі жоғалып, иммуногендігі сақталады. Тірі вакциналарды жасанды аттенуирлендіру арқылы алады (штаммды әлсіздендіру BCG -200-300 өт сорпасында егу, ЖВС жасыл маймыл бүйрегінің ұлпасында егу) немесе табиғи авирулентті штаммдарды іріктеу.
Тірі вакциналар қызылшаға қарсы (Рудивакс), қызамыққа қарсы (Рувакс), полиемиелитке қарсы (Полие Сэбин Веро), туберкулезге, паротитке қарсы (Имовакс Орейон). Полиемиелитке қарсы вакцинадан басқа, тірі вакциналар лиофилизацияланған күйде шығарылады.
Инактивацияланған немесе өлі вакциналарды микроорганизмге формалин, ацетон, фенол, жылу, УКС, ультрадыбыспен әсер ету арқылы алады. Мұндай вакциналар едәуір тұрақты әрі қауіпсіз болады, себебі вируленттілік реверсиясын тудыра алмайды, практикалық қолданыста ыңғайлы болатыны, олар суықта сақтауды талап етпейді. Алайда бұл вакциналардың жағымсыз жақтары болады да, олар әлсіз иммунитет тудырады және бірнеше егу мөлшерін қолдануды талап етеді (бустерлі иммунизация). Грипп, құтыру, жапон энцефалиті т.б. қарсы вакциналар жатады [3].
Бір инфекцияға қарсы моновакцина, екі инфекцияға қарсы дивакцина деп аталады, ассоциацияланған вакциналар түрлі микроп антигендері мен анатоксиндерінің қоспасы, мысалы АКДС [1].
Химиялық вакциналар адъювантпен байланысқан микроп клеткаларының антигендік комплектерінен тұрады. Адъювант арқылы вакцина иммуногендігі жоғарлайды және антигендік бөлшектер іріленеді. Адьюванттарға алюминий гидроксиді, минералды және органикалық майлар жатады [1].
Коньюгацияланған вакциналар. 1931 жылы карбогидрат пен бөтен белоктан коньюгат құрастырылды. В типті Haemophilis influenzae - ның капсулалы полисахаридін дифтерия немесе сіреспе анатоксинімен коньюгат жасағанда жедел антиденелер түзілу мен IgM-нің IgG- ге айналуы эксперементальды жануарларда байқалды, коньюгатты вакциналар иммуногендігі жоғары болады.
Суббірлікті вакциналар адекватты иммунды жауап тудыра алатын антиген фрагменттерінен тұрады.
Бактериальды полисахаридті вакциналар. 1881 жылы Л.Пастер бактерияларда ерекше құрылым-капсуланы анықтады. Қазіргі таңда стрептококтар, менингококтар, стафилококтар кіретін инкапсулалы бактериялар туысына жататын Streptococcus pneumaniae, Haemophilis influenzae, Escherichia coli және т.б.-дың көпфункциялы полисахаридті қабықшасы қызығушылық тудырады.
Анатоксиндерге негізделген вакциналар. Кейбір бактериальды инфекциялар қоздырғыштары токсиндер секрециялайтындықтан патогенді болады. Негізгі жетістігі - иммуногендігін сақтай отырып, бұл белоктардың детоксикациясының тәсілдерін табу, негізгі мысалы, дифтерия мен сіреспеге қарсы вакциналар. Ондай вакциналар микроп бөлшектерінен тұрады немесе гендік инженерлік жолмен лабораторияда алынған болады [3].
