Изопикникті центрифугалау

Жұмыс түрі: Реферат
Тегін: Антиплагиат
Көлемі: 10 бет
Таңдаулыға:

Қазақ Ұлттық аграрлық Университеті

Ветеринариялы- санитариялық сараптау және гигиена кафедрасы

Тақырыбы: Центрифугалауға арналған аспап-құралдар

Орындаған: Әлтай Жансая

(Вм-204)

Тексерген: Базарбаев Рыскелді

2014 жыл

Жоспары:

Кіріспе:

1. Центрифугалауға арналған аспап- құралдар және олардың түрлері.

Негізгі бөлім:

1. Изопикникті центрифугалау.

2. Зоналы- жылдамдықта центрифугалау.

3. Тығыздық градиентінде тепе-теңдікпен центрифугалау.

4. Аналитикалық центрифугалау.

5. Молекулалық салмақты седиментация жылдамдығы арқылы анықтау.

Қорытынды:

Центрифугалауға арналған аспап-құралдардың маңызы.

Пайдаланған әдебиеттер

Қосымша әдебиеттер

Центрифугалуға арналған аспап құралдар дегініміз -негізінен сұйықтықты бөліп алуға арналған құралдар.

Центрифугалауға арналған аппараттар: зертханалық және клиникалық, вакуумдық және рефрижераторлық, препараттық және аналитикалық ультрацентрифугалар.

Изопикникті (сахароза-тығыздығындағы) центрифугалау
Үлкендігі және тығыздығы орташа бөлшектерді бөліп алу үшін бірінші центрифугалаудан алынған супернатантты жылдамдығы алғашқыдан жоғары айналымда центрифугалайды. Бұл кезде орташа бөлшектер тұнбаға түседі. Ол тұнбаның бөлшектерін таза күйінде алу үшін жоғарыда айтылған процедура қайталанады. Сонымен, ақырында үлкендігі мен тығыздығы ең төмен бөлшектер центрифуга арқылы тазаланып алынады

$C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\№.jpg$

Изопикникті центрифугалау . Мұндай центрифугалауды тығыздық градиентінде, сонымен қатар қалыпты жағдайда жүргізуге болады. Егер центрифугалау тығыздық градиентінде өткізілетін болса, онда биологиялық препараттың ішіндегі зерттелетін қосылыстан ауыр басқа заттар тұнбаға түсетіндей етіп центрифугалайды. Зерттелетін ерітінді қажетсіз бөлшектермен немесе түіршіктермен ластанған болса - онда ерітіндіні алдын ала төмендеу жылдамдықта центрифугалап, қажетсіз заттар тұнбаға түсіріліп, лақтырылады. Одан алынған супернатантты ары қарай оның ішіндегі молекулалардың тығыздығына байланысты бір-бірінен бөлу үшін таңдап алынған жылдамдық үдеуінде центрифугалайды. Ондай центрифугалауды төмендегі схемадан түсінуге болады (7-ші сурет) .

Зоналы-жылдамдықта центрифугалау . Бұл әдісті басқаша s -зоналды центрифугалау деп атайды. Зерттелетін ерітінідіні центрифуга прбиркасының ішіндегі үздіксіз тығыздық градиенті түрінде жасалған қоймалжың сұйықтың жоғары бетіне сұйық-қабат етіп құяды. Содан кейін дайындаманың құрамындағы әртүрлі бөлшектер немесе үлкен молекулалар градиенттің бойында бір-бірінен ажыратылған қабаттар немесе зоналар түрінде бөлінгенге дейін центрифугалайды. Тығыздық градиентіндегі конвекцияның (макробөлшектердің қозғалысы) нәтижесінде пайда болатын зоналар бір-бірімен араласпайды. Зоналы-жылдамдықтағы центрифугалауды РНҚ-ДНҚ гибридтерін, рибосоманың суббірліктерін және басқа да клетка компоненттерін бір-бірінен бөлу үшін пайдаланылады.

