Апикальды меристемаларды криосақтау

Жұмыс түрі: Курстық жұмыс
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 33 бет
Таңдаулыға:

ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫҢ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТРЛІГІ

ӘЛ-ФАРАБИ АТЫНДАҒЫ ҚАЗАҚ ҰЛТТЫҚ УНИВЕРСИТЕТІ

Биология факультеті

Генетика және молекулалық биология кафедрасы

Бітіру жұмысы

Алма гермоплазмасының криогенді коллекциясын жасау

Алматы - 2010
МАЗМҰНЫ

КІРІСПЕ 3
1. НЕГІЗГІ БӨЛІМ 4-29
1.1 Әдебиетке шолу 4-18
1.1.1 Криобиологияның дамуы 4-5
1.1.2 Өсімдік материалын криосақтаудың ерекшеліктері 5-6
1.1.3 Өсімдік клеткаларының төмен температураларға бейімделу
жолдары 6-8
1.1.4 Криосақтаудың негізгі сатылары 8-14
1.1.5 Сұйық азотта сақтау 14
1.1.6 Еріту, криопротектордан тазарту және өсімдіктердің регенерациясы
14
1.1.7 Криосақталған гермоплазманы бағалау әдістері 15
1.1.8 Алма гермоплазмасын криосақтау 15-16
1.1.9 Генетикалық ресурстарды сақтау үшін криоcақтау әдістерін
пайдалану 17-18
1.2. Материалдар мен әдістер 19-23
1.2.1 In vitro жағдайына енгізу 19
1.2.2 Эксланттарды Viss ортаға тексеру 19-20
1.2.3 In vitro өсімдіктерді микроклональды көбейту 20
1.2.4 Апикальды меристемаларды бөліп алу 20
1.2.5 Апикальды меристемаларды криосақтау
20-23
1.3 Нәтижелер мен оларды талқылау 24-29
1.3.1 Aлманың апикальды меристемарын бөліп алу әдісін жетілдіру
24
1.3.2 Алма меристемаларын криосақтау әдісінің оптимизациясы
25
1.3.3 Алма гермоплазмасының коллекциясын жасау 25-29
ҚОРЫТЫНДЫ 30
ПАЙДАЛАНЫЛҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ 31-33

КІРІСПЕ

Жемісті культураларды генетикалық жақсартудың негізгі шарттарының бірі
– шаруашылыққа құнды белгілерге ие өсімдіктердің жабайы формалары мен
мәдени түрлерінің генофондын сақтау болып табылады. Қазіргі кезде
өсімдіктердің генетикалық материалын сақтаудың бірнеше тәсілі бар. Бәрінен
бұрын, бұл далалық гендер банкі мен помологиялық коллекциялар.
Әлемдік практикада генетикалық материалды сақтаудың дәстүрлі формаларын
толықтыру ретінде баяу жүретін метаболизмді қамтамасыз ететін, гермоплазма
үлгілерін in vitro криоконсервациялаудың биоинженерлі әдістері кең
қолданылады.
Криоконсервацияның артықшылықтары: егу аудандарын үнемдеу, вирустар мен
патогенді микроорганизмдерден таза өсімдік алу, көбею коэффициентін мың есе
арттыру, сирек кездесетін және жоғалып бара жатқан өсімдіктердің сорттары
мен формаларының генофондын ұзақ уақыт сақтау мүмкіндігі [1].
Криосақтау – бұл өсімдік ұлпаларын, мүшелерін және клеткаларын терең
мұздату және өте төмен температурада сақтау әдісі (-1960C). Бұл
обьектілердің генетикалық сипаттамаларын кез келген мерзімде сақталуына
мүмкіндік береді. Бұл әдіс арқылы әр түрлі материалдарды, бөліп алынған
протопласттардан бастап ұрық пен тұқымдарға дейін сақтауға болады [2].
Жұмыстың мақсаты алманың селекциялық құнды сорттары мен формаларының
криогенді коллекциясын жасау және алма гермоплазмасын сұйық азотта сақтау
ұзақтығының әсерін анықтау болып табылады.
Міндеттері:
- пробиркалық өсімдіктердің апикальды меристемаларын бөліп алу және
культивирлеудің әдістемелерін жетілдіру;
- алма меристемаларын криосақтау әдісінің оптимизациясы;
- алма гермоплазмасының коллекциясын жасау.

