ПТР компоненттерінің рөлі

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

Жоспар:
І. Кіріспе
ІІ. Негізгі бөлімі
2.1. Жалпы ПТР әдісінің жүруі
2.2. ПТР компоненттерінің рөлі
III. Қорытынды
IV. Пайдаланылған әдебиеттер

І. Кіріспе
Полимеразды тізбекті реакция (PCR, ПТР) молекулалық биология әдісі болып табылады, ол түпнұсқалық үлгідегі ДНҚ-ның белгілі бір фрагменті көшірмесін жасауға мүмкіндік береді, оның құрамындағы үлгіні бірнеше рет реттейді. Тұқым қуалайтын аурулар мен инфекцияларды тез және тиімді диагностикалауға мүмкіндік беріледі, қылмыскерлердің біреуін бір шашты анықтайды және гендерді еркін басқарады. Егер бұл бірегей әдіс болмаса, адамзат ген терапиясының дәуірінде болмас еді.
1957 жылы американдық Артур Корнберг Escherichia Coli бактерияларынан ДНҚ-полимераза ферментін бөліп алған. 1971 жылы норвегиялық Хьелль Клеппе Journal of Molecular Biology журналында ПТР-ге өте ұқсас әдісті сипаттап жарияланған және 1976 жылы АҚШ-тың ғалымдары Эллис Чиен, Дэвид Эдгар және Джон Трела - Thermus aquaticus бактериясынан термостабилді ДНҚ-полимеразаны анықталды және оны Так полимераз деп атады. 1977 жылы ағылшын Фредерик Сенгер секвенирования ДНК әдісі ұсынылған. 1983 жылы американдық ғалым Кэри Myullis ойлап және ПТР әдісін сынақтан. ПТР циклының бірінші прототипі Цикл 1987 жылы компания Cetus ПТР әдісі патентiн алды, 1985 жылы пайда болды. Компания Taq-полимераза бар Cetus ПТР патентiн алды. 1991 жылы, ПТР әдісі және 1993 жылы 1992 жылы $ 300 млн Хоффман La Roche сатып Taq-полимераза, полимеразды тізбекті реакция, профессор негізін қалаушы пайдалану құқықтары -. Carey Myullis [12] ПТР өнертабыс химия бойынша Нобель сыйлығын жеңіп алды.
Біз екі құрылымдар тиісті астар байланысты, толық метражды матрицалық тізбек бар, олардың әрқайсысы, салқындату кейін алынды деп күтуге болады: ДНҚ-полимераза арқылы Kleppe Khorana және арнайы жөндеу идентификатор ынтымақтастықта жазбаша бап мынадай жолдар қамтылған. Репаративтік репликация процесін аяқтау үшін ДНК полимеразы қосылуы керек. Нәтижесінде бастапқы дуплекстің екі молекуласы бар. Циклды қайталауға болады, әр кезде ферменттің жаңа бөлігін қосады. Өкінішке орай, бұл гипотеза әлі күнге дейін гипотеза болып табылады. Мүмкін Kleppe тіпті кейбір эксперименттер жүргізді, бірақ нәтижелерді жарияламады.
Cetus Корпорацияда ДНК синтезі зертханасының (АҚШ) Carey Myullis сәуір түнде (1983) басшысы өз елі үйінде, Сан-Франциско жылғы шақтар Мендосино жағалауының бойымен кеткен. Үш сағаттық ұзақ жол, ол демалыс емес болып саналады, және секвенирования ДНК бойынша алдағы эксперимент. Ал содан кейін (Myullisa сәйкес) оған түсінді: ол анық кейінірек полимеразды тізбекті реакцияны аталды Ген (толықтыру) күшейту процесін, ұсынылған .