Рекомбинантты ДНК технологиясы негізіндегі жаңа буынды вакциналар. 20 ғасырдың биологиялық жаңалығы ДНҚ құрылымын және универсалдығын анықтау болып табылады. 70 - ші жылдары химерлі ДНҚ - лар, ДНҚ сегменттерін клондау, басқа клеткаға енгізу, енгізілген ДНҚ-ның керекті белок өндіруі ойлап табылды. Вирус немесе бактерия геномынан ДНҚ тізбектерінің селективті делециясы, бөтен ДНҚ-ға сегмент ДНҚ-ларды енгізу арқылы реципиент организмде иммунитет тудырып, химерлі енгізілген ДНҚ сегменттеріне жауап беруге арналған зерттеулер жасалды. Осындай аналогиялық ұзын тізбектерді де тірі аттенуирленген вирус немесе бактериальды вакциналар геномына енгізіп, векторда кодталған химерлі ДНҚ ақуыздарын синтездей алады. Гендік инженерия арқылы алынған вакциналар алу әдістің мәні: протективті антигендер синтезіне жауапты вирулентті микроорганизмнің гендерін басқа зиянсыз микроорганизм геномына енгізіп, оларды дақылдандырғанда керекті антигенді өндіріп, жинақтайды. Вирусты гепатит В-ға және ротавирусты инфекцияға қарсы вакцина мысал болады. Иммунды жауап тудыру үшін ДНҚ-ның өзін иммунизациялауға мүмкіндік туғызды, сонымен қатар пероральды белгіленетін иммуноген ретінде трансфицирленген өсімдіктер, прокариотты клеткалар, төменгі эукариотты клеткалар, сүткоректілердің клеткаларының трансфекциясын қолдану арқылы вакцина жасау ойлап табылды. Клеткалардың ДНК және кДНК трансфециясы процедурасында 3 түрлі клеткалар қолдананылады: прокариотттық, мысалы E.coli, төменгі эукариоттық, мысалы ашытқылар және сүткоректілердің линиялы немесе штамм түріндегі клеткалары. Таңдалған ДНК тізбегі автономды репликацияланатын векторға, яғни ротавирус немесе плазмидаға енгізіледі, сонда транформацияланған немесе трансфекцияланған клетка пайда болады.
Нуклеин қышқылдарының тізбектерінің селективті делециясы арқылы аттенуация. Арнайы ДНҚ сегменттерінің геномынан делециялану мүмкіндігі инфекциялық қоздырғыштар штамдарының аттенуациясын жасау практикасын өзгертті. Vibrio cholerae және Salmonella-дан иммуногендігін сақтай отырып, қоздырғышқа төмен вируленттік беру үшін, нуклеин қыщқылдарының негіздерінің тізбегінің селективті делециясы арқылы аттенуирленген препараттар жасалды [3].
Вакцинопрофилактиканың негізгі мақсатының бірі - тұрғындарды профилактикалық егулерге бағдар беріп, вакцина егудің кепілдемелері мен жанама әсерлері жайлы консультация беру.
Қазіргі таңдағы вакцинология актуальды мақсаты вакциналық препараттарды әрдайым жетілдіріп отыру.Вакцинацияны бақылайтын халықаралық ұйымдардың сарапшылары вакцина өндіруші барлық мемлекеттерде орындалатын эффективті вакциналардың критерийлерін бір қатарын құрастырды:
* қауіпсіздік
* вакциналар ауру мен өлім себебі болмау керек
* протективтік немесе қорғаныштық қасиеті
* патогеннің жабайы штаммы тудыратын аурулардан қорғау керек
* қорғаныштық иммунитетті сақтау, қолдау
* қорғаныштық нәтижесі бірнеше жыл сақталу керек
* бейтараптандыратын антиденелерді индукциялау
* протективті Т-жасушалардың индукциясы
* вакцинаның салыстырмалы төмен бағасы
* қолдану жеңілдігі
* нәтижесі кең болу керек
Дамыған және дамушы елдерде барлық жас топтары мен әлеуметтік топтар үшін вакцинация белсенді ұзақ өмір сүрудің ең тиімді, ең үнемді және қол жетерлік жолы. Вакцинопрофилактика бүкіл әлемде денсаулық сақтаудың негізгі құралы және негізгі құрал болып қалады [4].