1. НЕГІЗГІ БӨЛІМ

1.1 Әдебиетке шолу

1.1.1 Криобиологияның дамуы

Өсірілетін материалды сақтаудың ең тиімді және сенімді әдістері
криогенді әдістер болып табылады. Температура өте қатты төмендегенде, яғни
материал мұздағанда, зат алмасу толық тоқтап, сақтау кезінде молекулаларда
айтарлықтай физико-химиялық өзгерістер болмайды [1,2].
Өсімдік клеткаларын сақтаудың криогенді әдістері өткен ғасырдың
алпысыншы жылдарында жасала бастады, алайда 1905 жылы-ақ сұйық азотта
тұқымдар мұздатылған. Өсімдіктердің суыққа төзімділігін зерттеуді 1908 жылы
академик Н.А.Максимов бастаған [3].
Клеткалық және ұлпа культураларын ең алғаш 30 жыл бұрын мұздата
бастады. Бұл жұмыстарды И.И.Туманов, Р.Г.Бутенко мен И.В.Оголевец жемісті
дақылдардың каллустарымен жүргізді [4]. Каллустарды сұйық азот
температурасына дейін мұздату мүмкіндігін А.Сакаи мен И.Сугавара терек
ұлпасында, М.Такучи маршанция ұлпасында көрсетті [5]. Бұл жұмыстарда
каллустарды алдын-ала шынықтырып, қант мөлшері көп орталарда өсірді.
Суспензиялы культураларды зерттеуді Кватран зығыр клеткаларынан бастап,
Латто, И.Сугавара, А.Сакаи мен Б.Финкль сәбіз, темекі, т.б.өсімдіктермен
жалғастырды [3]. Б.Финкль мен Дж.Ульрих криопротекторлардың әр түрлі
қатынасын пайдаланып, қант қамысының суспензиялы және каллус клеткалары
культурасын сәтті мұздатуға қол жеткізді [6].
Қазіргі кезде әр түрлі жеміс-жидекті дақылдардың меристемаларын
криоконсервациялау әдістерін жетілдіру жұмыстары жүргізілуде. АҚШ-та
криоконсервация бұрыннан бері жеміс-жидекті дақылдар мен жүзімнің
генетикалық материалын сақтаудағы негізгі әдіс болып табылады. АҚШ-та
өсімдіктер гермоплазмасын сақтаудың Ұлттық жүйесі құрылған. Мұнда 1983
жылдан бері суықта сақтау, ал 1987 жылдан бері криосақтау әдістері
қолданылады.
Қазақстанда криосақтау бағытындағы жұмыстар 2002 жылдан бастап Ұлттық
Ғылым Академиясының академигі, профессор И.Р.Рахимбаевтың жетекшілігімен
Өсімдіктер физиологиясы, генетикасы және биоинженериясы институтында
жүргізіле бастады [7,8].
Ресейдің Қиыр Шығысының 5 регионында өсетін өсімдіктердің 33
тұқымдасының 103 түрінің тұқымдарының криотөзімділігі зерттелген.
Зерттелген түрлердің тұқымдарының 89,1%-ның криосақтау процесінде тіршілік
қабілеті төмендемегені анықталды. Тұқымдардың төмен температураға жауап
реакциясының популяция аралық өзгергіштігі алты түр үшін анықталды. Терең
анабиозды тудыратын сұйық азотта тұқымдарды мұздату – оларды ұзақ уақыт
сақтау режимі ретінде қолданылуы мүмкін. Генетикалық әртүрлілікті популяция
деңгейінде алдын-ала бағалау түр генофондының мобилизациясын жүргізуге
мүмкіндік береді. Алынған нәтижелер жабайы өсетін флораны сақтау және
табиғи ресурстарды қалпына келтіру мақсатымен тұқымдар банкін жасауда
маңызды саты болып табылады [9].

1.1.2 Өсімдік материалын криосақтаудың ерекшеліктері

Қазіргі кезде клетка ұлпалары мен мүшелерді терең мұздату медицина мен
мал шаруашылығында кең қолданылуда. Криосақтаудың қиыншылықтары өсімдік
клеткаларының ерекшеліктерімен байланысты: өлшемі үлкен, вакуольдерінің
болуы, судың көп мөлшері. Мұздату және қайта ерітіп алу кезінде
клеткалардың осы ерекшеліктері арқасында клетка мембраналары күшті
зақымдалады. Мұздату кезінде клетканың өлуі бірнеше себеппен болады.
Клеткалардың зақымдалуы клетка ішінде де, сыртында да мұз кристалдарының
түзілуімен байланысты. Мұз кристалдары алдымен клетка сыртындағы
ерітіндіде, яғни клетка сыртындағы кеңістікте пайда болады. Цитоплазманың
қату нүктесі -10C, алайда клеткалар -100C-150C-қа дейін қатпайды, өйткені
плазмалемма клетка сыртында түзіліп жатқан мұз кристалдарының клетка ішіне
өтуіне кедергі жасап тұрады. Клека ішінде мұз кристалдарының түзілуі
клетканың мембранасын зақымдайды [2].
Егер температура баяу төмендесе, клеткадағы бос сулар клетка сыртына
шығып, сыртқы кеңістікте түзіліп жатқан мұз кристалдарына қосылады. Жылдам
мұздатқан кезде дегидратация процесі жүрмей, бос су клетка ішінде, яғни
цитоплазмада мұз кристалдарына айналады. Баяу мұздату кезінде клетка ішінде
мұз кристалдары мүлдем түзілмеуі мүмкін, алайда бұл кезде протоплазманың
қысылуы және күшті дегидратация процесі жүреді. Клетканың сусыздануы мұз
түзілуі нәтижесінде клетка сыртындағы ерітіндінің концентрленуінен жүреді.
Плазмолиз және ол тудырған осмостық стресс клетканың өлуіне әкеліп соғады
[10].
Криозақымдалудың 2 факторлы гипотезасы бар. Бірінші фактор – мұздың
түзілуі (мұздың клеткаішілік кристалдары тез мұздатқанда механикалық зақым
келтіреді). Екінші фактор – мұздың түзілуімен байланысты клетканың
сусыздануы, осмостық стресс.
Әртүрлі зерттеулерде осмотикалық зақымдалу эффектісі клетка ішіндегі
көлемнің азаюымен, клетка сыртындағы және клетка ішілік заттардың
концентрациясы, рН өзгеруі және ферменттердің активтілігімен байланысты деп
көрсетіледі.
Бұл мәселені шешу үшін өсімдік ұлпаларын криоқорғаудың екі негізгі
стратегиясы ұсынылады:
– криоқорғайтын заттарды қосу,
– қатуға, мұзға айналуға қабілетті судың көп бөлігін буландыру жолымен жою.
Бұл екі стратегияның мақсаты – ұлпалардағы мұздың түзілуін азайту
немесе болдырмау [11].
Плазмолизге ұшыраған клетка