$C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\untitled.bmp$ $C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\д.bmp$

Тығыздық градиентінде тепе-теңдікпен центрифугалау . Бұл жағдайда тығыздық градиентін құру үшін цезий және рубидий секілді металдардың тұздарын, сонымен қатар сахарозаның ерітінділерін қолданады. Зерттелетін препаратты, мысалы ДНҚ-ны, концентрленген хлорлы цезий ерітіндісімен араластырады. Ерітіндідегі қосылыс (бұл жерде ДНҚ) және еріткіштің қоспасы центрифуга пробиркасының барлық көлемінде біркелкі болып құйылады. Центрифугалау барысында концентрацияның тепе-тең болып таралуы іске асады. Соның нәтижесінде цезий ионының массасы үлкен болғандықтан хлорлы цезийдің де тығыздығы барлық көлемге тепе-тең болып таралады. Центрден тебілу үдеуінің әсерінен ДНҚ молекулалары пробиркадағы өздеріне сәйкес келетін тығыздықтың аймағында бөлекше зона түрінде қайта топтасады. Америка ғалымдары Месельсон мен Сталь дәл осы әдісті ДНҚ-ның жартылай консервативті репликациясын ашуда орынды пайдаланған.

Ерітінділердің тығыздығының градиентін құру үшін көбінесе сахарозаның ерітінділерін қолданады, кейде ол тұрақты рН мәнінде жүргізіледі. Градиентті таңдап алу фракциялаудың нақты мақсаттарына байланысты болады. Мысалы, сахарозаның эпихлоргидридімен бірлескен полимері - фикол (молекулалық массасы 4 дальтон, «Pharmacia Fine Chemicals» фирмасы) осмотикалық қысымы төмен және тығыздығы жоғары градиентті құрған кезде сахарозаның орнына пайдаланылады. Тығыздығы жоғары градиентті жасау үшін ауыр металдардың тұздарын да пайдаланады.

$C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\отшгщ.jpg$

Аналитикалық центрифугалау . Заттарды бір-бірінен бөлетін және тазалайтын препаративті центрифугалаумен салыстырғанда аналитикалық ультрацентрифугалау негізінен биологиялық макромолекулалар және басқа құрылымдардың седиментациялық қасиеттерін зерттеу үшін қолданылады. Сондықтан аналитикалық центрифугалауда ерекше роторлар және конструкциясы ерекше бақылаушы жүйемен жабдықталған. Олар зерттелетін заттың центрден тебілетін өрісте седиментациясын үздіксіз бақылауға мүмкіндік береді. Бұл әдісті рибосома секілді макромолекулалардың таза препаратын зерттеу үшін пайдаланады. Бұл жағдайда биологиялық материалдың аз мөлшері жеткілікті болады. Ал, зерттелетін бөлшектердің седиментациясы (жоғары айналым кезінде центрден тебілуі) арнайы оптикалық жүйе арқылы бақыланып отырады. Осы әдіс арқылы биологиялық материалдың тазалығы, молекулалық массасы және құрылысы туралы мәлімет алуға болады.

Аналитикалы центрифугалар жылдамдықты минутына 7 айналысқа дейін үдете алады. Әдетте олардың роторларының формасы эллипсоидты болады және ротор айналыстың жылдамдығын өзгертіп отыруға мүмкіндік беретін мотормен өзекті құрылым арқылы жалғасқан. Ротор вакуумды камерада айналады және камера тұрақты түрде төменгі температурада салқындатылып тұрады.

Аналитикалық центрифугалар центрифугалаудың барлық кезеңінде бөлшектердің седимантациясын бақылап отыруға мүмкіндік беретін оптикалы жүйемен жабдықталған. Әрбір уақыт аралығында седиментацияланып жатқан зерттелетін материалды фотоға түсіріп алуға болады. Белоктар мен ДНҚ-ны фракциялаған кезде седиментацияны ультркүлгін сәуле аймағындағы жұту деңгейі арқылы бақыланады. Ал егер ерітінділердің сыну коэфициенттері әртүрлі болса - онда сыну зоналарының шекарасын анықтау арқылы бақылау жүргізеді. Седиментация кезінде ауыр және жеңіл бөлшектердің зоналарының арасында сәулені сындыратын линза секілді шекара түзіледі. Ал, тіркегіш ретінде қолданылатын фотопарақта сол «линзаға» сәйкес шың (пик) пайда болады. Седиментацияның барысында әлгі шекара жылжып отырады, онымен бірге пик те орын ауыстырады - соның қозғалу жылдамдығына сүйене отырып, материалдың седиментация жылдамдығына баға беруге мүмкіндік туады.

Биологияда аналитикалы центрифугалауды макромолекулалардың молекулалық салмақтарын анықтау, үлгілердің тазалығын тексеру, сонымен қатар макромолекулалардың конформациялық өзгерістерін зерттеу үшін қолданылады. Аналитикалық ультрацентрифуганың көмегімен молекулалық салмақты анықтаудың үш әдісі бар: седиментация жылдамдығын анықтау, седиментациялық тепе-теңдік әдісі және седиментациялық тепе-теңдікке жақындау әдісі.