1.3 Рекомбинантты ДНК технологиясы негізіндегі жаңа буынды вакциналар

Рекомбинантты ДНҚ технологиясын (РДТ) in vitro жағдайьшда әртүрлі ДНК молекулаларын, бөтен гендерін біріктіру технологиясын іске асырып, кейін реципиент организмде олардың репликациясын жүргізіп инженерия аясындағы жетістік деп сипаттауға болады. Рекомбинантты ДНҚ технологиясының тірі клеткада, in vivo жағдайында мутация және рекомбинация негізінде жүретін дәстүрлі клеткалық селекциядан айырмашылығы осында.
Екінші айтарлықтай айырмашылығы: РДТ - бұл мүлдем түрлі генетикалық материалдарды қосу және клондау (мысалы, прокариот және эукариот организмдер гендерін біріктіру). Ал дәстүрлік селекцияда бұл мүмкін емес. РДТ молекулалық биология, нуклеин қышқылдарының химиясы, гендік-инженерлік энзимология жетістіктері арқылы тұраралық, тінаралық тосқауылдарды жеңуге мүмкіндік береді.
Дәстүрлік селекция алдымен жаңа штаммпродуценттерді, осімдіктердің жаңа сортын, жануарлардың жаңа түқымын алуда белгілі нәтижелерге қол жеткізеді. Кейін алынған онімнің фенотиптік өзгерістеріне жауапты гендерді анықтауга зерттеулер жүргізеді. Ал РДТ алдымен генетикалық өзгерістердің багдарламасын жасайды, содан кейін өнімді алып фенотиптік қорытындысын жасайды.
Кейбір зерттеушілер РДТ гендік микрохирургия деп атайды, бірақ ол рестриктазалар мен лигаза ферменттері арқылы жүзеге асатын химиялық хирургия.
Сонымен қатар, РДТ - бұл дәстүрлік селекцияның жалғасы, мутантты организмдер алу кезінде мутация мен рекомбинация-ларды практика жүзінде қолдану нәтижелерініц анализі. Спонтанды және индуцияланған мутациялар, рекомбинацияның әр түрлі әдістері (конъюгация, трансформация), in vitro-дa ДНҚ рекомбинантты молекуласын жасау - мұның бәрі зерттеу нысаны ген болатын клеткалық және молекулалық генетиканың эволюциялық жетістіктері.
РДТ дәстүрлік селекция жетістіктерінен бас тартпайды, керісінше оған негізделеді.