Мұз кристаллдары
А)
Б)
Сурет 1. Клеткаларды мұздату: А) Жылдам, Б) Баяу

Криосақтаудағы барлық тәсілдер осы зақымдаушы екі факторды баланстауға
бағытталған.
Терең мұздату үшін әр түрлі клеткалар, ұлпалар мен мүшелер, каллус және
суспензиялық культуралар, протопласттар, эмбриоидтер, тұқымдар, сонымен
қатар апикальды меристемалар қолданылады.
Дәл осы апикальды меристемалар өсімдіктердің регенерациясын қамтамасыз
етеді, өйткені бұлар бастапқы өсімдіктердің дәл генетикалық көшірмелері
болып табылады.
Апикальды меристемаларды in vitro жағдайда қоректік орталарда
өсірілетін асептикалық өсімдіктерден, өркендерден бөліп алады.

1.1.3 Өсімдік клеткаларының төмен температураларға бейімделу жолдары

Мұздатудың өсімдік организмінің құрылымдық және функционалдық
бүтіндігіне әсерін зерттегенде, төмен температура өсімдік құрылымының әр
түрлі деңгейінде комплексті өзгерістер тудыратыны анықталды.
In vivo жағдайда табиғи суыққа төзімділік пен in vitro жағдайда
криотөзімділік бойынша әр түрлі зерттеу нәтижелері өсімдіктер клеткаларында
гипотермия кезінде, төмен температуралық факторға бейімделуге бағытталған
белгілі бір механизмдер әсер ететінін көрсетеді [7].
С.В.Климовтың статьясында [12] өсімдіктер құрылымының әртүрлі
деңгейлерінде (организмнен молекулалық деңгейге дейін) өсімдіктердің төмен
температураға бейімделуінің әртүрлі жолдарын бір стратегия аясында
қарастырған.
Организм деңгейінде бұл стратегия кеңістік пен уақытта өсімдіктердің
бейімделіп орналасуы арқылы іске асады. Бұл активті және пассивті қорғаныс
есебінен суықтың әсерін біршама жақсарту немесе болдырмауға; өсімдіктің
жылуды сақтауына; қоршаған ортадағы жылуды жұтуға; т.б. мүмкіндік береді.
Ұлпа деңгейінде мына механизмді бөліп көрсетеді: клетка аралық мұз түзу
– клетканың беткі жағында немесе протопласт пен клетка қабырғасы арасында
мұздың түзілуі болмайды, екінші жағынан, мұз түзілуі кезінде бөлінетін жылу
әсерінен протопласт қызуы жүреді. Ұлпаны сусыздандыру – ұлпадағы су
мөлшерін азайтып, төмен температуралық зақымдалулардың алдын алудың ең
тиімді тәсілі.
Ұлпаны салқындату – мұзға айналу болмаған кезде ұлпа сұйықтығының қату
нүктесінен төмен, мұздауы, сууы.
Төмен температураға бейімделудің клеткалық деңгейін майда, ұсақ
клеткалық бағытында клеткалардың құрылымдық өзгеруі, клетка қабырғаларының
қаттылау болуы, цитоскелеттің деполимеризациясы, протопласттағы судың
азаюы, протопласт қызметінің өзгерістері құрайды.
Субклеткалық деңгейде органеллалар саны мен өлшемдерінің өсуі
бақыланады. Әсіресе бұл өзгеріс энергия беруші органеллалар – митохондрия
мен хлоропластарға байланысты.
Мембраналық деңгейде көптеген инвагинация мен қатпарлардың пайда болуы
арқылы мембрананың жалпы ауданы өседі, липидті қосқабатта белокты
бөлшектердің орналасу тығыздығы төмендейді. Мембрананың өз қызметін сақтап
қалуы клетка үшін өте маңызды. Алайда төмен температуралар липидті
қосқабаттың қатаюымен клетка үшін зиянды мембрананың сұйық кристалды күйден
гель күйіне ауысуына әкеп соғады.
Молекулалық деңгейде негізгі молекулалық және сандық өзгерістер болады.
Полярлы липидтер, соның ішінде суды ұстап қалу қабілеті жоғары және
зарядталған топтардың болуы тән фосфолипидтер де интенсивті синтезделеді.
Сәйкесінше бейтарап липидтердің үлесі азаяды. Май қышқылдарының ішінде ұзын
тізбекті қанықпаған қышқылдар көбірек синтезделеді. Суықпен шынықтыру
кезінде мембрананың фосфолипидтерімен қанықпаған май қышқылдарымен баюы
мембрананың фазалы ауысу нүктесін температура төмен аумаққа жылжытады.
Қазіргі кезде организмнің төмен температураға бейімделуінде маңызды
орынды мембрана липидтерімен қоса, белоктар да алады. Ферментативті
бейімделудің негізгі типтері:
1) модуляционды типті бейімделу – мұнда біріншілік құрылымы өзгермей,
төмен температураларда фермент активтілігінің бейімделу өзгергіштігі туады;
2) сандық бейімделу – фермент концентрациясында бейімделу өзгергіштігі
пайда болады;
3) сапалық бейімделу – “изоферменттер” синтезделеді [13].
Өсімдіктердің төмен температураға деген бейімделу реакциясының ең жақсы
зерттелгені суда еритін көмірсулардың жиналуы: сахароза, фруктоза, глюкоза,
т.б. Суда еритін көмірсулар өсімдіктердің төмен температураға төзімділігін
клетканың мембраналық жүйесіне криопротекторлық әсері, энергия көзі ретінде
метаболитті әсері, клетка ішінде мұздың түзілуін азайтатын осмостық әсері
арқасында жоғарылатады.
Соңғы кезде қанттар криопротекторлар ретінде әсер етіп қоймай, тікелей
плазмалемманы модификациялайды деген мәліметтер бар [4].
Суда еритін көмірсулардың жиналуы мүмкін әртүрлі құрылым деңгейінде
өсімдіктердің төмен температураларға бейімделу тәсілдері мен жолдарын
бастайды.
In vitro криосақтау әдісі криотөзімділікті клеткалық деңгейде зерттеп,
өсімдіктерді өте төмен температураларға бейімделу механизмдерін анықтау
үшін қолданылады. Өсімдіктердің in vivo жағдайдағы бейімделу механизмдерін
білу in vitro жағдайда төмен температураларға бейімделу тәсілдері мен
жолдарын жасау үшін қажет.