ІІ. Негізгі бөлімі
ДНҚ тізбегін жасанды бөлу. ПТР әдісі, сондай-ақ ДНҚ-ның репликациясының табиғи процесі ДНҚ полимераз ферментінің жұмысына негізделген. ДНК полимеразының жаңа тізбектерді синтездеуді бастау үшін, ең алдымен, матрицаның бастапқы ДНҚ тізбектерінің азот негіздері арасындағы сутегі байланыстарын бұзу қажет. Біз білетініміздей, тірі ағзалардың жасушаларында бұл процесс ақуыздар мен ферменттер кешенімен жүзеге асырылады. In vitro (in vitro) ДНК тізбектерін бөліп алу үшін, мысалы, жоғары температура, жоғары рН, органикалық еріткіштер, несепнәр, төмен тұз деңгейлері және т.б. үшін әртүрлі физикалық-химиялық факторларды қолдануға болады.
Мысалы, температура 90-95 ° C дейін көтерілгенде, барлық сутегі байланыстары жойылып, тізбектердің толық ажыратылуына алып келеді. ДНҚ тізбектері өздерінің бастапқы құрылымын өзгертпейді, бірақ ДНК полимеразы жұмысына қол жетімді болады. ДНҚ тізбектеріндегі бұл процесс ДНҚ-ның денатурациясы немесе балқу деп аталады. Тізбектің температурасы төмендеген кезде ДНҚ бастапқы құрылымды қалпына келтіре бастайды. Бұл тізбекті қайта өңдеу процесі ДНҚ-ны ренатациялау немесе жаулап алу деп атайды. ДНК-ны ортаны температурасы өзгеруімен денатурациялау-ренатурациялау қабілеті ПТР әдісін жасаудың басты элементі болды.
Күшейтудің кезеңдері. Осылайша, ПТР-ның бірінші кезеңі барлық ДНК молекулаларының бөлінуі үшін платформаны 92-95 ° C дейін сынақ түтіктерімен жылытады. Бұл кезең ДНҚ алдын-ала денатурация деп аталады және әдетте 23 минутқа созылады. Осыдан кейін күшейту сатысы үш кезеңнен тұратын тікелей басталады: ДНК денатурация, праймерлердің жыртылуы және созылу, 3040 рет қайталанады (циклдар).
Бірінші цикл барысында келесі жағдайлар орын алады:
ДНҚ-ны тексеру. Бағдарламаға сәйкес жылу циклді платформасы 92-95 ° C температураға дейінгі сынақ құбырларымен жылытылады.

Бұл температурада матрицаның ДНК-нің азот негіздері арасындағы сутегі байланысы бұзылады және тізбектер бір-бірінен бөлінеді.
Праймерлердің жануы. Сонымен қатар, құрылғы температураны 55-65 ° C дейін төмендетеді және renaturing процесін бастайды, яғни ДНК тізбектері арасындағы сутегі байланыстарын қалпына келтіру. Дегенмен, реакциялық қоспада көп мөлшерде кездесетін алға және кері праймерлер тез үлгідегі ДНҚ-ның қосымша аймақтарын тауып, ДНҚ байланысы алдында оларды байланыстырады.

Жаңа ДНҚ тізбегін кеңейту. Құрал сынақ түтіктерінің температурасын 72 ° C дейін көтереді, бұл Так полимераз ферменттерінің белсенділігі үшін оңтайлы болып табылады.

Сынақ түтіктеріндегі Так полимеразы молекулалары алға және артқа праймерлердің 3 'ұшына бекітіліп, түпнұсқа ДНҚ матрицасының 5' соңына қарай қозғалатын жаңа ДНҚ тізбегін синтездей бастайды. Сонымен бірге жаңа ДНҚ молекулалары күтілгендей 5 '-- 3' бағытта синтезделеді. Бұл жаңа ДНҚ тізбектері ұзын матрицалар деп аталады.
Термиялық сикслер қайтадан температураны 92-95 ° C дейін көтереді. Бұл жағдайда матрицаның барлық түпнұсқалық ДНҚы және жаңа синтезделген ұзақ матрицалар жеке тізбектерге бөлінеді. Температура 55-65 ° C дейін төмендеген кезде, праймерлер бастапқы ДНҚ матрицалары ғана емес, сондай-ақ ұзақ матрицалар сияқты тиісті қосымша тізбектерге қосылады. Температура 72 ° C дейін көтерілгенде, Так полимеразы жаңа ДНҚ тізбегін синтездей бастайды. Бұл жағдайда түпнұсқалық ДНҚ матрицасында жаңа ұзын матрица синтезделеді, ал ұзын матрицада қысқа өнім қысқа матрица деп синтезделеді. Бұл ПТР-ның мақсатты өнімі болып табылатын қысқа матрицалар. Күшейту өнімі ампликондар деп аталады. Көріп отырғанымыздай, ДНҚ күшейту тізбекті реакция сипатына ие: түпнұсқа ДНҚ матрицаларына негізделген синтез нәтижесінде алынған ампликон, жаңа ампликонды синтездеу үшін матрицаға айналады. Сондықтан бұл процесс полимеразды тізбекті реакция деп аталды.
Күшейтудің 25-30 циклі бойынша сынақ түтіктерінде миллиондаған ампликондар бар, бұл гель электрофорезі арқылы әрі қарай талдау үшін жеткілікті. Дегенмен, белгілі бір циклде (шамамен 3040) күшейту тиімділігі төмендейді және ПТР өнімдерінің экспоненциалды өсу қисықтары плато сатысына көшеді. Бұл сынақ түтіктер еркін нуклеотидтер мен праймерлердің қорларын, сондай-ақ ДНҚ полимераз молекулаларының температуралық зақымдануын төмендетеді.
ДНҚ матрицасы зерттеудің нысаны болып табылады, яғни биологиялық материалдан (қан, тін, бактериялық мәдениет және т.б.) оқшауланған ДНҚ үлгісі. Олар хромосомалар, нуклеоидтар, плазмидтер немесе тірі ағзалардың әртүрлі түрлерінің генетикалық материал қоспасы болуы мүмкін. ДНК ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.