2 ДНҚ вакциналарын алудың негізгі бағыттары

2.1 Модификацияланған организмдерді алу технологиясының мазмұны

Модификацияланған организмдерді алу технологиясын мазмұндаудан бұрын клеткадағы генетикалық ақпараттьң сақталу және берілу механизмдеріне тоқталған жөн және прокариот пен эукариот организмдер арасындағы айырмашылықтарды атап өткен жөн.
Бактериалық клетка геномы жалғыз хромосомасында (95-98%) және плазмидасында (2-5%) орналасқан. Тіршілік үшін маңызды генетикалық ақпараттың басым бөлігі хромосомада жиналған суперспиралданған ДНҚ молекуласы ретінде берілген. ДНҚ екі спиральдан тұрады, олардың әр қайсысы белгілі нуклеотидтер (аденин, тимин, гуанин, цитозин) тізбегінен тұрады. Бұл негіздер комплементарлы: бір тізбектің аденині келесі тізбектегі тиминмен, ал гуанин цитозинмен жұп құрайды. Негіздердің миллиондаған жүптары ген құрылымын қалыптастырады (бір құрылымдық генде мыңға жуық негіздер жұбы), соңғылары ақуыз синтезін кодтайды. Құрылымдық гендерге жанасқан негіздер тізбегі - бұл гендердің клеткада - матрицалық РНҚ синтезінің және трансляцияның -мРНҚ-ны рибосомалардағы матрица ретінде қолданумен ақуыз түзілуі экспрессиясын бақылауды жүзеге асырады.
Транскрипция промотор және терминатормен реттеледі. Промотор - бұл РНҚ-полимераза ферментімен тығыз байланысатын ДНҚ-ның қысқа фрагменті. Ол ферменттің ДНҚ-матрицасы бойымен қозғалуына ықпал жасайды да, құрылымдық ген басының алдында орналасқан ДНҚ-ның кодтаушы тізбегінің нүктесінде транскрипция процесін инициациялайды. ДНҚ-ның терминатор деген болігі құрылымдық ген соңында орналасып, транскрипция аяқталуының сигналы болып табылады. Промотор мен құрылымдық ген аралығында ДНҚ-ның оператор деген тагы бір бөлігі орналасқан. Ол клеткада метаболизмнің артық концентрациясы жиналғанда арнайы ақуыз-репрессормен байланысып, транскрипция процесін тоқтатады.
Рибосомадағы ақуыз трансляциясын реттеуін мРНҚ түзілуі кезінде транскрипцияланған басқа тізбектер жүзеге асырады. Рибосомалардың мРНҚ-ның рибосомамен байланысуына жауапты арнайы бөлігіне жалғасуының арқасында трансляция старттық сигналдан - кұрылымдық геннің бірінші кодонынан басталады. Ген соңындағы "стоп кодон" синтезделетін ақуыздық молекуланың толықтай босануына жағдай жасайды. Кодтаушы бөліктегі өзгерулер ферменттің амин қышқылдық тізбегін өзгертіп, оның бел-сенділігіне эсер етуі мүмкін. Промотор тізбектеріндегі аз ғана өзгерулер оның РНҚ-полимеразамен байланысу мүмкіншілігін арттырып транскрипцияны жылдамдатуы мүмкін. Оператор мен ген-реттеуші аймағындағы мутация репрессордың байланысуына кедергі жасау мүмкін. Нәтижесінде транскрипция нәтижелігін арттырады. Басқа организмдерге көшірілген тендер промотор мен рибосомамен байланысу аймағы құрылымдық бойынша сәйкес келсе, экспрессияланады.
Генетикалық код және транскрипция мен трансляцияның негізгі биохимиялық реакциялары прокариоттық және эукариоттық клеткаларда "бірдей. Бірақ, эукариоттардың құрылымдық гендерінде кодтаушы аймақтар (экзондар) арасында кодтамайтын аймақтар − интрондар орналасқан. Интрондар экзондармен бірге транскрипцияланады, бірақ экспрессияланбайды.
Интрондарды қиып тастап экзондарды біріктіру процесі сплайсинг деп аталады. Сплайсинг нәтижесінде жетілген мРНҚ түзіледі. Одан белок трансляцияланады. Интрондардың болуы прокариоттык клеткаларда рекомбинанттық ДНҚ экспрессиясын қиындатады. Өйткені бактерияларда сплайсинг процесін жүргізетін ферменттер жоқ. Табиғи эукариоттық ген прокариоттық жүйеде экспрессиялану үшін алдын-ала интрондардан босатылу керек. мРНҚ-ға кері тарнскриптаза ферменті көмегімен ДНҚ-ң комплёментарлы тізбегі (кДНҚ) репликацияланады. Кейін ДНҚ-полимераза ферменті арқылы ДНҚ-ның екінші тізбегі түзіледі. Бөтен ген осылайша клеткареципиентте экспрессияланады.
Вирустардың, прокариоттық клетка геномы құрылымы бойынша өсімдіктер мен жануарлар геномдарымен салыстырғанда қарапайым, өте күрделі емес. Сондықтан, гендік инженерияда вирустар немесе бактериялар гендерін қолданғанда оларды бөліп алу айтарлықтай қиындықтар тудырмайды. Ал адам организмінің көптеген тендер жинағы арасынан керекті генді табу мен бөліп алу өте қиын. Сондыктан эукариоттық клеткада керекті геннен транскрипцияланған мРНҚ идентификациялау жүргізу жеңілірек. Жануарлар клеткаларында мРНҚ транскрипииясы клеткалық ядрода жүзеге асады; ядродан цитоплазмаға генетикалық ақпаратты матрицалық РНҚ тасымалдайды, рибосомаларда ақуыз трансляциясы жүріп жатады. Прокариотты клеткаларда қалыптасқан ядролары болмайды, транскрипция және трансляция үрдістері параллель жүріп отырады, ал мРНҚ тура рибосомалармен байланысады.
Жоғарыда айтылған транскрипция және трансляция үрдістерінің кейбір ерекшеліктері, генетикалың ақпараттың іске асу механизмі негізінде рекомбинантты ДНҚ технологиясы жатады.

2.2 Рекомбинантты ДНҚ технологиясының механизмі

Рекомбинантты ДНҚ технологиясы келесіде: алдымен донор клет-касынан нативті ДНҚ бөліп алынады (клонданатын ДНҚ, енетін ДНҚ, ДНҚ-нысана, бөтен ДНҚ), кейін рестриктаза ферменті көмегімен белгіленген сайтта ажыратады және босатылған генді (тендер) лигаза ферменті қатысуымен ДНҚ тасымалдайтын вектормен байланыстырады (клонданатын вектор), яғни in vitro рекомбинантты ДНҚ молекуласын алуға болады (1, 2-суреттер.).
Осылай конструкцияланған рекомбинантты ДНҚ реципиент клеткасына енгізеді.
Бірінші этап - баска организмге тасымалдайтын генді (гендер ді) бөліп алу: а) донор ДНҚ-нан оны рестрикциялау, белгілі нуклеоидты катары бар ДНҚ бөліктің эндонуклеаза рестрикциялайтын ферментімен кесіп алу. Осы кезде ДНҚ екі спиральді жібі жазылатын жағынай ыдырайды, "табалдырық" пайда болады - ДНҚ бір жібі бірнеше нуклеотидтерге бөлінеді. Бір жіпті (жабысқақ) шеттері пайда болады. Егер бір түрлі рестриктаза бөлген 2 жабысқақ ДНҚ фрагменті кездесетін болса, қатарлар шеттері комплементарлы болғандықтан жеңіл бір-бірімен өзара байланысады.