1.1.4 Криосақтаудың негізгі сатылары

Өсімдік клеткалары мен ұлпаларын криосақтаудың сатылары:
1) Өсімдік материалын алдын-ала өңдеу
2) Ұлпаларды криосақтаудың бір әдісімен мұздату
3) Сұйық азотта сақтау
4) Жылдам еріту
5) Криопротектордан тазарту
6) Меристемаларды рекультивирлеу және өсімдіктер регенерациясы (сурет 1).
Сатылардың әрқайсысын толығырақ қарастырайық.
Өсімдік материалын алдын-ала өңдеу. Мұздату кезінде өсімдік
клеткаларының өлуінің себебі, жоғарыда айтылып кеткендей, клетканың ішінде
мұздың түзілуі және оның мембраналарының механикалық зақымдалуы клетканың
сусыздануы нәтижесіндегі осмостық стрестің әсері болып табылады.
Криосақтауда қолданылатын тәсілдердің барлығы зақымдаушы факторлардың
әсерін азайтуға бағытталған.
Криосақтау кезінде өсімдік материалын алдын-ала өңдеу өсімдіктер
криопротектордың әсерін және мұздату процедурасын жеңіл өткеру үшін
қолданылады [14]. Өсімдіктерді алдын-ала өңдеудің басты мақсаты − жоғары
концентрленген және көбінесе улы зат болып келетін криопротекторларды
енгізгенге дейін клеткаларды сусыздандыру. Кейбір алдын-ала өңдеулерде
сусыздандыру мен мембраналарды тұрақтандыру бірге жүргізіледі.
Өсімдік материалын алдын-ала өңдеудің үш тәсілін бөліп көрсетеді:
1)Суықты акклиматизация; 2) Химиялық өңдеу; 3) Ұлпалардың дегидратациясы.
Криосақтау тиімділігін жоғарылатудың бір тәсілі – in vitro жағдайдағы
өсімдіктерді суықпен өңдеу немесе акклиматизациялау. Іn vitro жемісті
дақылдардың акклиматизациясы үшін негізінен тұрақты температураларды
пайдаланады: 5oC, 8 сағат жарықта немесе 4oC, қараңғы жағдайда. Алайда
акклиматизация үшін әр түрлі температураларды пайдалану (22oC-1oC) сұйық
азотта мұздатудан кейін меристемалардың тіршілік қабілетін айтарлықтай
жоғарылатады [15].
Іn vitro өркендерді ауыспалы температурада (8 сағат 220C, жарық
10мкмоль м-2 c-116сағат -10C, қараңғыда) клима камерада жүргізу ұсынылады.
Әр түрлі дақылдар үшін акклиматизацияның оптимальды үзақтығы 1-4 апта
аралығында болады. Қарақат үшін 1-2 апта жеткілікті, ал таңқурайға – 2-3
апта, алмаға – 3-4 апта қажет [16].
Алманың асептикалық өркендерін ұзақ уақыт суықпен өңдеудің
криосақтаудың әр түрлі екі әдісін ( витрификация, инкапсуляция-дегидратация
) пайдаланғанда, криосақталған меристемаларға әсері зерттелді. Іn vitro
өркендерді ауыспалы температурада (8 сағат 220C, жарық 10мкмоль м-2 c-
116сағат -10C, қараңғыда) 3 апта бойы өсіргенде, криосақталған
меристемалардан өркендердің пайда болуы жоғары пайызды көрсетті (50-80%)
[17].
Суықты акклиматизация тропикалық өсімдіктер үшін тиімді болмаса да,
басқа өсімдіктер үшін тиімділігі жоғары тәсіл болып табылады. Бұл тәсіл
крахмалды гранулалар, липидті қоспалар, қанттардың мөлшері мен клеткалардың
құрғақ салмағын көбейтеді.
Суықты акклиматизацияны өсімдіктің төмен температураларға
төзімділігінің табиғи механизмдерін іске қосу үшін пайдаланады.
Акклиматизацияланған өсімдіктерден бөліп алынған меристемалардың тірі
қалу деңгейі криосақтаудан кейін 2 есе артады [18].
Мембрананың зақымдалуы мұздату кезінде пайда болатын ең алғашқы
белгілердің бірі болып табылады. Мұздату-еріту циклі кезінде
акклиматизацияланбаған меристемалардың протопласттарында лизис жүреді.
Өйткені дегидратация кезінде клетка мембраналары майда везикулалар түзетін