$C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\роиоргмиогри.jpg$ $C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\отшот.jpg$ $C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\ототого.jpg$ $C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\щ.jpg$

Молекулалық салмақты седиментация жылдамдығы арқылы анықтау .

Бұл кең тараған әдіс. Алғаш барлық кеңістікке біркелкі таралған бөлшектер үлкен жылдамдықпен центрифугалау жүргізгенде айналудың центрінен радиус бойынша рет-ретімен қозғала бастайды. Бөлшектерден босанып үлгерген еріткіштің аймағы және оның әлі де бөлшектер бар бөлімінің арасында оларды анық бөліп тұратын шекара пайда болады. Сол шекара центрифугалау кезінде жылжып, бөлшектердің седиментциясының жылдамдығын анықтауға мүмкіндік береді, фотопарақта тіркеліп отырады.

Седиментация коэффициенті деп жылдамданудың бірлігіне жататын жылдамдықты айтамыз. Оны Сведберг бірліктерімен (S) өлшейді. Сведбергтің 1 бірлігі 10 ^-23 S мәніне тең. S-тің сандық мәні молекулалық салмақ пен бөлшектердің формасына байланысты және ол берілген молекуланы немесе молекуладан үлкен структураны сипаттайтын шама болып табылады. Мысалы, лизоцимнің седиментация коэффициенті 2, 15 S-ке тең (лизоцимнің молекулалық массасы 13 930 дальтонға тең), бактерияның рибосомасының суббірліктері 30 S және 50 S-ке тең. Яғни, анықталған Сведберг бірлігі арқылы белоктың молекулалық массасын арнайы есептеу бойынша шамалауға болады.
$C:\Users\Балғын\Desktop\Бал\ощтшотт.bmp$
Препараттардың тазалығын бағалау .

Аналитикалық ультрацентрифугалау ДНҚ, белоктар және вирустардың тазалығын бағалу үшін кеңінен қолданылады. Препараттардың тазалығы молекуланың салмағын анықтауда маңызды роль атқарады. Көпшілік жағдайда препараттың гомогендігін (бір текті молекуладан тұратындығын) седиментация шекарасының бейнесі арқылы сипаттауға болады. Әдетте гомогенді препарат нақты бір шекара бейнесін береді. Егер препарат таза болмаса - алынатын пик ассиметриялы немесе ол пикте қосымша иықшалар пайда болады.

Белоктарды қоюландыру (концентрлеу) әдістері

Экстракт дайын болған соң бір немесе бірнеше белок түрлерін тазалап бөліп алу үшін әртүрлі әдістерді пайдалануға болады. Алғаш әртүрлі өңдеулерге түсетін экстрактты фракциялау, яғни одан физико-химиялық қасиеттері бір-біріне жақын бірқатар белоктарды әртүрлі топтарға бөліп тазалау басталады. Фракциялаудың барлық сатыларында тазалау процесі белоктың рН мәніне байланысты ерігіштігі, температураға, тұзға және басқа да факторларға төзімділігі ескере отырып жүргізіледі.

Аммоний сульфаты арқылы концентрлеу . Жоғарыда белоктардың молекулаларын әрқашан буфер ерітінідісінің ішінде зерттейді дедік. Осы кезде оның изоэлектрлі нүктесі анықтау өте маңызды, себебі - дәл осы рН мәнінде көрші молекулалардың қарама-қарсы зарядталған топтарының арасында өзара әректтесуге қолайлы жағдай туады және оның нәтижесінде олар агрегацияланып, тез тұнбаға түсіп кетеді. Агрегацияны, яғни белок молекулаларының бір-бірімен бірігіп, тұнбаға түсуін оның ерітіндісіне аммоний сульфаты секілді тұзды қосу арқылы іске асыруға болады. Гидратация кезінде белок молекуласының сыртқы бетіндегі зарядталған топтар және бейорганикалық иондар су молекулалары үшін таласады. Ерітіндідегі тұз белгілі бір концентрациясына жеткен кезде белок-пен-белоктың арасындағы өзара әрекеттесулер белок-пен-су арасындағы байланыстардан артып кетеді, яғни сусыз қалған белок молекулаларының қарама-қарсы зарядталған топтары бір-біріне тартылып, молекулалар агрегацияланады және оның нәтижесінде белок тұнбаға түседі. Осы әдісті клетка экстракттарынан белокты тазалаудың алғашқы кезеңдерінде, сонымен қатар тазаланған белокты да тұнбаға түсіріп, концентрациялау үшін кеңінен қолданады. Бір белоктың зарядталған топтарының саны және сапасы кез келген басқа белоктікімен салыстырғанда әрқашан өзгеше болатындықтан олардың изоэлектрлік нүктелері де бір-біріне ұқсамайды, яғни аммоний сульфатының концентрациясын өзгерте отырып, таңдап тұндыру арқылы клетка сұйығында әртүрлі белоктарды бір-бірінен бөлуге болады (белоктарды фракциялауға арналған аммоний сульфатының концентрацияларының кестесі «Жалпы мәліметтер тарауында» көрсетілген) . Әдетте белоктардың ерігіштігі тұздың концентрациясы жоғарылағанда - төмендей бастайды. Тұзды қоса бастағанда белоктардың түрлері бірінен кейін екіншісі, және ары қарай сол тәртіппен тұнбаға түсе бастайды. Әртүрлі белоктарды кезекпен тұнбаға түсіру үшін аммоний сульфатының біртіндеп жоғарылайтын концентрациялары кеңінен қолданады.