Шеті жабысқақ нуклеотидті қатар болуы мүмкін:
1) алғашында сол рестриктазамен өнделген вектормен қосылады және
2) сызықты молекуладан комплементарлы шеттерін өзара байланыстыра тігіп, сақиналы түрге ауыстыру. Бірақ, бұл процедура қиын емес, егер бірнеше мың тендер бар бактериялар туралы немесе бірнеше ондық гендері бар вирустар туралы сөз болса. Ал жануарлар клеткасы геномынан (бірнеше миллиондаған гендері бар) нақты мақсатты генді бөліп алуға болады:
б) қысқа тізбекті ДНҚ фрагменттерінің (олигонуклеотидтерін) химиялық синтезі әдісін қолданып, нуклеотидтер арасында эфирлі байланыстар түзілген соң ДНҚ лигаза көмегімен олигонуклеотидтер бір-бірімен тігіліп тізбекті полинуклеотидтерді алу;

1-сурет. Streptomyces рекомбинанттық штамдарының трансформациясы мен сұрыптау үлгісі. Трансформацияланған клеткалар қара, трансформацияланбағандар ақ түспен белгілеген. ПЭГ - полиэтиленгликоль.

2-сурет. Рекомбинанттық ДНҚ-ны клондау.

в) донор клеткасынан ДНҚ фрагменті емес, одан транскрипцияланған мРНҚ бөліп алу - бұл жиі қолданатын әдіс. мРНҚ негізінде кері траскриптаза ферменті (ревертаза) көмегімен комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) жібі синтезделінеді, әрі қарай ДНҚ-полимераза ферменті қатысуымен кДНҚ екінші жібі құрастырылады; сөйтіп басқа организмге тасымалдайтын ген алынады.
Екінші этап. Донор клеткасынан бөлінген ген нақты құрылымды ақуыз туралы информацияға ие, бірақ өз бетімен клетка-реципиентте іске асыра алмайды. Осы жаңа генді баска организмдерге ендіріп және оның репликациясын қамтамасыз ететін қосымша ДНҚ молекуласы қажет. Осындай генетикалық ақпаратты тасымалдаушысы (вектор) ретінде плазмидалар, жануарлар вирустары мен бактериофагтарды қолдануға болады. Трансгенді өсімдіктер алуына қолданатын типті вектор Agrobacterium tumefaciens топырақ бактериясынан бөлінген Ті-плазмида. Agrobacterium tumefaciens бактериясымен өсімдіктер симбиозды өзара қарым-қатынасқа түседі, Ті-плазмида өсімдік клеткасына трансформациясы барысында "тамырлық жаңғақша - корончатый галл" ауруын тудыратын Т-ДНҚ геномын ендіреді (3-сурет).
Трансформаланған өсімдік клетка
Agrobacterium
tumefaciens
Тамырлық жаңғақша
Т-ДНҚ
Хромосома
Т-ДНҚ

3 - сурет. Өсімдік хромосомаларымен Т-ДНҚ-ның интеграциясы және тамырлық жаңғақша ісігінің түзелуі (Э.С. Перузян).