заттан айырылып қалады. Осы везикулалар еріту кезінде қайта
қосылмағандықтан, протопласттарда лизис жүреді. Акклиматизацияланған
протопласттарда осы заттар қайта қосылып, клетка лизиске ұшырамайды,
өйткені клетка ерітуден кейін өзінің қалыпты су құрамын қалпына келтіреді
[5].
И.Чанг пен Б.Ридтің жұмыстарында суықты акклиматизация алмұрт
өркендерін мұздату кезінде меристемалардың криосақталуына әсері туралы
мәліметтер берілген. Пробиркалық өсімдіктерді шынықтырудың әр түрлі
режимдері зерттелген:
1) ауыспалы температура (220C, жарық, -10C, қараңғы);
2) тұрақты температура (40C, 8 сағаттық фотопериод). Акклиматизацияланбаған
өсімдіктермен салыстырғанда суықты аклиматизацияның екі түрі де
меристемалардың криосақтаудан кейінгі өсімдіктердің регенерациясын
жақсартты. Ауыспалы температуралы акклиматизация біршама жақсы нәтижелер
берді [19].
Осы авторлардың жұмыстарында [20] суықты акклиматизациядан кейінгі
(220C, 16 сағат қараңғы) таңқурай меристемаларының регенерациясы жақсарғаны
туралы мәліметтер келтірілген. Акклиматизация ұзақтығы 1-ден 3 аптаға дейін
артқанда, тірі қалған меристемалардың үлесі 63% -дан 90%-ға, ал өркендердің
түзілуі 25% -дан 75%-ға дейін өсті.
Сонымен қатар криопротекторлармен – химиялық қосылыстармен өсімдік
материалын алдын-ала өңдеу қолданылады. Криопротекторлар қату нүктесін
төмендетіп, клетканың ішіндегі суды байланыстыра отырып, клетканы
механикалық зақымданудан және осмостық стрестен сақтайды [2, 21].
Криосақтауда криопротекторлардың екі негізгі типі қолданылады: клеткаға
енетін және енбейтін криопротекторлар. Клеткаға енбейтін криопротекторлар
ретінде, әдетте, қанттардың жоғары молярлы ерітінділері, полиэтиленгликоль,
маннит, сорбит пайдаланылады. Бұлар осмостық әсер көрсетіп, клеткадағы суды
байланыстырады. Клеткаға енетін криопротекторлар – глицерин мен
диметилсульфоксид (ДМСО) клеткаға еніп, клетканың сыртында және ішінде
біркелкі таралады. Осылайша, бұлар осмостық стресс көрсетпейді және клетка
көлемін өзгертпейді. Клеткаға енетін криопротекторларды пайдаланағанда
клетка компартменттерінің екеуінде де сусыздану бірдей жүреді. Клеткаға
енетін криопротекторлар өте төмен температураның зақымдаушы әсерін азайту
үшін қату нүктесін төмендетеді [11].
Ең көп қолданылатын криопротекторлардың бірі – диметилсульфоксид
(ДМСО). ДМСО – меристема секілді ірі, тығыз құрылымдар үшін маңызды
клеткаға ену қабілетіне ие. Әдетте, меристемаларға арналған алдын-ала өсіру
ортасына 5% диметилсульфоксид (ДМСО) қосылады. Диметилсульфоксид бүкіл
апекс бойынша тиімді криоқорғауды қамтамасыз етеді [7,22]. Осы әдіс бойынша
түймедақ меристемаларымен тәжірибе жасағанда, жақсы нәтижелер алынды.
Түймедақтың меристемаларын алдын-ала диметилсульфоксид (ДМСО) қосылған
ортада өсірді, ал криопротектор ретінде диметилсульфоксид, глицерин мен
сахарозаның қоспасы қолданылды [1,5].
Сонымен қатар, сахароза да табиғи криопротекторлық қасиеттерге ие.
А.Сакаи мен И.Сугавара сахароза капуста клеткалары үшін ең жақсы
криопротектор екенін анықтады [5]. Сахароза клеткаларда осмостық агент
ретінде қызмет етіп, мембрананың қосқабаты мен ферменттерін тұрақтандырып,
мембрананы қорғайды. Сахарозамен алдын-ала өңдеу осмос көмегімен клетка
ішіндегі суды төмендетеді [14]. Тұқымдар мен өсімдіктердегі табиғи