Тазалаудың бір әдісі арқылы алынған белоктың препараты келесі әдіске көшер алдында әртүрлі қажетсіз қоспалардан таза болуы керек. Мысалы, аммоний сульфатымен тұнбаға түскен белокты буферде қайта еріткенде, белоктың жаңа ерітіндісінде осы тұздың едәуір мөлшері бәрібір қалдық түрінде қалып қояды. Бұл тұздың сол мөлшері белокты келесі тазалау әдісіне кері әсер етуі мүмкін. Сондықтан, аммоний сулфатын белоктың ерітіндісінен бөліп, алып тастау керек. Ол үшін төмендегі диализ әдісін қолдануға болады.

Диализ.

Бұл әдістің көмегімен белоктарды еріткіштен және басқа да әртүрлі кіші молекулалы қосылыстардан бөлуге болады. Ол үшін экстракттан біршама тазаланып алынған белок ерітіндісін жартылай өткізгіш мембранадан жасалған қапшық немесе түтікке құяды. Осы кішкентай «торсықты» көлемі одан ондаған есе жоғары буфердің ерітіндісіне ендіріп, бекітіп қояды. Мембрананың сыртындағы сұйықта кіші молекулалардың концентрациясы өте төмен болу керек, сұйықтың иондық күші сәйкес келу керек. Диализ, немесе мембрана-қапшықтың ішіндегі кіші қосылыстардың мембрана арқылы сыртқы сұйыққа шығуы, ішкі және сыртқы сұйықтардағы олардың концентрациялық тепе-теңдігі пайда болғанға дейін жүреді. Белоктардың тұрақтылығын сақтау үшін диализ міндетті түрде салқын температурада жүруі керек. Кіші молекулалардың мембранадан сыртқы ортаға шығуын тездету үшін сыртқы сұйықты магнитті айналдырғышпен тұрақты түрде араластырып отырады. Мысалы, белокты аммоний сульфатымен тұнбаға түсіргеннен кейін тұнбаны мембраналы торсықтың ішіне құйып, тұздың қалдығынан құтылу үшін жоғарыда айтылғандай диализ жүргізеді.

Белоктың тұнбаға түсуіне қажет аммоний сульфатының концентрациясын алдын ала білген жағдайда, сол белоктың өте сұйық ерітіндісін қоюлату үшін кейде кері диализді қолданады. Яғни, диализ қапшығының ішіне белоктың сұйық ертіндісі құйылып, сыртқы сұйық аммонийдің сульфатының сол белокты тұнбаға түсіретін концентрациядағы ерітіндісі болуы керек. Диализ барысында қапшық ішіндегі белок ерітіндісінде тұздың концентрациясы біртіндеп өседі және сыртқы және ішкі ортадағы аммоний сульфатының концентрациясы теңелгенде белок толық тұнбаға түсіп үлгіреді (ішкі және сыртқы теңелген аммоний сульфатының мөлшері белокты тұнбаға толық түсіретін концентрациясы деген сөз) . Бірақ, белоктың мөлшері өте аз жағдайда бұл кері диализ әдісі тиімсіз, мембрана қапшығының ішіндегі тұнбаланған белокты толық алып шығу қиынға түседі.

... жалғасы

Сіз бұл жұмысты біздің қосымшамыз арқылы толығымен тегін көре аласыз.