Алдымен бөліп алган генді вектормен қосу in vitro пробиркада жүргізіледі, вектордың сақиналы молекуласын рестриктазамен кеседі, "жабысқақ" шеттері пайда болады, оларға лигаза көмегімен ауыстырылатын геннің "жабысқақ" шетімен біріктіреді. Осылай рекомбинантты ДНҚ конструкциясы жасалынады, оны әрі қарай реципиент клеткасына ендіреді.
Нысаналы генді тасымалдау қабілеттілігімен қоса векторда генетикалық маркерлер болуға тиісті (жиі бұл нақты антибиотиктерге төзімділік - оны селективті қоректік ортаға себу қорытындысы бойынша анықтайды), онда рестрикция сайттарының саны көп болуға тиісті (спецификалық рестриктазамен кесіп алатьш вектордың ДНҚ сақиналы молекуласының бөліктері). Векторда репликацияны бастайтын бөлік - "оrі" болуы тиіс. Айта кету керек, өкінішке орай плазмидалар вектордың барлық белгілерін үстанбайды, сондықтан оларға алдын-ала жоспарланған қасиетті конструкциялайды.
Дегенмен, вектор ретінде плазмидаларды жиі қолдануы олардың жоғары коньюгативтілігінде (реципиент клеткасына ену қабілеттілігі). Олар бактериялар клеткасыньң табиғи құрылымдық компоненті, цитоплазмада ДНҚ сақиналы молекуласы түрінде орналасады. Автономды репликацияланады, себебі оның құрамында репликацияны бастайтын сайты (ori) бар, бактериялардың зат алмасуына қатысады, фенотиптік ондай-мұндай белгілерін айқындатады.
Үшінші этап. Конструкцияланған рекомбинантты ДНҚ реципиент клеткасына ендіреді, тұрақты қадағаланады, яғни репликацияланып келесі үрпақтарына ауысып отырады. Трансформацияның нәтижелілігі реципиент клеткасының компетенттілігіне, вектордың экспрессиялаушы белсенділіге, донор мен реципиенттің генетикалық материалы туысты жақындықта болуына тәуелді.
Клеткада рекомбинантты ДНҚ жақсы трансформациялануы үшін протопласт алынады, реципиент клеткасына жылумен әсер етеді, клетка мембранасы еткізгіштігін жоғарлату үшін СаСl2 ерітіндісі қосылады. Экспериментте байғалған. 1000 клеткалардан трансформацияға 1-2 клетка ұшырайды. Одан кейін осы клеткалардағы ендірілген рекомбинантты ДНҚ клетка-иесі рестриктазаларынан қорғау керек, олар бөтен ДНҚ деградацияға ұшыратып, ыдыратуы мүмкін.
Клеткаға рекомбинантты ДНҚ ендірілген соң оның экспрессиясы жүреді (транскрипция және трансляция). Микробтық клеткаға енген бөтен геннің транскрипциясы жүреді, егер осы ген алдында клетка-иесінің РНҚ-полимеразаны танитын күшті промотор болған жағдайда ғана. РНҚ полимераза транскрипцияны детерми-нациялайды, ал мРНК рибосомада бөтен ақуыздың синтезін трансляциялайды. Осы жерде де синтезделетін ақуыз клетканың протеазаларымен бедсенді деградацияға ұшырамауын қадағалау қажет, яғни клондалған клеткаларда соңғыларды тежеу міндетті.
Айтарлықтай өзекті мәселелеріне жатады - модификацияланған микроорганизмдер клонын тұрақтандыру қиыншылығы, себебі микроорганизмдер үрпақтан келесі үрпақка ауысып отырғанда кейбір клондар рекомбинантты гендері бар плазмидалардан айырылып қалады. Осындай плазмидалары жоқ клеткалар плазмидасы барларымен салыстырғанда өте жылдам өседі, көбейеді. Соңында популяцияда плазмидасыз микроорганизмдер варианттары басым болады.
Рекомбинантты ДНҚ технологиясының мақсатын көрсететін түрлі анықтамалар бар, соның бірі "химиялық микрохирургияға" теңестіру, онда микроскальпель ретінде келесі топтағы ферменттер технологияны жүзеге асырады:
- ДНҚ молекуласын белгілі сайттарда ұсақ фрагменттерге бөлетін ферменттер. Рестрикциялайтын эндонуклеазалардың үш типі анықталған (I, II, III). Генетикалық инженерияда негізінен II типтегі рестриктазалар қолданады, себебі олар нуклеотидтік қатардың нақты қажетті бөліктің ДНҚ танып, оны ажыратады; әрі қарай оны кесіп "жабысқақ" шеттерімен вектор ДНҚ біріктіреді. Танып алу және боліп алу сайттары бойынша рестриктазалардың спецификасы күшті, бірнеше жүздері анықталған;
- мРНҚ-да комплементарлы ДНҚ жібін (кДНҚ) синтездейтін фермент, РНҚ-тәуелді ДНҚ-полимераза немесе ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.