криопротекторлы механизмдер алдын-ала өңдеу үшін қажет химиялық заттардың
жаңа көзі болады. Стресс әсеріне жауап ретінде ген экспрессиясының өзгеруі
нәтижесінде жаңа белоктар түзіледі. Олардың ішінде абциз қышқылының әсеріне
жауап беретін белоктар да бар. Бұл белоктар гидрофильді және термотұрақты
болып табылады. Абциз қышқылы гидраттаушы агент ретінде әсер етеді, иондар
концентрациясы жоғары болғанда цитоулылықтың алдын алу үшін артық иондарды
байланыстырады.
Қант қамысының 6 генотипінің инкапсулденген апекстерінің тірі қалуына
алдын-ала өсіру кезінде сахароза концентрациясының әсері зерттелген.
Cусыздандырылмаған бақылау апекстерінің тірі қалу деңгейі барлық жағдайда
100%-ға жақын болды. Екі генотипте (В34104 және В69566) сахарозаның ең
төмен концентрациясында (0,3 М) өсірілген бақылау апекстері алты сағаттық
сусыздану периодына шыдамады. Нәтижесінде, сұйық азотта мұздатудан кейін
апикальды меристемалардың тірі қалу деңгейі сызықты түрде сахароза
концентрациясы өскен сайын өсіп отырды және оптимальды сахароза
концентрациясы 0,75М болды. Бұдан жоғары концентрациялар тірі қалу деңгейін
мулдем төмендетіп жіберді [23]. Зерттелген қанттардың ішінен ең жақсы
криоқорғаушы әсерді сахароза мен сорбит көрсетті [24].
Жоғарыда айтып өткендей, клетканың ішінде мұз кристалдарының түзілуі
клетка үшін өте зиянды. Осы процестің алдын алу мақсатымен клеткалардың
дегидратациясын жүргізу керек. Донор өсімдікті өсіру ұзақтығын ұзарту
криосақтаудан кейін апекстердің тіршілік қабілетінің өсуіне қолайлы әсер
етеді. Бұл – ұзақ уақыт басқа ортаға көшірілмеген донор өсімдіктерден бөліп
алынған апекстердегі судың аз болуымен байланысты болуы мүмкін. Осы
гипотезаны тексеру үшін қосымша тәжірибелер жүргізілуде [21].
Осылайша, клеткалар мен ұлпаларды дайындау криосақтаудағы ең маңызды
саты болып табылады. Бұл саты өсімдік клеткалары мұздату процедурасына
төзімді болу үшін және криопротекторлардың улы әсерін азайту мақсатымен
жүргізіледі.
Криосақтаудың екінші сатысы өсімдік ұлпаларын мұздату болып табылады.
Мұздатудың әр түрлі үш тәсілі бар:
1) Меристемаларды бақылап немесе баяу мұздату - өсімдік ұлпаларын
бағдарламалы мұздатқышта (фризер) -400C-қа дейін біртіндеп мұздатуға
негізделген. Өсімдіктер алдын-ала суықты акклиматизациядан өтеді. Бөліп
алынған меристемаларды құрамында 5% диметилсульфоксид (ДМСО) бар ортаға 48
сағатқа отырғызады, сосын криопротектормен өңдейді. Өйткені баяу мұздатқан
кезде мұздың түзілуі клетка сыртындағы кеңістікте пайда болады, клеткалар
біршама бос су мөлшерінен арылады. Мұздату процесі температура өте баяу
төмендейтін (0,1-ден 10C-қа минутына) программалы мұздатқыш көмегімен іске
асады. Осы -400C температураға жеткен соң ұлпаларды сұйық азотқа (-1960C)
ауыстырады. Еріту бір минут бойы 450C температурада, сосын екі минут бойы
250C температурада су моншасында жүргізіледі. Меристемаларды 1,2M сұйық
Мурасиге-Скуг ортасымен екі рет шайып, қалпына келтіретін немесе
регенерацияға арналған ортаға отырғызады [11]. Бұл кезде витрификация
әдісіне қарағанда, баяу мұздатуда криопротектордағы ДМСО концентрациясы
төмендеу болады.
Осы әдісте клеткадан шыққан су клетка сыртындағы ортада қатады, ал бұл
дегидратация мен протопласттың қысылуына әкеп соғады. Дегидратацияны
болдырмау үшін өте жылдам мұздату әдісін қолданады [1].

Сурет 2. Өсімдік клеткалары мен ұлпаларын криосақтаудың сатылары.

2) Витрификация әдісі – криопротектор қолданылатын, жақында жасалған
криоконсервация әдісі. Криопротектор суды байланыстыра отырып, оны аморфты-
гель күйіне келтіріп, кристалды формаға, яғни мұзға айналуына жол бермейді.
Витрификация әдісінде қолданылатын ерітінділер өте улы заттар болғандықтан,
концентрациясы мөлшерден артып кетсе, фотосинтез тежеледі, мембрана
бүтіндігі бұзылады, плазмолизге ұшырайды. Витрификация алдында
өсімдіктерді, ең аз дегенде бір апта, суықты акклиматизациядан өткізеді.
Витрификация әдісін пайдаланғанда өсімдік материалын жоғары концентрленген
криопротекторлар ерітіндісімен өңдеп, сұйық азотқа жылдам енгізеді. Баяу
мұздатқан үлгілерді еріткендей ерітіп алады. Бұл жағдайда криопротекторы
бар ерітіндіден меристемаларды жылдам алу керек.
Бұл әдісті көптеген өсімдік түрлерінің апикальды меристемаларын
криосақтау үшін пайдаланады [16].
3) Инкапсуляция-дегидратация – өсімдік ұлпаларын мұздатуға дейін
кептіргенде клетка ішіндегі мұз кристалдары түзілмейтін әдіс.
Меристемаларды альгинатты шариктерге енгізеді, жоғары молярлы сахароза
ерітіндісінде біртіндеп сусыздандырып, ылғалдың белгілі бір мөлшері
қалғанша кептіреді. Кептірілген шариктерді сұйық азотқа енгізеді.
Пробиркаларды дьюардан алып, бөлме температурасында ерітеді. Бұл әдісті
қолданғанда тірі қалу деңгейі өте жоғары болады. Криосақталған үлгілердің
қалпына келуі каллус түзілуінсіз тікелей жүреді [11, 25].
In vitro алма өсімдіктерінің үстіңгі бүршіктеріне осы үш әдістің (екі
сатылы мұздату, витрификация, инкапсуляция-дегидратация) қайсысы тиімді
екені және бастапқы өсімдіктерді өңдеудің әсері зерттелді. Бастапқы
өсімдіктерді 3 апта бойы 50C температурада суықты акклиматизациямен өңдеу
криосақтаудың кез келген әдістемесін пайдаланғанда, өсімдіктердің
регенерациясын жоғарылатты. Апекстерді бөліп алмай тұрып бастапқы
өсімдіктерді стандартты ортада ұстау уақыты арттырғанда, үстіңгі
өркендердегі су мөлшері 85-88%-дан 63-66%-ға дейін азайды. Ең жақсы нәтиже
инкапсуляция-дегидратация әдісін қолданғанда алынды, яғни криосақтаудан
кейін 86%-ға дейін каллус түзілуінсіз регенерация жүрді [26].
Тыныштық күйіндегі алма бүршіктерінен бөліп алынған (Malus domestica
Borkh, Голден Делишес сорты) апестерді пайдаланғанда өсудің қалпына
келуінің ең жоғары деңгейін витрификация (60%) мен инкапсуляция-
дегидратацияға (60%) қарағанда, екі сатылы мұздату әдісі көрсетті.
Керісінше тыныштық күйдегі бүршіктерді екі сатылы мұздату әдісін пайдаланып
сұйық азотқа батырып, кейін олардан үстіңгі бүршіктерді (өркендерді) бөліп
алғанда, олар қалпына келудің төмен деңгейін көрсетті (16%) [27].
Витрификация және инкапсуляция-дегидратация әдістерінің сатылары кіретін
комбинирленген әдісті пайдаланған кездегі мәліметтер бар. In vitro өскен
жалбыздың қолтық бүршіктерінен алынған меристемалар альгинатқа енгізіліп,
витрификация әдісі көмегімен сәтті криосақталған. Түйін сегменттерінен
бөліп алынған меристемаларды 3 апта бойы 4°C температурада
акклиматизациялады, инкапсулдеп, 2М глицерин және 0,4 М сахароза қоспасымен
өңдеді. Осы меристемаларды жоғары концентрленген PVS2 витрификациялық
ерітіндіде 3 сағат 0°C-та дегидратациялап, сұйық азотқа енгізді. Қоректік
ортаға көшірген соң бір аптадан кейін меристемалардан каллус түзілуінсіз
өркендер пайда болды. Орташа есеппен алғанда, меристемалардың 90%-да
өркендердің түзілуі бақыланды. Осы әдіс жалбыздың басқа түрлеріне де сәтті
қолданылды [28].

1.1.5 Сұйық азотта сақтау

Өсімдіктердің үлгілері сұйық азотта -196°C температурада шексіз ұзақ
уақыт сақтала алады. Гладиолустың 7 сортының криосақталған тозаңдарының
тіршілік қабілеті және фертильдігін зерттегенде, криогенді әдістерді осы
түрдің гаплоидты гендерін сақтауға қолдануға болатынын көрсетті. Тозаңдарды
1 және 10 жыл бойы криогенді сақтағанда тіршілік қабілетінің (in vitro)
төмендеуі байқалмады. Криогенді сақтаудан кейін тозаңдармен егістікте
тозаңдандыру жүргізгенде, капсула мен тұқымдардың түзілуін индукциялады.
Гладиолустың тозаңдарын ұзақ криогенді сақтау селекция эффективтігін
жақсартуы мүмкін. Аталық тозаң селекциялық бағдарламалар үшін жеткілікті
болады. Осы түр үшін “тозаң криобанкін” жасау генетикалық әртүрліліктің
гаплоидты деңгейде сақталуына ықпал етеді [29].

1.1.6 Еріту, криопротектордан тазарту және өсімдіктердің регенерациясы

Еріту және дақылдың өсуін қалпына келтіру – криосақтау процесінің ең
маңызды және критикалық сатылары болып табылады. Клеткаларды баяу
еріткенде, онда зақымдайтын мұздың қайта түзілуі мүмкін. Жылдам еріту судың
кристаллизациясын болдырмайды. Витрификация әдісін пайдаланғанда, еріту
үшін пробиркаларды жылы су моншасына батырады. Еріткен соң криопротекторды
алып тастайды. Баяу мұздату әдісін пайдаланғанда да, өсімдік материалын осы
жолмен ерітіп алады. Инкапсуляция-дегидратация әдісімен мұздатқанда өсімдік
материалын криопробиркаларда бөлме температурасында ерітеді. Клеткалардағы
физикалық өзгерістердің негізгі бөлігі мұздату және еріту кезінде жүреді.
Әсіресе, жаңа ерітілген клеткалар зақымдануға бейім болады, сондықтан
ерекше күтімді, бағып-қағуды қажет етеді. Бұған криопротекторлардан
тазартып, клеткаларды 1,2М сұйық Мурасиге-Скуг ортасымен 2 рет шайған соң,
қалпына келтіретін ортаға отырғызу жатады [12]. Мұздату – еріту циклінен
кейінгі өсімдіктердің регенерациясы криосақтау тиімділігінің көрсеткіші
болып табылады. Крисақталған меристемалардың тіршілік қабілетін жасыл түсі
мен өркендердің регенерациясы бойынша бағалайды.

1.1.7 Криосақталған гермоплазманы бағалау әдістері

Материал криосақтауда тұрғанда дақылдың күйін бағалау мүмкін емес.
Бағалау еріткеннен кейін жүргізіледі және дақылды пайдалану үшін қажет.
Дақылдарды жылдам бағалау үшін тіршілік қабілетін тексеретін тесттер
қолданылады.
Тірі қалудың сандық бағалауы өсу болып табылады. Стандартты
цитологиялық әдістер көмегімен ұлпаларда жүретін қалпына келу процестері
мен зақымдану дәрежесін анықтауға болады. Бұдан да нақты мәліметтерді
электронды микроскопта ультрақұрылымын зерттегенде алуға болады.
Клеткалардың гетерогендігін және мұздатуға дайындалғанын ескере отырып,
қандай да бір субпопуляция үшін селективті артықшылықтардың көріну
мүмкіндігін толығымен жоқ қылуға болмайды. Сондықтан генетикалық,
физиологиялық және биохимиялық тексерулер қажет.
Рекультивирлеу сатысында, кейде мутантты суыққа төзімді клеткалардың
селекциясын болдырмау үшін клетка өсуін интенсификациялаудың белгілі
тәсілдерін қолданады. Сұйық азотта сақтаудың тіршілік қабілеті мен клетка
культураларының жаңаруына ешқандай кері әсері болмайтыны анықталды.
Жаңарған дақылдар өсу жылдамдығы мен морфогенетикалық, биосинтетикалық және
биотрансформациялаушы потенциалдарының толық сақталуымен сипатталады. Сұйық
азотта сақтаудан кейін рекультивирленген клетка культуралары бастапқы
культурамен ұқсас және биотехнологиялық қолдануға жарайды. Терең мұздату
тозаңдардың тіршілік қабілеті мен фертильдігін сақтайды. Осылайша,
клеткалардың, меристемалардың, тозаңдардың криобанкі тек in vitro
өсірілетін штамдар емес, сонымен қатар сирек және жоғалып бара жатқан
түрлердің генофондының сақталуын қамтамасыз етеді. Өсімдіктердің in vitro
генофонды – ғылыми зерттеулер мен технология үшін бағалы зерттеу материалы
болып табылады. Сондықтан криобанктерді жасау бойынша жұмыстар бүкіл әлемде
жүргізіліп жатыр [2].

1.1.8 Алма гермоплазмасын криосақтау

Жаңа сорттарды шығару үшін әр түрлі өсімдік материалдары қажет, алайда
ол жеткіліксіз. Генетикалық әртүрлілік өсімдіктердің зиянкестерге,
ауруларға және стресс факторларға төзімді жаңа өсімдік сорттарын алуға
мүмкіндік береді. Генетикалық әртүрлілікті толықтыру көздері өсімдіктердің
жабайы өсетін формалары мен туыcтығы жақын өсімдік түрлері болып табылады.
Алайда жабайы өсетін өсімдіктердің территориясы жыл сайын азайып барады
және көптеген түрлері мәңгілікке жоғалып бара жатыр [30].
Қазақстан территориясы климаты әр түрлі және өсімдік әлеміне бай табиғи
зоналарға бай. Бұлардың ішінде кейбір жеміс-жидекті өсімдіктер топтанған
Іле және Жоңғар Алатауларының тау бөктерлері ерекше орын алады.
Н.И.Вавиловтың зерттеулері бойынша Қазақстан территориясы мәдени
өсімдіктердің, соның ішінде алманың да, шыққан орталықтарының бірі болып
табылады [31,32]. Өкінішке орай күшейіп келе жатқан антропогенді әсердің
нәтижесінде жабайы жемісті ормандар ареалы, олардың түрлік және формалық
сан алуандығы күннен-күнге қысқарып, олардың жоғалып кету қаупі бар [33].

Әлемде вегетативті көбейетін өсімдіктердің гермоплазмасы сақталатын ген
банктерінің саны көп [34,35,36]. Европаның көптеген елдерінде (Бельгия,
Франция, Ұлыбритания, Венгрия) алманың жабайы өсетін түрлері мен
сорттарының егістік коллекциялары бар [37,38,39,40]. АҚШ-та өсімдіктердің
Ұлттық Гермоплазма Жүйесі бар. Ол әлемнің барлық елдерімен гермоплазманы
алмасады. Осындай жүйені құру әлемдік өсімдіктердің әр түрлілігін сенімді
сақтауға мүмкіндік береді [31].

Алайда, мәні зор болғанымен, генофондты табиғи өсу ортасы, помологиялық
және ботаника бақтарында сақтаудың мынадай кемшіліктері бар: 1) тірі
коллекцияларда геномның тек бір бөлігі байқалады; 2) популяцияларда өзін-
өзі тозаңдандыру жүріп, туыс түрлермен гибридизация жүруі мүмкін,
нәтижесінде ген эрозиясына немесе генотиптің арнайылығының жоғалуына әкеліп
соғады; 3) егістіктегі үлкен аудандардағы коллекцияларды ұстау үшін
айтарлықтай материалды шығын және күтімді қажет етеді; 4) табиғи ортадағы
коллекциялар қауіпті аурулармен (әсіресе, вирустық) инфекцияланып, әр түрлі
зиянкестердің қолайсыз әсерінен өліп қалуы мүмкін [8].

ХХ ғасырдың 70-ші жылдары әлемдік ... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.